efeito da olmesartana na inflamaÇÃo intra articular
TRANSCRIPT
UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO GRANDE DO NORTE
FACULDADE DE ENFERMAGEM
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SAÚDE E SOCIEDADE
MESTRADO ACADÊMICO EM SAÚDE E SOCIEDADE
MARILIA STEFANI SOUZA DE MENEZES
EFEITO DA OLMESARTANA NA INFLAMAÇÃO INTRA-ARTICULAR
INDUZIDA POR ZYMOSAN
MOSSORÓ
2016
MARILIA STEFANI SOUZA DE MENEZES
EFEITO DA OLMESARTANA NA INFLAMAÇÃO INTRA-ARTICULAR
INDUZIDA POR ZYMOSAN
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Saúde e Sociedade, da Universidade do Estado do Rio Grande do Norte, como requisito final para obtenção do grau de Mestre em Saúde e Sociedade. Orientadora: Profa. Dra. Caroline Addison Carvalho Xavier de Medeiros
MOSSORÓ
2016
Menezes, Marilia Stefani Souza De Efeito da Olmesartana na inflamação intra-articular induzida por Zymosan. / Marilia Stefani Souza De Menezes – Mossoró, RN, 2016.
68 f.
Orientador(a): Prof. Dra. Caroline Addison Carvalho Xavier de Medeiros
Dissertação (Mestrado) Universidade do Estado do Rio Grande do Norte. Campus Central. Programa de Pós - Graduação em Saúde e Sociedade, da Universidade do Estado do Rio Grande do Norte,
1. Inflamação. 2. Injeções Intra-Articulares. 3. Anti-inflamatórios. I. Medeiros,
Caroline Addison Carvalho Xavier de. II. Universidade do Estado do Rio Grande do Norte. III.Título. UERN/ BC CDD 616.15
Catalogação da Publicação na Fonte. Universidade do Estado do Rio Grande do Norte.
Bibliotecário: Sebastião Lopes Galvão Neto – CRB - 15/486
UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO GRANDE DO NORTE – UERN
FACULDADE DE ENFERMAGEM-FAEN
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SAÚDE E SOCIEDADE
MESTRADO ACADÊMICO EM SAÚDE E SOCIEDADE
A COMISSÃO ABAIXO ASSINADA APROVA A DISSERTAÇÃO INTITULADA
EFEITO DA OLMESARTANA NA INFLAMAÇÃO INTRA-ARTICULAR
INDUZIDA POR ZYMOSAN
Elaborada por
MARILIA STEFANI SOUZA DE MENEZES
COMO REQUISITO FINAL PARA OBTENÇÃO DO TÍTULO DE MESTRE EM
SAÚDE E SOCIEDADE
BANCA EXAMINADORA:
Prof Drª Caroline Addison Carvalho Xavier de
Medeiros
(Orientadora)
UFRN/RN ________________________________
Prof Drª Patricia Batista Barra Medeiros
Barbosa
(Examinador interno)
UERN/RN ________________________________
Prof Drª Aurigena Antunes de Araújo
(Examinador externo)
UFRN/RN ________________________________
MOSSORÓ
2016
Ao meu Deus, Pai amoroso que sempre
têm me sustentado. “Não tenho palavras
para agradecer Tua bondade (...). Tudo o
que tenho, tudo o que sou, o que vier a
ser, vêm de ti Senhor.”
Aos meus pais por serem a minha base.
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, por mais essa oportunidade concedida.
À minha família, pai, mãe e irmã, por sempre apoiarem as minhas decisões e
acreditarem em mim.
Ao meu esposo Alexandre, por muitas vezes abdicar das suas obrigações e
priorizar as minhas, sem você tudo teria sido muito mais difícil.
À minha orientadora, Caroline Addison, por ter me iniciado na pesquisa desde
a graduação em Enfermagem e continuar guiando meus passos em mais essa
jornada. Obrigada pela compreensão, por me deixar livre para que eu pudesse
aprender sozinha, por fazer pressão quando as coisas precisaram andar mais
rápidas e, pelas boas referências que sempre foram dadas.
Agradeço às professoras Drª Maria de Lourdes e Drª Isabela Pinheiro, pela
disponibilidade e contribuição na banca de qualificação, suas críticas e sugestões
foram imprescindíveis na conclusão deste estudo.
À banca de defesa, Drª Aurigena Antunes e Drª Patricia Barra, pelo interesse
em aceitar participar deste momento de grande importância na minha caminhada
acadêmica e pelo conhecimento compartilhado que só engrandeceu este trabalho.
Aos professores do Programa Mestrado em Saúde e Sociedade, pelos
conhecimentos repassados que foram tão necessários nessa construção.
Ao meu amado grupo dos “fantoches”: Cintia, Ana Maria, Paulo e Diógenes.
Obrigada pela amizade, união, risadas e confraternizações. Vocês se tornaram
amigos para a vida.
Aos demais colegas de turma, pelas conversas, momentos de descontração e
aprendizado. Desejo sucesso a todos vocês!
A todos que contribuíram direta e indiretamente. Muito obrigada!
RESUMO
A inflamação intra-articular é o principal sintoma clínico encontrado em processos
que envolvem doenças das articulações agudas e crônicas, tais como a Artrite
Reumatoide (AR), osteoartrite (OA) e gota. O objetivo desta pesquisa foi estudar o
efeito do pré-tratamento da olmesartana (OLM) na inflamação intra-articular induzida
por Zymosan (Zy) em ratos Wistar. A inflamação intra-articular (i.a.) foi induzida por 1
mg de Zymosan dissolvido em solução salina no joelho direito dos ratos. Os animais
foram divididos em seis grupos: grupo salina – animais receberam solução salina por
via oral (VO) trinta minutos antes da injeção (i.a.) de solução salina; grupo Zy –
animais receberam solução salina VO e Zy (i.a.); grupos tratados - animais
receberam Olmesartana nas doses de 5, 15 ou 30 mg/kg ou Diclofenaco de Sódio
(DS) 100 mg/kg VO antes da indução com Zymosan (i.a.). 24 horas após a injeção
de Zymosan, houve a coleta de líquido sinovial para contagem total de leucócitos,
coleta de sangue para dosagens bioquímicas (ureia, creatinina, aspartato
aminotransferase – AST e alanino aminotransferase - ALT) e coleta do tecido sinovial
para dosagem de mieloperoxidase (MPO), malondialdeído (MDA), glutationa (GSH)
por determinação de grupos sulfídricos não proteicos (NP-SH), exame
histopatológico e imuno-histoquímica. A OLM 15 ou 30 mg/kg, apresentou efeito
protetor, tal como evidenciado pela redução de alterações inflamatórias no exame
histopatológico da sinóvia dos animais, redução no número de leucócitos totais,
redução nos níveis de MPO e MDA; aumento nos níveis dos grupos NP-SH, em
comparação com o Zymosan. Olmesartana reduziu imunomarcação para
cicloxigenase-2 (COX-2) e aumentou a imunomarcação para superóxido dismutase
(SOD) e glutationa peroxidase (GSH-Px). Os resultados para DS foram semelhantes
aos observados com OLM (p<0,05). Olmesartana não causou alterações a nível
renal (ureia e creatinina) ou hepático (AST e ALT) nos animais e mostrou efeito
protetor sobre a inflamação intra-articular induzida por Zymosan.
DESCRITORES: Inflamação. Injeções Intra-Articulares. Anti-inflamatórios. Pleiotropia
Genética/ efeitos de drogas.
ABSTRACT
Intra-articular inflammation is the main clinical sign found in cases involving acute
and chronic joint diseases, such as Rheumatoid Arthritis (RA), osteoarthritis (OA) and
gout. The objective of this research was to study the effect of olmesartan (OLM) in
inflammation intra-articular zymosan-induced (Zy) in Wistar rats. Inflammation intra-
articular (i.a.) was induced by 1 mg of Zy dissolved in saline at right knee of rats. The
animals were divided into six groups: saline group – animals received saline solution
orally thirty minutes before the injection (i.a.) saline solution; Group Zy – animals
received saline solution orally and intra-articular Zy; and groups treated - animals
received the doses of 5, 15 or 30 mg/kg or diclofenac sodium (DS) 100 mg/kg orally
before induction with Zymosan (i.a.). 24 hours after injection of Zymosan, there was
the synovial fluid collection for total count of leukocytes, blood collection for
biochemical dosages (urea, creatinine, aspartate aminotransferase - AST and alanine
aminotransferase - ALT) and collecting the synovial tissue myeloperoxidase dosage
(MPO), malonaldehyde (MDA), glutathione (GSH) determining non-protein sulfídricos
groups (NP-SH), examination histopathology and immunohistochemistry. The OLM
15 or 30 mg/kg, showed a protective effect, as evidenced by the reduction of
inflammatory changes in synovial histopathological examination of animals, reduction
in the number of total leukocytes, reduction in levels of MPO and MDA; increase in
levels NP-SH groups, compared with zymosan. OLM has reduced immunostaining
for cyclooxygenase-2 (COX-2) and increased the immunostaining to superoxide
dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GSH-Px). The results for DS were
similar to those seen with OLM (p<0,05). Olmesartan caused no changes in the
kidney (urea, creatinine) and liver (AST and ALT) in animals and showed a protective
effect on intra-articular inflammation induced by Zymosan.
KEYWORDS: Inflammation. Injections, Intra-Articular. Anti-Inflammatory Agents.
Genetic Pleiotropy/ drug effects.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 Representação das deformidades em mão ocasionadas pela
AR........................................................................................................
25
Figura 2 Radiografias em perfil dinâmico (A - hiperextensão; e B -
hiperflexão), evidenciando a instabilidade atlanto-
axial.....................................................................................................
26
Figura 3 Representação do Cisto de
Baker...................................................................................................
26
Figura 4 Esquema do protocolo
experimental........................................................................................
39
Figura 5 Influxo celular no lavado sinovial após 24 horas de indução de
sinovite (média ± DP) em
ratos.....................................................................................................
47
Figura 6 Representação histopatológica da sinóvia de grupos não tratados e
tratados que receberam solução salina ou zymosan intra-
articular................................................................................................
49
Figura 7 Escores atribuídos às alterações histopatológicas observadas nos
animais dos diferentes grupos
experimentais.......................................................................................
50
Figura 8 Efeito atenuador da Olmesartana e Diclofenaco Sódico na atividade
de MPO na sinóvia de ratos.................................................................
51
Figura 9 Produção de MDA na sinóvia de ratos submetidos à inflamação
articular por zymosan...........................................................................
51
Figura 10 Concentração de GSH na sinóvia de ratos submetidos à zymosan e
salina (i.a.) pela determinação de NP-SH............................................
52
Figura 11 Representação de imuno-histoquímica de ciclo-oxigenase 2 (COX-
2), superóxido dismutase (SOD) e glutationa peroxidase (GSH-Px)
em tecido sinovial de ratos, 24 horas após a administração de
Zy.........................................................................................................
53
Figura 12 Níveis bioquímicos de ureia (A), creatinina (B), aspartato
aminotransferase (AST) (C) E alanina aminotransferase (ALT) (D)....
54
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Desenho experimental.....................................................................
38
Tabela 2 Valores de escores para parâmetros utilizados na análise
histopatológica das sinóvias............................................................
42
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ACR Colégio Americano de Reumatologia
AIEs Anti-inflamatórios esteroides
AIMR Artrite imuno-mediada em roedores
AINEs Anti-inflamatórios não-esteroides
ALT Alanina aminotransferase
Ang Angiotensina
ANTI-CCP Anti Peptídio Cíclico Citrulinado
AR Artrite Reumatoide
AST Aspartato aminotransferase
AT1-R Antagonistas dos receptores tipo 1
AVE Acidente Vascular Encefálico
Azy Artrite induzida por Zymosan
BRA Bloqueadores dos Receptores da Angiotensina
CDG Carga de doença global
CFA Adjuvante Completo de Freund
COX Ciclo-oxigenase
DCV Doenças cardiovasculares
DM Diabetes mellitus
DMARDs Drogas modificadoras do curso da doença
DNA Ácido desoxirribonucleico
DS Diclofenaco de sódio
DTNB Ácido Ditiobis Nitrobenzóico
ECA Enzima Conversora de Angiotensina
EDTA Ácido etileno-diamino-tetra-acético
EROs Espécies Reativas de Oxigênio
FGF Fator de crescimento de fibroblastos
FLS Fibroblastos
FR Fator Reumatoide
GSH Glutationa
GSH-Px Glutationa peroxidase
HÁ Hipertensão Arterial
HE Hematoxilina-eosina
HLA Antígenos leucocitários humanos
HTAB Tampão brometo de cetil trimetil amônio
i.a. Via intra-articular
IAM Infarto Agudo do Miocárdio
ICAM Molécula de Adesão Intercelular
ICC Insuficiência Cardíaca Congestiva
IECA Inibidores da Enzima Conversora de Angiotensina
IFA Adjuvante incompleto de Freund
IFNγ Interferon gama
Ig Imunoglobulinas
IL Interleucina
INOs Síntese de Óxido Nítrico Induzível
i.p Via intraperitoneal
LES Lúpus Eritematoso Sistêmico
M-CSF Fator estimulador de colônias de granulócitos
MDA Malondialdeído
MLS Macrófagos
MMPs Metaloproteinases da matriz
MPO Mieloperoxidase
MTX Metotrexato
NF-κB Fator nuclear de transcrição kappa B
NP-SH Grupos sulfidrílicos não proteicos
AO Osteoartrite
OLM Olmesartana
PA Pressão Arterial
PCR Proteína C Reativa
PG Proteoglicanos
PGs Prostaglandinas
RANK Receptor ativador do fator nuclear κB
RANKL Ligando do receptor ativador do NF-κB
SOD Superóxido dismutase
SRAA Sistema Renina-Angiotensina-Aldosterona
TLR2 Receptores semelhantes a toll like 2
TNF Fator de Necrose Tumoral
VEGF Fator de crescimento vásculo-endotelial
VHS Velocidade de hemossedimentação
ZY Zymosan
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO................................................................................................... 17
1.1 INFLAMAÇÃO INTRA-ARTICULAR E ARTRITE REUMATOIDE.................... 17
1.1.1 Artrite Reumatoide e estresse oxidativo............................................... 23
1.1.2 Manifestações Clínicas............................................................................... 24
1.1.3 Diagnóstico.................................................................................................. 27
1.1.4 Tratamento da AR........................................................................................ 29
1.2 MODELO DE INFLAMAÇÃO INTRA-ARTICULAR INDUZIDA POR
ZYMOSAN..............................................................................................................
31
1.3 EFEITO ANTI-INFLAMATÓRIO DA OLMESARTANA..................................... 32
2 OBJETIVOS........................................................................................................ 35
2.1 OBJETIVO GERAL........................................................................................... 35
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS............................................................................ 35
3 MATERIAIS E MÉTODOS.................................................................................. 36
3.1 ANIMAIS........................................................................................................... 36
3.2 DROGAS, ANTICORPOS, SOLUÇÕES, LÍQUIDOS E CORANTES
UTILIZADOS..........................................................................................................
36
3.3 APARELHOS E INSTRUMENTOS LABORATORIAIS.................................... 37
3.4 INFLAMAÇÃO ARTICULAR INDUZIDA POR ZYMOSAN................................ 37
3.4.1 Modelo experimental................................................................................... 37
3.4.2 Grupo salina................................................................................................. 39
3.4.3 Grupo zymosan........................................................................................... 39
3.4.4 Grupos tratados com Olmesartana ou Diclofenaco de Sódio................ 40
3.5 PARÂMETROS AVALIADOS PARA O ESTUDO DA MODULAÇÃO
FARMACOLÓGICA NA ARTRITE INDUZIDA POR ZYMOSAN............................
