effects of tanshinone iia on the expressions of p53, pp53 and...

中南大学学报（医学版）J Cent South Univ (Med Sci) 2015, 40(11) htt p://www.csumed.org

1210

丹参酮 IIA 对 AD 大鼠脑组织 p53，pp53 表达及细胞凋亡的影响

李建1，王芳2，周军3，李闻文1

(1. 中南大学湘雅医学院医学检验系，长沙 410013；2. 滕州市中心人民医院检验科，山东滕州 277100；

3. 中南大学湘雅医院医学实验中心，长沙 410008)

[摘要] 目的：观察丹参酮IIA(tanshinone IIA，Tan IIA)对β-淀粉样蛋白(Aβ)诱导的阿尔茨海默病(Alzheimer’s

disease，AD)模型大鼠脑组织中p53与磷酸化p53(phosphate p53，pp53)表达以及细胞凋亡的影响。方法：将30只雄性SD

大鼠随机分为假手术组、AD模型组和Tan IIA治疗组。在大鼠海马内注射Aβ建立AD动物模型，采用免疫组织化学法和

Western印迹检测AD大鼠脑组织p53与pp53的表达水平，TUNEL法检测大鼠脑组织中的细胞凋亡。结果：Aβ在假手术

组中无表达；而在AD模型组和Tan IIA治疗组均有表达且两组间差异无统计学意义(P>0.05)，证明AD模型建造成功。

AD模型组p53与pp53的表达水平明显高于假手术组(P<0.05)和Tan IIA治疗组(P<0.05)。AD模型组凋亡细胞数显著多于

假手术组(P<0.05)和Tan IIA治疗组(P<0.05)。结论：Aβ引起脑组织p53与pp53的表达明显增高，凋亡细胞增多；Tan IIA

可能是通过降低大鼠p53与pp53的表达而抑制细胞的凋亡，从而起到神经保护作用。

[关键词] β-淀粉样蛋白；阿尔茨海默病；凋亡；丹参酮IIA

Effects of tanshinone IIA on the expressions of p53, pp53 and apoptosis in the rats with Alzheimer’s disease

LI Jian1, WANG Fang2, ZHOU Jun3, LI Wenwen1

(1. Department of Laboratory Medicine, Xiangya School of Medicine, Central South University, Changsha 410013; 2. Department of Clinical Laboratory, Tengzhou Central People’s Hospital, Tengzhou Shandong 277100;

3. Medical Science Research Center, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, China)

ABSTRACT Objective: To observe eff ects of tanshinone (Tan) IIA on the apoptosis and expressions of p53 and pp53 in brain tissues of rats with Alzheimer’s disease (AD).

Methods: Thirty male Sprague-Dawley rats were randomized into 3 groups: Sham, AD, and Tan IIA groups. The AD models were established by injecting Aβ into the hippocampus of rats. Brain tissues were collected and paraffin sections were prepared to assess pathological changes. Th e expression of p53 and pp53 was detected by immunohistochemical staining and Western blot.

收稿日期(Date of reception)：2015-03-16

第一作者(First author)：李建，Email: [email protected]

通信作者(Corresponding author)：李闻文，Email: [email protected]

基金项目(Foundation item)：中南大学研究生自主探索创新项目(2015zzts288)。Th is work was supported by Central South Universty Innovation Foundation

For Postgraduate, P. R. China (2015zzts288).

DOI:10.11817/j.issn.1672-7347.2015.11.008

www.csumed.org/xbwk/fi leup/PDF/2015111210.pdf

丹参酮 IIA 对 AD 大鼠脑组织 p53，pp53 表达及细胞凋亡的影响李建，等 1211

Apoptosis was detected by TUNEL assay. Results: There was no Aβ staining in the sham group, and the difference of Aβ staining between the

AD group and the Tan IIA group was not significant (P>0.05). The expressions of p53 and pp53 were significantly higher in the AD group than those in the control group (P<0.05). The number of apoptotic cells in the AD group was significantly higher than that in the sham groups (P<0.05). Treatment of Tan IIA for AD rats significantly reduced the numbers of apoptotic cells (P<0.05).

