TITULO

EFECTO PROTECTOR DE LOS ESTEROIDES NEUROACTIVOS

PROGESTERONA Y DEHIDROEPIANDROSTERONA EN LA

POBLACIÓN NEUROGLIAL DEL HIPOCAMPO DE RATAS MACHO

ADULTAS, AFECTADAS POR EL HACINAMIENTO Y EL RUIDO.

ÍNDICE PÁG.

RESUMEN 1

SUMMARY 2

ANTECEDENTES 3

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 18

HIPÓTESIS 19

OBJETIVO GENERAL 19

OBJETIVOS ESPECÍFICOS 19

DISEÑO EXPERIMENTAL 20

MATERIALES Y MÉTODOS 23

ANÁLISIS ESTADÍSTICO 36

RESULTADOS 37

DISCUSIÓN DE RESULTADOS 58

CONCLUSIONES 70

PERSPECTIVAS 71

BIBLIOGRAFÍA 72

VII

INDICE DE FIGURAS Y GRÁFICAS PÁG.Fig. No. 1 Diagrama de flujo 25

Fig. No. 2 Campo de agujeros 29

Fig. No. 3 Laberinto Acuático de Morris 31

Fig. No. 4 Método de Conteo Puntual de Weibel. 35

Fig. No. 5 Recolección de la muestra urinaria. 37

Fig. No. 6 Implante Progesterona, Zona CA3 del Hipocampo 48

Fig. No. 7 Grupo Control, Zona CA1 del Hipocampo. 49

Fig. No. 8 Población Microglial en Zona DG del Hipocampo 54

Fig. no. 9 Transformación Microglial en Zona CA1 del Hipocampo 57

Gráf. No.1A Liberación de Implantes de Progesterona 38

Gráf. No.1B Liberación de Implantes de Dehidroepiandrosterona 38

Gráf. No.2A Niveles de Corticosterona en grupos co ntroles 39

Gráf. No.2B Niveles de Corticosterona en grupos de hacinamiento 40

Gráf. No.2C Niveles de Corticosterona en grupos de ruido 40

Gráf. No.3 Prueba de Morris. Cruces con la Platafo rma 43

Gráf. No.4 “Hole Board” (Campo de agujeros). Tiemp o en Zona Central 44

Gráf. No.5 Hole Board. Visitas Totales 45

Gráf. No.6A Población Astrocitaria en Zona CA1 del Hipocampo 47

Gráf. No.6B Población Astrocitaria en Zona CA3 del Hipocampo 47

Gráf. No.6C Población Astrocitaria en Zona DG del Hipocampo 47

Gráf. No.7A Transformación Astrocitaria en Zona CA1 del Hipocampo 51

Gráf. No.7B Transformación Astrocitaria en Zona CA3 del Hipocampo 51

Gráf. No.7C Transformación Astrocitaria en Zona DG del Hipocampo 51

Gráf. No.8A Población Microglial en Zona CA1 del Hipocampo 53

Gráf. No.8B Población Microglial en Zona CA3 del Hipocampo 53

Gráf. No.8C Población Microglial en Zona DG del Hi pocampo 53

Gráf. No.9A Transformación Microglial en Zona CA1 del Hipocampo 56

Gráf. No.9B Transformación Microglial en Zona CA3 del Hipocampo 56

Gráf. No. 9C Transformación Microglial en Zona DG del Hipocampo 56

VIII

RESUMEN

Antecedentes: El hipocampo es una estructura sensible al incremento de

glucocorticoides durante el estrés, el cual genera cambios bioquímicos y celulares en

esta estructura que afectan las funciones asociadas a ella, tales como la memoria

espacial y la conducta exploratoria. En este estudio hemos analizado la influencia de

los neuroesteroides progesterona (PROG) y dehidroepiandrosterona (DHEA) sobre los

efectos que el estrés por hacinamiento o ruido tienen sobre los niveles de

corticosterona (CORT), la población y transformación glial en el hipocampo, y sobre la

memoria espacial y la conducta exploratoria. Metodología: 90 ratas macho adultas

castradas fueron sometidas a estrés crónico por hacinamiento o ruido durante 10 días,

en presencia de implantes de liberación prolongada de PROG, DHEA ó vehículo

(VEHI). Los neuroesteroides liberados y la cantidad de CORT fueron analizados en

muestras de orina mediante cromatografía de líquidos de alta resolucion (HPLC). Se

realizó un análisis morfológico de población y transformación celular en el hipocampo

con microscopía de luz, utilizando anticuerpos dirigidos contra la proteína acídica

fibrilar glial (GFAP) para astrocitos y marcaje con isolectina-B4 para microglia.

Resultados: El incremento en los niveles de CORT debidos al estrés fue inhibido por la

PROG y DHEA liberadas por los implantes. La PROG previno el impedimento en la

habilidad de recordar claves espaciales para ubicar la plataforma en el laberinto de Morris

generados por el estrés. Ambas hormonas inhibieron el incremento en la actividad

exploratoria producido por el estrés, y DHEA incrementó el tiempo de permanencia en la

zona central del campo de agujeros. La PROG no produjo inhibición sobre las reducciones

del número y transformación morfológica astrocitaria y microglial generadas por el estrés.

La DHEA disminuyó estos efectos en las áreas analizadas, independientemente de las

condiciones de estrés. Conclusiones: Los esteroides liberados desde los implantes

hormonales disminuyeron los niveles de CORT, ejercieron efectos ansiolíticos; reflejados

en la conducta exploratoria y preservaron la memoria espacial, frente al estrés. Estos

esteroides tambien inhibieron la astrogliosis y reactividad microglial en las regiones

cerebrales analizadas de los animales estresados.

1

SUMMARY

Background: The hippocampus is a structure sensitive to high levels of glucocorticoids

during stress response, which generates biochemical and cellular alteration, and changes

in the related behavioral functions, such as the spatial memory and the exploratory

behavior. In this study, we analyzed the influence of the steroids progesterone (PROG) and

dehydroepiandrosterone (DHEA) on the stress-induced changes in the corticosterone

(CORT) level, number and reactivity of glial cells in the hippocampus, the spatial memory

and the exploratory behavior. Methods: 90 male adult castrated rats were exposed to

chonic stress by overcrowding and ultrasonic noise for 10 days. They were previously

implanted with PROG, DHEA or a vehicle (VEHI). Steroids and CORT levels were assesed

in the urine with high performance liquid chomatography (HPLC). The number and

reactivity of cells were measured with light microscopy morphologic analysis, using

antibodys against glial fibrilar acidic protein (GFAP) for astrocytes, and isolectine-B4 for

microglia. Results: The stress-induced rising CORT level was inhibited by PROG and

DHEA. PROG prevented the stress-induced spatial memory impairing in the Morris Water

Maze test. Both hormones inhibited the stress-induced enhancement of the exploratory

behavior in the Hole Board, but only DHEA incremented the time elapsed in the central

zone of this field. PROG had no effects on the stress-induced reduction in the number and

reactivity of astrocytes and microglia. DHEA caused the more notable effects on the

astrocytic and microglial populations decreasing and reactivity, wthitout a relation ship with

the kind of stress.

Conclusions: Steroides delivered from the hormonal implants caused a diminution of

the CORT levels, exerting an ansiolytic effect manifested by a modified exploratory

behaviour, and also maintained the spatial memory, against stress. Astrogliosis and

microglial reactivity were inhibited too by these steroids, in the examined brain regions

from the stressed animals.

2

ANTECEDENTES

Estrés y glucocorticoides.

El estrés se define como una condición en la cual un organismo enfrenta una

situación adversiva, la cual influye en su percepción o habilidad para controlar la

presencia o la intensidad de los estímulos adversos (Jeansok y Diamond, 2002). El

estrés activa el eje hipotálamo-pituitario-adrenal (HPA) liberando grandes cantidades

de glucocorticoides (GC´s), especialmente si el estímulo es de características crónicas

(McEwen, 2000).

Algunas funciones relacionadas con el hipocampo como son el aprendizaje, la

memoria y la conducta exploratoria, son modificadas por el estrés, mediante la

activación de glucoreceptores tipo I (mineraloreceptores) o tipo II (glucoreceptores)

localizados en esa área (Jeansok y Diamond, 2002). Por consiguiente, el estrés se

relaciona estrechamente con los cambios celulares en el hipocampo y en

consecuencia, con cambios conductuales asociados a este órgano cerebral.

El uso de diversos estímulos adversos sirven como modelo experimental para

generar la respuesta fisiológica de estrés. El ruido por ejemplo; ha sido ampliamente

utilizado para estudiar el comportamiento animal ante situaciones estresantes

(Mollenauer y cols., 1992), resulta de gran importancia su estudio debido a su impacto

creciente en las actividades cotidianas de los seres humanos (Cohen y Williamson,

1991), ya que al incrementar significativamente los niveles plasmáticos de GC´s

(Arcana y Navasivayam, 1999) o de la hormona ACTH (Van Raaij y col., 1997), induce

cambios importantes en la regulación hormonal de los individuos.

Los modelos experimentales con animales sometidos a estrés de tipo social se

han utilizado también con frecuencia. Estos modelos parecen ser una analogía mucho

más válida de la respuesta al estrés en los h umanos ya que representan situaciones

menos ajenas a nuestra especie (Henry y cols., 1993). Se usan por ejemplo, la

confrontación a jerarquías sociales, el hacinamiento, las vocalizaciones

3

ultrasónicas (USVs) como un tipo social de ruido, y los enfrentamientos o peleas con

otros individuos (Blanchard, 1991; Fokkema y col., 1995; McEwen, 2000).

Las vocalizaciones ultrasónicas (USVs) constituyen una especie de ruido social,

ya que son sonidos de alta frecuencia emitidos por los roedores ante diferentes

situaciones. Las USVs de distrés (18-24 KhZ), se han utilizado (producidas por

animales o por dispositivos electrónicos) para generar estrés en ratas (Blanchard y

col., 1991; Commissaris y col., 2000). También como factores sociales estresantes se

han evaluado las condiciones de alojamiento, tales como la mezcla de machos y

hembras en ratas (Klein y col., 1992), el aislamiento y el hacinamiento en ratones (Aioi

y col, 2001) y ratas (Boranic y col., 1982; Csermely y col., 1995).

El hacinamiento, es decir, la convivencia de varios individuos en un espacio

reducido es por su parte una variable útil en la in vestigación con modelos animales, ya

que se presenta con mucha frecuencia en diferentes comunidades, y en las personas

ha sido relacionado como un factor de riesgo para la esquizofrenia (Torrey y Yolken,

1998). En ratas sometidas a estas circunstancias, se ha observado un incremento en

los niveles de los neurotransmisores serotonina y noradrenalina (Boranic y col., 1982).

Sin embargo, para que el hacinamiento produzca efectos fisiológicos se requiere de un

tiempo de exposición prolongado. Csermely y col. (1995) observaron que un

hacinamiento de tres meses incrementaba la concentración intracelular de calcio, lo

cual constituye un marcador sensitivo de la homeostasis en las células vivas. Los

efectos de ambos factores fueron estudiados en una investigación a largo plazo (8 a 14

meses) en la que se analizó la influencia del ruido y el hacinamiento sobre el

aprendizaje y la memoria de ratas; la estimulación estresante incrementó estas

habilidades en sujetos de 10 a 12 meses de edad. Sin embargo, cuando los animales

envejecieron mostraron deterioro de estas habilidades (Bubna-Littitz y col, 1981). Estos

tipos de estrés han mostrado incrementos en los niveles de corticosterona (CORT),

siendo el GC más común en los roedores (Meerlo y col., 1999).

4

Asimismo, inducen hiperactividad del eje HPA (Ely y col., 1997), supresión de la

conducta exploratoria en las ratas (Meerlo y col., 1999), e inducen una remodelación

neuronal del área CA3 del hipocampo (McKittrick y c ol., 2000).

Efectos del estrés sobre las neuronas.

Los efectos nocivos del estrés sobre las neuronas hipocampales se deben a que

éstas células poseen abundantes receptores a esteroides adrenales, y particularmente

el hipocampo es sensible y muy vulnerable a los efectos del estrés (McEwen, 2000). El

estrés psicosocial y la inmovilización de los animales en espacios reducidos durante el

hacinamiento, producen atrofia después de 3-4 semanas, y resultan particularmente

afectadas las neuronas piramidales de la región CA3 del hipocampo. Sin embargo, el

proceso de atrofia puede bloquearse al inhibir la síntesis de esteroides adrenales y los

efectos citotóxicos de aminoácidos excitadores (Magarinos y col., 1997). Como

resultado del estrés repetitivo, el aná lisis de la ultraestructura de las fibras musgosas

terminales de neuronas de la región CA3 del hipocampo ha revelado una depleción de

las vesículas sinápticas. Así, las fibras musgosas parecen ser las responsables de

producir la atrofia en neuronas CA3, que afecta principalmente a las dendritas apicales,

y posiblemente produce un desensamblaje del citoesqueleto dendrítico (McEwen y

Magarinos, 1997). Con la atrofia de las dendritas apicales se produce déficit

cognoscitivo específico en el aprendizaje espacial y en la memoria (Magarinos y col.,

1997).

