必見！lcカラム選択のノウハウ - waters corporation...2...

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必見！LCカラム選択のノウハウ

日本ウタズ株式会社

©2012 Nihon Waters K.K. 1

日本ウォーターズ株式会社

JASIS2012 Sep.6

1

1

k

k

4

NRs

逆相クロマトグラフィーの分離に影響を与えるファクター逆相クロマトグラフィーの分離に影響を与えるファクター

4

最大化するには :

幅広いケミストリラインアップ複数のパーティクル基材幅広い使用pH範囲 [BEH]高い保持能 [HSS]


超低分散システム小さい粒子径[< 2 µm]高耐圧性適切に設計されたカラム


高い保持能 [HSS]幅広い選択性 [CSH™]

適切に設計されたカラム

分離への影響Nを2倍kを2倍αを2倍

改善% 20 – 40%15 – 20%> 400%

初期値（理論段数：N=10000段、保持係数：k=5、分離係数：α=1.1）の場合

2

表面シラノール基は移動相 pHによりチャージが変化します

シラノールとは?

OH O

H+Si Si陽イオン交換体として働く


(pH 2) (pH 7)

Result: 表面シラノール基と塩基性対象物質 (正にチャージしている

もの)が強くインタラクションする

ミックスモードによるミックスモードによる保持保持

結合相との疎水性インタラクション

チャージサイトとのイオン交換性インタラクション

O SiO-SiO-SiO-O-SiO-SiO-O-SiO-O-SiO-SiO Si

O-SiO-SiOHO-SiO-SiOH

O-SiOHO-SiO-SiO-Si

(CH3)2HN+(CH3

)2

HN+

移動相 pH < 3

Si - OH


O-SiO-

O--SiO-Si

OHO-SiO-Si -

移動相 pH > 3

Si – O

塩基性化合物塩基性化合物

3

第一世代メチルハイブリッドパーティクル第一世代メチルハイブリッドパーティクル

官能基結合後のパーティクルシリカゲル vs. 第一世代ハイブリッド


シリカゲル C18 マテリアル残存シラノール50%, pKa ~ 7

XTerra C18 マテリアル残存シラノール33%, pKa ~ 9

シリカマトリックス中の架橋エタン2004: 第二世代エチレン架橋型ハイブリッドパーティクル

更なる革新更なる革新第二世代第二世代エチレン架橋型ハイブリッドパーティクルエチレン架橋型ハイブリッドパーティクル

U.S. Patent No. 6,686,035 B2

©2012 Nihon Waters K.K. 6Anal. Chem. 2003, 75, 6781-6788BEH パーティクル合成法

4

1. Uracil2. Propranolol3. Butylparaben4 Dipropylphthalate

XBridge™ C18

1

2

3 4

5

バランスのとれたカラム効率とピーク対称性：バランスのとれたカラム効率とピーク対称性：BEH Technology BEH Technology （（HPLCHPLC用カラム）用カラム）

4. Dipropylphthalate5. Naphthalene6. Acenaphthene7. Amitriptyline

高純度シリカ C181

2 3

4+5

67

16 75

AmitriptylineS = 1.15

Amitriptyline


Minutes0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00

ポリマーコーティング C181

2 3 4

67

5

AmitriptylineS = 2.85

p yS = 1.41

Amitriptyline pKa=9.4本比較試験結果は全てのアプリケーションを代表するものとは限りません

0.10

0.15

pH 3.0

xyl

am

ine

アルカリpHではAPIがN

CH3

移動相移動相 pH:pH:選択性変更のための強力なツール選択性変更のための強力なツール

AU

0.00

0.05

0.10

0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.000.15

pH 10

am

ine

do

x

分子型になるため保持・負荷量ともに向上

ON

CH3

CH3

©2012 Nihon Waters K.K. 8CM, ESG

AU

0.00

0.05

0.10

0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00

do

xyla

5

更なる課題解決に向けて更なる課題解決に向けて問題の確認問題の確認::最新高純度固定相最新高純度固定相

分析法開発における選択性変更のための選択肢が少ない

低pH移動相中では荷電した陽イオン性（塩基性）分析種の重量キャパシティーが低下し、

オーバーロードが起こりやすい

– テーリングファクタが大きい

– シグナル応答が小さい

高pH移動相暴露後の溶出（保持）時間のずれ*1

– 分析法のスクリーニングを実施する際に分析の性能が再現できない

バな高グ


o バッファを添加しない移動相での低/高pHスイッチング

*1 Marchand, D.H., et al., J. Chromatogr. A 2003, 1015, 53-64

課題解決のための新テクノロジー

CSHテクノロジー

Step 1 Step 2 Step 3


6

ローディングキャパシティの比較ローディングキャパシティの比較 (0.1% (0.1% ギ酸ギ酸))AU

1 0

2.0

3.0ACQUITY UPLC® CSH C18

2.1 x 50 mm, 1.7 µmQuetiapine

(base)Propiophenone

(neutral)