Conclusion: Aβ can increase the expression of p53 and pp53, and the number of apoptotic cells. Tan IIA treatment may inhibit apoptosis by down-regulation of p53 and pp53 in rats, and in turn to protect neurons.

KEY WORDS Aβ; Alzheimer’s disease; apoptosis; tanshinone IIA

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一

种常见的神经退行性病变，随着全世界人口老龄

化，其发病率呈逐年增高趋势 [ 1 ]。主要临床表现

为记忆和认知功能减退、行为异常和语言功能障

碍；病理学特征为Aβ聚集形成老年斑、微管蛋白

磷酸化形成神经纤维缠结以及神经元的缺失和脑

血管淀粉样变性 [2]。目前AD仍缺乏特效且安全的

防治方法，西医治疗均只能缓解症状。而我国传

统中药与西药相比具有独特的优势，如毒副作用

小、价格低廉和作用靶点多等 [3]。因此随着对AD发病机制的不断研究，从传统中药中筛选有效的

防治药物，对于AD的治疗具有重要意义[4]。

丹参酮(t a n s h i n o n e I I A， Ta n I I A )是一种从

丹参中提取分离得到的二萜酮类化合物，具有抗

凋亡、抗炎症、诱导细胞分化、降血脂及抗动脉

粥样硬化等药理作用 [ 4 - 5 ]。 Ta n I I A 已被广泛应用

于冠心病、心绞痛等心血管系统疾病的防治，但 Tan IIA治疗AD模型大鼠的相关报道尚不多见[6]。

本实验通过检测Tan IIA对AD模型大鼠脑组织

p53和磷酸化p53(phosphate p53，pp53)的表达水平

以及凋亡细胞的影响，探讨Tan IIA在抗凋亡中的

关键作用，旨在为Tan IIA治疗AD提供更多的理论

和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠30只，体质量

220~280 g，由中南大学实验动物学部提供。动物级

别：无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级。

1.1.2 药物与试剂

Tan IIA注射液，批号101003，由上海第一生

化药业有限公司生产。 A β 1 - 4 2 购自美国 S i g m a 公

司，6E10，p53与pp53一抗购自美国Santa Cr uz公

司，所有二抗、ABC试剂盒和DAB试剂盒购自美国

Vector公司。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制备

取Sprague-Daw ley大鼠，于腹腔注射100 g/L的水合氯醛(3.5 mg/kg )麻醉，置于脑立体定位仪

上，去除头顶部毛发，消毒皮肤，于头顶部正中

切口，暴露前囟，按大鼠脑立位图谱，于前囟后

3.0 mm，中线右侧2.0 mm处，用微量注射器自脑

表面垂直进针2.8 mm，以1 μL/min的速度缓慢向侧

脑室内注入10 μL Aβ1-42，留针5 min以确保注射溶

液充分扩散后缓慢撤针[7]。实验大鼠随机分为假手

术组、AD模型组和Tan IIA治疗组。模型制备24 h后，Tan IIA(溶于生理盐水)以8 mg/(kg·d)剂量注

射于大鼠腹腔，假手术组及AD模型组大鼠以等量

生理盐水注射腹腔，连续注射30 d。

1.2.2 脑组织切片的制备

实验完成后，取脑组织置于4%多聚甲醛溶液

中固定过夜，次日以PBS冲洗组织，将组织脱水透

明和石蜡包埋后，切片(厚约4~5 μm)[8]。

1.2.3 免疫组织化学检测 p53 和 pp53石蜡切片脱蜡水化后在抗原修复液 ( 柠檬

酸 - 柠檬酸三钠缓冲液， p H = 6 ) 8 0 ℃ 水浴箱内

修复 2 0 m i n ，自然冷却后， P B S 洗涤 3 次，再加