El hipocampo puede resultar afectado básicamente p or dos formas de

plasticidad estructural en respuesta al estrés; 1) atrofia de las dendritas apicales de la

zona CA3 y, 2) supresión de la neurogénesis en el giro dentado. Los glucocorticoides,

los aminoácidos excitatorios y lo s receptores NMDA (un sub-tipo de receptores a

glutamato) están implicados en estas d os formas de plasticidad, ambas son relevantes

para el funcionamiento del hipocampo humano frente a atrofia selectiva, acompañada

por deficiencias en la ejecución de la memoria declarativa episódica, espacial y

contextual (McEwen, 1999; Kuroda y McEwen, 1998).

5

Efectos del estrés sobre los astrocitos.

Las células de la microglia y los astrocitos desempeñan importantes funciones

durante el metabolismo normal del cerebro, entre otras funciones permiten mantener la

homeostasis, al actuar como reservorio de substancias precursoras de

neurotransmisores y como un sistema de depuración de productos del catabolismo

neuronal. Estas células contribuyen a la respuesta neuronal frente al estrés, y su

activación excesiva y prolongada se ha propuesto como una de las causas asociadas a

trastornos neurodegenerativos (McEwen, 2000).

La expresión estructural de la proteína acídica fibrilar glial (GFAP), determinante

de la motilidad y de la forma astrocitaria, es esencial para la interacción neurona-

astrocito, y depende principalmente de los niveles de corticosterona circulante, ya que

esta proteína no está tan relaci onada con otras hormonas adrenales (Zilles y col.,

1991). Su regulación es fundamental durante la plasticidad glial-neuronal en el proceso

adaptativo del sistema nervioso adulto, frente a las necesidades fisiológicas (Garcia-

Segura y col., 1996).

Los glucocorticoides ejercen influencias potentes in vivo e in vitro, sobre la

proliferación, maduración, diferenciación y funciones de los astrocitos (Aizenman y

Vellis, 1987; Kniss and Burry, 1985; Morale y col., 2001; Patel y col., 1983), y más de

10 tipos diferentes de isoformas de proteinas incluyendo la GFAP, resultan afectados

en los astrocitos por cambios en la CORT (Magnaghi y col., 2000; Nichols, 2003; O

´banion y col., 1994). Los efectos de la CORT sobre la expresión de GFAP no están

mediados únicamente por los mecanismos neuron ales, sino que también pueden

ejercerse a través de la acción directa sobre los receptores astrocitarios a la hormona

(Maurel y col., 2000), en especial por los glucoreceptores o receptores tipo II (Nichols y

col., 1990; Bohn y col., 1994; Crossin y col., 1997). Estas hormonas inhiben la

expresión de genes para GFAP (Crossing y col., 1997; Laping y col., 1994; Nichols y

col., 1990; O’callaghan y col., 1991), y se ha observado que la adrenalectomía produce

los efectos opuestos (Gould y col., 1992; Krugers y col., 1994). Los glucocorticoides

también pueden inhibir la síntesis de DNA en los

6

astrocitos y por lo tanto su proliferación (Alonso, 2001; Crossing, y cols 1997; Kniss,

1985), aunque este efecto puede ser reversible con PROG y DHEA (Crossin y col.,

1999). Adicionalmente, la CORT impide la capacidad de los astrocitos para retirar

aminoácidos excitatorios de las sinapsis, lo cual e xacerba el daño ocasionado por los

mismos (Chou, 1998; Virgin y col., 1991); dificulta el control que ejercen sobre la

homeostasis de sodio y potasio (Lian y Stringer, 2004), y reduce su actividad

fagocitaria (Roldan y col., 1997). Este papel inhibitorio es opuesto al encontrado en

algunos estudios in vitro, en los que se observa un incremento del mRNA de GFAP y

de la tasa de transcripción de la proteina (Melcangi y col., 1997; Rozovsky y col.,

1995), o incrementos en la proliferación de astrocitos (Deniselle y col., 1999). Asi

mismo, Maurel y col. (2000) han mostrado un incremento in vivo de la proteína GFAP

en el Núcleo Supra Quiasmático (SQN) y un decrement o de esta en el hipocampo

ante la exposición a glucocorticoides, lo que sugiere que, las respuestas de expresión

de GFAP pueden ser regionalmente específicas. Recientemente, en nuestro

laboratorio se ha encontrado evidencia de que la exposición subaguda al

glucocorticoide prednisona (PRED) por implante subcutáneo (González-Perez y col.,

2001) y por administración oral crónica (González-Castañeda y col., 2002) incrementó

la reactividad glial en varias regiones cerebrales. También se ha observado alta

reactividad astrocitaria en ratas ancianas (Björklund y col., 1985), lo cual puede estar

relacionado con procesos de envejecimiento cerebral asociado a la exposición

prolongada a glucocorticoides (McEwen, 2000).

La investigación del estrés psicológico y su impacto sobre las células

astrocitarias es escasa; la mayoría de los experimentos se han hecho in vivo o in vitro,

mediante la aplicación directa de GC´s. Sin embargo, recientemente Ritchie y col.

(2004), encontraron que el estrés crónico de ntensidad media redujo la

inmunoreactividad de GFAP en ratas en CA1 y CA3, y en el hilus del hipocampo.

Efectos del estrés sobre las células de la microglia.

Las células de la microglia representan la principal respuesta inmune cerebral,

ya que éstas responden al daño neuronal a través de diversos cambios en su

7

morfología que inducen una hiper-ramificación, estados reactivos y de macrófagos

cerebrales (Streit y col., 1999).

Aunque las celulas de la microglia poseen receptores para la hormona

liberadora de corticotropina (CRH), (Wang y col., 2002) y a CORT (Tanaka y col.,

1997) que participan de forma muy importante en el mecanismo de activación del

sistema HPA, el efecto directo de los glucocorticoides sobre la microglia ha sido poco

evaluado. Por ejemplo, se ha observado que la administración prolongada de CORT en

ratas adultas genera cambios en la proliferación de progenitores de oligodendrocitos

(Alonso, 2000) y más recientemente , se ha mostrado que la adrenalectomía (ADX)

genera una activación de la microglia que puede ser revertida con CORT (Moga y col.,

2005; Nichols y col., 2005). También han sido estudiados otros corticosteroides en

relación con las transformaciones de microglia. Por ejemplo: la dexametasona genera

cambios en la proliferación de la microglia ameboide en fetos de rata (Wang y col.,

1998). Además, se ha ob servado cambios morfológicos de la microglia con la

administración neonatal de cortisona, y respecto a la generación de isquemia (McRae y

col., 1996). En nuestro laboratorio, la administración crónica de prednisona produjo

cambios en la cantidad de microglia marcada en la corteza prefrontal, estriado e

hipocampo en grupos experimentales tratados con altas dosis del fármaco, en

comparación con el grupo control (Gonzalez-Castañeda y col., 2002).

La sobreactivación celular por el estrés crónico produce incrementos en los

niveles de glutamato, algunos estudios han mostrado activación microglial ante

incrementos de diferentes neurotransmisores (Streit y col., 1999), particularmente ante

la neurotoxicidad por exceso de glutamato (Gehmann y col., 1995) que desequilibra la

homeostasis celular, e incrementa las transformaciones citoplasmáticas de la microglia

(Gonzalez-Perez y c ol., 2001). Por último, los efectos de los corticosteroides sobre la

microglia no necesariamente son unidireccionales, pues se ha observado que pueden

actuar sobre éstas células gliales como estimulantes a través de mineraloreceptores, y

como inhibitorios a través de los glucorreceptores (Tanaka y col., 1997) y que la

exposición in vitro a Gc´s durante

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24 h se relaciona con su inhibición, pero la exposición más prolongada resulta en

excitación.

Efectos conductuales del estrés.

El aumento de corticosteroides inducido por el estrés produce deficiencias en el

aprendizaje y en la memoria (de Kloet y cols, 1999). En modelos con animales y en los

humanos, dependiendo de la intensidad y duración, el estrés produce alteraciones del

hipocampo y deficiencias en la memoria (Lupien y McEwen, 1997). Los corticosteroides

son responsables de esta relación, ya que a través de ellos los eventos estresantes

generan modificaciones sobre la estructura y la funcionalidad del hipocampo, como por

ejemplo, la atrofia de las dendritas apicales de las células piramidales de CA3, lo que

dificulta el aprendizaje espacial (Brown, y col., 1999).

Por ejemplo, se ha descrito que la corticotropina y los glucocorticoides facilitan la

memoria a dosis bajas, pero la impiden a dosis altas (McGaugh y cols, 1995). En

estudios con resonancia magnética de pacientes psiquiátricos y seniles en los que

existen anormalidades de corticosteroides se ha observado atrofia selectiva del

hipocampo, acompañada por deficiencias en la memoria declarativa (la capacidad

para recordar hechos o eventos con orden temporal), la memoria espacial (la

capacidad para recordar sitios específicos, recorridos y claves para guiarse en el

espacio) y la memoria contextual (la capacidad para recordar un conjunto de estímulos

como un evento espacial integrado) (McEwen, 2000).

La motivación para explorar ambientes ha sido otra de las consecuencias de la

alteración del eje HPA y del hipocampo, los receptores tipo I o MRs están relacionados

con el comportamiento exploratorio de nuevos ambientes y la conducta en laberintos

acuáticos, y los receptores tipo II e stán relacionados con efectos en la consolidación y

retención del comportamiento aprendido (Oitzl y col., 1994). Aunque ambos tippos de

receptores se activan con corticosteroides, los tipo I tienen mayor afinidad por ellos y

responden ante niveles normales de estas hormonas, mientras los tipo II se activan

principalmente ante el exceso de corticosteroides. Además, el

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deterioro del funcionamiento hipocampal reduce el aprendizaje, la memoria espacial y

la habilidad para explorar adecuadamente el ambiente (Raber, 1998).

El hipocampo juega un papel importante en las respuestas ante estímulos

novedosos. Al afectarse esta estructura se reduce la tendencia del animal a explorar

flexiblemente su ambiente y perseveran en ellos comportamientos previamente

adquiridos. La incapacidad para reaccionar a estímulos, es debido a los receptores

MRs los cuales están relacionados con el proceso de selección de respuesta, y por

tanto determinan el patrón de conducta generado por un nuevo ambiente.

Se ha observado que los niveles disminuidos de CORT provocan un mayor

tiempo de recorrido de la zona central en un ambiente novedoso y un mayor tiempo de

permanencia en la misma, mientras que los niveles normales de CORT (ocupación de

MRs) resultan en menores niveles de este patrón de exploración (Oitzl y cols., 1994).

Sin embargo, un exceso de CORT (ocupación de MRs y GRs) los vuelve a incrementar.

Al bloquearse los MRs, vuelve a resultar disminución de la conducta exploratoria

central. En esta prueba, el bloqueo de GRs no tuvo efectos significativos sobre el

patrón de exploración, tampoco impidió la consolidación de la información espacial, ni

la adquisición y evocaciónde la información aprendida, en cambio; el bloqueo de MRs

produjo un patrón de búsqueda alterado, al parecer la función de MRs está involucrada

con la elección de la respuesta conductual. El bloqueo de ambos tipos de receptores

alteró la navegación para el aprendizaje de lugar (Oitzl y de Kloet, 1992). En general,

los estudios al respecto sugieren que los glucocorticoides, a través de sus receptores

MR tienen una gran influencia sobre la conducta exploratoria ante eventos novedosos

(de Kloet y col., 1999).

Como puede observarse, el efecto de los GC´s en la respuesta frente al estrés

es bastante amplia, esta activación hormonal interactúa de manera compleja a trávés

de neuronas y células gliales en el SNC con otro tipo de moléculas que han sido

denominadas neuroesteroides, los cuales pueden funcionar como anti-

glucocorticoides.

10

Origen y efectos de los neuroesteroides sobre el sistema nervioso.

Los neuroesteroides son compuestos sintetizados en el sistema nervioso central

y periférico, tanto en las neuronas como en las células gliales, a partir del colesterol o

de precursores esteroideos importados de fuentes periféricas (Baulieu y col., 2001). En

el sistema nervioso central (SNC) existe como fuente de ellos, una concentración

elevada de colesterol (Clemens y Weaver, 1985), independientemente de la actividad

sintética de glándulas endocrinas p eriféricas (Hu y col., 1987; Baulieu y Robel 1990;

Akwa y col., 1993a; Kabbadj y col., 1993).

La conversión de colesterol está catalizada por la enzima citocromo P450scc,

localizada en la membrana interna mitocondrial de los tejidos esteroidogénicos, y el

colesterol debe ser trasladado hasta el interior de la mitocondria para que pueda

sintetizarse la pregnenolona, -primera molécula en la síntesis de hormonas esteroides

(Costa y col., 1994; Brown y col., 1979). En diferentes estructuras sus concentraciones

pueden variar de acuerdo a circunstancias ambientales y comportamentales tales

como la presencia de estrés, reconocimiento sexual o agresividad (Baulieu y col.,

2001).