0.0

1.0

AU

0 0

1.0

2.0

3.0

Quetiapine (base)

Propiophenone (neutral)

全多孔性シリカ C18

2.1 x 50 mm, 1.8 µm


0.0

AU

0.0

1.0

2.0

3.0

Minutes0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6

Quetiapine (base)

Propiophenone (neutral)

コアシェルシリカ C18

2.1 x 50 mm, 1.7 µm

パーティクルテクノロジープラットフォームパーティクルテクノロジープラットフォーム

BEH パーティクルEthylene-Bridged Hybrid

130Å, 200Å, 300Å

1.7 µm for UPLC2.5, 3.5, 5 and 10 µm for HPLC

HSSパーティクルHigh Strength Silica

100Å

1.8 µm for UPLC2.5, 3.5 and 5 µm for HPLC

CSH パーティクルCharged Surface Hybrid

130Å

1.7 µm for UPLC2.5, 3.5 and 5 µm for HPLC

保持の向上および選択性のためにデザイン

•極性化合物の保持向上 [HSS T3]

µ

業界最高レベルの化学的耐久性のためにデザイン

•汎用カラムとして選択

選択性およびサンプルローディング最大化のためにデザイン

•塩基性化合物の卓越したピーク形状


•卓越したピーク形状、耐久性および保持 [HSS C18]

•良好なピーク形状を維持した異なる選択性 [HSS C18 SB, HSS Cyano , HSS PFP]

•XSelect HSS HPLC カラムとのシームレスな選択性

•比類ない範囲の移動相pH、温度、圧力で使用可能

•幅広いケミストリラインアップ：低分子用6種、バイオ医薬品用8種

•XBridge HPLCカラムとシームレスな選択性

越およびローデイングキャパシティ

•独自のカラム選択性と業界最高レベルの（バッチ間）再現性を同時に達成

•低/高pHにおける卓越した耐久性と速い平衡化

•XSelect CSH HPLCカラムとのシームレスな選択性

7

多様なカラムラインアップ：多様なカラムラインアップ：UPLCUPLCカラムカラム

5種類のパーティクル基材

– 130Å, 200Å, 300Å BEH [エチレン架橋型ハイブリッド], HSS

[High Strength Silica], CSH[Charged Surface Hybrid][ g g ], [ g y ]

– 全てHPLCおよびUPLC®粒子径で販売（SEC用を除く）

種類豊富でさらに増え続けるカラムケミストリ

– 16 種の固定相

o BEH 130Å C18, C8, Shield RP18, Phenyl, HILIC,

Amide

o BEH 300Å C18 and C4

o HSS C18, T3, C18 SB, PFP, Cyano

o CSH C18, Fluoro-Phenyl, Phenyl-Hexyl

専用試験を行ったアプリケーションベースのソリューション


– SEC, AAA, OST, PST, PrST and Glycan

HPLC⇔UPLC間での分析法移管性

– XBridge HPLC ⇔ACQUITY UPLC BEH カラム

– XSelectTHSS HPLC ⇔ ACQUITY UPLC HSS カラム

– XSelect CSH HPLC ⇔ ACQUITY CSH カラム

専用ガードカラム：VanGuard

eCordテクノロジー

LaunchDate

CH3N

H3C H

+

極性基内包型逆相官能基による充てん剤表面のシールド効果モデル

極性基内包型カラム極性基内包型カラム

Water “Shield” Layer

+


塩基性化合物の保持能が減少

ピークテーリングが減少

シラノールの負チャージを封印

8

化合物1.Uracil (N)2.Propranolol (B)3.Butylparaben (N)4.Naphthalene (N)5 Dipropylphthalate (N)

XBridge C18

官能基による選択性の相違官能基による選択性の相違: : XBridgeXBridge C18 vs. C18 vs. XBridgeXBridge Shield RP18Shield RP18

5 5.Dipropylphthalate (N)6.Acenaphthene (N)7.Amitriptyline (B)