41
3.5.1 Análise do influxo celular........................................................................... 41
3.5.2 Análise histopatológica das sinóvias........................................................ 41
3.5.3 Dosagem de mieloperoxidase (MPO)........................................................ 42
3.5.4 Determinação dos níveis de glutationa (GSH).......................................... 43
3.5.5 Níveis de malondialdeído (MDA)................................................................ 43
3.5.6 Imuno-histoquímica para cicloxigenase 2 (COX 2), superóxido
dismutase (SOD) e glutationa peroxidase (GSH - Px).......................................
44
3.5.7 Avaliação de dosagens bioquímicas (ureia, creatinina, AST, ALT)........ 44
3.4.8 Métodos estatísticos................................................................................... 45
4 RESULTADOS.................................................................................................... 46
4.1 ANÁLISE DO INFLUXO CELULAR NO LÍQUIDO SINOVIAL.......................... 46
4.2 ANÁLISES HISTOPATOLÓGICAS DAS SINÓVIAS........................................ 47
4.3 ATIVIDADE DA MIELOPEROXIDASE............................................................. 50
4.4 PRODUÇÃO DE MALONDIALDEÍDO.............................................................. 51
4.5 NÍVEIS DE GLUTATIONA................................................................................ 52
4.6 IMUNO-HISTOQUÍMICA.................................................................................. 52
4.7 AVALIAÇÃO DAS DOSAGENS BIOQUÍMICAS.............................................. 54
5 DISCUSSÃO....................................................................................................... 55
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS................................................................................ 61
ANEXOS................................................................................................................ 62
REFERÊNCIAS...................................................................................................... 63
16
1 INTRODUÇÃO
1.1 INFLAMAÇÃO INTRA-ARTICULAR E ARTRITE REUMATOIDE
O processo inflamatório é um mecanismo de reação dos tecidos para que
haja uma eliminação, neutralização e destruição da causa da agressão. Esse
processo se caracteriza pela saída de líquidos e células (exsudação) e induz o
processo de reparo celular. A inflamação pode ser aguda (entre 1 a 2 semanas) ou
crônica (superior a 3 meses), porém, os mecanismos iniciais serão os mesmos para
os dois tipos. Assim sendo, o que diferencia essa divisão é o tempo de exposição ao
agente agressor, o tipo de agente e a resposta imune (KUMAR; ABBAS e FAUSTO,
2008).
Existem cinco sinais no processo inflamatório que são chamados sinais
cardinais: calor, rubor, edema, dor e perda da função. O calor e o rubor são
decorrentes da vasodilatação que leva ao local afetado uma maior quantidade de
sangue (hiperemia), e, portanto, há um aumento da temperatura pelo aumento de
sangue e vermelhidão pela concentração de sangue. O edema se dá pelo aumento
da permeabilidade vascular que permite o extravasamento de líquidos. A dor
aparece tanto por compressão dos nervos pelo edema quanto por mediadores
químicos liberados como prostraglandinas (PGs) E2 e cininas. A perda da função
pode ser total ou parcial e ocorre em decorrência dos outros quatro sinais cardinais.
Durante todo o processo inflamatório há liberação de mediadores químicos, como as
aminas vasoativas (histamina e serotonina), metabólitos do ácido araquidônico (PGs
e leucotrienos), citocinas e espécies reativas de oxigênio (EROs) (BRASILEIRO
FILHO, 2009).
A inflamação intra-articular é o principal sintoma clínico encontrado em
processos que envolvem doenças das articulações agudas e crônicas, tais como a
artrite reumatoide (AR), osteoartrite (OA) e gota. Artrite é um termo genérico para
várias doenças articulares que envolve a inflamação de uma ou mais articulações ou
do sistema musculoesquelético. Existe mais de 150 tipos de doenças reumáticas e
musculoesqueléticas categorizadas como artrite; no entanto, a forma mais comum é
a OA, também denominada de artrose ou osteoartrose (CONTE et al., 2015; CROSS
et al., 2014).
17
Durante as últimas duas décadas, o cenário global da saúde passou por uma
rápida transformação. As pessoas estão vivendo mais do que em qualquer outra
época e a população está envelhecendo. Como resultado, o fardo das doenças é
cada vez mais definido pela invalidez ao invés da mortalidade prematura. A
abordagem do estudo de carga de doença global (GBD) é um esforço sistemático e
científico para quantificar a magnitude comparativa da perda de saúde decorrente de
doenças, lesões e fatores de risco por idade, sexo e geografia para pontos
específicos no tempo. A classificação das doenças se dá pela soma de fatores,
como anos perdidos em decorrência de morte prematura e anos vividos com
invalidez. Neste contexto, algumas formas de artrite foram classificadas como
doenças que levam à maior carga de saúde a nível mundial, como a artrite
psoriática, lúpus eritematoso sistêmico (LES), artrite infecciosa e AR, tendo essa
última maior destaque por ocupar a posição 42 dentre as 291 condições estudadas
globalmente (ROY; KANWAR e KANWAR, 2015).
A AR é uma artropatia inflamatória sistêmica, autoimune, progressiva,
caracterizada por poliartrite crônica que começa insidiosamente com fadiga,
anorexia, astenia e sintomas musculoesqueléticos vagos até o aparecimento da
sinovite se tornar evidente (MOTA et al., 2011).
A poliartrite ocorre por causa de uma sinovite mediada por respostas
imunológicas – celular e humoral –, e o distúrbio afeta, principalmente, as
articulações periféricas de modo simétrico, iniciando pelas articulações dos dedos,
mãos e pés, com destaque para as articulações metacarpofalangeanas e
interfalangeanas proximais e, evoluindo para articulações maiores, como ombros e
joelhos (ABBAS; LICHTMAN e PILLAI, 2008; KOURILOVITCH; GALARZA-
MALDONADO e ORTIZ-PRADO, 2014).
A AR tem uma prevalência mundial em torno de 0,5 a 1,0% da população
adulta, sendo as mulheres duas a três vezes mais acometidas que os homens,
ocorrendo em todas as regiões do mundo e em todas as etnias. A doença se inicia,
geralmente, entre 30 a 50 anos, sendo que 20% a 30% dos pacientes não tratados
tornam-se incapacitados para o trabalho dois a três anos após o diagnóstico. A
prevalência aumenta com a idade em ambos os gêneros, acompanhando o
envelhecimento da população. No Brasil, a prevalência é similar à da população
mundial, predominando na população do gênero feminino, com início após os 40
anos e com maior incidência na faixa dos 50 anos (GIBOFSKY, 2012; BLAY et al.,
18
2012; VOGELPOEL et al., 2015).
A sobrevida dos pacientes com AR é menor do que a da população em geral
e a expectativa de vida pode decrescer de três a dez anos, dependendo da
gravidade e da idade do paciente no início da doença. As causas mais comuns
descritas para as mortes desses pacientes são as doenças cardiovasculares, alguns
tipos de câncer, doenças infecciosas e renais. Pacientes com AR apresentam maior
número de dias com comprometimento da saúde física e mental comparados com
indivíduos sem a doença. Devido ao caráter progressivo, ao desenvolvimento das
deformidades e ao comprometimento da capacidade funcional, a AR representa um
importante impacto econômico e social (AVIÑA-ZUBIETA et al., 2008; GABRIEL e
MICHAUD, 2009; HOOTMAN; HELMICK e BRADY, 2012; ZHANG et al., 2010).
A patogenia da AR ainda é objeto de estudo de pesquisas, e a doença
parece ser de origem multifatorial – fatores hormonais, ambientais e imunológicos,
que atuam em conjunto sobre indivíduos geneticamente suscetíveis –, com
manifestações ocasionadas a partir de diversos mecanismos inflamatórios. Os
fatores genéticos estão fortemente associados à positividade do anticorpo anti
peptídio cíclico citrulinado (anti-CCP). Diversos genes já foram relacionados com o
desenvolvimento da AR, sendo o sistema de histocompatibilidade humano (HLA:
human leukocyte antigens) no locci DRB1 – que codifica as moléculas de
histocompatibilidade presentes na superfície das células apresentadoras de
antígenos – a principal associação genética, estando também associados ao
desenvolvimento de formas mais graves da doença (BALSA et al., 2010; STAHL et
al., 2010).
Sabe-se que a sinovite causa ativação e proliferação das células de
revestimento sinovial, bem como expressão de citocinas pró-inflamatórias,
recrutamento de células inflamatórias mediada por quimiocinas e ativação de células
B, com produção de autoanticorpos. Todos estes fatores agem em conjunto e
amplificam a resposta inflamatória, havendo contínua alteração na expressão de
citocinas e consequente ativação de mecanismos de sinalização celular e inibição de
apoptose, que contribuem para a destruição de cartilagens e a perda óssea,
mecanismos mediados principalmente por osteoclastos (SWEENEY e FIRESTEIN,
2004).
A compreensão da fisiopatologia dos mecanismos envolvidos na lise da
cartilagem articular e do osso subcondral - que consiste de uma fina placa de osso
19
localizada diretamente sob a cartilagem articular, juntamente com o osso esponjoso
que dá sustentação a esta placa óssea – é necessária para se buscar tratamentos
que possam alterar o curso evolutivo da doença.
A cartilagem articular é essencial para o movimento normal das articulações,
apresentando em sua composição condrócitos imersos numa matriz extracelular.
Essa matriz consiste principalmente de colágeno e proteoglicanos sulfatados (PG), o
que confere a esse tecido, resistência e elasticidade (REGO, 2010).
A membrana sinovial normal que reveste as articulações tem uma espessura
de duas a cinco camadas de células, dispondo de uma rica vascularização. Esta
apresenta-se como um tecido composto por duas camadas: uma camada superficial,
de revestimento, denominada camada íntima ou camada de revestimento sinovial, e
uma camada subíntima, localizada abaixo do revestimento e composta,
principalmente, por tecido conjuntivo. A camada íntima apresenta uma espessura de
normalmente uma a três células, sendo uma camada avascular e sem a presença de
lâmina basal. Dois tipos celulares predominam no tecido sinovial: os sinoviócitos do
tipo A e B. As células do tipo A assemelham-se estrutural e funcionalmente a
macrófagos (MLS) e compõem entre 20 e 30% das células da membrana. Os
sinoviócitos do tipo B, que são a maioria – cerca de 70% das células do tecido
sinovial -, são também conhecidos como sinoviócitos semelhantes a fibroblastos
(FLS), e parecem ter um papel-chave não somente no desencadeamento da
sinovite, como também nos mecanismos que levam a perda óssea e destruição de
cartilagens, que são complicações frequentes da AR (SWEENEY e FIRESTEIN,
2004; MOR; ABRAMSON e PILLINGER, 2005).
Uma das hipóteses propostas para explicar o evento inicial na AR atribui o
fato à presença de um agente infeccioso ou outro tipo de exposição ambiental, que
poderia ativar mecanismos locais de imunidade inata no microambiente articular,
ativando células do revestimento sinovial e permitindo uma subsequente resposta
celular adaptativa em indivíduos suscetíveis geneticamente, ocasionando a sinovite.
Projeções de tecido proliferativo penetram na cavidade articular, invadindo a
cartilagem e o tecido ósseo, formando o pannus, característico da AR (VOGELPOEL
et al., 2015).
A invasão da cartilagem pelo pannus leva a degradação do colágeno tipo II
por metaloproteinases da matriz (MMPs), e por outras enzimas produzidas por
células sinoviais e condrócitos quando estimulados por citocinas, como fator de
20
necrose tumoral alfa (TNFα), interleucina (IL) 1β, IL 6, IL 17 e oncostatina. As
melatoproteinases da membrana tipo 1 (MMP-1) são proteinases chave que
medeiam a ação do pannus na cartilagem. Além do colágeno tipo II, o proteoglicano
agrecan é outro importante componente da cartilagem, conferindo a esta
propriedades de resistência à compressão, mantendo as moléculas de água nos
tecidos. Na AR, há diminuição do agrecan na cartilagem, devido a ação de
agrecanases (MILLER et al., 2009).
Sabe-se, além disso, que os fibroblastos sinoviais são células que estão
relacionadas ao controle do volume do líquido sinovial. Em condições saudáveis, um
aumento no volume deste líquido gera estresse na camada íntima e, em mecanismo
de feedback negativo, os fibroblastos sinoviais diminuem a produção de hialuronano
– que tem propriedades lubrificantes e imunomoduladoras –, reduzindo a pressão
oncótica local e reduzindo a retenção de plasma no líquido sinovial. No pannus
reumatoide, ocorre uma falha nestes mecanismos de feedback, de modo que a
produção de hialuronano não é reduzida frente ao estresse mecânico, aumentando a
retenção de líquido na cavidade articular e gerando estresse mecânico na camada
íntima sinovial (MOR; ABRAMSON e PILLINGER, 2005).
Em consequência à exposição inicial (como um agente infeccioso, por
exemplo), há um influxo de macrófagos e o aumento na proliferação de sinoviócitos,
ocasionando uma hiperplasia da membrana sinovial; o tecido é então infiltrado por
células mononucleares, em especial linfócitos T auxiliares e linfócitos B, podendo
haver a formação de estruturas semelhantes a nódulos linfáticos, com a participação
de macrófagos e células dendríticas, em aproximadamente um quinto dos pacientes
(SWEENEY e FIRESTEIN, 2004).
O quadro inflamatório se agrava em função da produção de autoanticorpos,
resultando na formação de imunocomplexos. Os autoanticorpos reconhecem
antígenos articulares, tais como o colágeno tipo II e PG ou ligam-se à porção Fc de
imunoglobulinas da classe IgG – também conhecido como fator reumatoide (FR) –
que possam estar presentes no local. A região Fc realiza ativação de complemento
(quando unida ao antígeno) e auxilia a fagocitose por se ligar a macrófagos. A
ativação do sistema complemento pelos imunocomplexos pode ainda iniciar uma
inflamação vascular com depósitos de FR em arteríolas, originando vasculites, cujo
impacto negativo na qualidade e na expectativa de vida do paciente é significativo
(TURESSON e MATTESON, 2009).
21
Adicionalmente, há uma ativação de mecanismos pró-inflamatórios por meio
da produção de citocinas. As células T que se acumulam na membrana sinovial
produzem IL-17 e interferon gama (IFNγ) em concentrações fisiologicamente
relevantes, enquanto os sinoviócitos A e B produzem citocinas como IL-1, TNFα –
envolvido na regulação de outras citocinas, recrutamento celular, angiogênese e
destruição tecidual – e IL-8, que provavelmente contribuem para a progressão e
perpetuação da inflamação sinovial, uma vez que haverá estímulo à proliferação de
sinoviócitos e produção contínua de outras citocinas e enzimas que levam a efeitos
que vão desde o influxo de outros macrófagos até mesmo a destruição articular,
mantendo um mecanismo de retroalimentação positiva entre sinoviócitos e
macrófagos recrutados que contribui para a progressão da doença (SWEENEY e
FIRESTEIN, 2004).