Los neuroesteroides actúan mediante el mecanismo cl ásico de acción de las

hormonas a través de receptores nucleares, modulando canales iónicos y actuando

sobre receptores en la membrana plasmática al GABA A, glicina y glutamato (Baulieu y

col., 2001; Majewska y col., 1986; Lambert y col., 1987; Puia y col., 1990; Akwa y col.,

1991; Wu y col., 1990; Wu y col., 1991; Majewska, 1992). También tienen una

influencia importante sobre los receptores sigma1 que modulan la movilización

intracelular y el flujo extracelular de calcio, asi como las respuestas mediadas por

NMDA, la liberación de acetilcolina y la alteraciónde sistemas monoaminérgicos. A

nivel comportamental, estos receptores están involu crados con el aprendizaje y la

memoria, la respuesta de estrés, la depresión, la neuroprotección y la

farmacodependencia (Maurice y col., 2001).

Los efectos regulatorios de los neuroesteroides sobre los receptores a

neurotransmisores constituyen un medio de comunicación vital entre el cerebro y el

11

resto del cuerpo; origen de numerosos fenómenos psico-fisiológicos. La síntesis

alterada de esteroides centralmente activos puede contribuir a defectos de la

neurotransmisión, causantes de diferentes trastornos (Majewska y col, 1986; Majewska

1992). En general, pero tambien de manera dependiente del contexto celular, las

formas ésteres de ácidos grasos de neuroesteroides ejercen efectos inhibitorios

mientras que sus derivados sulfatados efectos excitatorios (Baulieu y Robel 1990;

Akwa y col., 1993a; Kabbadj y col., 1993; Baulieu, 1981, 1991).

Han sido descritos numerosos neuroesteroides (Baulieu y Robel, 1990; Baulieu,

1991), pero los principales especies son compuestos polares (Garcia-Segura y col.,

1994), entre los más importantes están la pregnenol ona (PREG), progesterona

(PROG) y dehidroepiandrosterona (DHEA), -progenitores de muchos otros esteroides

(Baulieu, 1981).

La DHEA es un esteroide adrenal, su derivado hidrofílico sulfatado (DHEAS) es

el más abundante en la circulación sanguínea de hum anos y primates, y posee gran

actividad en los tejidos diana periféricos como las gónadas, donde sirve como

precursor para la formación de andrógenos y estrógenos (Ebeling y Koivisto, 1994;

Hennebold y Daynes, 1994; Luu y col., 1995). Además , la DHEA es conocida por sus

efectos funcionales en el SNC, incluyendo la estimulación de la memoria y el

aprendizaje, efectos neurotróficos y neuroprotectores (Wang y col., 2001).

Otro de los efectos benéficos de los esteroides, particularmente de la PROG, es

su capacidad para inhibir el desarrollo de edema cerebral tras isquemia (Olmos y col.,

1989; Naftolin y col 1993); reducen la permeabilidad de la barrera hemato-cerebral y

bloquean el transporte activo de sodio por capilares cerebrales in vitro (Koenig y col.,

1995; Betz y Coester, 1990a). PREG y DHEA son precursores de hormonas sexuales y

esteroides neuroprotectores, y los efectos de ambas pueden estar mediados

parcialmente por su conversión a testosterona y estradiol gracias a la enzima

aromatasa. Esta enzima es inducida en astrocitos reactivos luego de distintas formas

de lesiones neurodegenerativas, y resulta una producción local aumentada de

estradiol, que tiene propiedades neuroprotectoras (Veiga y col., 2003).

12

En términos generales, el sistema nervioso incrementa la producción de

esteroides como un mecanismo para bloquear condiciones neurodegenerativas. Este

mecanismo es el resultado de la interacción coordinada entre las neuronas y la glia.

Los esteroides producidos por la glia regulan la función sináptica, modulan la ansiedad,

la cognición, el sueño y el comportamiento, al mismo tiempo que ejercen

neuroprotección. Adicionalmente, las células gliales son diana de los esteroides y

regulan algunos de los efectos de estas moléculas sobre las neuronas, incluyendo la

supervivencia y regeneracón (Garcia-Ovejero y col., 2005).

Relación de los neuroesteroides con las células gli ales.

En el cerebro de la rata los astrocitos y oligodendrocitos sintetizan y

metabolizan neuroesteroides (Hu y col., 1987; Akwa y col., 1993b; Kabbadj y col.,

1993; Majewska, 1992; Kleinrok y col., 1994; Zwain y Yen, 1999). En el sistema

nervioso periférico (SNP) las células de Schwann también sintetizan pregnenolona,

independientemente de la edad y del sexo (Morfin y col., 1992).

La biosíntesis de neuroesteroides está regulada po r un complejo receptor

mitocondrial hetero-oligomérico, con sitios de reconocimiento de alta afinidad para las

carboxamidas de isoquinolina, las imidazopiridinas, benzodiacepinas y las 2-aril-

indolacetamidas (Morfin y col., 1992). Este complejo se expresa abundantemente en

las células gliales y tiene un ligando endógenoputativo, el péptido inhibidor de unión a

diazepam, que también es abundante en células gliales donde estimula la

esteroidogénesis (Morfin y col., 1992; Korneyev y col., 1993),

En general, los astrocitos parecen ser las células más importantes en la

expresión de esteroides en el SNC, en especial de PROG y DHEA (Zwain y Yen,

1999). Pueden liberar progesterona y una gran variedad de neuroesteroides a las

células vecinas, y ejercen un efecto modulador sobre el sistema nervioso -resultante

de las interacciones neurona-glia. La progesterona, participa de modo muy importante

en la plasticidad sináptica que ordinari amente se produce en el hipotálamo a través

del ciclo ovárico (Akwa y col., 1993b), y en modular la

13

reorganización del citoesqueleto astrocitario en respuesta a otras hormonas gonadales

(Pérez y col., 1993; Luquín y col., 1993).

Una vez liberados los neuroesteroides, estos afectan también el

comportamiento de las células gliales. Se ha observado por ejemplo un efecto

inhibitorio de la PROG y la DHEA sobre los astrocitos, ya que DHEA aplicada de

manera crónica y aguda impide el incremento en la expresión de GFAP, que

normalmente se produce por la denervación del bulbo olfatorio (Hoyk y col., 2004),

además in vitro, la DHEA disminuye la proliferación astroglial (Bolota y col., 1987). Sin

embargo, la administración del neuroesteroide a ratas recién nacidas, produjo un

incremento a largo plazo en el tamaño y la cantidad de astrocitos GFAP-

inmunoreactivos en el hipocampo, antes y después de la pubertad (Shirayama y col.,

2005). Por su parte, la PROG inhibió el crecimiento astrocitario in vitro (Jung y col.,

1992) y se observó inhibición de astrogliosis y déficit funcionales luego de lesiones

cerebrales (Djebaili y col., 2005), probablemente a través de sus acciones sobre la

respuesta de células inflamatorias (Grossman y col., 2004) gracias al efecto de varios

de sus metabolitos (Ciriza y col., 2004).

En cuanto a la microglia, la DHEA in vitro tuvo efectos inhibitorios sobre células

microgliales y su respuesta inmunológica (Wang y col., 2001), además, inhibió la

viabilidad celular de células de microglia, en proporción inversa a la cantidad de

glucosa en el medio de cultivo (Yang y cols., 2000). In vivo; la DHEA redujo la

activación microglial en el sistema dopaminérgico nigroestriado de ratas (Tomas-

Camardiel y col., 2001). Asimismo, se observó un efecto inhibitorio en algunas de las

proteínas sintetizadas, tales como el componente interferón gama de la respuesta

microglial (Bargers y col., 2000) y el factor de necrosis tumoral TNF en astrocitos y

microglia (Di Santo y col., 1996). Por su parte la PROG no inhibió las respuestas

inmunes de la microglia (Bruce-Keller y col., 2000), pero si impidió su transformación

(Fujita y col., 1996), sin embargo; en estudios anteriores se observó que la PROG no

tuvo efecto sobre cultivos mixtos de astrocitos y microglia, pero inhibió la proliferación

microglial en cultivos deestas células aisladas (Ganter y col.,

14

1992). Finalmente, DHEA y PROG redujeron la acumulación de tejido glial alrededor

de una lesión en el tejido nervioso (Garcia-Estrada y col., 1999).

Estrés y neuroesteroides.

El medio ambiente esteroideo del cerebro influencia su estructura y su función.

Asi pues, el estrés incrementa los niveles de glucocorticoides, y en diferentes regiones

cerebrales la concentración de neuroesteroides se modifica por su efecto (Majewska,

1992). La alteración en las concentraciones normales de neuroesteroides o de su

metabolismo provoca a su vez trastornos funcionales y tróficos en el sistema nervioso

(Baulieu EE. 1997, 1998; Robel y Baulieu, 1995).

En general, durante el estrés agudo puede observarse disminución de algunos

neuroesteroides, pero normalmente ocurre un aumento cuando el estrés es prolongado

(Obut y col., 2004). Además, puede suced er el efecto inverso, ya que algunos

neuroesteroides como la DHEA ejercen un efecto inhibidor sobre el incremento de

CORT producido por el estrés (Obut y col., 2002), en especial sobre el estrés crónico y

no el agudo (Obut y col., 2003).

El incremento de neuroesteroides debido al estrés ha sido observado en PREG

y PROG en la corteza e hipocampo de ratas ante la exposición a CO2

(Barbaccia y col., 1994; Shimada y col., 1998), en PREG y ALOP en la corteza frontal

de ratas expuestas a nado forzado (Vallee y col., 2000), en los niveles de PROG central

de crias ante la separación de la madre en ratas (Kehoe y col., 2000), en PREG pero no

de la DHEA ante estrés psicosocial (Shimada y Yago, 2000), y en los niveles generales

de neuroesteroides ante la combinación de estrés social crónico y choques eléctricos

(Serra y col., 2000).

Adicionalmente, las hormonas del eje HPA, CRH y ACTH incrementaron de

manera significativa los niveles de PREG y DHEA en el cerebro y sangre en ratas

(Torres y Ortega, 2003). Sin embargo, es posible encontrar también una relación

inversa entre los niveles de estrés y de neuroesteroides, ya que se ha observado que,

en ratas jóvenes recién destetadas sometidas a estrés por aislamiento social

15

durante 30 días, se produjo un decremento en la concentración de neuroesteroides en

plasma, corteza e hipocampo, al igual que un incremento en los niveles de CORT y

una disminución en la función de los receptores GABAA (Serra y col., 2000). Los

resultados opuestos pueden obedecer a la utilización de diferentes procedimientos

experimentales para la generación del estrés, sin embargo, lo más frecuente es la

relación del estrés con el aumento de neuroesteroides en el SNC.

En relación al estrés, la DHEA produce efectos neuroprotectivos al disminuir la

neurotoxicidad por análogos del glutamato y los cor ticoides, posiblemente actúa como

antiglucocorticoide (Herbert, 1998), pues se ha observado que protege las células

hipocampales en cultivo del daño inducido por estrés oxidativo (Bastianetto y col.,

1999), y del daño generado por la presencia de CORT (Kimonides y col., 1999) y

aminoácidos excitatorios (Kimonides y col., 1998) . El efecto anti glucocorticoide, se

infiere también de experimentos en los que la DHEA bloquea el incremento en la

actividad de la triptófano hidroxilasa en el mesencéfalo y corteza de ratas resultante del

estrés por ruido (Singh y col., 1994); antagoniza por ejemplo los efectos de la

inmovilización repetida sobre la pérdida de peso corporal, los niveles de GR´s en

glandulas adrenales y la generación de radicales libres (Hu y col., 2000) y provoca

efectos ansiolíticos en ratones, en el laberinto elevado en cruz (Melchior y Ritzmann

1994a). En contraposición, también se ha observado que aunque la DHEA fortaleció la

potenciación primaria hipocampal en ratas sin estrés, no tuvo este efecto benéfico en

ratas estresadas (Diamond y col., 1999).

Por su parte, la PROG tiene un papel ansiolítico ante diferentes situaciones de

estrés, el incremento en la expresión de mRNA para c-fos luego de estrés por

inmovilización fue menor en el hipocampo y corteza de ratas en proestro y estro, en

comparación con ratas en diestro y ratas machos, lo que sugiere que estas estructuras

son activadas diferencialmente por el estrés, dependiendo de los niveles de PROG

(Figueiredo y col., 2002). Además; la PROG inhibe de manera confiable las

consecuencias provocadas por la inmovilización, efecto que puede bloquearse por los

antagonistas de receptores a GABAA, (picrotoxina y bicuculina), pero no por el

antagonista de benzodiacepinas (flumazenil) (Reddy y Kulkarni, 1996).

16

A pesar de sus acciones ansiolíticas ante situaciones de estrés, también puede

generar efectos secundarios en individuos controles, esta hormona disminuyó el

consumo de alcohol en ratas estresadas por aislamiento social (Mediratta y col., 2003),

y en ausencia de estrés produjo un incremento del consumo total de líquidos.

Adicionalmente, la PROG inhibió la respuesta inmune humoral y celular frente a estrés

por inmovilización, pero por si misma suprimió esta respuesta en ratas no estresadas.

Este efecto compensatorio frente al estrés parece estar modulado por su acción sobre

receptores GABAA, pero su acción inmunosupresora requiere un mecanismo

alternativo en los sujetos no estresados (Mediratta y col., 2003).