分析条件カラム：4.6 x 100 mm, 3.5 µm 移動相：65/35(v/v)

MeOH /20mM K3PO4, pH7.0流速：1.0 mL/min装置：Alliance® 2695

XBridge Shield RP18

N：中性化合物 B：塩基性化合物

5

5


5

5. Dipropylphthalate

7. Amitriptyline

NCH3

CH3

PhenylPhenylカラムカラム

p-p結合により芳香族化合物の選択性が変化

SiO

Si

CH3

H3C

官能基


分析対象成分

9

官能基による選択性の相違官能基による選択性の相違::XBridgeXBridge Phenyl vs. C18 vs.Phenyl vs. C18 vs. Shield RP18Shield RP18

XBridge Phenyl低pH, ACN

1674,5 8

2 10

911

12

XBridge Shield RP18

XBridge C18

1 3 5 672 4 89,10

11

12

12

1 3672


g

官能基によって選択性の違いが見られる。三環系抗うつ剤（ピーク6,7）はPhenylで顕著に保持が強くなる。

Jenkins, Diehl

109

864 5117

1 32

NEWNEWHSS PFPHSS PFPカラムカラム / HSS CN/ HSS CNカラムカラム

＜XSelect HSS/ ACQUITY UPLC HSS PFPカラム＞

下記化合物の分離選択性向上:疎水性塩基性化合物– 疎水性塩基性化合物

– 高極性化合物

– ハロゲン化合物、異性体、芳香族化合物

塩基性および芳香族化合物の保持向上と卓越したピーク形状

＜XSelect HSS / ACQUITY UPLC HSS CNカラム＞

疎水性化合物の保持は弱め (vs C18s)


疎水性化合物の保持は弱め (vs. C18s)

順相分析にも対応

水系比率の高い移動相でも使用可能

CN結合相として酸性移動相条件下で非常に安定

10

HSS CNHSS CNカラムを用いたステロイドの分離カラムを用いたステロイドの分離逆相逆相//順相順相

XSelect HSS CN 3.5 µm 2.1 x 100 mm

1. Hydrocortisone2. Corticosterone3 β Estradiol

逆相

0.00

0.10

0.20

1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00

3. β - Estradiol4. Progesterone

Isocratic: 40% ACN

1

2

3

4

1. β-Estradiol 2. Progesterone 3 Corticosterone

順相


0.00

0.05

0.10

0.15

Minutes

1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0

1

2 3 4

3. Corticosterone 4. Hydrocortisone

Isocratic: 83% Hexane / 5% DCM / 12% IPA

Conditions :Columns: 2.1 x 50 mmMobile Phase A: 0.1% CF3COOH in H2OMobile Phase B: 0.08% CF3COOH in ACNFlow Rate: 0.5 mL/min Gradient: Time Profile Curve

(min) %A %B0.0 92 8 60 1 92 8 6

1 2 453

BEH C18

BEH C8

BEH Shield RP18

12 4 53

1 2 453

UPLC UPLC カラム選択性比較カラム選択性比較カフェ酸誘導体カフェ酸誘導体

0.1 92 8 64.45 50 50 74.86 10 90 65.0 92 8 66.0 92 8 6

Injection Volume: 1.0 µLSample Diluent: 50:50 H2O: MeOH

with 0.05% CF3COOH Sample Conc.: 100 µg/mLTemperature: 40 oCDetection: UV @ 330 nmSampling rate: 40 pts/secTime Constant: 0.1Instrument: Waters ACQUITY UPLC®, with

ACQUITY UPLC® TUV

BEH Phenyl1 2 453

HSS CN 1 2

4

35

1 2 43 5 CSH Phenyl-

Hexyl

1 2

4

3

5

CSH Fluoro-Phenyl

CSH C181 2

3,4

5

©2012 Nihon Waters K.K. 20Minutes0.0 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00

化合物1. Caftaric acid2. Chlorogenic acid3. Cynarin4. Echinacoside5. Cichoric acid

1 2 4 53HSS T3

HSS C181 43 52

1 2 453

HSS C18 SB

HSS PFP1 23

45

Comparative separations may not be representative of all applications

11

2.3

2.8

hen

e)

選択性チャートの活用方法

疎水性・選択性を変更せず：現在使用しているカラムのプロット位置と

カラム変更をしたい* 近いカラムを選択

Y

逆相カラム選択性チャート逆相カラム選択性チャート

0 8

1.3

1.8

選択性

変化

mit

rip

tylin

e/ac

enap

hth カラム変更をしたい* 近いカラムを選択

疎水性化合物保持能を高めたい：X軸の数値の大きいカラムを選択

選択性を変化させたい：Y軸の数値が異なるカラムを選択

*:最新カラムへの変更等の際

メタノール /20 mM KH2PO4-K2HPO4 pH 7.0 (65/35)