入 3 % H 2O 2室温反应 5 m i n 。 P B S 洗涤后，切片在

3 % 羊血清中封闭 1 h 。之后分别滴加兔抗大鼠

中南大学学报 ( 医学版 ), 2015, 40(11) http://www.csumed.org1212

p53(1:100)与兔抗大鼠pp53一抗(1:100)，于4 ℃过

夜后以PBS洗涤3次，再分别滴加相应二抗(1:400)溶液，在室温下孵育2 h，再以PBS洗涤后，于ABC试剂盒配置的混合液中孵育2 h。用DAB试剂盒配

置的显色液进行显色。然后切片经无水乙醇和二

甲苯处理后用中性树胶封片。切片在普通光学显

微镜下观察结果，使用高清晰度彩色病理图文分

析系统(high-resolution pathological image analysis system，HPIAS)计数每个动物脑组织海马区2个和

皮质3个非连续视野区的阳性细胞，并取其平均值

作为该大鼠阳性细胞数的最终值[8]。

1.2.4 Western 印迹法测定 p53 和 pp53 蛋白相对表达量

制备 S D S -PA G E 胶板，根据蛋白质量浓度计

算出上样体积，与上样缓冲液 1 : 1 混匀，于 9 8 ℃

加热 5 min后迅速置于冰水中冷却，依次加样。以

100 V恒压电泳约1 h，290 mA恒流转膜1.5 h。膜经

5%脱脂奶粉封闭后依次与一抗(p53 1:1 000，pp53 1:1 000)孵育过夜、辣根过氧化物酶( hor serad i sh perox i da se，H R P)标记二抗(羊抗鼠或羊抗兔Ig G 1:1 000)孵育2 h，在Bio-R ad凝胶成像系统经ECL显色后扫描处理，所得条带吸光度值分别与对应

β-actin内参计算比值获得相对吸光度值[8]。

1.2.5 TUNEL 法检测脑组织中凋亡细胞

石蜡切片经二甲苯和梯度酒精脱蜡水化后用

蛋白酶K(20 μg/mL)室温抗原修复10 min，然后用

PBS洗涤5 min，共3次。以TDT缓冲液(30 mmol/L Tr i s - H C l ， 1 4 0 m m o l / L 甲次砷酸盐， 1 m m o l / L二氯化钴； p H = 7 . 2 ) 预孵 1 0 m i n 后，每张切片滴

加 1 5 0 L 杂交液 ( 将 D I G - 1 1 - d U T P 4 0 0 U ，T Ta s e 1 nmol加入到1 mL TDT缓冲液)覆以蜡膜，37 ℃孵育3 h，2×SSC(300 mmol/L NaCl，30 mmol/L柠

檬酸钠；pH = 7 . 0 )溶液、0 . 5 × SSC溶液、0 . 1 × SSC溶液，在室温下分别洗涤 1 5 m i n 。用 Tr i s 缓冲

液1(100 mmol/L Tr i s -HCl，150 mmol/L NaCl；pH=7.5)孵育30 min，滴加抗地高辛-抗血清碱性磷

酸酶复合物(1:1 000)在室温下孵育过夜。用Tris缓

冲液2(100 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl，50 mmol/L MgCl2；pH=9.5)洗涤15 min，共2次，

避光滴加显色液[ 1 m L Tr i s缓冲液2中加入4 . 5 μ L四唑氮蓝(n i t ro b l u e te t r az o l i u m，N BT )和3 . 5 μ L 5 -溴 - 4 -氯 - 3 -吲哚基 -磷酸盐( 5 - b ro m o - 4 - c h l o ro - 3 -indolyl phosphate，BCIP)]在显微镜下观察，凋亡

细胞胞核呈现紫蓝色，适时置于Tr i s缓冲液3中终

止反应。以水溶性封片剂封片，于显微镜下观察

结果，统计 5 个非连续高倍镜视野下阳性细胞个

数，并求其均值作为凋亡细胞数。

1.3 统计学处理

统计学分析采用SPSS18.0 统计学软件，计量

资料以均数±标准差( x± s)表示，各组间比较采用

单因素方差分析(ANOVA)，两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Aβ 在各组脑组织中的表达