En términos generales, el incremento en los niveles de neuroesteroides frente a

situaciones estresantes juega un papel importante en los mecanismos homeostáticos

que regulan la inhibición de los receptores GABAA durante la respuesta de estrés

(Higashi y col., 2005). Sin embargo; la disminución observada algunas veces en los

neuroesteroides por el estrés, puede deberse a una disminución en la actividad de el

eje HPA, como un mecanismo para reducir el incremento de GC´s (Serra y col., 2004).

17

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

En los vertebrados, el estrés eleva los niveles séricos de glucocorticoides (GC

´s) y estimula el eje hipotálamo hipofisiario (HPA) causando efectos adversos sobre el

SN, evidenciados por una reorganización en las regiones que poseen una alta

densidad de receptores a glucocorticoides, como el hipocampo. Las alteraciones

cerebrales pueden ser transitorias o permanentes, según afecten cerebros inmaduros

o adultos respectivamente. Los efectos son más severos cuando suceden durante el

desarrollo cerebral temprano y el hipocampo resulta especialmente afectado, puesto

que éste forma parte del sistema de retroalimentación negativa hacia el eje HPA y está

estrechamente relacionado c on la conducta exploratoria, la memoria explícita,

episódica y la memoria espacial, las cuales se afectan notablemente.

Por lo anteriormente descrito; analizar la reactividad astrocitaria y microglial en el

hipocampo de ratas, como consecuencia de la exposición crónica a estrés por

hacinamiento o ruido y bajo la influencia protectora de neuroesteroides progenitores

(progesterona ó dehidroepiandrosterona), liberados desde implantes subcutáneos.

Es el motivo del presente estudio en el cual también se analizaran las manifestaciones

cognoscitivas; expresadas por la conducta exploratoria, memoria y aprendizaje

espacial.

18

HIPÓTESIS

Los neuroesteroides progenitores progesterona ó dehidroepiandrosterona ejercen

efectos neuroprotectores en el hipocampo de ratas estresadas por hacinamiento o

ruido, y estos efectos benéficos se manifiestan sobre la citoarquitectura glial y el

comportamiento de los animales.

OBJETIVO GENERAL

Analizar el efecto del estrés por hacinamiento o ruido sobre parametros

conductuales y sobre la citoarquitectura glial en ratas macho adultas.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

1 Establecer los efectos del estrés por hacinamiento o ruido sobre el aprendizaje

espacial y la memoria de ratas adultas jóvenes, bajo la influencia

neuroprotectora de los esteroides neuroactivos progesterona ó

dehidroepiandrosterona.

2 Analizar los efectos del estrés en presencia y ausencia de neuroesteroides,

sobre la citoarquitectura glial de las zonas CA1, CA3 y DG del hipocampo de las

ratas.

19

DISEÑO EXPERIMENTAL

Sujetos de experimentación

Ratas macho Swiss-Wistar adultas con 2 meses de edad y 250 y 280 g de peso.

Grupos de estudio:

a) Grupo 1 (VEHI): ratas castradas con implante subcutáneo (sc) de un a cápsula

de silicona con aceite de sésamo (vehículo solo), (n =30).

b) Grupo 2 (PROG): ratas castradas con implante subcutáneo (sc) de un a cápsula

de silicona con progesterona (8 mg/rata), ( n =30) (Luquín-S y col., 1993).

c) Grupo 3 (DHEA): ratas castradas con implante subcutáneo (sc) de un a cápsula

de silicona con dehidroepiandrosterona, (8 mg/rata), (n=30).

Divididos en subgrupos de 10, los animales fueron sometidos a tres distintas

situaciones durante 10 días:

· Control (C): condiciones estándar de mantenimiento y ruido nor mal del bioterio

(30-40 dB).

· Hacinamiento (H): alojamiento en 45 cm2/rata en condiciones estándar de bioterio.

· Ruido (R): sometidas a estrés por ruido con tonos de ultrafrecuencia de 22 kHz

(USVs) y 80-90 dB de intensidad durante 8 h diarias.

20

· Descripción de variables:

a) Independientes:

Condición estresante (Hacinamiento o ruido).

Tipo de neuroesteroide liberado desde el implante subcutáneo (progesterona ó

dehidroepiandrosterona).

b) Dependientes:

Conducta exploratoria y memoria espacial.

Citoarquitectura de células gliales en las zonas CA1, CA3 y DG del hipocampo de

la rata.

Tipo de estudio:

Experimental

Longitudinal con cortes transversos

Cuantitativo.

21

Criterios de inclusión:

1. Ratas macho Swiss-Wistar con 2 meses de edad y 250-280 g de peso.

2. Ratas que se recuperaron satisfactoriamente de los procedimientos quirúrgicos

durante los experimentos.

Criterios de exclusión:

1. Animales que resultaron lesionados y/o que se infecten durante los diferentes

procesos experimentales.

Criterios de eliminación:

1. Cerebros que no se fijaron adecuadamente durante la perfusión intravascular.

2. Animales en los que se observó alguna patología durante el proceso de

perfusión.

3. Animales en los que no se localizó la cápsula de silicona en el espacio

subcutáneo dorsal, para la liberación prolongada del vehículo o los esteroides.

22

MATERIALES Y METODOS

Descripcion general del estudio.

Se utilizaron 90 ratas machos adultos Swiss-Wistar jóvenes con peso corporal

inicial de 250-289 g, mantenidas con ciclos de luz y oscuridad de 12:12 h, a 22 ± 3 °C

de temperatura, humedad relativa del ambiente entre 50 y 55%; alimentadas “ad

libitum” con dieta balanceada para roedores (Ralston-Rations USA) y agua potable. Se

utilizaron ratas macho para controlar las variaciones en los niveles de esteroides

generados por el ciclo reproductivo de las hembras. Las ratas fueron castradas para

evitar la interferencia de los esteroides gonadales sobre el experimento, ya que

muchos de ellos tienen la misma vía metabólica y pueden variar los niveles generados

por el implante. Se dejaron pasar 21 días post-castración antes de iniciar el estudio.

Ese día 21 se recolectó la orina total de 6 PM a 8 PM, para determinar los valores

basales de corticosterona, progesterona y DHEA mediante cromatografía de líquidos

(HPLC) (Fig. 1 del diseño experimental).

La totalidad de animales fueron distribuidos en grupos: Implante vehículo

(n=30), 2) implante de progesterona (n=30), 3) implante con DHEA (n=30). El vehículo

de difusión de las hormonas fue aceite de sésamo. En este se diluyeron las hormonas

(8 mg/rata). La mezcla se depositó en el nterior de cápsulas permeables de silicona

implantadas subcutáneamente (Gómez-Pinedo U. y col., 2001). El procedimiento

quirúrgico de implantación de las cáp sulas de silicona con vehículo o cada uno de los

esteroides se realizó bajo anestesia ligera por inhalación con cloroformo, tratando de

provocar el estrés mínimo a los animales (Gómez-Pinedo U. y col., 2001).

Divididos en grupos de 10, los animales fueron sometidos a tres distintas situaciones

durante 10 días.

1) Control: 10 ratas de cada tipo de implante estuvieron sometidas a en

condiciones de alojamiento de 240cm2/rata y con el ruido ambiental del

bioterio.

23

2) Hacinamiento: 10 ratas de cada tipo de implante fueron alojadas en una

misma jaula con un espacio de 45 cm2/rata y bajo las mismas condiciones

estándar de bioterio.

3) Ruido: 10 ratas de cada tipo de implante fueron sometidas a 8 h diarias

durante 10 días, a tonos de ultrafrecuencia de 22 kHz (USVs) y 80-90 dB de

intensidad. Un día antes y durante todo el periodo de estrés por ruido

Se recolectó para todos los grupos orina cada 48 h para la determinación de la

concentración de corticosterona por HPLC y los mismos esteroides con el método de

Juricksay y Telegdyde (2000) ligeramente modificado, para luego iniciar los estudios de

comportamiento.

Se determinó la ansiedad (comportamientos de autoprotección), excitabilidad

(cambios en los umbrales de respuesta motora ante la estimulación novedosa) y

conducta exploratoria (frecuencia y patrones de exploración del ambiente novedoso)

mediante la prueba del campo de agujeros durante un día (Hole-Board). Al día

siguiente se iniciaron los ensayos para determinar el aprendizaje espacial y la

retención de memoria, que duró 2 días utilizando elparadigma del laberinto acuático

modificado de Morris (Morris, 1984).

Posteriormente, los animales fueron inyectados con una dosis intra-peritoneal

(ip) subletal de pentobarbital sódico, y se hizo perfusión intracardíaca con

paraformaldehído para fijar su cerebro. Para ello, se hizo pasar solución salina

lavadora para eliminar el exceso de sangre, seguida por solución de paraformaldehído

al 4%. Posteriormente se realizó una craneotomía, se extrajeron los cerebros y se

colocaron en la misma solución fijadora durante 24 h. Se seleccionó el área del

hipocampo útil para los estu dios de microscopía, de la cual se tomó una sección la

cual fue procesada mediante latécnica histológica convencional (deshidratación,

aclaración) hasta su inclusión enparafina, a fin de obtener cortes de 20 µm de espesor.

Los cortes fueron destinados al procedimiento inmunocitoquímico con anticuerpos

dirigidos para la identificación de astrocitos (anticuerpos anti-GFAP), análisis

histoquímico de la microglia utilizando is olectina-B4 de Griffonia simplicifolia.

24

Diseño experimental

Castración

21días

Implantes

(8 mg hormona/implante)

n=30 VEHI n=30 PROG n=30 DHEA

7 7 7

día día día

Condiciones durante 10 días.

RECOLECCIÓN 10 controln= 30 10 hacinamientoDE ORINA

10 ruido

-70ºC

Prueba del campo de agujeros

Prueba del laberinto acuático de Morris

Perfusión

Análisis por Análisis de Análisis decromatografía citoarquitectura citoarquitectura

de líquidos microglial astrocitaria

Figura 1. Diseño experimental en diagrama de flujo.

25

Procedimientos quirúrgicos:

1. Castración:

Los animales fueron anestesiados por vía ip con pentobarbital sódico a una dosis

de 50 mg/kg de peso y se colocaron en decúbito dors al, en la zona de los conductos

deferentes se hizo una incisión lineal de 1 cm en la piel del escroto de cada testículo,

que se expulsó de su bolsa escrotal para liberar el epidídimo; se localizó el paquete

vascular y mediante hemostasia por trombosis se desprendió cada testículo. La herida

se cerró con 2 puntos de seda trenzada 3-0.

2. Implante subcutáneo de cápsulas de silicona.

21 días después de la castración los animales fueron anestesiados por inhalación

de cloroformo. Se afeitó el dorso y a nivel del espacio interescápulo-vertebral se hizo

una incisión cutánea longitudinal de 1 cm y bajo di sección roma con pinzas de

mosquito largas, (mediante movimientos repetidos de apertura y cierre) se formó un

túnel subcutáneo en el cual se colocó una cápsula d e silicona conteniendo el vehículo

o cada uno de los neuroesteroides disueltos en aceite de sésamo. La herida quirúrgica

fue cerrada mediante dos puntos separado s con seda 3-0. Al término del periodo de

prueba los animales fueron sacrificados por perfusión, asegurando la localización e

integridad del implante.

Las cápsulas de silicona fueron elaboradas con un t ubo semipermeable de silicona

(Sani-Tech) de 1.8 cm de longitud, 3.12 mm de diámetro interno y 3.92 mm de

diámetro externo, y rellenados con acite de sesa mo más los 8mg del esteroide

correspondiente, los extremos fueron sellados con pegamento de silicona de grado

médico (Medical Adhesive 8919). Con el propósito deasegurar la rápida liberación de

los neuroesteroides las cápsulas fueron preincubada s a 37º C en solución salina al

0.9% (sigma S-9625) con 0.01% de albúmina sérica bovina para lograr la saturación de

las paredes y bajo agitación suave durante 12 h.

26

Cromatografía de líquidos.

La cuantificación de los neuroesteroides corticosterona, progesterona y DHEA

se realizó a partir de los valores resultantes de una curva de estandarización con

niveles conocidos de estas hormonas disueltas en metanol, mediante determinación

cromatográfica de sus tiempos de retención y el áre a bajo la curva de sus respectivos

picos. El análisis de correlación de las concentraciones del estándar y el área bajo la

curva de los picos arrojados por el cr omatógrafo, permitió la determinación de una

línea del mejor ajuste con una ecuación lineal cuyos valores de pendiente y cruce con

el eje de las ordenadas sirvieron para convertir los valores del área bajo la curva de los

picos de las muestras, en valores de concentración expresados en ng/l. El

procedimiento de extracción y medición de los esteroides para cuantificación de la

corticosterona en orina se llevó a cabo siguiendo el procedimiento descrito por

Juricksay y Telegdyde (2000) modificado de la siguiente manera: se hizo pasar 1 ml de

la orina a través de un cartucho de extracción C18 (Waters Assoc., Milford, MA USA)

para retener los esteroides, estos fueron eluidos, es decir, extraídos del cartucho en

viales de vidrio con tapa recubierta de teflón utilizando 5 ml de metanol, este fue

evaporado mediante una corriente de nitrógeno en baño de 40-45 ºC y se agregó

tampón acetato pH 4.6. Esta solución se incubó con 50 l de la enzima glucoronidasa

de Helix Pomatia (Merck KGsA, Darmstadt, Germany) a 37 ºC durante 48 h. Una vez

completada la incubación esta solución nuevamente se pasó a través de cartuchos de

extracción C18 y los esteroides fueron nuevamente eluídos con 5 ml de metanol. Por

último se concentró el volumen bajo corriente de nitrógeno hasta 100 l. De esta

muestra se extrajeron 10 l que se introdujeron automáticamente a través de una

microi nyección, en el cromatógrafo de líquidos.