A IL-18, em particular, resulta em ativação de macrófagos, indução de IFNy e
diferenciação dos linfócitos T presentes no microambiente articular em um padrão de
resposta Th1, o que explica, em parte, a presença de granulomas na sinóvia
inflamada. Já a IL-6 é conhecida por facilitar a diferenciação de células T em células
T efetoras (Th1, Th2 e Th17) ou células T reguladoras (Treg). Citocinas produzidas
por estas células T sinoviais incluem TNF-α, IFN-γ, e a IL-17A. É comprovado
também que os efeitos resultantes da ação sinérgica das várias citocinas presentes
no ambiente articular inflamado incluem uma produção exacerbada de MMPs,
peças-chave para a destruição articular característica da artrite reumatoide
(SWEENEY e FIRESTEIN, 2004; KIKUCHI et al., 2015). Os estudos para elucidar o
perfil da resposta imunológica na artrite reumatoide revelam, portanto, a participação
de diversas citocinas, com os mais diferentes papéis, agindo em sinergia em uma
progressão inflamatória e ocasionando o quadro clínico característico do distúrbio.
A inflamação sinovial é regulada por mecanismos de vias de sinalização
intracelular e regulação da expressão gênica. O destaque nessa regulação é para a
ativação do fator nuclear de transcrição kappa B (NF-κB) – capaz de controlar a
expressão de TNFα, interleucinas, síntese de óxido nítrico induzível (iNOS),
cicloxigenase 2 (COX-2) e molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1) – moléculas
que favorecem a adesão de leucócitos do sangue periférico ao endotélio (KUKAR;
PETRYNA e EFTHIMIOU, 2009).
A COX-2 é uma enzima induzida em processos inflamatórios e está
envolvida na síntese de prostaglandinas e citocinas inflamatórias que promovem a
22
inflamação e dano do tecido local. Autores sugerem que a COX-2 expressa em
fibroblastos sinoviais de pacientes com AR, contribui para o aumento de citocinas
inflamatórias na matriz da cartilagem (HUANG e HUANG, 2014).
A maturação e a proliferação dos precursores dos osteoclastos, assim como
sua formação, ativação e sobrevivência, dependem muito do M-CSF (fator
estimulador de colônias de granulócitos) e RANKL (ligando do receptor ativador do
NF-κB). O RANKL é uma proteína transmembranar produzida pelos osteoblastos
que, ao ligar-se ao RANK (receptor ativador do fator nuclear κB), existente nos
precursores dos osteoclastos, vai estimular a sua diferenciação em osteoclastos
maduros. Os efeitos osteoclastogênicos de RANKL são reforçados pelo TNFα, IL1,
IL6, IL17 e inibidos por IFNγ e IL4. O TNFα é o mais potente estimulador da
diferenciação dos osteoclastos. Em pacientes com AR, o RANKL, além de ser
produzido pelos osteoblastos, é produzido por células T ativadas e por células
sinoviais, estimulando assim a maturação dos osteoclastos e promovendo a
reabsorção óssea, que culmina nas comuns erosões ósseas presentes em
portadores da AR (REGO, 2010).
O influxo de neutrófilos também é um importante achado histopatológico na
AR, atribuído à produção sinovial de IL-8 – citocina quimiotática para leucócitos
polimorfonucleares e produzida em abundância na sinóvia durante a doença. A
inflamação na sinóvia também apresenta como característica uma
neovascularização do tecido, necessária para fornecer nutrientes ao tecido, bem
como para permitir a migração de células inflamatórias para o sítio da inflamação.
Moléculas promotoras da angiogênese, como o fator de crescimento vásculo-
endotelial (VEGF) e o fator de crescimento de fibroblastos (FGF), são produzidos
pelas células presentes no revestimento sinovial, permitindo que haja essa
neovascularização em caso de inflamação, e contribuindo também para proliferação
dos sinoviócitos tipo B, etapa fundamental para o desenvolvimento de fibrose no
tecido sinovial, um outro achado histopatológico da artrite reumatoide (SWEENEY e
FIRESTEIN, 2004).
1.1.1 Artrite Reumatoide e estresse oxidativo
Espécies reativas de oxigênio referem-se aos átomos ou moléculas
altamente reativas, que contêm número ímpar de elétrons em sua última camada
23
eletrônica. É este não emparelhamento de elétrons da última camada que confere
alta reatividade a estes átomos ou moléculas, embora alguns deles não apresentem
elétrons desemparelhados em sua última camada. Em sua maioria são derivados do
metabolismo do O2 e são encontrados em todos os sistemas biológicos (FEITOSA,
2011).
Em condições fisiológicas do metabolismo celular aeróbio, o O2 sofre
redução tetravalente, com aceitação de quatro elétrons, resultando na formação de
H2O. Durante esse processo são formados intermediários reativos, como os radicais
superóxido (O2-), hidroperoxila (HO2) e hidroxila (OH-), e o peróxido de hidrogênio
(H2O2) (TARIQ et al., 2006).
Normalmente, a redução completa de O2 ocorre na mitocôndria, e a
reatividade das EROs é neutralizada com a entrada dos quatro elétrons. Todos os
componentes celulares são susceptíveis à ação das EROs, porém a membrana é
um dos mais atingidos em decorrência da peroxidação lipídica, que acarreta
alterações na estrutura e na permeabilidade das membranas celulares.
Consequentemente, a perda da seletividade na troca iônica e liberação do conteúdo
de organelas, como as enzimas hidrolíticas dos lisossomas, e formação de produtos
citotóxicos (como o malonaldeído), culminam com a morte celular (TARIQ et al,
2006).
Em condições normais, a concentração destas espécies dentro das células é
extremamente baixa pelo fato de existirem enzimas antioxidantes que as removem,
ou impedem sua formação. Estes radicais tendem a serem eliminados do organismo
do organismo pelo conjunto das enzimas superóxido dismutase (SOD), glutationa
peroxidase (GSH-Px), glutationa redutase (GR) e catalase (CAT) (FEITOSA, 2011).
O estresse oxidativo desempenha um papel importante na patogênese da
AR. Os pacientes com AR têm níveis elevados de estresse oxidativo, o
malondialdeído (MDA) é mais elevado do que em pacientes normais. Outros dados
sugerem que o uso de antioxidantes na dieta reduz a incidência da doença (JIA e
HE, 2016; SAHEBARI et al., 2015; CERHAN et al., 2003).
1.1.2 Manifestações Clínicas
O quadro clínico da AR é caracterizado por importantes alterações
articulares e sistêmicas. Tipicamente, o acometimento articular é múltiplo e
24
simétrico, apresentando rigidez matinal com duração maior que uma hora e dor que
piora com a movimentação. As articulações mais frequentemente afetadas são as
das mãos (articulações metacarpofalangeanas e interfalangianas proximais) e pés,
progredindo para os punhos e, depois, demais articulações (MOTA et al., 2011).
Edema, dor e calor local são características das articulações afetadas, que
podem ainda apresentar rubor local. Deformações articulares ocasionadas por
inflamação persistente são comuns, sendo encontradas com mais frequência nas
mãos e punhos. Assim, o desvio ulnar dos dedos decorre de uma frouxidão dos
tecidos moles nas articulações metacarpofalangianas. O dedo em “pescoço de
cisne” (boutonnière) representa uma hiperextensão das interfalangianas proximais
associada à hiperflexão das interfalangianas distais. O dedo em “abotoadura”
corresponde à hiperflexão das interfalangianas proximais com hiperextensão das
distais. O punho em “dorso de camelo” é o resultado da associação das
deformidades das articulações do punho com as das articulações
metacarpofalangianas (Figura 1) (GOELDNER et al., 2011).
FIGURA 1 – Representação das deformidades em mão ocasionadas pela AR (Adaptado de ADAM
images).
25
Outras articulações também são tipicamente acometidas: coluna cervical
(subluxação atlantoaxial) (Figura 2), articulações temporomandibulares (limitação
dolorosa da abertura da boca) e joelho (cistos de Baker, que podem simular um
episódio de tromboflebite) (Figura 3) (KLARESKOG et al., 2006).
FIGURA 2 - Radiografias em perfil dinâmico (A - hiperextensão; e B - hiperflexão), evidenciando a instabilidade atlanto-axial (Adaptado de Moreira Jr.).
FIGURA 3 – Representação do Cisto de Baker (Adaptado de ADAM images).
26
Além dos sintomas articulares, manifestações extra-articulares são
observadas em aproximadamente 50% dos pacientes, sendo a síndrome de Sjögren
– doença autoimune que afeta as glândulas lacrimais e salivares, que leva ao
desenvolvimento de xerostomia e xeroftalmia - a mais comum, além dos típicos
nódulos reumatoides, que resultam da vasculite de pequenos vasos, e a
consequente necrose com proliferação de fibroblastos e histiócitos epiteliais;
manifestações pulmonares (pleurite e fibrose pulmonar) e pericardite
(assintomática). Ao raio-X, a AR pode se manifestar desde um simples edema de
tecidos moles ou aumento do volume articular, até a erosão óssea e destruição
cartilaginosa (GOELDNER et al., 2011; MOTA et al., 2011).
Com a progressão da doença, os pacientes desenvolvem incapacidade para
realização de suas atividades cotidianas, o que leva a um significativo impacto
econômico para o paciente e para a sociedade. Algumas pessoas com AR têm
surtos agudos da doença, seguido por um período de remissão clínica (SMITH e
HAYNES, 2002).
A AR é considerada uma doença sistêmica que afeta, principalmente, as
articulações, mas mediadores inflamatórios envolvidos na patogênese da doença
podem afetar outros órgãos tais como o coração. Os pacientes com AR tem uma
maior taxa de doenças cardiovasculares, incluindo infarto agudo do miocárdio (IAM),
acidente vascular encefálico (AVE), insuficiência cardíaca congestiva (ICC) e
aumento da mortalidade por doenças cardiovasculares (DCV). Citocinas pró-
inflamatórias, complexos imunitários, proteínas de fase aguda e as partículas de
lipídeos modificados aumentam a ativação de células endoteliais e, potencialmente,
a instabilidade da placa aterosclerótica (HOLMQVIST, 2010).
1.1.3 Diagnóstico
O diagnóstico da AR é feito por meio da associação de uma série de
sintomas e sinais clínicos, achados laboratoriais e radiográficos.
A orientação para diagnóstico é baseada nos critérios de classificação do
Colégio Americano de Reumatologia (ACR), que são direcionados para o
diagnóstico precoce da doença em pacientes que se apresentam com
sintomatologia de curta duração. A população-alvo para esses novos critérios é
formada por pacientes com ao menos uma articulação edemaciada, caracterizada
27
clinicamente como sinovite clínica, e pacientes com sinovite que não pode ser
explicada por outra doença, como lúpus eritematoso sistêmico (LES), artrite
psoriática ou gota (GOELDNER et al., 2011).
Os critérios estabelecidos pela ACR são: rigidez matinal durando pelo menos
1 hora; artrite de três ou mais áreas, evidenciado por edema de partes moles ou
derrame articular; nódulos reumatoides; fator reumatoide sérico e alterações
radiográficas (erosões ou descalcificações), sendo necessário estarem presentes
por mais de seis semanas (LAURINDO et al., 2004).
Exames de imagem sofisticados têm contribuído de forma significativa para
o diagnóstico precoce da AR. Atualmente, a ressonância magnética (RM) é a técnica
de imagem que traz mais benefícios ao diagnóstico da doença, pois evidencia
precocemente alterações tanto de tecidos moles quanto de cartilagem e ossos. A
determinação do FR é amplamente utilizada no diagnóstico da AR, porém, estudos
mostraram uma positividade baixa no primeiro ano de doença, variando de 15 a
50%, e pouca especificidade. FRs podem ser encontrados no soro de pacientes com
outras doenças difusas do tecido conjuntivo (20-60%), doenças auto-imunes,
doenças infecciosas, hiperglobulinemias, doenças neoplásicas e indivíduos
saudáveis. Além disso, o FR serve para classificar os pacientes em soropositivos e
soronegativos, o que auxilia na determinação de características evolutivas próprias e
orientação terapêutica. Pacientes soropositivos e com altos títulos têm associação
com doença mais grave e manifestações extra-articulares, principalmente nódulos
reumatóides. A associação da presença do FR com aumento da mortalidade de
origem cardiovascular tem despertado interesse (KOURILOVITCH; GALARZA-
MALDONADO e ORTIZ-PRADO, 2014; SILVEIRA, 2005).
Uma família de auto-anticorpos na AR ganhou importância nos últimos anos:
os anticorpos contra proteínas citrulinadas. Entre eles, o antipeptídeo citrulinado
cíclico (anti-CCP) de segunda geração tem demonstrado melhor sensibilidade e
especificidade em relação aos anteriores. Anti-CCP são anticorpos muito específicos
para AR, e podem aparecer até 10 anos antes do início dos sintomas da doença.
Esses testes são marcadores de doença erosiva com pior evolução clínica. Existe
ainda uma associação do anti-CCP com HLA-DRB1, indicando doença mais grave
(SILVEIRA, 2005).
A fim de monitorar a atividade da doença, após o diagnóstico, é comum a
solicitação de exames como a velocidade de hemossedimentação (VHS) e a
28
dosagem de proteína C reativa (PCR), sendo esta última mais relacionada ao
monitoramento da elevação das citocinas inflamatórias, como IL-6 e TNFα, e à
progressão radiológica da inflamação, constituindo, portanto, um marcador mais
indicado para este monitoramento. Desta maneira, é importante uma atenção
especial para que o diagnóstico não seja confirmado a partir de nenhum teste
isolado, preconizando-se que há importância em detectar alterações laboratoriais, de
imagem e histopatológicas, se possível, para uma maior acurácia no diagnóstico
(MOTA et al., 2011).
1.1.4 Tratamento da AR
Na terapia medicamentosa da AR são empregados os anti-inflamatórios
esteroides (AIEs), as drogas modificadoras do curso da doença (DMARDs) e os anti-
inflamatórios não-esteroides (AINEs).
Os AIEs ou glicocorticoides são fármacos cujo mecanismo envolve a ligação
à proteínas receptoras intracelulares específicas: receptores esteroides, esterol
(vitamina D), hormônio tireoidiano, ácido retinóico, entre outros. O efeito induzido por
esses fármacos pode ser resultado da interação direta sobre sequências de DNA
específicas levando a uma transativação de genes de proteínas anti-inflamatórias
ou, indiretamente, pela inibição dos fatores de transcrição de genes, como o NF-kβ,
que codificam mediadores inflamatórios como citocinas, moléculas de adesão e
enzimas. Como consequência, ocorre supressão da produção de citocinas
inflamatórias, quimiocinas e moléculas de adesão, por meio da inibição da função
dos macrófagos e células apresentadoras de antígenos, inibição da desgranulação
dos mastócitos, redução da produção de prostaglandinas (PGEs) e leucotrienos pela
redução da expressão do COX-2, entre vários outros efeitos que contribuem para as
marcantes atividades anti-inflamatórias e imunossupressoras dessa classe. Embora
sejam fármacos anti-inflamatórios eficazes, a sua administração crônica
frequentemente resulta em reações adversas graves como elevação da glicose
sérica e do glicogênio hepático; depressão da função tireoidiana, reprodutiva e da
síntese de hormônios sexuais; interferência na absorção intestinal do cálcio
antagonizando a ação da vitamina D; aumento da reabsorção de sódio e água, com
retenção hídrica e elevação da pressão arterial; entre outras (SCHIMMER e
FUNDER, 2011).