用6E10(Aβ1-16)抗体标记脑组织中的Aβ，显

微镜下假手术组未发现Aβ的沉积(图1A)，而AD模

型组和Tan IIA组海马周围Aβ注射区可见有大小不

等、分布不均的6E10阳性反应颗粒或斑块表达(图

1B，1C)，两组比较差异无统计学意义(P>0.05，

图1D)。

2.2 免疫组织化学法和 Western 印迹检测 p53 的表达

水平

p53棕黄色阳性反应见于许多细胞的胞质、胞

核和突起。假手术组阳性反应少(图2A)，与AD模

型组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。Tan IIA组

(图2B)与AD模型组(图2C)比较，阳性细胞较少，

细胞染色较浅，差异有统计学意义 ( P< 0 . 0 5 ，图

2D)。Western印迹检测结果发现；AD模型组p53的

条带明显粗于假手术组和Tan IIA组(图3A)，差异

有统计学意义(P<0.05，图3B)。

2.3 免疫组织化学法和 Western 印迹检测 pp53 的表

达水平

pp53阳性细胞也呈棕黄色反应，主要表达于

胞质。假手术组未见明显阳性反应 ( 图 4 A ) ， Ta n IIA组阳性细胞较少(图4B)，两组与模型组(图4C)比较，差异均有统计学意义 ( P< 0 . 0 5 ，图 4 D ) 。

Western 印迹检测结果显示：AD模型组pp53的条带

明显粗于假手术组和Tan IIA组(图5A)，差异有统

计学意义(P<0.05，图5B)。

2.4 TUNEL 法检测各组大鼠脑组织中的凋亡细胞

TUNEL染色阳性细胞为蓝紫色至黑色，位于

细胞核内。由TUNEL染色结果可见，假手术组脑

组织凋亡细胞很少(图6A)，Tan IIA治疗组凋亡细

胞比假手术组稍多(图6B)，Tan IIA治疗组与AD模

型组(图6C)相比，凋亡细胞数明显减少，差异有

统计学意义(P<0.05，图6D)。


图1 各组脑组织中6E10的表达(DAB，×200)

Figure 1 6E10 expressed in each group of brain tissues (DAB, ×200)

A: Sham group; B: Tan IIA treatment group; C: AD group; D: Semi-quantitative analysis

A

C

B

D假手术组 Tan IIA 治疗组 AD 模型组

0.25

0.2

0.15

0.1

0.05

0

6E10

阳性

细胞

吸光

度值

50 μm

50 μm 50 μm

图2 各组大鼠脑组织p53的检测结果(DAB，×200)

Figure 2 p53 expressed in each group of brain tissues (DAB, ×200)


*P<0.05 vs the sham group; †P<0.05 vs the Tan IIA treatment group

A

C

B


60

50

40

30

20

10

0

p53

阳性

细胞

吸光

度值

*†

50 μm 50 μm

50 μm


图3 各组大鼠脑组织p53的Western 印迹检测结果

Figure 3 p53 determined by Western blot analysis

A: Representative Western blot; B:Western blot quantitation normalized relative to β-actin


假手术组 Tan IIA 治疗组 AD 模型组

53 kD

42 kD

p53

β-actin

A 假手术组 Tan IIA 治疗组 AD 模型组

*†0.60.50.40.30.20.1

0

p53

相对

表达

值

B

图5 各组大鼠脑组织pp53的Western印迹检测结果

Figure 5 pp53 determined by Western blot analysis

A: Representative Western blot; B: Western blot quantitation normalized relative to β-actin


假手术组 Tan IIA 治疗组 AD 模型组

0.400.350.300.250.200.150.100.05

0

pp53

相对

表达

值

*†

BA假手术组 Tan IIA 治疗组 AD 模型组

pp53

β-actin

53 kD

42 kD

图4 各组大鼠pp53的免疫组织化学法检测结果(DAB，×200)

Figure 4 pp53 expressed in each group of brain tissues (DAB, ×200)



A

C

B


50

40

30

20

10

0

pp53

阳性

细胞

吸光

度值

*†

50 μm 50 μm

50 μm


3 讨论

Tan IIA作为中药丹参脂溶性成分的代表，广

泛应用于临床长达30余年。研究[9]发现Tan IIA能降

低脑中动脉栓塞所引起的神经元凋亡反应，对神

经元具有保护作用，但是其机制尚未完全明确。

在某些神经变性疾病中，一个明显的病理

特征是神经元的缺失，其中细胞凋亡起了主要作

用，特别是在AD中[10]。Aβ有很强的神经细胞毒性

作用，可以直接激活p53的启动子，p53通过其活

化形式pp53调控一系列基因的表达，通过上调促

凋亡蛋白的表达，如仅含Bcl-2同源结构域3(Bcl-2 homology domain 3，BH3)的“损伤蛋白”(Noxa)和 p 5 3 正向细胞凋亡调控因子 ( p 5 3 u p r e g u l a t e d modulator of apoptosis，pmua)，Bax，p53调节凋亡