Se corrieron las muestras en una columna no polar (Altech) CP SIL 5CB de

30mm x 0.32 x 0.25 m, para aminas, hidrocarburos, pesticidas, fenoles y compuestos

sulfurados. La temperatura fue de 30 ºC, El tiempo total del corrimiento fue de 35 min.

27

Comportamiento animal.

1. Actividad exploratoria en el campo de agujeros:

Para evaluar la actividad exploratoria de un animal en un ambiente novedoso,

así como la excitabilidad y ansiedad se utilizo el campo de agujeros, el cual es un cubo

hueco de acrílico negro de 60x60x60 cm. 5 cm por encima del piso de la caja está una

plataforma (tabla de agujeros) con 36 aguj eros de 3.5 cm de diámetro, repartidos en

una matriz de 6x6 (ver fig.2). La tabla de agujeros está dividida por una línea

imaginaria en una sección periférica (la línea de agujeros del perímetro de la tabla), y

una central de 4x4 agujeros. Para iniciar la prueba, el animal se puso en el centro de la

tabla de agujeros y durante 10 min. fue video-filmado su comportamiento, para

posteriormente registrar los siguientes parámetros a través del software del analizador

RatMove (patente en trámite ):

---Tiempo en que el animal permanece en el área cen tral o en el área periférica de la

tabla,

- Tiempo total de movimiento e inmovilidad,

- Número de agujeros centrales, periféricos y totales visitados,

- Frecuencia relativa de visitas (número de visit as por minuto de movimiento).

- Distancia recorrida

- Velocidad promedio de la distancia recorrida

28

Fig. No.2 Campo de agujeros (Hole Board).

Se consideró visitado un agujero cuando la rata introdujo su cabeza hasta que

la superficie de la tabla le ocultó los ojos (Lordi y col, 2000). Todos los sujetos

realizaron la prueba el mismo día entre las 9:00 y las 11:00 h.

2. Laberinto acuático de Morris:

Para medir la capacidad del individuo para modificar su comportamiento, a partir

de la experiencia con estímulos espaciales se uso el laberinto de Morris el cual

consiste de una piscina circular con 180 cm. de diá metro y paredes con 37 cm. de

altura pintada de negro y dividida en cuatro cuadrantes imaginarios, ésta se llenó con

agua (20 ± 3 ºC), hasta una altura de 25 cm. y en su interior fue sumergida una

plataforma de escape cilíndrica de color negro con 12.5 cm. de diámetro y 22 cm. de

29

altura (invisible para la rata) y esta tuvo una ubicación fija en uno de los cuadrantes

durante todo el experimento (Fig. 3). La tarea consistió en que la rata debía nadar en el

laberinto hasta localizar la plataforma, las primeras veces por accidente; sin embargo,

en las sesiones posteriores debía reconocer su sitio de ubicación para poder

localizarla, en este caso; con la ayuda de indicadores visuales, a manera de claves

espaciales externas. Las funciones cerebrales implicadas para ejecutar esta tarea

dependen básicamente de la actividad hipocamp al.

Para este estudio se siguió la metodología descrita por de Quervain, Roozendaal

y McGaugh (1998) con ligeras modificaciones. Los experimentos están basados en dos

tipos de ensayos; uno de entrenamiento y otro de prueba. El ensayo de entrenamiento

consistió en depositar la rata en el agua desde uno de los cuatro sitios de partida de la

periferia (uno por cada cuadrante) y esperar hasta un máximo de 60 s para que

encontrara la plataforma. El tiempo desde que la rata fue depositada en el agua hasta

que localizó la plataforma fue considerado como latencia de escape y su latencia

máxima fue de 60 s , si una vez completado este tiempo no localizaba la plataforma

oculta se le guió hasta ella y allí se le dejó permanecer durante 20 s. Enseguida la rata

fue retirada, secada y se le dejó permanecer en la caja con los otros animales durante

30 s, mientras empezaba el siguiente ensayo, y así sucesivamente; hasta completar 8

ensayos consecutivos para cada rata ese mismo día, distribuyendo de manera

balanceada los sitios de partida entre los cuatro cuadrantes, de manera que cada rata

inició su navegación dos veces desde cada cuadrante, sin seguir un patrón ordenado.

Además de la latencia de escape, durante el entrenamiento fue registrado el tiempo

que la rata navegó en el cuadrante donde se encuentra la plataforma, en el cuadrante

opuesto, su velocidad y la distancia recorrida.

Para el ensayo de prueba fue retirada la plataforma y se introdujo a cada sujeto

una vez en la piscina, en un cuadrante lateral (ni el de la plataforma, ni el opuesto). Se

le permitió nadar durante 60 s. y fue retirado del laberinto. Fue registrado el tiempo

que la rata permaneció navegando en el cuadrante donde estuvo

30

la plataforma y en el cuadrante opuesto, la distancia recorrida y la velocidad promedio,

así como las veces que cruzó el sitio donde se encontraba la plataforma. La prueba se

llevó a acabo 24 h después del último ensayo de entrenamiento, entre las 7:00-10:00

am., fue videofilmada y posteriormente calificada por el sowftware de RatMove.

Diámetro 180 cm.

Plataforma

de escape

Profundidad Nivel de agua 25 cm.

37 cm

I III

II IV

Fig. No.3. Laberinto Acuatico de Morris.

31

Histología del Hipocampo

Los animales fueron anestesiados mediante una dosis subletal ip de

pentobarbital sódico (50 mg/kg). Se les practicó toracotomía amplia para exponer el

corazón, a nivel torácico se pinzó la arteria aorta descendente y después de seccionar

la aurícula derecha, a través del ventrículo izquierdo, bajo presión de una columna de

120 cm3 de agua y a temperatura corporal (37°C) se hizo pas ar durante tres min. 150

ml de una solución de lavado compuesta por 0.9% de cloruro de sodio con 10,000 UI

de heparina y 1 gr de procaína/litro.

Después de hacer pasar la solución de lavado, el cerebro fue perfundido con

200 ml de una solución de paraformaldehído al 4% en amortiguador fosfato 0.1M pH

7.3. Posteriormente se realizó la craneotomía y el cerebro se postfijó en la misma

solución fijadora por 24 h a 4 °C. Los tejidos fuer on deshidratados en una serie de

alcoholes de concentración creciente y posteriormente fueron incluidos en parafina

para realizar cortes coronales de 20 m.

Análisis inmunocitoquímico para cuantificar proliferación microglial yastrocitaria.

A fin de analizar los efectos del estrés y los neuroesteroides, sobre la citoarquitectura

glial de las zonas CA1, DG y CA3 del hipocampo de la rata, se realizaron los

siguientes procedimientos:

De los cerebros parafinados, provenientes de ratas sacrificadas al finalizar la

prueba de retención de memoria (20 días después de colocar los implantes) fueron

obtenidos cortes coronales seriales de 20 µm de espesor del hipocampo dorsal

comprendidos entre 4.0 y 7.0 mm anterior a lambda (Paxinos y Watson, 1982).

Para la prueba inmunocitoquímica, todos los anticuerpos (ac) fueron disueltos

en una solución tampón de fosfato salino (PBS) 0.1 M pH 7.3 con 1% de albúmina

32

sérica bovina y 0.2% de Tritón X-100. Esta misma solución fue utilizada para todos los

lavados del tejido que se hicieron después de cada etapa de incubación.

1. Cuantificación de la microglia.

Para la identificación de la microglia se utilizó solectinaI-B4 (griffonia

simplicifolia) acoplada con peroxidasa, en dilución de 10x10-4 mg/ml, disuelta en PBS

(1:100). Se inactivaron las peroxidasas endógenas mediante incubación de los cortes

en 10% de metanol disuelto en PBS, con 0.3% de H2O2 durante 20 min a temperatura

ambiente, luego los tejidos fueron lavados mediante cambios con PBS (2x5 min). Después se incubaron durante 10 min en una solución tampón catiónica (cloruro de calcio 0.1 mM, cloruro de magnesio 0.1 mM y cloruro de manganeso 0.1 mM). Los

tejidos fueron incubados con la isolectina-B4 durante 18-20 h a 4 ºC con movimientos

suaves y en la oscuridad. Al finalizar la incubación las preparaciones fueron lavadas en PBS (3x15 min). El revelado de la reacción se hizo mediante ncubación de los cortes

en una solución compuesta por 0.03% de 3´3-diaminobencidin (DAB), 0.1% de H2O2, y

sulfato de níquel al 1% durante 10-15 min para formar un precipitado visible de color purpura.

2. Análisis de la astrogliosis.

Para el marcaje de la proteína acídica fibrilar glial (GFAP), presente en los

astrocitos y que por lo tanto permite observarlos, el ac primario fue policlonal generado

en conejo contra GFAP de bovino (inmunógeno) en dilución 1:800, la incubación se

realizó durante una noche a 4°C, el ac secundario (ac de enlace) fueron IgG generadas

en cerdo contra IgG de conejo en dilución 1:250 y la incubación fue durante 2 h a

temperatura ambiente. Los tejidos luego fueron incubados en el complejo PAP de

conejo en dilución 1:250 durante 1.5 a 2 h a temperatura ambiente y en la oscuridad. El

producto de la reacción tisular se reveló con una solución de DAB-H2O2 al 0.07% y

0.1% respectivamente, durante 10-15 min (coloración marrón).

33

Durante el estudio, los cortes de tejido fueron montados sobre portaobjetos y se

cubrieron con una película de “parafilm” para formar un lecho capilar que distribuya

uniformemente la solución y evite la evaporación. Finalmente los cortes se

deshidrataron en series crecientes de alcohol y se montaron con Entellan (Merck) para

su análisis con microscopía de luz.

1 Análisis de la reactividad glial.

1. Cuantificación estereológica de la población gli al.

Para la cuantificación del número de células gliales en las estructuras

hipocampales se utilizó el método del fraccionador óptico modificado de West, (1999).

El conteo fue ejecutado en uno sólo de los hemisferios del hipocampo. Cada 40 cortes

(factor 1 = número de cortes entre muestr eo f1=40). Se muestrearon campos de

observación con un área de 61900 m² (área de campo) en el analizador óptico Leica

Q5001W (Leica Imaging Systems, Ltd. Cambridge, UK) conectado al microscopio de

luz. De esta área se contaron las cé lulas de un área de 22500 m² (área de conteo).

Cada área de campo inicial fue al eatoriamente seleccionada y el tamaño del

desplazamiento de un área de campo a otra se determinó por movimientos de x=150

m, y=150 m. La fracción contabilizada será entonces un factor f2 = área de campo/área de conteo.También es necesario tener en cuenta la altura del disector del

microscopio hdis = 15m para obtener un tercer factor f3 = ancho del corte/hdis. Se

obtuvo entonces la sumatoria de células contadas ΣC, y se multiplicó por los tres

factores fraccionados f1, f2 y f3 (Ntotal= ΣC f1 f2 f3) para obtener el número estimado de

células por área en uno de los h emisferios.

2. Análisis de transformación citoplasmática astrocitaria.

Se analizaron 400 células por área cerebral para c ada grupo con ayuda de

una rejilla estereológica según el método de conteo puntual de Weibel (1979).

34

Dibujada en el analizador de imágenes, la rejilla c onsistió en cinco círculos

concéntricos con 90 m de separación entre ellos. Se fijó el núcleo de la célula en el

centro de los anillos, y se contaron los cruces que sus prolongaciones (en un solo

plano de foco) tengan con los anillos, en la medida en que sean continuas (Fig. 4).

Cuando la prolongación citoplasmática se interrumpe, se realiza el conteo hasta dicha

interrupción.

Fig. No. 4. Método de conteo puntual de Weibel (Rejilla de Weibel).

35

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Los resultados obtenidos de las diferentes técnicas cuantitativas fueron

analizados con la prueba estadística de ANOVA de doble vía para comparar todos los

grupos entre sí, seguida de la prueba de Tukey para las comparaciones post-hoc de

los valores de medias, con un nivel de confianza de p<0.05 para definir como

significativas las diferencias. Adicionalmente, aquellas variables dependientes que

mostraron una interacción significativa entre los factores analizados, fueron sometidas

a pruebas t de Student entre pares de medias para analizar más específicamente los

cambios significativos. Dado el alto número de combinacione s de parejas entre

grupos para las comparaciones t post-hoc, se tomó como nivel de significancia un

p<0.01 para esta última prueba.