— なぜ pH7.0 で試験するのか？

o 酸性のシラノール基と塩基性化合物共に大きく解離するので


-0.2

0.3

0.8

1 1.5 2 2.5 3 3.5

疎水性化合物の保持能増加

(ln [k] acenaphthene)

(ln

[a]

am

X

シラノール基の影響を評価しやすい

カラム温度： 23 °C

カラム選択性チャート試験化合物

Amitriptyline

塩基性化合物

pKa = 9.4

Acenaphthene

中性化合物

N+

保持時間は充てん剤の固定相の疎水性に依存

保持時間は充てん剤固定相の


定相の疎水性に依存。保持能（ k ）が高い程、充

てん剤の疎水性が高い。

疎水性と残存シラノールの活性及び濃度に依存する（分析が難しい塩基性物質の良い例）

本試験法の関連論文

– Reproducibility of a reversed-phase packing1

– Hydrophobic property and residual silanol activity of reversed-phase packings2

1Uwe D. Neue et al, J. Chromatogr. A 849, 87 (1999)2Uwe D. Neue et al, J. Chromatogr. A 849, 101 (1999)

12

ますます増え続けるカラムラインアップ・選択性ますます増え続けるカラムラインアップ・選択性2011Nov.2011Nov.最新逆相カラム選択性チャート（最新逆相カラム選択性チャート（WebWeb版）版）

弊社WEBページにてご覧いただけます。「selectivity chart」で検索またはhttp://www.waters.com/waters/promotionDetail.htm?id=10048475

ACQUITY BEH PhenylXBridge Phenyl

ACQUITY HSS C18 SBXSelect HSS C18 SB

ACQUITY HSS T3XS l t HSS T3

ACQUITY CSH Fluoro-PhenylXselect CSH Fluoro-Phenyl

ACQUITY HSS CNXSelect HSS CN

ACQUITY HSS PFPXSelect HSS PFP


ACQUITY BEH C18XBridge C18

ACQUITY BEH Shield RP18XBridge Shield RP18

ACQUITY BEH C8XBridge C8

ACQUITY HSS C18XSelect HSS C18

XSelect HSS T3

ACQUITY CSH C18XSelect CSH C18

ACQUITY CSH Phenyl-HexylXSelect CSH Phenyl-Hexyl

Appendix


13

1

1

k

k

4

NRs

逆相クロマトグラフィーの分離に影響を与えるファクター逆相クロマトグラフィーの分離に影響を与えるファクター

4


幅広いケミストリラインアップ複数のパーティクル基材幅広い使用pH範囲 [BEH]高い保持能 [HSS]


超低分散システム小さい粒子径[< 2 µm]高耐圧性適切に設計されたカラム


高い保持能 [HSS]幅広い選択性 [CSH™]

適切に設計されたカラム

分離への影響Nを2倍kを2倍αを2倍

改善% 20 – 40%15 – 20%> 400%

初期値（理論段数：N=10000段、保持係数：k=5、分離係数：α=1.1）の場合

バンド拡散のピーク形状への影響バンド拡散のピーク形状への影響

狭いバンド狭いバンド

狭いピーク向上した感度

向上した分離能

UPLCTechnology

HPLC向上した分離能

Technologyブロードなバンド – ブロードなピーク – 低い感度


緑色の化合物分子の集団は全てより近い時間内に検出器セルに到達し、より濃縮される

バンド拡散を最小限に抑えるためには適切に設計されたカラムと装置の両方が必要

緑色の化合物分子の集団は大きく異なる時間で検出器セルに到達する

14

多流路拡散（A項）

– 充塡ベッド均一性を向上させる

o カラム充塡法の向上

拡散についての理解拡散についての理解::van van DeemterDeemter式式

Cuu

BAH

o カラム充塡法の向上

o 粒子径分布の減少

– 粒子径を小さくする

カラム軸方向での成分の分子拡散（B項）

– 移動相の流速を上げる

u


固定相と移動相における物質移動の合計（C項）

– 拡散速度を上げる（温度を上げる）

– 拡散距離を短くする（より小さな粒子径)

– 拡散距離を制限する (コアシェルパーティクル)