29
Os DMARDs incluem um diversificado grupo de pequenas moléculas,
podendo ser agentes biológicos e não biológicos, sendo os mais comuns o
metotrexato (MTX), a hidroxicloroquina e a sulfassalazina. O objetivo primário das
terapias com esses medicamentos é preservar as funções das articulações,
reduzindo ou prevenindo danos (BLUMBERG e FOX, 2001). Alguns desses
fármacos inibem a produção de citocinas inflamatórias ou impedem a interação com
os receptores. Sendo os fármacos biológicos eficazes imunossupressores, existe o
risco da ocorrência ou agravamento de infecções agudas ou crônicas ou reativação
de infecções latentes, com consequências graves para o paciente (HAROON e
INMAN, 2009; KUKAR et al., 2009).
Os AINEs são anti-inflamatórios não esteroides que apresentam atividades
analgésica, antipirética e antiedema. Entre os mecanismos de ação propostos para
esses fármacos está a inibição das enzimas COX-1 e COX-2, as quais estão
envolvidas na produção de mediadores inflamatórios como PGEs. Entretanto, o seu
uso requer cautela devido à possibilidade de ocorrência de reações adversas como
dor epigástrica, úlceras gastrintestinais, lesões renais e eventos tromboembólicos
(ROUBILLE et al., 2015).
Os AINEs não são considerados DMARDs na AR e devem ser utilizados
somente como sintomáticos. Podem ser utilizados na fase de investigação da
doença e seu uso não costuma mascarar o processo inflamatório intenso observado
na AR. Durante a evolução da doença também pode ser utilizado, mas somente
para melhorar sintomas de rigidez matinal, por exemplo. Não devem ser usados
como a única droga na AR, pois não evitam o aparecimento de erosões ósseas
(TREVISANI; FIDELIX e APPENZELLER, 2011).
Quanto à escolha do melhor AINE, deve ser levado em conta o aspecto
financeiro, comorbidades e o histórico de eventos adversos do paciente. Como os
pacientes geralmente estão em uso de múltiplas medicações, a preferência é para
os inibidores seletivos ou específicos da COX2, evitando assim efeitos colaterais do
trato gastrintestinal (TGI). Os anti-inflamatórios não específicos, como o Diclofenaco,
presente na rede pública, também podem ser utilizados com eficácia similar. Porém
deve ser lembrado que no uso crônico é recomendada a associação de um protetor
gástrico, como o omeprazol (TREVISANI; FIDELIX e APPENZELLER, 2011).
30
1.2 MODELO DE INFLAMAÇÃO INTRA-ARTICULAR INDUZIDA POR ZYMOSAN
No desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para a AR, são
comumente utilizados modelos experimentais que fornecem conhecimento sobre os
mecanismos da doença e estudo de novos agentes terapêuticos. Apesar de não se
dispor de uma forma de AR em animais, a maioria dos modelos de artrite
empregados atualmente apresenta similaridades com a doença humana. Entre as
semelhanças, incluem-se o edema de articulação, a infiltração celular e as
alterações histopatológicas (WILSON et al., 2006; ROCHA et al., 2008).
Variações de modelos de artrite imunomediada em roedores (AIMR) têm
sido investigadas nas ultimas décadas a fim de verificar sua adequação para
avaliação de doença articular. As opções de AIMR estão relacionadas a variáveis
como espécie empregada (rato, camundongo ou porco da Índia), tipo de doença
(induzida, espontânea ou por modificação genética) e agente indutor (adjuvantes,
polissacarídeo, proteoglicanas, colágeno e outras proteínas) (BOLON et al., 2011).
A AR pode ser induzida em animais por vários agentes artritogênicos, tais
como o Zymosan (Zy), adjuvante (adjuvante incompleto de Freund - IFA e adjuvante
completo de Freund - CFA), colágeno bovino tipo II, antígeno e imunocomplexos. A
inflamação (i.a.) induzida por Zymosan é um modelo de baixo custo operacional, tem
início definido e permite a reprodução da lesão em 6 horas (fase aguda), podendo
ser usado em rápidos protocolos experimentais (MENEZES, 2013).
O Zymosan é um polissacarídeo preparado a partir da parece celular de
fungos leveduriformes, como o Saccharomyces cerevisiae. Seu principal
componente estrutural é a β-glucana, que apresenta propriedades
imunoestimulatórias. É reconhecido pelo receptor dectina 1, expresso em monócitos,
macrófagos, neutrófilos e células dendríticas (CARDOSO, 2007).
Após a injeção de Zymosan na cavidade articular, ocorre uma intensa
inflamação, com início duas horas após esta administração e atividade máxima na
sexta hora após a indução. Este polissacarídeo é um agonista dos receptores
semelhantes a toll like 2 (TLR-2), sendo capaz de promover resposta a partir da
expressão dos genes responsivos ao NF-κB, favorecendo a expressão de citocinas
pró-inflamatórias, que provocam aumento da permeabilidade vascular, resultando
em edema local e acentuado influxo celular, com predomínio de polimorfonucleares
(PMNs) (ABBAS; LICHTMAN e PILLAI, 2008; CARDOSO, 2007).
31
1.3 EFEITO ANTI-INFLAMATÓRIO DA OLMESARTANA
A Olmesartana é um anti-hipertensivo utilizado na clínica médica, da classe
dos fármacos antagonistas dos receptores tipo 1 (AT1-R) da angiotensina II
(Bloqueadores dos Receptores de Angiotensina - BRA) de ação prolongada, que
desempenha um importante papel no sistema renina-angiotensina-aldosterona
(SRAA), diretamente relacionado aos mecanismos intrínsecos de controle da
pressão arterial (PA) (NTOUNTANIOTIS et al., 2014).
Pesquisas sobre as ações do SRAA trazem sólidas informações sobre como
esse sistema é capaz de contribuir, de forma expressiva, na homeostase
hidroeletrolítica, controle da PA, regulação de processos metabólicos, modulação do
crescimento e proliferação celular de vários tecidos. Assim, a capacidade desse
sistema de se adaptar ou contribuir para uma doença está intimamente relacionada
ao seu envolvimento em processos tanto fisiológicos como fisiopatológicos. Cada
vez mais, a hiperatividade do SRAA tem sido relacionada à gênese de várias
doenças, sendo mais comumente relatadas: a hipertensão arterial (HA), o infarto
agudo do miocárdio (IAM), a insuficiência cardíaca congestiva (ICC), as arritmias
cardíacas, o diabetes mellitus (DM), a insuficiência renal crônica e o acidente
vascular encefálico (AVE) (FYHRQUIST e SAIJORUNAA, 2008).
A renina, uma protease produzida exclusivamente pelas células
justaglomerulares dos rins, hidrolisa o angiotensinogênio, um substrato de renina
produzido pelo fígado, formando angiotensina (Ang) I, um decapeptídeo, que é
convertido pela enzima conversora de angiotensina (ECA) para o octapeptídeo
angiotensina II (Ang II). Além da ECA, outra protease, a quimase, pode proporcionar
uma via alternativa para conversão da Ang I para Ang II (FYHRQUIST e
SAIJORUNAA, 2008).
A Ang II é o principal peptídeo efetor do SRAA e exerce suas ações via
receptores AT1 e AT2, que parecem mediar ações opostas. Os receptores AT1,
encontrados de forma abundante nos vasos, rins, coração, fígado e cérebro mediam
a vasoconstricção, a sede, a liberação de vasopressina, a fibrose, o crescimento e a
migração celular, a geração de EROs, a inflamação vascular, o remodelamento
cardíaco e vascular e a produção e liberação de aldosterona que contribuem não
somente para a gênese da HA, mas também para acelerar os danos nos chamados
"órgãos-alvo" (coração e rins). Já os receptores AT2, encontrados em tecidos como
32
glândulas adrenais, coração, aorta, rins, ovários, útero e cérebro, induzem
vasodilatação, liberação de óxido nítrico no endotélio e parece inibir o crescimento
celular (SEZAI et al., 2011; LIU et al., 2009).
Estudos demonstram que a Ang II possui efeitos pró-inflamatórios que
podem contribuir para a patogênese de doenças autoimunes, como a estimulação
da proliferação de linfócitos, que pode contribuir para a modulação das respostas
imunes, contudo, essa contribuição ainda não foi completamente elucidada. Além
disso, a angiotensina II pode ainda promover o aumento da permeabilidade vascular
(através da liberação de prostaglandinas e do fator de crescimento de células
endoteliais vasculares/fator de permeabilidade vascular) e participar do recrutamento
de células inflamatórias do infiltrado tecidual através da sua ativação direta ou pela
regulação da expressão de moléculas de adesão e quimiocinas pelas células
residentes; dessa forma, Ang-II participa de diversos eventos-chave da resposta
inflamatória (SAGAWA et al., 2005; OKUNUKI et al., 2009).
A partir da compreensão do SRAA, observou-se que os componentes
envolvidos neste mecanismo poderiam representar um bom alvo terapêutico no
controle da hipertensão, de modo que duas classes de fármacos anti-hipertensivos
agem sobre estes componentes: os inibidores da enzima conversora de
angiotensina (IECA) e os bloqueadores dos receptores da angiotensina (BRA), como
a olmesartana, alvo do presente estudo. Os medicamentos da classe BRA
apresentam efeitos pleiotrópicos anti-inflamatórios que suprimem citocinas como
TNF-α e IL-6, induzidos por ativação do fator nuclear NF-кB em células endoteliais
vasculares. Além de reduzir EROs e inibir o estresse oxidativo (NAKANO et al.,
2009; LI et al., 2013).
É comum que fármacos com propriedades conhecidas sejam estudados,
mesmo após sua introdução no mercado e na prática clínica, a fim de elucidar outras
possíveis propriedades farmacológicas. Embora sejam raros estudos que
correlacionem a terapia com olmesartana e as ações do medicamento na artrite
induzida em animais, nos últimos anos têm sido relatados uma interessante
propriedade anti-inflamatória para este fármaco em outros modelos de inflamação,
inibindo o estresse oxidativo e até mesmo reduzindo os níveis de citocinas
inflamatórias (ARAÚJO et al., 2013; DEROSA et al., 2014; MIYOSHI et al., 2014; LI
et al., 2013; ANDREEVA, 2013; MASON, 2011; KIM et al., 2011; SUKUMARAN et al.,
2011).
33
Desta forma, a realização do presente estudo mostra-se bem fundamentada.
Olmesartana possui propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias, podendo trazer
benefícios ao paciente com AR. Assim, propomos avaliar o efeito da olmesartana na
inflamação intra-articular induzida por Zymosan, vislumbrando melhorar a qualidade
de vida dos pacientes.
34
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Estudar o efeito da Olmesartana na inflamação intra-articular induzida por
Zymosan em ratos Wistar.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Verificar a ação da olmesartana sobre a infiltração neutrofílica pela análise de
parâmetros inflamatórios;
Avaliar atuação da Olmesartana sobre o estresse oxidativo;
Investigar o efeito da olmesartana na lesão intra-articular pela análise de
dosagens bioquímicas.
35
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 ANIMAIS
Os protocolos experimentais foram aprovados pela Comissão de Ética no
Uso de Animais (CEUA) da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN),
número 016/2013.
Para o estudo, foram utilizados 36 ratos da linhagem Wistar (Ratus
norvegicus albinus), machos, com massa corpórea entre 180 e 220 g, procedentes
do Biotério Setorial do Departamento de Biofísica e Farmacologia da UFRN. Os
mesmos foram colocados em gaiolas plásticas apropriadas, laváveis e com tampas
vazadas de metal, permanecendo em média cinco animais em cada uma, sobre
maravalha de madeira de pinho, trocadas a cada dois ou três dias. Todos receberam
ração comercial balanceada e água ad libitum, e foram mantidos sob condições de
temperatura adequada (22 ± 1°C), em ciclos claro-escuros controlados (12h/12h)
durante os experimentos.
3.2 DROGAS, ANTICORPOS, SOLUÇÕES, LÍQUIDOS E CORANTES UTILIZADOS
Água destilada
Álcool etílico 70%
Anticorpos cicloxigenase-2 (COX-2), superóxido dismutase (SOD), glutationa
peroxidase (GSH-Px) – Santa Cruz Biotecnologia, Interprise, Brasil
Avidina-peroxidase - Kit ABC Vectastain
Cromógeno DAB (3,3`diaminobenzidine-peróxido)
Diclofenaco - NOVARTIS
Diidrocloreto de O-dianisidina – Sigma, São Paulo, Brasil
DTNB (ácido 5,5-ditiobis 2-nitrobenzóico) - Sigma, São Paulo, Brasil
EDTA (ácido etileno-diamino-tetra-acético) – Reagen, Paraná, Brasil
Eosina - Merck
Formaldeído 10%
HCl 37% (ácido clorídrico puro)
Hematoxilina - Reagen, Paraná, Brasil
36
Kits aspartato amino transferase (AST), alanina amino transferase (ALT), ureia e
creatinina - Labtest Diagnóstica SA
Olmesartana medoxomila (Benicar 20mg) – Daiichi Sankyo Brasil Farmacêutica
Ltda
Peróxido de hidrogênio 1%
Tetraetoxipropano – Santa Cruz Biotecnologia, Interprise, Brasil
Solução de Turk
Soro fisiológico 0,9% (NaCl 0,1M)
Tampão fosfato salino (PBS)
Tampão HTAB (brometo hexadecil-trimetil-amônio) - Sigma, São Paulo, Brasil
Tampão citrato 0,1 M
Tampão fosfato de potássio
Tampão TRIS (0,4M Ph 8,9)
Tampão Tris HCl
Xilol
Zymosan - Sigma, São Paulo, Brasil
3.3 APARELHOS E INSTRUMENTOS LABORATORIAIS
Balança digital eletrônica – Filizola
Balança analítica (Analytical Standard – Ohaus)
Centrífuga refrigerada (Centrifuge 5804R – Epemdorf)
Espectrofotômetro (Spectrônic 20 – Genesys)
Geladeira e freezer (-70º)
Instrumental cirúrgico (pinças, bisturis, tesouras, etc.)
Micropipetas automáticas
Microscópio óptico binocular
Micrótomo (Olympus)
3.4 INFLAMAÇÃO ARTICULAR INDUZIDA POR ZYMOSAN
3.4.1 Modelo experimental
Inicialmente, os animais foram pré-tratados com Olmesartana ou Diclofenaco
37
de Sódio por via oral, em seguida foram anestesiados com xilazina (10 mg/Kg) e
quetamina (70 mg/Kg) por via intramuscular, realizou-se a injeção intra-articular (i.a.)
de 1 mg de zymosan, diluído em 50 L de solução salina a 0,9%, no joelho direito
dos ratos para indução da inflamação (ROCHA et al., 2008). Após 24h da indução da
artrite, como realizado por Conte et al. (2008), os animais foram eutanasiados com
tiopental (80 mg/Kg) por via intraperitoneal (i.p.) e foi realizada a exsanguinação via
intracardíaca, a fim de evitar hemorragia intra-articular. Após eutanásia foram
realizadas coletas de sangue por meio de punção cardíaca para dosagens
bioquímicas de ureia sérica, creatinina, aspartato aminotransferase (AST) e alanina
aminotransferase (ALT), coleta do líquido sinovial por aspiração intra-articular, para a
contagem do influxo celular, e coleta de sinóvias pela dissecção dos joelhos para a
dosagem de mieloperoxidade (MPO), glutationa (GSH) pela determinação dos
grupos sulfídricos não proteicos (NP-SH), malondialdeído (MDA), avaliação
histopatológica e imuno-histoquímica.
Os animais foram divididos em 6 grupos experimentais – Salina, Zymosan,
Olmesartana 5 mg/Kg, Olmesartana 15 mg/Kg, Olmesartana 30 mg/Kg, Diclofenaco
de Sódio 100 mg/Kg. Cada grupo era composto por 6 (seis) animais.