36

RESULTADOS

Liberación de las hormonas en los implantes

La liberación de las hormonas contenidas en los implantes subcutáneos fue

determinada a través de cromatografía líquida de alta precisión (HPLC) para

progesterona (PROG) y dehidroepiandrosterona (DHEA) en muestras de orina

recolectadas cada 24 h durante 10 días (Fig. 5). Los resultados de PROG indican que

hubo una liberación constante y estable de la hormona a niveles muy superiores

comparada con los niveles de grupos con implante DHEA o vehículo (VEHI) (Ver gráf.

1A). El análisis estadístico mostró un fuerte impacto del factor Implante p=0.000 y el

factor de grupo p=0.000, (p≤0.001), el cual no fue observado para la interacción

(p=0.002). De manera similar, la cuantificación de DHEA arrojó niveles muy superiores

de esta hormona en los grupos implantados con la misma, en comparación con los

grupos implantados con PROG o VEHI (gráf. 1B). Igualmente, la significancia del

impacto del factor implante fue bastante alta p=0.000 y el factor grupo p=0.000 y la

interacción no tuvo impacto significativo p=0.002 (p≤0.001).

Figura 5. Recolección de la muestra urinaria

37

A PROGESTERO NA .CP Implante = 0.000HP

Grupo = 0.000RP

500 Vehiculo Interacción= 0.002

400

Urin

aria

300de

Pro

gest

eron

a

200

ng/u

l

100

0

0 2 4 6 8 10

Tiempo (días)

B VEHIDHEA

Implante = 0.000CID Grupo = 0.000

500 HID Interacción= 0.002RID

400

Urin

aria 300

200

DH

EA

ng/u

l de 100

0

-100

0 2 4 6 8 10

Tiempo (días)

Gráfica No.1. Niveles urinarios de hormonas de losimplantes utilizados, a lo largo de los días de estrés. El eje Y indica los niveles urinarios de la hormona en ng/ul, y el eje X los días durante los cuales se llevó a cabo la exposición al estrés. Los resultados indican niveles estables de liberación de PROG (A) y DHEA (B), significativamen te superiores en comparación con los grupos con implantes vehículo quienes mostraron cantidades insignificantes de la hormona respectiva. Los nombres de los grupos están abreviados según e l tipo de condición estresante y el tipo de implante*. Las barras indican el intervalo de confianza del 99%.

* CIV: Control Implante Vehículo; CIP: Control Implante Progesterona; CID: Control Implante DHEA; HIV: Hacinamiento Implante Vehículo; HIP: Hacinamiento Implante Progesterona; HID: Hacinamiento Implante DHEA; RIV: Ruido Implante Vehículo; RIP: Ruido Implante Progesterona; RID: Ruido Implante DHEA.

38

Cuantificación de los niveles de corticosterona uri narios.

La corticosterona (CORT) urinaria fue cuantificada con HPLC para evidenciar

los niveles de estrés de cada uno de los grupos. El factor de grupo mostró un impacto

significativo p=0.000 (p≤0.001) en todos los días de estrés, lo cual demuestra la

efectividad de los estímulos estresantes. En los grupos control no se dieron diferencias

significativas entre los diferentes tipos de implante, p=0.999 lo cual indica que los

grupos sin estrés mantuvieron niveles basales de CORT independientemente del tipo

de implante subcutáneo utilizado en ellos (gráfica 2A). En contraste, en los grupos de

hacinamiento fue posible observar como el grupo VEHI mostró un incremento de los

niveles de CORT en los días 8 y 10 que fue prevenido por los implantes hormonales en

los otros dos grupos PROG y DHEA, los cuales mantuvieron niveles basales de CORT

(gráf. 2 B y 2C). En el análisis estadístico se observó que los niveles de CORT fueron

significativamente superiores en el grupo de hacinamiento con implante VEHI en

comparación con PROG y DHEA, y significativamente superiores que los grupos

control en los días 8 y 10 (p≤0.001).

A Control500

CIVCIP

ng/u

l 400 CID

Urin

aria

300

Cor

ticos

tero

na

200

100

0

0 2 4 6 8 10Tiempo (días)

Gráfica No. 2A. Niveles urinarios de CORT a lo largo de los días de estrés. Los grupos control

(grupos no estresados) no mostraron diferencias significativas en sus niveles de CORT a pesar

de los diferentes implantes. El eje Y muestra los niveles de CORT urinaria expresados en ng/ul, y el

eje X los días durante los cuales se llevó a cabo la exposición al estrés.

39

B Hacinamiento500

HIV

ng/u

l 400HIPHID

Urin

aria

300* *

Cor

ticos

tero

na

200

100

0

0 2 4 6 8 10Dias

Gráfica No. 2B. Niveles urinarios de CORT a lo largo de los días de estrés en los grupos de

hacinamiento. Se observan niveles basales de CORT en grupos implantados con PROG y DHEA

en comparación con el grupo implantado con VEH I, en el cual el hacinamiento generó un

incremento significativo de CORT a partir del día 8. El eje Y muestra los niveles de CORT urinaria

expresados en ng/ul, y el eje X los días durante los cuales se llevó a cabo la exposición al estrés .

C Ruido500 RIV *

RIPRID

ng/u

l 400 * *

Urin

aria

300 **

Cor

ticos

tero

na

200

100

0

0 2 4 6 8 10Dias

Gráfica No. 2C. Niveles urinarios de CORT a lo largo de los días de estrés en los grupos sometidos a ruido. El grupo implantado con VEHI mostró un incremento inmediato de los niveles de CORT que se mantuvo constante. En contraste, para los grupos implantados con PROG y DHEA se observó un retardo en dicho incremen to y una disminución de los niveles de CORT hacia el final del periodo de estrés. El eje Y muestra los niveles de CORT urinaria expresados en ng/ul, y el eje X los días durante los cuales se llevó a cabo la exposición al estrés.Las barras indican el intervalo de confianza del 95%.

CIV: Control Implante Vehículo; CIP: Control Implante Progesterona; CID: Control Implante DHEA; HIV: Hacinamiento

Implante Vehículo; HIP: Hacinamiento Implante Progesterona; HID: Hacinamiento Implante DHEA; RIV: Ruido Implante

Vehículo; RIP: Ruido Implante Progesterona; RID: Ruido Implante DHEA.

40

De manera similar, de acuerdo al análisis post-hoc para el factor de implante, en

los grupos de ruido se observó un incremento de CORT en el grupo VEHI en

comparación con los grupos con hormonas PROG y DHEA los días 0 y 10 (p≤0.001).

Esto indica que los implantes hormonales retrasaron el incremento de CORT, que se

produjo a partir del día 2, y que redujeron los niveles del glucocorticoide hacia el final

del periodo de estrés en el día 10. El mismo anális is para el factor de grupo, mostró

que estos niveles de CORT eran significativamente superiores para los grupos de ruido

comparación con los grupos controles los días 4, 6 y 8 (p≤0.001), y en comparación

con los grupos de hacinamiento los días 2, 4 y 6 (p≤0.001).

Laberinto Acuático de Morris.

Con esta prueba se evaluaron las habilidades en el comportamiento de las ratas

con respecto al aprendizaje espacial durante la fase de entrenamiento y la memoria

espacial, es decir su capacidad para retener el aprendizaje, durante la fase de prueba.

El entrenamiento

Durante la fase de entrenamiento de todos los grupos independientemente del

tipo de implante y la condición estresante a la que fueron sometidos, mostraron una

ejecución similar en la que se observaron curvas de aprendizaje apropiadas para el

desempeño de la prueba en cuanto a su latencia de escape, tiempo de nado en el

cuadrante de la plataforma y en el cuadrante opuesto. No se encontraron diferencias

significativas en cuanto a las medidas de distancia recorrida y velocidad promedio. La

ausencia de impacto de los factores de grupo e implante, así como de la interacción

entre los mismos, sugiere que las condiciones estresantes y los implantes no tuvieron

un efecto importante sobre el aprendizaje espacial.

41

La prueba

En la fase de prueba, se encontraron efectos importantes del factor de implante

y de la interacción de ambos factores (Gráfica 3). La prueba post-hoc mostró que en

términos generales el efecto del factor implante es atribuible a que los grupos con

progesterona tuvieron medias significativamente superiores a VEHI (p≤0.001) y DHEA

(p≤0.001). Las comparaciones directas entre los grupos independientes efectuadas a

través de la prueba t mostraron que los grupos con implante VEHI expuestos a

hacinamiento y ruido, tuvieron un decremento en su capacidad de consolidación de

memoria espacial en situaciones de estrés, en comparación con los individuos del

grupo control (p≤0.001), evidenciada por una menor cantidad de cruces con el área

donde se encon traba la plataforma durante el entrenamiento. Sin embargo, los grupos

con PROG en las mismas situaciones de estrés, mantuvieron un puntaje de cruces con

la plataforma similar al del control, que fue significativamente superior al de los grupos

con el mismo tipo de estrés pero con implante VEHI. Esto sugiere un efecto protector

de PROG sobre las alteraciones de la memoria espacial que puede producir el estrés,

ya que además no se observaron efectos de PROG sobre el grupo control en

comparación con VEHI.

Los grupos estresados expuestos a DHEA por el contrario, mostraron puntajes

similares a los de VEHI, es decir, que la hormona no tuvo un efecto sobre su

capacidad para recordar la ubicación de la plataforma; pero además, la DHEA

disminuyó esta habilidad en los sujetos en condiciones de control, es decir que por si

sola tuvo un efecto inhibitorio sobre la memoria espacial (gráf. 3).

42

Prueba de MorrisCruces con la plataforma

3,0Control Grupo p=0.002Hacinamiento Implante p=0.000Ruido Interacción p=0.001

2,5

* *

2,0

Frec

uenc

ia * *

1,5 * *

1,0*

*0,5 *

0,0

VEHI PROG DHEA

Gráfica 3. Frecuencia de cruces con el área de la plataforma durante la fase de prueba delLaberinto Acuático de Morris.El estrés deterioró la ejecución de los grupos H y R con implante VEHI. Esta situación fue impedida con el implante P ROG, que mejoró la ejecución en las situaciones de estrés sin afectar la del grupo control. DHEA disminuyó los puntajes basales del grupo control y no mostró efectos sobre los grupos estresados en comparación con VEHI. El eje Y muestra la frecuencia absoluta de ocasiones en las que durante la fase de prueba, las ratas pasaron por el lugar donde previamente se encontraba la plataforma. El eje X muestra los grupos sometidos a distintos tipos de estrés e implantes hormonales. Las barras señalan el error estándar.

Campo de agujeros.

Los puntajes que evalúan excitabilidad (tiempo de m ovilidad e inmovilidad) no

mostraron diferencias entre los tipos de estrés o de implante, al igual que la distancia

recorrida y la velocidad promedio. Sin embargo, si se observaron alteraciones en los

niveles de ansiedad en cuanto al tiempo en la zona central y en los patrones de

exploración medidos con las visitas totales.

43

Para su protección, los roedores tienen la tendencia a permanecer en la

periferia y salir poco hacia el centro de los espacios que exploran, de manera que el

tiempo en áreas centrales es considerado un indicad or de ansiedad ya que los

animales tranquilos tienden a explorar más estos es pacios.

Los resultados indican que las situaciones de estrés tuvieron poco o ningún

efecto sobre el tiempo que los grupos pasaron en el área central (gráf. 4), como se

puede inferir por el bajo impacto del factor de grupo. Por otra parte el factor implante

tuvo un impacto significativo (p=0.016) para el cual, el análisis post-hoc mostró que

DHEA tuvo tiempos significativamente superiores a progesterona y control (p<0.001).

Esto indica que los implantes DHEA generaron probablemente un estado ansiolítico lo

suficientemente potente como para permitir a los sujetos un mayor tiempo de recorrido

en el área central en comparación con aquellos con implante VEHI y PROG.

Hole BoardTiempo en zona central

160Control Grupo: p= 0.196Hacinamiento Implante: p= 0.016

Interacción: p= 0.682Ruido140

120 *

Seg

undo

s

100

80

60

40

20

0VEHI PROG DHEA

Gráfica No. 4. Tiempo que pasaron las ratas en la z ona central de la tabla de agujeros. Las situaciones de estrés no mostraron un efecto importante sobre la ansiedad evaluada por el tiempo de estancia de las ratas en la zona central. Sin embargo, para el factor implante, los grupos con PROG mostraron niveles similares a los VEHI, mientras que aquellos con DHEA mostraron menores niveles de ansiedad al recorrer por más tiempo el centro de la tabla. El eje Y muestra el tiempo en segundos que las ratas pasaron el área central. El eje X muestra los grupos sometidos a distintos tipos de estrés e implantes hormonales.Las barras muestran el error estándar.

44

En cuanto a los patrones de exploración, cada uno de los factores por separado

no tuvo un impacto significativo, sin embargo se pudo observar en la interacción una

significancia limítrofe (p=0.069) (gráf. 5). El post-hoc con la prueba t, mostró que el

ruido, pero no el hacinamiento en la condición VEHI, incrementó el número de visitas

totales en comparación con el control. Este incremento fue disminuido de manera

limítrofe (p=0.055) por PROG y de manera significativa (p0.01) por DHEA.