拡散拡散[C[C項：物質移動項：物質移動] ] についての理解についての理解::粒子径の影響粒子径の影響


粒子径を小さくして拡散距離を小さくすることでより狭く、高効率のクロマトグラフィーバンドが得られる

15

拡散についての理解拡散についての理解::van Deemtervan Deemterプロットプロット

– カラム効率（理論段数:N）

o 理論段高(HETP)～１理論段あたりのカラム長

o カラム長 (L)/粒子径 (dp)o カラム長 (L)/粒子径 (dp)


Efficiency vs. Backpressure Comparisons

400000

450000

カラム粒子径と背圧との関係カラム粒子径と背圧との関係

1.0 μm

150000

200000

250000

300000

350000

Eff

icie

nc

y (

N/m

)

1.4 μm

1.7 μm

2.5 μm

1.8 μm21% 高効率79% 高背圧

70% 高効率390% 高背圧

15% 高効率40% 高背圧


0

50000

100000

0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 80000

Backpressure (psi)

3.5 μm

5.0 μm

10.0 μm

Assume:1) 100 mm length columns2) Pmax at uopt3) ACN/H2O Gradient, 40oC

16

HPLCHPLCととUPLCUPLCの間の“失われた環”の間の“失われた環”….….

AU

0.10

0.20

0.30 XSelect CSH C184.6 x 100 mm, 3.5 µm

HPLC System 3.5 µmTolm

etin

Nap

roxen

Fenoprofen

omethacin

Diclofenac

0.00

0.10

Minutes0.00 4.00 8.00 12.00 16.00 20.00 24.00 28.00

F

Indo


ACQUITY UPLC CSH C182.1 x 50 mm, 1.7 µm

UPLC System

9X Faster than 3.5 µm HPLC

AU

0.00

0.10

0.20

0.30

0.00 0.50 1.00 1.50 2.50 3.00 3.50Minutes 2.10

1.7 µm

2.5 µm e2.5 µm eXXtended tended PPerformance erformance XPXP カラムカラム

AU

0.10

0.20

0.30 XSelect CSH C184.6 x 100 mm, 3.5 µm

HPLC System 3.5 µmTolm

etin

Nap

roxen

Fenoprofen

omethacin

Diclofenac

AU

0.00

0.10

0.20

0.30XSelect CSH C18 XP

4.6 x 75 mm, 2.5 µmHPLC System


2.5 µm XP

0.00

0.10

Minutes0.00 4.00 8.00 12.00 16.00 20.00 24.00 28.00

F

Indo


Minutes0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00

ACQUITY UPLC CSH C182.1 x 50 mm, 1.7 µm

UPLC System


AU

0.00

0.10

0.20

0.30

0.00 0.50 1.00 1.50 2.50 3.00 3.50Minutes 2.10

1.7 µm


17

バンド拡散を最小限にする超低拡散ハードウェアに充てん

高耐圧に設計

New New 2.5 µm 2.5 µm eeXXtendedtended PPerformance erformance カラムカラム::

高耐設計

– 4.6 mm 内径カラムは9,000 PSIまで

– 2.1 および 3.0 mm 内径カラムはUPLC耐圧（18000psi）

幅広いカラムサイズ＆ケミストリラインアップ

– 内径2.1, 3.0 and 4.6 mm (2.1 および 3.0mm は eCord テクノロジーを採用)

– 長さ30, 50, 75, 100 and 150 mm14 種類の固定相


– 14 種類の固定相

XBridge [BEH] および XSelect [CSH and HSS] の2.5 µm パーティクル／ケミストリを充てん

– BEH C18, Shield RP18, C8, Phenyl, HILIC and Amide

– CSH C18, Phenyl-Hexyl and Fluoro-Phenyl– HSS C18, T3, C18 SB, Cyano and PFP

全てシームレスに分析法移管が可能な全てシームレスに分析法移管が可能な２種類の２種類のLCLCカラムプラットフォームカラムプラットフォーム

pH 耐久性のためにデザイン、選択性のためにデザイン、最適化されたカラムファミリー

市場で最もMS-適合性の高いHPLC カラム

択最適化されたカラムファミリー

多様なクロマトグラフィーの問題解決のための複数のパーティクル基材

2.5 µm XP eXtended

Performanceカラム


1.7 [UPLC], 2.5, 3.5, 5, 10 µm

1.8 [UPLC], 2.5, 3.5, 5 µm HSS

1.7 [UPLC], 2.5, 3.5, 5 µm CSH

カラム

New

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