A tabela 1 resume os grupos em que foram distribuídos os animais, bem
como os fármacos administrados e suas doses. A figura 4 representa o esquema do
protocolo experimental.
Tabela 1 – Desenho experimental
Grupos Administração via oral Administração i.a.
Salina (n = 6) Solução salina a 0,9% Solução salina a 0,9%
Zymosan (Zy) (n = 6) Solução salina a 0,9% 1 mg Zymosan
Olmesartana 5 mg/Kg
(OLM 5) (n = 6)
Olmesartana 5 mg/Kg 1 mg Zymosan
Olmesartana 15 mg/Kg
(OLM 15) (n = 6)
Olmesartana 15 mg/Kg 1 mg Zymosan
Olmesartana 30 mg/Kg
(OLM 30) (n = 6)
Olmesartana 30 mg/Kg 1 mg Zymosan
Diclofenaco Sódico
(DS) (n = 6)
Diclofenaco Sódico 100
mg/Kg
1 mg Zymosan
38
FIGURA 4 - Esquema do protocolo experimental. 3.4.2 Grupo salina
Administrou-se 0,5 mL de solução salina, via oral, através de gavagem com
cânula. Após trinta minutos foram administrados 50 L de solução salina estéril
(0,9%) intra-articular. A eutanásia foi realizada na 24ª hora do experimento.
3.4.3 Grupo zymosan
Aplicou-se 1 mg de Zymosan intra-articular (i.a.), dissolvido em 50 L de
solução salina e os animais não receberam qualquer forma de tratamento, apenas
39
0,5 mL de solução salina 0,9%, administradas por via oral (por meio de gavagem com
cânula de metal apropriada), trinta minutos antes da injeção do Zy (i.a.). Os animais
foram eutanasiados na 24ª hora do experimento.
3.4.4 Grupos tratados com Olmesartana ou Diclofenaco de Sódio
Foram submetidos ao pré-tratamento com Olmesartana ou Diclofenaco de
Sódio, 24 animais, divididos em quatro grupos experimentais:
Animais submetidos à artrite experimental tratados com Olmesartana na dose de 5
mg/Kg, administrada por via oral, 30 minutos antes à indução.
Os animais receberam Olmesartana na dose de 5 mg/Kg, via oral por
gavagem, trinta minutos antes da indução com Zymosan (i.a.).
Animais submetidos à artrite experimental tratados com Olmesartana na dose de
15 mg/Kg, administrada por via oral, 30 minutos antes da indução.
Os animais receberam Olmesartana na dose de 15 mg/Kg, via oral por
gavagem, trinta minutos antes da indução com Zymosan (i.a.).
Animais submetidos à artrite experimental tratados com Olmesartana na dose de
30 mg/Kg, administradas por via oral, 30 minutos antes da indução.
Os animais receberam Olmesartana na dose de 30 mg/Kg, via oral por
gavagem, trinta minutos antes da indução com Zymosan (i.a.).
Animais submetidos à artrite experimental tratados com Diclofenaco de Sódio 100
mg/Kg, administradas por via oral, 30 minutos antes da indução.
Os animais receberam Diclofenaco de Sódio na dose de 100 mg/Kg, via oral
por gavagem, trinta minutos antes da anestesia e indução da artrite por Zymosan
(i.a.).
40
3.5 PARÂMETROS AVALIADOS PARA O ESTUDO DA MODULAÇÃO
FARMACOLÓGICA NA INFLAMAÇÃO ARTICULAR INDUZIDA POR ZYMOSAN
3.5.1 Análise do influxo celular
A coleta do líquido sinovial foi realizada através da lavagem na cavidade
articular, fazendo-se duas injeções com 0,2 mL de tampão fosfato de sódio (0,15 M,
pH 7,4) contendo 37,2 mg de ácido etilenodiamino tetra-acético - EDTA (0,01 M). O
lavado articular foi obtido por aspiração e mantido em banho de gelo. Utilizou-se
amostras desse lavado para contagem global de células na câmara de Neubauer,
diluídas em solução de Turk (composto de ácido acético glacial, azul de metileno e
água destilada), em proporção de 1:20, líquido diluidor que hemolisa as hemácias e
preserva as células nucleadas (ROCHA et al., 2008).
3.5.2 Análise histopatológica das sinóvias
Após a coleta do lavado sinovial, a sinóvia foi coletada e fixada em formol a
10% por um período de 24 horas. A seguir, as peças foram dispostas em álcool
etílico a 70% para desidratação, com posterior inclusão em parafina. Os cortes
teciduais foram colocados em moldes retangulares, formando blocos que foram
subsequentemente seccionados por navalhas de aço do micrótomo de 4 µm visando
a coloração por hematoxilina-eosina (HE) (ROCHA et al., 2008). Foi realizada
análise das lâminas, avaliando-se os seguintes parâmetros histopatológicos:
exsudato inflamatório, comprometimento do exsudado inflamatório (perivascular,
intersticial e epitélio sinovial), depósitos fibrinóides e células gigantes. Foram
atribuídos diferentes escores para os achados histopatológicos, a fim de quantificar
as alterações teciduais, de modo que a ausência de parâmetros inflamatórios foi
representada pelo escore 0; o escore 1 representa parâmetro presente com
intensidade leve, enquanto o escore 2 retrata parâmetro presente com intensidade
moderada e o escore 3 foi atribuído a parâmetro presente com intensidade
acentuada, como representa a tabela 2 (CARDOSO, 2007).
41
Tabela 2 – Valores de escores para parâmetros utilizados na análise histopatológica
das sinóvias
Escore 0 Parâmetro ausente
Escore 1 Parâmetro presente com intensidade
leve
Escore 2 Parâmetro presente com intensidade
moderada
Escore 3 Parâmetro presente com intensidade
acentuada
3.5.3 Dosagem de mieloperoxidase (MPO)
A membrana sinovial dos animais dos diferentes grupos experimentais foi
processada para dosagem, por espectrofotometria, com objetivo de verificar a
atividade da mieloperoxidase, enzima presente de forma abundante nos grânulos
azurófilos dos neutrófilos, liberada em resposta a micro-organismos e lesão oxidativa
celular. MPO, ao reagir com peróxido de hidrogênio (H2O2), forma radicais livres e
substâncias oxidantes que causam processo inflamatório e lesão tecidual. Assim,
tem sido utilizada como um marcador quantitativo da infiltração de neutrófilos nos
processos inflamatórios em vários tecidos. Sua presença foi determinada por
método colorimétrico, usando um leitor de placa. As medidas de atividade da MPO
foram realizadas a partir das sinóvias dos ratos, usando uma versão modificada do
método descrito por Bradley et al. (1982).
As membranas sinoviais foram removidas as sinóvias, pesadas e
congeladas em freezer a 70ºC negativos até a realização do ensaio. Durante o
ensaio, as amostras foram incubadas em solução de HTAB 0.5% (brometo de
hexadecil-trimetil-amonio) na proporção de 50 mg de tecido por mL e em seguida,
foram homogeneizadas (politron-13000 rpm). As amostras foram submetidas a um
ciclo de congelamento/descongelamento três vezes. Posteriormente, foi realizada a
centrifugação (5000 rpm, 20 min, 4°C) e as amostras foram congeladas por 24 horas
para recolhimento do sobrenadante. No dia seguinte, após plaqueamento de 7 µL do
sobrenadante, em duplicata (placas de 96 poços), adicionou-se 200 µL da solução
de leitura (água destilada, tampão fosfato de potássio e diidrocloreto de o-diasidina)
42
na placa, sendo adicionado o peróxido de hidrogênio a 1% imediatamente antes da
leitura. A absorbância foi medida a 450 nm através de espectrofotômetro no tempo 0
(basal) e 1 minuto. A mudança na absorbância foi obtida, plotada em curva padrão
de neutrófilos e os valores obtidos foram expressos como neutrófilos/mg de tecido
(atividade de MPO).
3.5.4 Determinação dos níveis de glutationa (GSH)
A glutationa (GSH) é um antioxidante hidrossolúvel reconhecido como o
mais importante componente endógeno do poll dos grupos sulfídricos não proteicos
(NP-SH) do organismo e atua protegendo as células contra toxinas como as EROs.
Os compostos sulfidrila ligam-se aos radicais livres formados durante o processo
inflamatório (FEITOSA, 2012).
A concentração de GSH na sinóvia dos animais foi avaliada pelo ensaio para
determinação de NP-SH (SEDLAK e LINDSAY, 1968). As amostras foram trituradas
em homogeneizador Politron Ultra-Turrax, utilizando-se 1 mL de EDTA 0,02M para
cada 100 mg de tecido, sob refrigeração. Alíquotas de 400 μL do homogenato foram
adicionadas a 320 μL de água destilada e 80 μL de ácido tricloroacético 50% (TCA)
para a precipitação de proteínas. Os tubos foram centrifugados (3000 rpm, 15 min,
4ºC) e alíquotas de 400 μL do sobrenadante foram adicionadas a 800 μL de tampão
Tris 0,4 M, pH 8,9 e 20 μL de ácido 5,5-ditiobis (2-nitrobenzóico) (DTNB) e agitados
por 3 minutos no agitador de tubos. A absorbância foi determinada imediatamente
após o acréscimo do DTNB, em 412 nm. A quantidade de grupos sulfidrílicos não
proteicos nas sinóvias foi expressa como mg/g de tecido.
3.5.5 Níveis de malondialdeído (MDA)
Malonaldeído é um aldeído formado pela decomposição dos hidroperóxidos
lipídico. Sua concentração tem sido utilizada para estimar a intensidade da
peroxidação lipídica que consiste na ação de radicais livres nos fosfolipídios da
membrana celular, causando ruptura da membrana celular, mutações no DNA e
ativação da via do ácido araquidônico (formação de prostaglandinas).
Para quantificar o aumento na produção de radicais livres em amostras de
tecido sinovial, o teor de MDA foi medido através do ensaio descrito a seguir. Para a
43
dosagem, foi adicionado tampão tris HCL 20 mM na proporção de 1:5 à amostra,
sendo o procedimento realizado em capela de exaustão. Após homogeneização, sob
refrigeração, os tubos foram centrifugados (2500 rpm, 10 min, 4ºC). Foram
adicionados 300 µl do sobrenadante e 750 µl do reativo cromogênico (1-metil-2-
fenilindol 10.3 mM em acetonitrila + 225μl HCL 37% - na capela de exaustão) em
novo tubo eppendorf e o material foi incubado durante 40 minutos à 45°C em banho
maria. Foi realizada nova centrifugação (2500 rpm, 5 min, 4ºC) e retirado 300 μL da
amostra para realizar leitura. A absorbância foi determinada a 586 nm e os valores
obtidos foram expressos em nmol/g de tecido. A técnica utilizada foi a descrita por
Gerard-Monnier et al. (1998).
3.5.6 Imuno-histoquímica para cicloxigenase 2 (COX-2), superóxido dismutase
(SOD) e glutationa peroxidase (GSH - Px)
A imuno-histoquímica para a cicloxigenase 2, superóxido dismutase e
glutationa peroxidase foi realizada utilizando a técnica biotina-estreptavidina-
peroxidase (HSU e RAINE, 1981).
Os cortes foram desparafinizados, hidratados em xilol e álcool e imersos em
tampão citrato 0,1 M (pH 6,0), sob aquecimento em forno de micro-ondas, por 15
minutos para a recuperação antigênica. Após o resfriamento, foram feitas lavagens
com solução salina tamponada fosfato (PBS), bloqueio da peroxidase endógena
com solução de peróxido de hidrogênio (H2O2) a 3% (15 minutos) e nova lavagem
com PBS (5 minutos).
As amostras foram incubadas com o anticorpo primário, e depois com
anticorpo secundário biotinilado, para posterior incubação com o complexo estrepto-
avidina peroxidase conjugada (complexo ABC Vectastain) por 30 minutos. Após
lavagem com PBS, seguiu-se coloração com o cromógeno 3,3`diaminobenzidine-
peróxido (DAB), seguida por contra-coloração com hematoxilina de Mayer. Realizou-
se a desidratação das amostras e montagem das lâminas.
3.5.7 Avaliação de dosagens bioquímicas (ureia, creatinina, AST, ALT)
A recolha de sangue de ratos foi realizada por meio de punção cardíaca após
a anestesia com tiopental. Medidas bioquímicas foram efetuadas a partir de
44
amostras de soro dos animais, usando os padrões kits LABTEST e leitura em
espectrofotômetro (MEDEIROS et al., 2011). Para as medições de ureia e creatinina
foi utilizado método colorimétrico. Para ALT e AST foi realizado ensaio de cinética.
3.5.8 Métodos estatísticos
As análises estatísticas foram realizadas a partir da utilização do software
GraphPad Prism versão 5. Os escores histopatológicos foram analisados a partir dos
valores de mediana, analisados pelo teste de Kruskal-Wallis e seguido pelo pós teste
de Dunn’s para diferenciação estatística. As médias dos vários testes experimentais
foram analisadas pelo método estatístico ANOVA, seguido pelo pós-teste de Tukey.
Todos os testes respeitaram o número mínimo de seis animais por grupo
experimental, e os valores de p<0,05 foram considerados como estatisticamente
significantes.
45
4 RESULTADOS
4.1 ANÁLISE DO INFLUXO CELULAR NO LÍQUIDO SINOVIAL
A Figura 5 apresenta a análise do influxo celular no lavado sinovial dos
grupos experimentais. Os animais do grupo salina apresentaram, na contagem
global do influxo celular no lavado sinovial coletado, uma média de 180 células por
mm³, após 24 horas. Os demais grupos, cujos animais foram submetidos à
inflamação experimental, apresentaram valores médios superiores na contagem
global de células, corroborando o fato de que o influxo celular inflamatório é uma
importante etapa na inflamação induzida por Zymosan.
Dessa forma, o grupo que não recebeu tratamento, isto é, ao qual foi
administrado solução fisiológica por gavagem, seguida pela indução da inflamação
por Zymosan, apresentou uma média de 1310 células por mm³ no lavado sinovial,
demonstrando um influxo leucocitário sete vezes maior que o detectado nos animais
do grupo salina.
Os grupos tratados apresentaram valores dentro do intervalo entre os grupos
controle supracitados, conforme esperado. O grupo cujos animais foram tratados
com Olmesartana 5 mg/Kg antes da indução da inflamação apresentou uma média
de 812 células por mm³ no lavado sinovial; não sendo esse valor estatisticamente
significativo (p<0,05) em relação ao grupo zymosan. Quando o tratamento foi
realizado com olmesartana na dose de 15 mg/Kg este valor foi de 310 células por
mm³, e quando a dose de olmesartana utilizada na gavagem foi de 30 mg/Kg, o
influxo celular médio no lavado sinovial foi de 290 células por mm³.
Portanto, os tratamentos com as doses de 15 mg/Kg ou 30 mg/Kg
resultaram em redução estatisticamente significante do influxo leucocitário (p<0,05).
O tratamento com o fármaco-padrão, isto é, o Diclofenaco Sódico 100 mg/Kg, antes
da indução da inflamação, levou a um influxo médio de 280 células por mm³ no
lavado sinovial, 24 horas após a indução.
46
Figura 5: Influxo celular no lavado sinovial após 24 horas de indução de sinovite (média ± DP) em ratos. Os dados representam a média ± DP do número de células/mm
3. Os grupos assinalados
por um asterisco (*) obtiveram redução estatisticamente significativa na infiltração leucocitária em comparação com o grupo Zymosan (p < 0,05). O grupo Zymosan (#) obteve elevação estatisticamente significativa na infiltração leucocitária, em comparação com o grupo salina (p < 0,05).