诱导蛋白1(p53-regulated apoptosis-inducing protein l，p53AIpl)，凋亡酶激活因子(apoptotic protease activating factor，Apaf )及周围髓鞘蛋白相关p53凋

亡效应子(p53 apoptosis effector related to peripheral myelin protein，PERP)，或抑制Bcl-2及细胞凋亡蛋

白抑制因子(inhibitor of apoptosis proteins，IAP)基

因的表达来实现其促细胞凋亡功能[11]。p53诱导的

凋亡可以通过转录依赖与转录非依赖两种途径。

转录依赖指线粒体锚定的促凋亡产物与p53诱导基

因通过 p 5 3 依赖的转录后可以破坏线粒体的完整

性，导致细胞色素C过多释放，促使细胞凋亡。而

转录非依赖凋亡信号是通过p53蛋白与其他蛋白在

线粒体中的相互作用完成的 [12]。也有研究 [1 3- 15]认

为：AD患者凋亡的发生是由一部分p53被诱导后易

位至线粒体，迅速启动p53转录非依赖途径的凋亡

应答，继而跳跃式启动并放大后续的慢转录依赖

的应答反应。

p53翻译后的修饰，包括了磷酸化与乙酰化，

二者是细胞DNA损伤后p53活化的主要形式 [16-17]。

体内p53水平是通过泛素化作用的连续循环与26S蛋白酶的降解来维持的。而p53一旦发生磷酸化，

即pp53，可以避开泛素化降解。活化的pp53可以

表现出多种功能，例如细胞周期调节、DNA 损伤

修复以及凋亡。

Aβ可以诱导皮层神经元氧化应激损伤，继而

上调p53并使之活化。二者在不同分组脑组织的表

达存在依存关系，即p53高表达的组别，pp53也呈

现升高趋势。本实验结果显示：A D模型组p 5 3与

pp53阳性表达多，Tan IIA治疗组p53与pp53水平明

显减低。证明了Tan IIA可以减少p53的表达，减轻

AD引起的凋亡而发挥脑保护作用。

通过 TUNEL法检测凋亡细胞可以看出Tan IIA治疗 A D 能够显著减少凋亡细胞数量。但 Ta n I I A脑保护作用的机制是多方位的，在AD大鼠中可发

挥抗炎症作用、扩张微动脉改善血流和抗氧化作

图6 各组大鼠脑组织凋亡细胞检测(NBT/BCIP，×200)

Figure 6 Number of apoptotic cells in each group of brain tissues (NBT/BCIP, ×200)



A

C

B

50 μmD假手术组 Tan IIA 治疗组 AD 模型组

*†120

100

80

60

40

20

0

凋亡

细胞

数

50 μm 50 μm


用。由于AD发病机制尚未明确以及Tan IIA作用靶

点的多样性，尚需进一步研究Tan IIA的神经保护

作用机制，为临床更好利用丹参酮治疗AD提供可

靠的理论依据。

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(本文编辑陈丽文)

本文引用：李建, 王芳, 周军, 李闻文. 丹参酮IIA对AD大鼠脑组

织p53，pp53表达及细胞凋亡的影响[ J]. 中南大学学报: 医学版,

2015, 40(11): 1210-1216. DOI:10.11817/j.issn.1672-7347.2015.11.008

Cite this article as: LI Jian, WANG Fang, ZHOU Jun, LI Wenwen.

Effects of tanshinone IIA on the expressions of p53, pp53 and apoptosis

in the rats with Alzheimer’s disease[ J]. Journal of Central South

University. Medical Science, 2015, 40(11): 1210-1216. DOI:10.11817/

j.issn.1672-7347.2015.11.008

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