Hole BoardVisitas totales

60 Control Grupo: p= 0.650Implante: p= 0.467

Hacinamiento Interacción: p= 0.069Ruido

50

40

Frec

uenc

ia

30

20

10

0VEHI PROG DHEA

Gráfica No. 5. Frecuencia de visitas totales en la Tabla de Agujeros. Las situaciones de estrés

mostraron una tendencia al incremento de las visitas totales en los grupos con VEHI,

especialmente para ruido. Esta tendencia se vio inhibida por DHEA y probablemente por PROG.

El eje Y muestra la frecuencia absoluta de visitas totales, mientras que el eje X muestra los grupos

sometidos a distintos tipos de estrés e implantes hormonales.Las barras indican el error estándar.

45

Análisis celular

Población astrocitaria

El número de astrocitos inmunorreactivos para GFAP fue registrado con el

método del fraccionador óptico (West, 1999) en el hipocampo Zonas CA1, CA3 y DG.

El efecto más obvio es la reducción del número de a strocitos inmunrreactivos a

anti-GFAP en los grupos implantados con DHEA en todas las áreas analizadas (gráf.

6A), y por este motivo el efecto del factor implante fue significativo en cada una de

ellas (p≤0.001). Adicionalmente, CA3 (p≤0.001) y GD (p≤0.05) mostraron un impacto

significativo del factor grupo (gráf. 6B y 6C), pero solo CA3 tuvo una interacción

importante entre los dos factores (p≤0.001). La prueba de Tukey para el CA3, señaló

que la influencia del factor grupo estaba determinada por una disminución en el

número de células inmunorreactivas (fig 6) en los grupos de hacinamiento (p≤0.05) y

ruido (p≤0.001). En los sujetos con implantes de VEHI, (fig. 7) los cambios generados

por las condiciones de estrés por hacinamiento mostraron una disminución en el

número de células microgliales.

46

Población Astrocitaria en Zona de CA1 del hipocampo

400 Control

Hacinamiento Grupo p = 0.889Ruido Implante p = 0.000

Interacción p = 0.762

300*

c é l u l a s

200

N o . d e

100

** ** **

0

VEHI PROG DHEA

Población Astrocitaria en Zona CA3 del Hipocampo

400 Control Grupo p = 0.000Hacinamiento Implante p = 0.000Ruido Interacción p = 0.000

300* ***

c é l u l a

200

N o . d e

100

** ** **

0

VEHI PROG DHEA

Población Astrocitaria en Zona GD del Hipocampo

Control

Hacinamiento140 Ruido Grupo p = 0.025

**Implante p = 0.000

120*

Interacción p = 0.151

100

lula

s

80

. de

cé

60

N o

40

20 ** ** **

0

VEHI PROG DHEA

Gráfica No. 6. Total de astrocitos estimados por

hemisferio con el método del fraccionador óptico. El

eje Y muestra la frecuencia absoluta de células

contabilizadas, mientras que el eje X muestra los

grupos sometidos a distintos tipos de estrés e

implantes hormonales. En todas las áreas analizadas se observó una fuerte reducción del número de células inmunorreactivas para GFAP con el implante de DHEA. A: en CA1 sólo el factor implante tuvo un efecto importante debido a la reducción en DHEA. B: en CA3 el factor grupo señala una reducción del número de astrocitos en los grupos estresados, específicamente para hacinamiento en la condición VEHI, sin embargo en la condición DHEA, ambos grupos estresados manifestaron esta reducción. C:

en DG tal disminución se presentó exclusivamente

mpara el estrés por hacinamiento. Las barras indican el

error estándar.

47

A B

Figura No. 6.

A) Implante PROG Grupo Control (40X). Zona CA3 del Hipocampo.

B) Implante PROG Grupo Hacinamiento (40X) Zona CA3 del Hipocampo. Mostró Cuna reducción en la población astrocitariacomparada con el grupo control y el grupode ruido.

C) Implante PROG Grupo Ruido (40X).Zona CA3 del Hipocampo. Mostró unareducción astrocitaria en comparación conel grupo control.

48

20 µm 20 µm

**

* **

***

* * * *

**

**

**

** A B

Figura 7. Imágenes de microscopia de luz para recue nto de la población microglial.

La imagen muestra el número celular por campo en un aumento de 20x en cortes coronales de

20 µm. El * corresponde a la densidad poblacional. A) Se muestra un corte coronal del grupo

control con implante de VEHI en la zona CA1 del hipocampo, el cual presenta un número

abundante de células de microglia con grandes prolongaciones citoplasmáticas, esta

morfología es indicativa de que las células se encontraban en reposo. B) Se muestra la zona

CA1 del hipocampo del grupo de animales estresados por hacinamiento, e implantados con

aceite de sésamo contenido en la cápsula de silicon a (VEHI) resultó un número disminuido de

células de microglia con pocas prolongaciones citoplasmáticas, -morfología indicativa de que

las células sufrieron un proceso de desramificación por haberse activado.

49

La Transformación Astrocitaria

La transformación astrocitaria fue evaluada mediante el conteo del total de

cruces de las prolongaciones continuas de los astrocitos con los círculos concéntricos

de la rejilla de Método de Conteo Puntual de Weibel, en las mismas estructuras

cerebrales.

*Los resultados muestran una tendencia común en la q ue ambos factores,

grupo e implante, así como la interacción entre ambos, mostraron un impacto

significativo (p≤0.001) en cada una de las áreas analizadas (gráf. 7 ).

En términos generales lo que puede observarse del impacto de ambos factores

y la interacción, es una tendencia generalizada para las tres áreas analizadas en la

que DHEA produjo una disminución de la reactividad astrocitaria en todas las

condiciones experimentales de estrés (p≤0.001), pero especialmente en la condición

de ruido. Por su parte, la progesterona no tuvo un efecto significativo sobre la

reactividad de los astrocitos expuestos a situaciones de estrés, sin embargo

decrementó de manera importante la misma variable en el grupo control, dejándolo a

la par con el nivel de los grupos estresados (p≤0.001).

50

A Transformación Astrocitaria en

Zona CA1del Hipocampo

8 ControlHacinamiento Grupo = 0.000 7

Implante = 0.000Ruido Interacción=0.000

6

6

Inte

rsec

cion

es * 5* *

44

3

de *

No.

22

****1

0 0

Vehículo PROG DHEA

B Transformación Astrocitaria enZona CA3 del Hipocampo

ControlGrupo = 0.000

Hacinamiento Implante = 0.000

Ruido Interacción=0.000

* * *

*

**

**

Vehículo PROG DHEA

C Transformación Astrocitaria enZona DG del Hipocampo.

8 Control Grupo = 0.000Hacinamiento Implante = 0.000Ruido Interacción= 0.000

inte

rsec

cion

es

6

* *

4

*

No.

de

2**

**

0

Vehículo PROG DHEA

Gráfica No. 7. Transformación de las

prolongaciones astrocitarias. El eje Y muestra la

media de la frecuencia de cruces con los círculos

concéntricos de la rejilla de Webel por célula,

mientras que el eje X muestra los grupos

sometidos a distintos tipos de estrés e implante

hormonal. Se observa una influencia significativa de los factores de grupo e implante, así como de la interacción entre ambos. La DHEA disminuyó las prolongaciones astrocitarias en todas las áreas analizadas, mientras que la progesterona las redujo en la situación control y no tuvo efecto en las situaciones de estrés. Las barras indican el error

estándar.

51

Población microglial

El número de células de microglia inmunorreactivas para anti-Isolectina B4

también fue contado con el método del fraccionador óptico (West, 1999) en el

hipocampo (CA1, CA3 y DG).

Los resultados mostraron que las células de microglia en aquellos grupos

implantados con DHEA tuvieron una inhibición en el metabolismo de las

glucoproteinas que pertenecen al glucocalix de la menbrana de las celulas microgliales

lo que no nos permite tener una inmunorreactividad para anti-Isolectina B4, por lo cual

no fue posible observalas en los cortes de los cerebros en los grupos implantados con

DHEA y por ello no se indican en las gráficas ni se incluyeron en el análisis estadístico,

pues sesgarían fuertemente el peso del factor implante.

Para el resto de los sujetos, el factor de grupo tuvo un efecto significativo en

todas las zonas analizadas, ya que los sujetos sometidos a estrés por hacinamiento

mostraron una reducción en el número de células de microglia inmunorreactivas.

Según el análisis post-hoc, esta tendencia fue esta dísticamente significativa para

todas las zonas (p≤0.05) en el caso del estrés por hacinamiento, pero no en el caso de

ruido, con excepción de DG en donde el grupo de ruido también sufrió un decremento

significativo (p≤0.05) (gráf. 8), (fig. 8).

Por su parte, el factor de implante, solo tuvo una influencia limítrofe en CA1

(p=0.067), lo cual se deriva de un incremento en la cantidad de células observadas en

los grupos con progesterona al compararlos con los grupos vehículo. Sin embargo, en

las demás áreas (CA3 y DG) este efecto no fue estadísticamente significativo. La

influencia principal de este fenómeno parece obedecer al incremento de la reactividad

celular del grupo control bajo el implante de progesterona. Ninguna de las áreas

analizadas tuvo una interacción signif icativa entre factores, aunque CA1 tuvo un nivel

limítrofe (p=0.079).

En términos generales lo que puede observarse es una tendencia al

decremento de la reactividad astrocitaria bajo la condición VEHI para el grupo de

52

hacinamiento, pero no para el de ruido (con excepción del DG). Esta relación entre las

diferentes condiciones de estrés parece mantenerse en los grupos con PROG, pero en

niveles más altos, sobre todo para el grupo control.

Población Microglial en Zona CA1del Hipocampo

18

* Grupo p = 0.004Control

16Implante p = 0.067

Hacinamiento Interacción p = 0.079Ruido

14

de c

élul

as

12

10 **

8

N o

.

6 *

4

2**

0

VEHI PROG

Población Microglial en Zona CA3 del Hipocampo

18Control

*Grupo p = 0.023

16 Hacinamiento Implante p = 0.602Ruido Interacción p = 0.400

14

de c

élul

as

12

10 **

8N

o .

6 **

4 *

2

0

VEHI PROG

Población Microglíal en Zona DG del Hipocampo

8Grupo p = 0.016ControlImplante p = 0.395Hacinamiento Interacción p= 0.277

Ruido

6

célu

las

4**

No.

de

**

2

**

0

VEHI PROG

Gráfica No. 8. Total de microglia estimada por

hemisferio. El eje Y muestra la frecuencia absoluta

de células contabilizadas, mientras que el eje X

muestra los grupos sometidos a distintos tipos de

estrés e implante hormonal. Se observa una tendencia generalizada en la que para el factor de grupo, la condición de hacinamiento decrementó de manera significativa el número de células contabilizadas. Por su parte el impacto del factor implante se debe en su mayor parte al incremento que produjo PROG sobre las células contabilizadas en el grupo control en comparación con VEHI . Las barras

indican el error estándar.

53

A B

CFigura 8.Población Microglial en Zona DG del Hipocampo.A) Grupo Control Implante Vehículo (40X). Zona DG del Hipocampo. Ratas no estresadas.

B) Grupo Control Hacinamiento (40X). Zona DG del Hipocampo. El factor Hacinamiento disminuyó la población microglial.

C) Grupo Control Ruido (40X). Zona DG del Hipocampo. El factor Ruido ocasiona una reducción muy importante en la población microglial.

54

Transformación microglial

La transformación microglial fue evaluada mediante el conteo del total de cruces

de las prolongaciones continuas de la microglia con los círculos concéntricos de la

rejilla de Método de Conteo Puntual de Weibel, en las mismas estructuras cerebrales.

Puede observarse en la gráfica 9 que todas las estr ucturas evaluadas

mostraron un impacto significativo del factor grupo. En términos generales las

condiciones estresantes mostraron una reducción significativa (p≤0.001) en la

transformación microglial comparadas con el control, de manera que la inhibición fue

más pronunciada en el grupo de hacinamiento que en el grupo de ruido en todas las

áreas (p ≤0.001). El factor implante sólo tuvo una influencia importante en CA3 y en

DG y de manera general esto parece deberse al incremento en la transformación

microglial mostrado por el grupo control bajo la influencia del implante VEHI.

En todas las estructuras cerebrales analizadas la interacción entre los dos

factores resultó significativa, lo cual permitió el análisis t de pares específicos de

grupos. De esta manera pudo observarse que el las condiciones estresantes generaron

una reducción de la transformación microglial en comparación con el grupo control bajo

la influencia del implante VEHI. Este efecto fue observado de manera significativa en

todas las áreas del hipocam po para la condición de hacinamiento, pero únicamente en

CA1 para la condic ión de ruido. Por su parte los grupos estresados implantados con

progesterona, tuvieron también una reducción significativa en comparación con su

propio control PROG, similar a la reducción observada para los grupos estresados en

la condición VEHI. El impacto más importante bajo la influencia de la progesterona fue

el incremento de la transformación microglial en la condición control para todas las

áreas (ver fig. 9).

55

A Transformación Microglial enZona CA1del Hipocampo

16 Control Grupo: p= 0.000Hacinamiento Implante: p= 0.107

14 Ruido Interacción: p=0.004

de In

tera

ccio

nes

12

10 * *

8 * *

6

No.