4.2 ANÁLISES HISTOPATOLÓGICAS DAS SINÓVIAS
As análises histopatológicas foram realizadas avaliando as alterações
inflamatórias comumente observadas na sinovite reumatoide. A análise das lâminas
foi semi-quantitativa, avaliando-se para cada grupo experimental os seguintes
parâmetros histopatológicos: exsudato inflamatório, comprometimento do exsudato
inflamatório, depósitos fibrinoides e presença de granulomas, sendo atribuído um
valor de escore para cada parâmetro analisado.
As sinóvias do grupo salina, após 24 horas da injeção intra-articular de
solução salina, não exibiram alterações inflamatórias à microscopia, isto é, o tecido
apresentava-se saudável do ponto de vista histológico, mesmo após o trauma
causado pela injeção (i.a.) de solução salina (cloreto de sódio) (Figura 6, imagens A,
E e I), recebendo escore de alterações histopatológicas equivalente a zero.
Os animais do grupo Zymosan não tratados, após 24 horas do experimento,
apresentaram resposta inflamatória intensa, observada pela presença de
granulomas, com a participação de células gigantes, intenso infiltrado inflamatório e
grande depósito de fibras colágenas, levando a fibrose. Neste grupo, as alterações
histopatológicas foram bastante extensas, estando presentes em toda a extensão da
membrana histopatológica (Figura 6, imagens B, F e J). A mediana dos escores de
47
alterações histopatológicas associada aos animais do grupo zymosan foi de 3,0.
Os animais que receberam zymosan intra-articular e foram tratados com o
Diclofenaco Sódico 100 mg/kg apresentaram uma sinóvia bastante saudável (Figura
6, imagens C, G e K), apresentando somente leves alterações inflamatórias e a
mediana dos escores histopatológicos foi de 1,0.
Os animais que receberam zymosan intra-articular e foram tratados com as
diferentes doses de olmesartana (5, 15 ou 30 mg/Kg), por sua vez, também
apresentaram uma sinóvia mais saudável e mais aproximada da histologia normal
do tecido, de maneira dose-dependente (Figura 6, imagens D, H e L). Assim, quase
não foi possível notar diferenças entre a histologia dos animais que receberam
doses de 30 mg/Kg de Olmesartana e aqueles dos grupos salina ou DS, não
havendo presença marcante de fibrose, infiltrado inflamatório ou granulomas, com
manutenção do tecido característico da membrana sinovial. A mediana dos escores
atribuídos ao grupo tratado com olmesartana 30 mg/Kg foi de 1,0. Fibrose e infiltrado
inflamatório estavam presentes, por sua vez, no tecido sinovial dos animais dos
grupos que receberam doses de 5 mg/Kg ou 15 mg/Kg de olmesartana, tendo o
primeiro maior comprometimento que o segundo.
48
Figura 6: Representação histopatológica da sinóvia de grupos não tratados e tratados que receberam solução salina ou zymosan intra-articular. As imagens em A, E e I representam cortes histopatológicos da sinóvia dos animais do grupo salina, que não foram expostos à artrite experimental, não havendo alterações histopatológicas. As imagens B, F e J são cortes histopatológicos obtidos da sinóvia dos animais do grupo Zymosan, que não foram tratados e que, portanto, apresentam diversas alterações (a = fibrose; b = infiltrado de células inflamatórias; c = presença de granulomas). As imagens C, G e K são cortes da sinóvia dos animais tratados com diclofenaco sódico (100 mg/Kg), demonstrando uma leve resposta inflamatória. As imagens D, H e L são da sinóvia de animais tratados com Olmesartana nas doses de 5 mg/Kg, 15 mg/Kg ou 30 mg/Kg, respectivamente, podendo ser observada a presença de fibrose (a) e infiltrado de células inflamatórias (b) em maior quantidade na imagem D e mais discreta na H e pouca ou nenhuma resposta inflamatória na imagem L.
49
Os dados referentes aos escores atribuídos às diferentes alterações
histopatológicas são demonstrados na Figura 7.
Figura 7: Escores atribuídos às alterações histopatológicas observadas nos animais dos diferentes grupos experimentais (mediana ± DP), demonstrando redução de achados histopatológicos característicos de inflamação aguda a partir da administração via oral de olmesartana, de maneira dose-dependente. Os grupos assinalados com um asterisco (*) obtiveram redução estatisticamente significativa dos escores histopatológicos em relação aos escores do grupo Zymosan (p < 0,05). O grupo Zymosan obteve uma elevação estatisticamente significativa dos escores histopatológicos em relação ao grupo salina (p < 0,05).
4.3 ATIVIDADE DA MIELOPEROXIDASE
O grupo salina teve atividade de MPO significativamente inferior (p<0,05)
aos grupos submetidos ao Zymosan (i.a.), corroborando com a baixa contagem de
leucócitos apresentada anteriormente. O grupo Zymosan, como esperado,
apresentou alta taxa de atividade de MPO em relação aos grupos que receberam
tratamento anterior à indução da artrite. A Olmesartana na dose de 5 mg/Kg reduziu
a MPO em relação ao grupo Zy, mas somente os grupos tratados com olmesartana
nas doses de 15 e 30 mg/Kg apresentaram redução significativa (p<0.05) em relação
ao grupo Zy, porém, tendo ação menor quando comparados ao diclofenaco de sódio
(DS) (Figura 8).
50
Figura 8: Efeito atenuador da Olmesartana e Diclofenaco Sódico na atividade de MPO na sinóvia de ratos. A atividade de MPO mostra-se bastante diminuída no grupo que recebeu salina (i.a.) em relação ao grupo zymosan. Todas as doses de olmesartana (5, 15 e 30 mg/Kg) diminuíram a atividade de MPO de maneira dose-dependente, sendo significantes estatisticamente (p<0,05) somente as duas doses mais altas. O grupo tratado com diclofenaco sódico (DS) também reduziu a MPO, semelhante a OLM 15 ou 30 mg/Kg.
4.4 PRODUÇÃO DE MALONALDEÍDO
É possível observar que o grupo Zy submetido à injeção de zymosan (i.a.)
apresentou aumento significativo na produção de MDA em relação ao grupo salina.
O grupo tratado com olmesartana na dose de 5 mg/Kg reduziu os níveis de MDA,
mas não foi significativo estatisticamente em relação aos grupos controle (p>0,05).
Já os grupos tratados com olmesartana em maiores doses (15 ou 30 mg/Kg) e
diclofenaco de sódio (100 mg/Kg) apresentaram redução importante nos níveis de
MDA em relação ao grupo Zy (Figura 9).
51
Figura 9: Produção de MDA na sinóvia de ratos submetidos à inflamação articular por zymosan. O grupo salina apresentou baixa produção de MDA em relação ao grupo submetido à artrite por zymosan (i.a.) não tratado. A olmesartana em maiores doses (15 ou 30 mg/Kg) apresentou níveis próximos ao grupo tratado com diclofenaco sódico (DS) e foi significante estatisticamente (p<0,05) em relação aos grupos Zy e salina.
4.5 NÍVEIS DE GLUTATIONA
Os valores médios de GSH na sinóvia de ratos submetidos à injeção intra-
articular de Zymosan mostrou-se significativamente menor (p<0,05) em relação ao
grupo salina. O grupo tratado com olmesartana na dose de 5 mg/Kg não apresentou
diferenças em relação ao grupo Zy, enquanto os que receberam doses mais altas de
Olmesartana (15 ou 30 mg/Kg) e diclofenaco de sódio (100 mg/Kg) apresentaram
aumento nos níveis de GSH em relação ao grupos controle (Figura 10).
Figura 10: Concentração de GSH na sinóvia de ratos submetidos à zymosan e salina (i.a.) pela determinação de NP-SH. O grupo salina apresentou alta concentração de glutationa em relação aos demais, enquanto o grupo Zy e o grupo tratado com olmesartana 5 mg/Kg apresentaram redução significativa. Os grupos tratados com olmesartana (15 ou 30 mg/Kg) e diclofenaco sódico (DS) apresentaram aumento significativo (p<0,05) em relação aos grupos controle.
4.6 IMUNO-HISTOQUÍMICA
Ratos com inflamação das articulações induzida e não tratados (grupo Zy)
apresentaram imunomarcação intensa na sinóvia para COX 2 (Figura 11 B), em
comparação com grupo salina. OLM 15 ou 30 mg/kg ou DS 100 mg/kg reduziu a
imunomarcação para a COX 2 (Figura 11 C, D, E). A imunomarcação para SOD e
GSH - Px foi mais pronunciada nos grupos tratados com Olmesartana 15 ou 30
mg/kg (Figura 11 H, I e M, N, respectivamente), em comparação com animais Zy.
52
Figura 11: Representação de imuno-histoquímica de ciclo-oxigenase 2 (COX-2), superóxido dismutase (SOD) e glutationa peroxidase (GSH-Px) em tecido sinovial de ratos, 24 horas após a administração de Zy. Os grupos experimentais foram salina, Zy, OLM 15, OLM 30 mg / kg e DS 100 mg / kg. A representação de imuno-histoquímica dos diferentes grupos experimentais para a COX 2 (A, B, C, D, E, respectivamente), SOD (F, G, H, I, J, respectivamente) e de GSH - Px (K, L, M, N, O, respectivamente). Membrana sinovial de ratos não tratados e injetados com Zy mostrou intensa imunocoloração na sinóvia para COX 2. OLM 15 ou 30 mg / kg ou DS 100 mg / kg reduziu a imunocoloração para COX 2 (C, D, E). A imunocoloração para SOD e GSH-Px foi mais pronunciada nos grupos tratados com OLM e DS (H, I, J e M, N, O), em comparação com os animais Zy.
53
4.7 AVALIAÇÃO DAS DOSAGENS BIOQUÍMICAS
O tratamento dos animais com Olmesartana (5, 15 ou 30 mg / kg) não
causou alterações renais ou hepáticas nos animais, como evidenciado pelos níveis
normais de ureia, creatinina, AST e ALT, dosados em soros dos ratos (Figura 12 A,
B , C, D, respectivamente). O diclofenaco de sódio pode favorecer níveis alterados
de ureia no soro de animais submetidos à inflamação das articulações (Figura 8A)
(p<0,05), o que não foi observado para a creatinina, AST e ALT (Figura 12 B, C, D,
respectivamente).
Figura 12: Níveis bioquímicos de ureia (A), creatinina (B), aspartato aminotransferase (AST) (C) e alanina aminotransferase (ALT) (D). Medidas bioquímicas foram efetuadas a partir de amostras de soro de ratos 24 horas após a indução de zymosan. Os ratos receberam apenas solução salina intra-articular (grupo salina); ratos não tratados foram injetados com zymosan intra-articular (grupo Zy) e outros grupos receberam Zy intra-articular e foram tratados com o olmesartana (OLM 5, 15 ou 30 mg / kg) ou com diclofenaco de sódio (DS 100 mg / kg). OLM ou DS foi administrada oralmente 30 min antes da injeção de Zy. Os resultados apresentados são a média ± SEM (n = 5). #p <0,05 comparação com solução salina e * p <0,05 em comparação com animais Zy (ANOVA e pós teste de Tukey).
54
5 DISCUSSÃO
No presente estudo, foi investigada a ação do medicamento da classe dos
anti-hipertensivos BRA, Olmesartana, em um modelo experimental de inflamação
intra-articular induzida por Zymosan, que é quadro comum em pacientes com AR.
O modelo de inflamação intra-articular induzida por Zymosan é fácil de
executar, tem boa reprodutibilidade dos dados e permite a obtenção de resultados
em um curto período de tempo (CARMO, 2015).
A administração intra-articular de Zymosan causou alterações
compatíveis com as características de inflamação aguda, validando o modelo de
estudo utilizado. Após a administração intra-articular de zymosan, os animais
desenvolvem intensa inflamação articular – caracterizada pelo aumento da
permeabilidade vascular, que leva a edema local e acentuado influxo celular
(XAVIER, 2005; BEZERRA et al., 2004).
No presente estudo, o pré-tratamento com Olmesartana nas doses de 15 ou
30 mg/Kg reduziu o influxo de células de modo dose-dependente. Existem vários
relatos na literatura que comprovam esse potencial de atividade anti-inflamatória em
outros modelos de inflamação: fibrose hepática induzida por ligadura do ducto biliar
(KURIKAWA et al., 2003), artrite induzida por colágeno (SAGAWA et al., 2005),
miocardite aguda imunomediada (SEKO, 2006), inflamação periondontal
experimental (ARAÚJO et al., 2013). Estudos em modelos experimentais de artrite
demonstraram que os neutrófilos são as primeiras células a migrar para a
articulação. Os neutrófilos ativados promovem fagocitose de complexos imunitários
formados em fases iniciais, que libertam EROs e, assim, levam a um estresse
oxidativo na cartilagem articular, que aumentam a produção de citocinas pró-
inflamatórias. A resposta inflamatória leva a um aumento no fluxo de sangue e
transudação local de histamina e serotonina, aumentando assim a infiltração de
neutrófilos, com a consequente superprodução de EROs. Estudos mostram que o
estresse oxidativo participa da patogênese da AR, promovendo lesão na cartilagem
articular (FERMOR et al., 2007; NONOSE et al., 2014).
Poucos trabalhos relatam a ação anti-inflamatória da Olmesartana em
modelos experimentais de artrite (SAGAWA et al., 2005). Autores demonstraram o
efeito protetor desta em outros modelos experimentais: Araújo Jr. et al. (2014)
mostraram o efeito anti-inflamatório da Olmesartana em um modelo de mucosite
55
intestinal induzida por Metotrexato, que resultou numa redução da infiltração da
mucosa inflamatória, ulcerações, vasodilatação e áreas hemorrágicas, assim como
houve concentrações reduzidas de MPO e citocinas pró-inflamatórias IL -1β e TNF-
a, aumentando ainda a expressão da citocina anti-inflamatória IL-10. Outros estudos
mostraram que Olmesartana reduziu níveis de PCR em pacientes com angina
estável (MIYOSHI et al., 2014), reverteu completamente a hipertrofia ventricular
esquerda em ratos hipertensos (LI et al., 2013) e reduziu a expressão de citocinas
pró-inflamatórias e marcadores do estresse oxidativo em ratos submetidos à
miocardite experimental (SUKUMARAN et al., 2011).
Quanto à presença de células no líquido sinovial, é natural que exista em
baixa quantidade. Mor, Abramson e Pillinger (2005) mostram que a maioria das
células encontradas neste fluido, em condições não inflamatórias, são células
fagocíticas do sistema mononuclear. Este resultado está de acordo com o que se
compreende, atualmente, em relação à composição histológica do revestimento da
membrana sinovial, já que, como visto anteriormente, uma parte das células do
tecido sinovial são sinoviócitos semelhantes a macrófagos. Já nos casos de sinovite,
são encontradas alterações na sinóvia que inclui influxo de macrófagos e linfócitos,
como também proliferação de células dendríticas (SWEENEY e FIRESTEIN, 2004),
dados que corroboram com a nossa pesquisa, em que foi observado um aumento
significativo na contagem global de células no líquido sinovial.
Nossos resultados obtidos no grupo Zy, são compatíveis com quadros de
inflamação aguda. Logo, o resultado obtido, que retratou a presença de uma
quantidade significativamente aumentada de células no líquido sinovial, era
esperado e tem relação com o mecanismo do Zymosan em induzir sinovite
semelhante à presente na Artrite Reumatoide a partir de expressão dos genes
responsivos a NF-κB e a estimulação de nociceptores. A cascata inflamatória
decorrente dos mecanismos supracitados simula a sinovite característica da artrite
reumatoide, já que esta é amplificada em grande parte por meio da sinalização
celular e resposta mediada por ativação de NF-κB (ABBAS; LICHTMAN e PILLAI,
2008). Assim, a administração intra-articular do Zymosan promove aumento da
permeabilidade vascular e permite com isso um acentuado influxo celular, em
conformidade com os resultados aqui obtidos.
Em relação à análise histopatológica da membrana sinovial, Sweeney e
Firestein (2004) relatam a evolução do quadro inflamatório e influência nas
56
mudanças histológicas do tecido, com hiperplasia da membrana sinovial ocasionada
pelo influxo e proliferação dos sinoviócitos tipo A e B, bem como infiltração de
linfócitos T e B, com formação de estruturas semelhantes a nódulos linfáticos e
granulomas. Junto a isso, a produção acentuada de citocinas promove a ativação
dos fibroblastos sinoviais, ocasionando produção excessiva de MMPs e destruição
sinovial, cartilaginosa e óssea, que leva também a um aumento na deposição de
fibras colágenas, gerando fibrose, aspecto histopatológico comum em situações
inflamatórias.
Em concordância com a literatura, os animais do grupo Zymosan, que
receberam apenas solução salina via oral, apresentaram morfologia histopatológica
semelhante à descrita para situações inflamatórias, isto é, apresentaram um tecido
com alterações compatíveis com a inflamação intra-articular.
Neste estudo, os resultados observados na análise histopatológica da
sinóvia dos demais grupos experimentais corroboram os resultados obtidos com a
análise do influxo celular no fluido sinovial e, por conseguinte, com a hipótese de
que a olmesartana confere importante ação anti-inflamatória na inflamação intra-
articular, em consonância com estudos anteriores, em modelos de inflamação em
outros sítios do organismo (KURIKAWA et al., 2003; SAGAWA et al., 2005; SEKO,
2006; ARAÚJO et al., 2013). Neste aspecto, foi notável a análise histopatológica da
sinóvia dos animais que foram tratados com Olmesartana na dose de 30 mg/Kg, que
revelou a ausência de alterações inflamatórias. Isto é, o fármaco apresentou
potencial efeito protetor anti-inflamatório, impedindo a instalação de inflamação intra-
articular, ou impedindo que haja alterações histopatológicas em grande escala.
Foi feita a determinação da atividade de MPO, com intuito de elucidar se as
células que migraram para a articulação seriam neutrófilos. Na presente pesquisa,
observou-se que os grupos tratados com Olmesartana nas doses de 15 ou 30 mg/Kg
por via oral trinta minutos antes da indução da inflamação, apresentaram uma
diminuição da atividade de MPO indicando uma inibição do influxo de neutrófilos, da
mesma forma ocorreu essa inibição no grupo tratado com Diclofenaco de Sódio
quando comparados ao grupo Zy que mostrou uma alta atividade da MPO.
Os neutrófilos estão envolvidos na patogênese de lesões teciduais na artrite,
são predominantes no exsudato sinovial e atuam como fonte de substâncias, tais
como citocinas, espécies reativas de oxigênio e espécies de nitrogênio, enzimas
lisossomais e metaloproteinases, que atuam na degradação da cartilagem e na
57
reabsorção óssea em episódios agudos de artrite (GUERRERO et al., 2006).
Nesta investigação, olmesartana reduziu a imunomarcação de COX-2 no
tecido sinovial de ratos, o que poderia resultar na proteção dos tecidos. Do mesmo
modo, estudos anteriores mostraram que olmesartana reduz a expressão de COX-2,
em outros modelos experimentais de inflamação (ARAÚJO et al., 2013; ARAÚJO
JUNIOR et al., 2014).
O desenvolvimento do processo inflamatório na membrana sinovial ocorre
devido à resposta das células inflamatórias que aumentam a produção de citocinas e
a formação de radicais livres conduzindo ao estresse oxidativo que amplifica a
inflamação e ocasiona a destruição articular, dor e edema (PAIVA et al., 2011).
Observou-se que o Diclofenaco de Sódio (DS), anti-inflamatório não
esteroide, melhorou os parâmetros inflamatórios analisados, de modo semelhante
aos resultados obtidos com a olmesartana. Na avaliação sistêmica, olmesartana não
promoveu mudanças nos marcadores séricos do fígado ou rins. DS não causou
alterações hepáticas, no entanto, foi observado aumento em níveis séricos de ureia.
O fato de o DS inibir a cicloxigenase 1 e 2, em meio não seletivo, explica este efeito
adverso sobre o sistema renal (BESEN et al., 2009), bem como os efeitos
gastrointestinais (MOORE; DERRY e MCQUAY, 2007), descritos anteriormente.
O ataque oxidativo aos componentes essenciais das células por radicais
livres de oxigênio é um mecanismo geralmente reconhecido como relevante na
patogenia de várias enfermidades, tais como as doenças cardiovasculares, a
aterosclerose, o diabetes mellitus e as doenças inflamatórias reumáticas
(MONTUSCHI; BARNES e ROBERTS, 2004).
A peroxidação lipídica pode ocorrer por via enzimática (cicloxigenases e
peroxidades) e por via não enzimática (auto-oxidação). O MDA é um produto
secundário da peroxidação lipídica por via enzimática, derivado da β-ruptura de
ácidos graxos poli-insaturados, tais como ácido linoleico, araquidônico e
docosahexanóico (FILIPPIN e al., 2008). Em nosso estudo, a produção de MDA na
sinóvia do grupo Zymosan foi significativamente mais elevada quando comparada ao
grupo salina. Estes resultados coincidem com os dados publicados por Ramos et al.
(2000), que encontraram concentrações séricas de MDA elevadas em pacientes
com AR, sugerindo que em pacientes com inflamação articular, a lipoperoxidação
está aumentada e existe evidência indireta da importância dos radicais livres na
patogenia desta doença. Os grupos tratados com Olmesartana nas doses de 15 ou
58
30 mg/Kg e DS 100 mg/Kg apresentaram redução considerável na produção de
MDA em relação aos grupos controle, sugerindo que o fármaco estudado pode
interromper a reação em cadeia que se propaga nas membranas lipídicas, reduzindo
o estresse oxidativo.
Em sistemas aeróbicos, é essencial o equilíbrio entre agentes óxido-
redutores e o sistema de defesa antioxidante. Esses agentes são gerados
endogenamente como consequência direta do metabolismo do oxigênio (O2) e por
suas reduções parciais, que dão origem às EROs, como o radical superóxido (O2-),
peróxido de hidrogênio (H2O2) e radical hidroxil (OH). Quanto ao potencial de
reatividade das EROs no meio biológico, o radical OH é o mais reativo e pode oxidar
qualquer molécula biológica. O H2O2 pode permear membranas e esta propriedade
possibilita a ocorrência de reações em alvos biológicos distantes do seu local de
formação. Já o O2 pode reagir com lipídios de membrana, proteínas, aminoácidos,
ácidos nucleicos, carboidratos e tióis. Dessa forma, para proteger-se, a célula possui
um sistema de defesa que pode atuar como detoxificadora do agente antes que ele
cause lesão, que é o caso da glutationa reduzida (GSH) (BARRY, 2007).
A glutationa desempenha um papel antioxidante intracelular importante na
manutenção de uma relação GSH/Glutationa oxidada elevada, condição essencial
para a proteção contra o dano oxidativo. No nosso estudo, a atividade enzimática da
NP-SH na sinóvia dos grupos tratados se mostrou significativamente aumentada, em
relação ao grupo Zy, resultado que sugere uma resposta adaptativa frente a uma
elevação do estresse oxidativo e poderia ser consequência de um processo de
indução enzimática.
Neste estudo, os animais tratados com olmesartana tiveram imunomarcação
aumentada das enzimas antioxidantes, como a SOD e GSH-Px, um reforço do efeito
protetor sobre o estresse oxidativo. Corroborando os nossos resultados,
olmesartana aumentou os níveis de SOD na nefropatia diabética, em diabetes
induzida por estreptozotocina em ratos (SI et al, 2014) e restaurou a atividade de
GSH-Px na nefrotoxicidade induzida por daunorrubicina em ratos (GOUNDER et al.,
2014).
Distintos estudos correlacionam o bloqueio de receptores AT1 com a
modulação anti-inflamatória, atribuindo propriedades pró-inflamatórias à ativação do
referido receptor a partir de ligação aos seus agonistas (SHAO et al., 2003; LIU et
al., 2009; NAHMOD et al., 2003; NABAH et al., 2004). A administração de
59
Olmesartana apresentou resultados positivos em todos os testes e dosagens deste
trabalho, sugerindo que a interação entre angiotensina II e os receptores AT1 tem
importância na fisiopatologia da artrite reumatoide, uma vez que a menor presença
de células inflamatórias no líquido sinovial denota uma menor infiltração leucocitária
no sítio da inflamação. É provável, portanto, que o bloqueio dos receptores AT1 seja
suficiente para alterar de maneira significativa a presença das citocinas pró-
inflamatórias produzidas na ocasião da sinovite, reduzindo os danos decorrentes da
inflamação.
Baseando-se nos dados obtidos nesse trabalho, é possível observar que
olmesartana apresentou efeito anti-inflamatório, ocasionando a diminuição da
migração de leucócitos para a articulação e reduzindo o estresse oxidativo.
Os nossos resultados são de grande importância, tendo em conta que a AR
está associada com um risco aumentado de DCV, e que a HA é um fator de risco
para essas doenças, com elevada prevalência em pacientes com artrite reumatoide.
Assim, a utilização de olmesartana em doentes com AR pode trazer benefício duplo,
devido ao efeito anti-inflamatório e anti-hipertensivo. Embora o bloqueio de
angiotensina II, provavelmente não vá substituir drogas anti-reumáticas, tais como
MTX, AIEs e agentes biológicos, o BRA pode ser um anti-hipertensivo que traz
benefícios para os pacientes com AR.
60
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os resultados desse estudo demonstram o efeito anti-inflamatório da
Olmesartana no modelo de inflamação intra-articular induzida por Zymosan em ratos
Wistar. Os efeitos desse fármaco estão relacionados com a diminuição da migração
de neutrófilos (MPO), redução da COX-2 e dos biomarcadores do estresse oxidativo
(MDA) e aumento nos níveis do sistema de defesa antioxidante (GSH, SOD, GSH-
Px), diminuindo assim o dano na membrana sinovial. No entanto são necessários
mais estudos para uma melhor elucidação dos mecanismos de sinalização
associados com o efeito da olmesartana na inflamação intra-articular induzida por
Zymosan. Concluímos que a Olmesartana teve um efeito protetor sobre a inflamação
intra-articular e merece um estudo mais aprofundado em seres humanos.
61
ANEXOS
ANEXO A – Aprovação CEUA
62
REFERÊNCIAS
ABBAS, A.K.; LICHTMAN, A.H.; PILLAI, S. Imunologia celular e molecular. 6. ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2008. 564 p. ANDREEVA, A.A. Dynamics the level of visfatin and markers of immune inflammation in hypertensive patients with abdominal obesity using the combination of antihypertensive therapy. Georgian Med News. v. 225, p. 72-7, 2013. ARAÚJO, A.A. et al. Olmesartan decreases IL-1β and TNF-α levels; downregulates MMP-2, MMP-9, COX-2, and RANKL; and upregulates OPG in experimental periodontitis. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. v. 386, n. 10, p. 875-84, 2013. ARAÚJO JUNIOR, R.F. et al. Olmesartan Decreased Levels of IL-1β and TNF-α, Down-Regulated MMP-2, MMP-9, COX-2, RANK/RANKL and Up-Regulated SOCs-1 in an Intestinal Mucositis Model. PLoS ONE. v. 10, n. 3, p. e0120057, 2014. AVIÑA-ZUBIETA, J.A. et al. Risk of cardiovascular mortality in patients with rheumatoid arthritis: A meta-analysis of observational studies. Arthritis Rheum. v. 59, n. 12, p. 1690-7, 2008. BALSA, A. et al. Influence of HLA DRB1 alleles in the susceptibility of rheumatoid arthritis and the regulation of antibodies against citrullinated proteins and rheumatoid factor. Arthritis Res Ther. v. 12, n. 2, p. R62, 2010. BARRY, H.J.G. Free Radicals in Biology and Medicine. 4 ed. New York: Oxford University Press, 2007. BESEN, A. et al. The effects of the nonsteroidal anti-inflammatory drug diclofenac sodium on the rat kidney, and alteration by furosemide. Int Urol Nephrol. v. 41, n. 4, p.919-26, 2009. BEZERRA, M.M. et al. Reactive nitrogen species scavenging, rather than nitric oxide inhibition, protects from articular cartilage damage in rat zymosan-induced arthritis. Brit J Pharmacol. v. 141, p. 172-82, 2004. BLAY, S. L. et al. Prevalence and concomitants of arthritis in the elderly in Rio Grande do Sul, Brazil. PLoS Med. v. 7, n. 9, 2012. BLUMBERG, S. N.; FOX, D. A. Reumathoid Arthritis: guidelines of emerging therapies. Am. J. Manag. Care. v. 7, n. 6, p. 617-26, 2001. BOLON, B. et al. Rodent preclinical models for developing novel antiarthritic molecules: comparative biology and preferred methods for evaluating efficacy. J Biomed Biotechnol. v. 2011, p. 21, 2011. BRADLEY, P.P.; CHRISTENSEN, R.D.; ROTHSTEIN, G. Cellular and extracellular myeloperoxidase in pyogenic inflammation. Blood. v. 60, p. 618-22, 1982.
63
BRASILEIRO FILHO, G. Bogliolo: Patologia Geral. 4ª edição. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2009. 378 p. BURSKA, A.; BOISSINOT, M.; PONCHEL, F. Cytokines as Biomarkers in Rheumatoid Arthritis. Mediators Inflamm, v. 2014, p. 1-24, 2014. CARDOSO, M.L. Efeito das frações obtidas da Fucoidana de Fucus vesiculosus em modelo experimental de artrite induzida por zymosan. 2007. 85 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) – Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal. 2007. CARMO, L.D. Proteínas isoladas do látex de Himatantus drasticus (mart.) plumel apocynaceae reduzem a resposta inflamatória e nociceptiva na artrite induzida por zymosan em camundongos. 2015. 91 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) – Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza. 2015. CERHAN, J.R. et al. Antioxidant micronutrients and risk of rheumatoid arthritis in a
cohort of older women. Am J Epidemiol. v. 157, n. 4, p. 345-54, 2003.
CONTE, F.P. et al. Effect of Gedunin on Acute Articular Inflammation and
Hypernociception in Mice. Molecules. v. 20, p. 2636-57, 2015. __________. Endothelins modulate inflammatory reaction in zymosaninduced arthritis: participation of LTB4, TNF-α, and CXCL-1. J Leukoc Biol. v. 84, 2008. CROSS, M. et al. The global burden of rheumatoid arthritis: estimates from the Global Burden of Disease 2010 study. Ann Rheum Dis. v. 73, n. 7, p. 1316-22, 2014. DEROSA, G. et al. Results from a 12 months, randomized, clinical trial comparing an olmesartan/amlodipine single pill combination to olmesartan and amlodipine monotherapies on blood pressure and inflammation. Eur J Pharm Sci. v. 23, n. 51, p. 26-33, 2014. FARKOUH, M.E. et al. Comparison of lumiracoxib with naproxen and ibuprofen in the Therapeutic Arthritis Research and Gastrointestinal Event Trial (TARGET), cardiovascular outcomes randomized controlled trial. Lancet, v. 364, p. 674-84, 2004. FEITOSA, M.L. Investigação dos mecanismos de ação da atividade gastropotetora de 1,4-cineol em modelos de úlcera gástrica em camundongos. 2011. 96 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) – Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza. 2011. FERMOR, B. et al. Oxygen, nitric oxide and articular cartilage. Eur Cell Mater. v. 11, n. 13, p. 56-65, 2007. FILIPPIN, L.I. et al. Influência de processos redox na resposta inflamatória da Artrite Reumatoide. Rev Bras Reumatol, v. 48, n. 1, p. 17-24, 2008.
64
FYHRQUIST, F.; SAIJORUNAA, O. Renin-angiotensin system revisited. J Intern Med. v. 264, p. 224-36, 2008. GABRIEL, S. E.; MICHAUD, K. Epidemiological studies in incidence, prevalence, mortality, and comorbidity of the rheumatic diseases. Arthritis Res. Ther. v. 11, n. 3, p. 229, 2009. GERARD-MONNIER, D. et al. Reactions of 1-methyl-2-phenylindole with malondialdehyde and 4-hydroxyalkenals. Analytical applications to a colorimetric assay of lipid peroxidation. Chem Res toxicol. v. 11, n. 10, p. 1176-83, 1998. GIBOFSKY, A. Overview of epidemiology, pathophysiology, and diagnosis of rheumatoid arthritis. Am J Manag Care. v. 18, n. 13, p. S295-302, 2012. GOELDNER, I. et al. Artrite reumatoide: uma visão atual. J Bras Patol Med Lab. v. 47, n. 5, p. 495-503, 2011. GOUNDER, V.K. et al. Olmesartan protects against oxidative stress possibly through the Nrf2 signaling pathway and inhibits inflammation in daunorubicin-induced nephrotoxicity in rats. Int Immunopharmacol. v. 18, n. 2, p. 282-9, 2014. GUERERRO, A.T.G. et al. Hypernociception elicited by tibio-tarsal joint flexion in mice: A novel experimental arthritis model for pharmacological screening. Pharmacol Biochem Be, v. 84, p. 244-251, 2006. HAROON, N.; INMAN, R. D. Infectious complications of biological therapy. Curr Opin Rheumatol. v. 21, n. 4, p. 397-403, 2009. HSU, S.M.; RAINE, L. Protein A, avidin, and biotin in immunohistochemistry. J Histochem Cytochemistry. v. 29, n. 11, p.1349-53, 1981. HOLMQVIST, M.E. et al. Rapid increase in myocardial infarction risk following diagnosis of rheumatoid arthritis amongst patients diagnosed between 1995 and 2006. J Intern Med. v. 268, n. 6, p. 578-85, 2010. HOOTMAN, J. M.; HELMICK, C. G.; BRADY, T. J. A public health approach to addressing arthritis in older adults: the most common cause of disability. Am J Public Health. v. 102, n. 3, p. 426-33, 2012. HUANG, Q.C.; HUANG, R.Y. The cyclooxygenase-2/thromboxane A2 pathway: a bridge from rheumatoid arthritis to lung cancer? Cancer lett. v. 354, n. 1, p.28-32, 2014. JIA, Z.; HE, J. Paeoniflorin ameliorates rheumatoid arthritis in rat models through oxidative stress, inflammation and cyclooxygenase 2. Exp ther med. v. 11, n. 2, p. 655-9, 2016. KIKUCHI, J. et al. Peripheral blood CD4(+)CD25(+)CD127(low) regulatory T cells are significantly increased by tocilizumab treatment in patients with rheumatoid arthritis: increase in regulatory T cells correlates with clinical response. Arthritis Res Ther. v.
65
17, n. 1, p. 10, 2015. KIM, H.J. et al. Role of intrarenal angiotensin system activation, oxidative stress, inflammation, and impaired nuclear factor-erythroid-2-related factor 2 activity in the progression of focal glomerulosclerosis. J Pharmacol Exp Ther. v. 337, n. 3, p. 583-90, 2011. KLARESKOG, L. et al. A new model for an etiology of rheumatoid arthritis: smoking may trigger HLA-DR (shared epitope)-restricted immune reactions to autoantigens modified by citrullination. Arthritis Rheum. v. 54, n. 1, p. 38-46, 2006. KOURILOVITCH, M.; GALARZA-MALDONADO, C.; ORTIZ-PRADO, E. Diagnosis and classification of rheumatoid arthritis. J Autoimmun. v. 48-49, p. 26-30, 2014. KUKAR, M.; PETRYNA, O.; EFTHIMIOU, P. Biological targets in the treatment of rheumatoid arthritis: a comprehensive review of current and in-development biological disease modifying anti-rheumatic drugs. Biologics. v. 3, p. 443-57, 2009. KUMAR, V.; ABBAS, A.K.; FAUSTO, N. Robbins & Cotran: Patologia - Bases patológicas das doenças. 8ª edição. Rio de Janeiro: Elsevier, 2008. 1458 p. KURIKAWA, N. et al. An angiotensin II type 1 receptor antagonist, olmesartan medoxomil, improves experimental liver fibrosis by suppression of proliferation and collagen synthesis in activated hepatic stellate cells. Brit J Pharmacol. v. 139, n. 6, 2003. LAURINDO, I.M.M. et al. Artrite reumatoide: diagnóstico e tratamento. Rev Bras Reumatol. v. 44, n. 6, 2004. LI, Z.C. et al. Olmesartan medoxomil reverses left ventricle hypertrophy and reduces inflammatory cytokine IL-6 in the renovascular hypertensive rats. Eur Rev Med Pharmacol Sci. v. 17, p. 3318-22, 2013. LIU, X. et al. Effects of angiotensin-II receptor blockers on experimental autoimmune myocarditis. Int J Cardiol. v. 137, n. 3, p. 282-8, 2009. LORENTE, L. et al. Sustained high serum malondialdehyde levels are associated with severity and mortality in septic patients. Crit Care. v. 17, n. 6, 2013. MASON, R.P. Optimal therapeutic strategy for treating patients with hypertension and atherosclerosis: focus on olmesartan medoxomil. Vasc Health Risk Manag. v. 7, p. 405-16, 2011. MEDEIROS, C.A. et al. Effect of atorvastatin on 5-fluorouracil-induced experimental oral mucositis. Cancer Chemother Pharmacol. v. 67, n. 5, p.1085-100, 2011. MENEZES, R.R. Monoartrite induzida por adjuvante completo de freund em ratos holtzman e avaliação dos efeitos induzidos pelo tratamento crônico com tiamina ou riboflavina. 2013. 112 f. Dissertação (Mestrado em Ciências
66
Farmacêuticas) - Faculdade de Farmácia da Universidade Federal de Minas Gerais, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte. 2013. MILLER, M.C. et al. Membrane type 1 matrix metalloproteinase is a crucial promoter of synovial invasion in human rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. v. 60, n. 3, p. 686-97, 2009. MIYOSHI, T. et al. Olmesartan reduces inflammatory biomarkers in patients with stable coronary artery disease undergoing percutaneous coronary intervention: results from the OLIVUS trial. Heart Vessels. v. 29, n. 2, p. 178-85, 2014. MONTUSCHI, P.; BARNES, P.J.; ROBERTS, L.J. Isoprostanes: markers and mediators of oxidative stress. Faseb J, v. 18, n. 15, p. 1791-800, 2004. MOORE, R.A.; DERRY, S.; MCQUAY, H.J. Cyclo-oxygenase-2 selective inhibitors and nonsteroidal anti-inflammatory drugs: balancing gastrointestinal and cardiovascular risk. BMC musculoskelet disord. v. 8, p.73, 2007. MOR, A.; ABRAMSON, S. B.; PILLINGER, M. H. The fibroblast-like synovial cell in rheumatoid arthritis: a key player in inflammation and joint destruction. Clin immunol. v. 115, n. 2, p. 118–28, 2005. MOTA, L.M. et al. Consensus of the Brazilian Society of Rheumatology for diagnosis and early assessment of rheumatoid arthritis. Rev Bras Reumatol. v. 51, n. 3, p. 199–219, 2011. NABAH, Y.N.A. et al. Angiotensin II induces neutrophil accumulation in vivo through generation and release of CXC chemokines. Circulation, v. 110, n. 23, p. 3581-6, 2004. NAHMOD, K.A. et al. Control of dendritic cell differentiation by angiotensin II. FASEB J, v. 17, n. 3, p. 491-3, 2003. NAKANO, A. et al. Telmisartan inhibits cytokine-induced nuclear factor kappaB activation independently of the peroxisome proliferator-activated receptor-gamma. Hypertens. v. 32,p. 765–9, 2009. NONOSE, N. et al. Oral administration of curcumin (Curcuma longa) can attenuate the neutrophil inflammatory response in zymosan-induced arthritis in rats. Acta Cir Bras. v. 29, n. 11, p. 727, 2014. NTOUNTANIOTIS, Dimitrios et al. The application of solid-state NMR spectroscopy to study candesartan cilexetil (TCV-116) membrane interactions. Comparative study with the AT1R antagonist drug olmesartan. BBA-Biomembranes, v. 1838, n. 10, p. 2439-50, 2014. OKUNUKI, Y. et al. Suppression of experimental autoimmune uveitis by angiotensin II type 1 receptor blocker telmisartan. Invest Ophthalmol Vis Sci. v. 50, n. 5, p. 2255-61, 2009.
67
PAIVA, A.A.O. et al. Antioxidant and anti-inflammatory effect of polysaccharides from Lobophora variegata on zymosan-induced arthritis in rats. Int Immunopharmacol, v. 11, p. 1241-50, 2011. REGO, C.M. Artrite Reumatoide: Fisiopatologia e Terapêutica biológica. 2010. 102 f. Dissertação (Mestrado em Medicina) - Faculdade de Ciências da Saúde, Universidade da Beira Interior, Covilhã - Portugal. 2010. ROCHA, F.A.C. et al. Protective effect of an extract from Ascaris suum in experimental arthritis models. Infect immun. v. 76, n. 6, p.2736-45, 2008. ROUBILLE, C. et al. The effects of tumour necrosis factor inhibitors, methotrexate, non-steroidal anti-inflammatory drugs and corticosteroids on cardiovascular events in rheumatoid arthritis, psoriasis and psoriatic arthritis: a systematic review and meta-analysis. Ann Rheum Dis. v. 74, p. 480-9, 2015. ROY, K.; KANWAR, R.K.; KANWAR, J.R. Molecular targets in arthritis and recent trends in nanotherapy. Int. J Nanomedicine. v. 10, p. 5407–20, 2015. SAGAWA, K. et al. Angiotensin receptor blockers suppress antigen-specific T cell responses and ameliorate collagen-induced arthritis in mice. Arthritis Rheum. v. 52, n. 6, p. 1920-8, 2005. SAHEBARI, M. et al. Pro-oxidant- Antioxidant Balance (PAB) in Rheumatoid Arthritis and its Relationship to Disease Activity. Curr Rheumatol Rev. 2015. SCHIMMER, B.P.; FUNDER, J.W. Pharmacokinetics and pharmacodynamics. The dynamics of drugs absorption, distribution, action, and elimination. In: BRUNTON L.L.; CHABNER B.A.; KNOLLMANN B.C. (Eds.). Goodman & Gilman’s the pharmacological basis of therapeutics. 12ª ed. New York: McGraw-Hill, p. 1209-35, 2011. SEDLAK, J.; LINDSAY, R.H. Estimation of total, protein-bound, and nonprotein sulfhydryl groups in tissue with Ellman’s reagent. Anal Biochem. v. 25, p. 192-205, 1968. SEKO, Y. Effect of the angiotensin II receptor blocker olmesartan on the development of murine acute myocarditis caused by coxsackievirus B3. Clin Sci. v. 110, n. 3, p. 379-86, 2006. SEZAI, A. et al. Effects of olmesartan on the renin-angiotensin-aldosterone system for patients with essential hypertension after cardiac surgery--investigation using a candesartan change-over study. Ann Thorac Cardiovasc Surg. v. 17, n. 5, p. 487-93, 2011. SHAO, J. et al. Imbalance of T-cell subsets in angiotensin II–infused hypertensive rats with kidney injury. Hypertension, v. 42, n. 1, p. 31-8, 2003. SI, X. et al. Renoprotective effects of olmesartan medoxomil on diabetic nephropathy in streptozotocin-induced diabetes in rats. Biomed rep. v. 2, n. 1, p. 24-8, 2014.
68
SILVEIRA, I.G. Probabilidade de artrite reumatoide a partir da testagem para
Fator Reumatóide e Anticorpos Antipeptídeo Citrulinado Cíclico. 2005. 105 f.
Tese (Doutorado em Medicina) – Faculdade de Medicina, Pontifícia Universidade Católica
do Rio Grande do Sul, Porto Alegre. 2005.
SMITH, J.B.; HAYNES, M.K. Rheumatoid arthritis: a molecular understanding. Ann Intern Med. v. 236, p. 908-22, 2002. STAHL, E. A. et al. Genome-wide association study metaanalysis identifies seven new rheumatoid arthritis risk loci. Nat Genet. v. 42, n. 6, p. 508-14, 2010. SUKUMARAN, V. et al. Olmesartan, an AT1 antagonist, attenuates oxidative stress, endoplasmic reticulum stress and cardiac inflammatory mediators in rats with heart failure induced by experimental autoimmune myocarditis. Int J Biol Sci. v. 7, n. 2, p. 154-67, 2011. SWEENEY, S. E.; FIRESTEIN, G. S. Rheumatoid arthritis: regulation of synovial inflammation. Int. J Biochem Cell Biol. v. 36, n. 3, p. 372–378, 2004. TARIQ, M. et al. Bromophenacyl bromide, a aphospholipase A2 inhibitor attenuates chemically induced gastroduodenal ulcers in rats. World J Gastroenterol. v. 12, n. 36, p. 5798-804, 2006. TREVISANI, V.F.M.; FIDELIX, T.S.A.; APPENZELLER, S. Uso dos anti-inflamatórios não hormonais na artrite reumatoide, osteoartrite e na lombalgia. RBM. v. 69, n. 1/2, 2011. TURESSON, C.; MATTESON, E. L. Vasculitis in rheumatoid arthritis. Curr Opin Rheumatol. v. 21, n. 1, p. 35-40, 2009. VOGELPOEL, L.T.C. et al. Control of cytokine production by human Fc gamma receptors: implications for pathogen defense and autoimmunity. Front Immunol. v. 6, p. 79, 2015. XAVIER, C.A.C. Efeito do Fucoidam de Fucus vesiculosus em um modelo experimental de atrite reumatoide. 2005. 85 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) – Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal. 2005. WILSON, A.W. et al. An animal model of chronic inflammatory pain: pharmacological and temporal differentiation from acude models. Eur. J. Pain. v. 10, n. 6, p. 537-49, 2006. ZHANG, W.; BANSBACK, N.; BOONEN, A.; YOUNG, A.; SINGH, A.; ANIS, A. H. Validity of the work productivity and activity impairment questionnaire--general health version in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis Res. Ther. v. 12, n. 5, p. 1-7, 2010.