4

2

0

VEHI PROG

B Transformación Microglial enZona CA3 del Hipocampo

16Control

Grupo: p= 0.000Implante: p= 0.027

Hacinamiento14

Interacción: p=0.000Ruido

mic

rogl

ia 12

10*

de

8 *

Inte

rsec

ción *

6

4

2

0

VEHI PROG

C Transformación Microglial enZona DG del Hipocampo

16Control

Grupo: p= 0.000Implante: p= 0.017

14Hacinamiento Interacción: p=0.000Ruido

de m

icro

glia 12

10

8 * *

Inte

rsec

ción

6

4

2

0

VEHI PROG

Gráfica No. 9. Transformación de las

prolongaciones microgliales. El eje Y muestra la

media de la frecuencia de cruces con los círculos

concéntricos de la rejilla de Webel por célula,

mientras que el eje X muestra los grupos

sometidos a distintos tipos de estrés e implante

hormonal. Se observa una reducción de la

transformación en todas las áreas en los grupos estresados bajo la influencia del implante VEHI y PROG, especialmente en la condición de hacinamiento. Además, la PROG incrementó de manera significativa la transformación microglial exclusivamente en ausencia de estrés, en todas las áreas analizadas. Las barras indican el error estándar.

56

A B

Figura 9.CTransformación Microglial en Zona CA1

del Hipocampo.A) Grupo Control Implante Progesterona(100X). Zona CA1 del Hipocampo. ElImplantedePROG aumentalatransformación microglial.

B) Grupo Hacinamiento Implante Progesterona (100X). Zona CA1 del Hipocampo. El Hacinamiento disminuyó la transformación microglial.

C) Grupo Ruido Implante Progesterona (100X). Zona CA1 del Hipocampo. El Ruido disminuyó la transformación microglial .

57

DISCUSIÓN

Liberación desde los implantes.

Los implantes hormonales utilizados produjeron un grado de liberación

constante y suprafisiológico a través del experimento (aproximadamente entre 300 y

400 ng/ul de orina). Así mismo, el grado de liberación fue casi el mismo para los dos

tipos de implante, lo cual apoya la confiabilidad del método.Los niveles de cada

implante, al parecer no se vieron afectados en gran medida por las condiciones de

estrés, ya que no hubo diferencias importantes en los niveles de liberación de las dos

hormonas ante hacinamiento y ruido. Esto podría indicar que las condiciones

estresantes no tuvieron un impacto importante sobre los niveles urinarios de los

neuroesteroides, sin embargo, dado que el grado de liberación fue claramente

suprafisiológico, es posible que la influencia del incremento de CORT generado por la

respuesta biológica de estrés no alcance la potencia necesaria para modificar la dosis

generada por los implantes.

Intensidad del estrés.

Tal como se había reportado previamente en otros estudios similares con ruido

por USVs (Commissaris y cols., 2000) y hacinamiento en ratas (Csermely y cols.,

1995), las condiciones experimentales generaron una respuesta de estrés, aunque en

este trabajo estuvo medido por una clara elevación de los niveles de CORT, y se

produjo en un tiempo mucho más corto, qu e siguió diferente curso temporal,

dependiente de cada situación experimental. Por esta razón se puede afirmar que el

modelo de estrés social seleccionado para este estudio fue el adecuado para alcanzar

los fines propuestos; inducir la elevación moderada, -pero sostenida de CORT, para

analizar los efectos de este incremento sobre la integridad celular del hipocampo y su

manifestación sobre habilidades cognoscitivas. La cuantificación de este parámetro

permitió comprobar la validez de las condiciones estresantes creadas artificialmente y

constituyó un indicador confiable de la potencia

58

del estrés y de la activación del eje HPA al igual que en otros estudios (Bhatnagar y

Vining, 2003).

En la situación de control, puede observarse que en ausencia de estrés, no

hubo cambios importantes en los niveles de CORT para cualquiera de los tipos de

implante. Esto significa que PROG y DHEA no tuvieron un efecto importante sobre los

niveles basales de CORT, y que las condiciones de alojamiento se relacionaron con

niveles normales de activación del eje HPA. Esta diferencia puede estar relacionada

con el hecho de que los efectos antiglucocorticoides de estos neuroesteroides se

encuentran relacionados con la modulación de receptores gabaérgicos, los cuales se

ven especialmente afectados ante el incremento de glucocorticoides y la activación de

receptores tipo II (Higashi y col., 2005).

En los animales sometidos al hacinamiento se produjo un incremento lento y

paulatino de los niveles de CORT de aquellos con implante VEHI, de manera que en el

octavo día de estrés, mostraron una elevación significativa con respecto a los controles sin

estrés y a los animales hacinados bajo la influencia de PROG y DHEA. Esto sugiere que

los dos neuroesteroides, ejercieron un rol inhibitorio sobre el incremento de CORT

producido por el hacinamiento, lo cual se encuentra en coherencia con otros experimentos

que demuestran el papel anti-glucocorticoide de ambos (Herbert, 1998; HIgashi y col.,

2005; Hu y col., 2000; Kimonides y col., 1999; Mediratta y col., 2003). El incremento de

CORT por hacinamiento, también ha sido mostrado previamente en diferentes especies

animales (Boranic y cols., 1982; Hessing y cols., 1993; Csermely y cols., 1995; Aioi, 2001),

aunque tales efectos por lo general requieren de un tiempo de hacinamiento más

prolongado (Csermely y cols., 1995 ; Hessing y cols., 1993).

En los grupos sometidos a ruido se observó una rápida elevación de los niveles

de CORT en las ratas con implante VEHI, lo cual se encuentra en coherencia con otros

estudios en los que las USVs funcionan como un estímulo estresante potente

(Blanchard y cols., 1991; Commissaris y cols., 2000). Esta elevación alcanzó su nivel

máximo en el día 2 y se mantuvo estable a lo largo de todo el tiempo de exposición al

estrés. En los grupos implantados con PROG o DHEA se produjo también un

59

incremento en los niveles de CORT, pero este fue diferente de la elevación del grupo

VEHI en dos aspectos básicos: 1. El incremento fue más lento, de manera que puede

observarse un retraso de esta respuesta. 2. Esta elevación fue revertida hacia el final

de la exposición al estrés. Como se mencionó anteriormente, este efecto de inhibición

de los niveles de CORT es ya conocido, en especial en circunstancias en las que e

glucocorticoide se encuentra lo suficientemente elevado como para activar recptores

tipo II (Higashi y col., 2005; Hu y col., 2000; Kimonides y col., 1999; Mediratta y col.,

2003). Este patrón de elevación de la respuesta deCORT en los grupos PROG y

DHEA, en el que se observa un retraso, una elevación pronunciada y una reversión de

los niveles del glucocorticoide pudiera explicarse por el hecho de que los

neuroesteroides implantados mantienen una regulación de incrementos fisiológicos

moderados de CORT como se observó en la respuesta de la hormona ante el

hacinamiento, a través de la regulación de receptores gabaérgicos que pueden inhibir

el eje HPA. Sin embargo, una vez superado un umbral de activación, se pierde la

capacidad de regulación y se da vía libre al incremento. Una vez presente la activación

del eje HPA pueden dispararse los mecanismos de autorregulación que tiene este

sistema de respuesta al estrés, de manera que el efecto conjunto de esta estrategia

adicionada a la presencia de los neuroesteroides anti-glucocorticoides, puede tener un

resultado sinérgico que finalmente termine por inhibir el incremento de CORT.

Por otra parte, la mayor potencia del estrés por ruido puede explicarse con base

en el carácter unimodal de esta estimulación aversiva, ya que la vía auditiva constituye

una herramienta fundamental para la supervivencia de roedores y posee una vía

neuronal muy específica con niveles de habituación muy bajos, dada su importancia

adaptativa. Lo anterior ha sido demostrado en experimentos con roedores, en los que

las USVs artificiales pueden desencadenar comportamientos de defensa (Beckett y

cols, 1996) similares a los inducidos por estimulación química o eléctrica en la

sustancia gris periacueductal (carreras, saltos y congelamiento), y el colículo superior

(estrechamente relacionado con la función auditiva) (Savvas y cols, 2000). Además, en

ratas el colículo inferior parece estar relacionado con la conducta de defensa, pues su

estimulación genera incrementos en la locomoción, exaltación y saltos, así como

60

incrementos en la presión sanguínea y la frecuencia cardíaca. (Commissaris y col,

2000; Brandao y cols., 1994; Maisonette y cols., 1996). De otro lado, el hacinamiento

provoca estímulos polimodales con la intervención de diferentes vías sensoriales

inespecíficas, lo que puede facilitar su enfrentamiento a nivel fisiológico y

comportamental. Posiblemente la herencia filogenética haya conferido a los roedores la

capacidad para desdencadenar respuestas fisiológicas dirigidas a minimizar o abolir

sus manifestaciones orgánicas frente al estrés por hacinamiento cuando no está

comprometida su supervivencia, mientras que la respuesta será diferente cuando el

hacinamiento se acompaña por restricción de agua yalimento, suciedad de la cama y

los enfrentamientos para establecer jerarquías, así; en el primer caso solo resulta una

alteración moderada de la respuesta fisiológica. Además, aunque el hacinamiento es

un estímulo utilizado con frecuencia, se ha visto que entre otros diferentes tipos de

estrés; hacinamiento, aislamiento, inmovilización y nado forzado, los dos últimos

provocaron mayores efectos adversos, lo cual cuestionó la capacidad estresante de los

dos primeros (Nagaraja y Jeganathan, 1999), o al menos sugiere que los estímulos

estresantes de características sociales pueden provocar efectos más sutiles y difíciles

de detectar.

Es importante señalar que en este estudio se recolectó la orina de un modo

distinto a como regularmente se hace en otros estudios de comportamiento o de

nutrición. En este experimento los sujetos se mantuvieron juntos todo el tiempo, - para

evitar el sesgo que hubiera podido resultar por el aislamiento en jaulas metabólicas

individuales que tienen un dispositivo en el fondo para recolectar las heces y la orina

por separado, por lo que así puede calcularse la cantidad de alimento ingerida. Dadas

las condiciones experimentales propuestas para este estudio no fue posible utilizar las

referidas jaulas, el que se haya realizado la recolección conjunta de las muestras de

orina podría explicar la variabilidad intraensayo observada, ya que la determinación de

los niveles de CORT se hizo a partir de mezclas de orina provenientes de distintos

animales.

61

En nuestro conocimiento, este es el primer estudio en reportar una inhibición in

vivo por parte de implantes hormonales de PROG y DHEA sobre los niveles de CORT

generados por estrés de características sociales.

Memoria espacial.

El laberinto acuático de Morris es una de las prueb as más usadas para evaluar el

aprendizaje y la memoria espacial en roedores. Este tipo de memoria, por su relación

con el hipocampo, constituye una analogía del sistema de memoria declarativa tan

importante para los humanos. En general, intenta detectar alteraciones en el

aprendizaje, es decir durante la fase de entrenamiento, para evaluar la función

mnemónica de adquisición del hipocampo; y cambios en la memoria, durante la fase

de prueba, con el fin de medir la función de consolidación.

Los hallazgos de este estudio revelaron un déficit en los procesos de

consolidación o memoria espacial, ya que las diferencias se observaron durante la fase

de prueba, mientras que en la fase de entrenamiento, los sujetos de los diferentes tipos

de implante y condiciones de estrés mostraron los mismos niveles de aprendizaje. Esto

significa que los procesos de memoria de trabajo en el hipocampo no se vieron

afectados por las manipulaciones experimentales. En cambio, el proceso de

consolidación evaluado al día siguiente con la prueba del laberinto de Morris, mostró

un impacto significativo en el número de cruces con la plataforma para el factor de

implante y el factor de interacción.

El resultado observado es que las ratas VEHI expuestas a las condiciones

estresantes mostraron una disminución en el número de cruces con el lugar de la

plataforma durante el nado, es decir, que recordaban menos el lugar que aprendieron

el día anterior durante el entrenamiento. Muchos estudios demuestran que el estrés

produce déficit en la memoria y el aprendizaje espacial (Lupien y McEwen, 1997;

McEwen y cols, 1998; Raber, 1998; de Kloet y cols, 1999; McEwen, 1999; de Kloet,

2000; McEwen, 2000), y los resultados aquí observados resultan coherentes con los

62

efectos sobre la memoria espacial por parte de otras manipulaciones experimentales

similares, como el estrés social crónico durante 21 días (Ma y cols., 2000), el

hacinamiento en Drosophila (Barth y Heisenberg, 1997), ruido de 105 dB en ratas

(Arnsten y Goldman-Rakic, 1998) y ruido grabado de tráfico en humanos (Belojevic y

cols., 1992).

Por el contrario, en la condición de PROG, los grupos expuestos a las situaciones

estresantes no mostraron una ejecución distinta a las ratas control, lo que sugiere que

este neuroesteroide ejerció un efecto benéfico o protector sobre los procesos de

consolidación de memoria en el hipocampo que se ven afectados por el estrés por

hacinamiento o ruido por USVs. Como se mencionó anteriormente, la PROG ha

mostrado un efecto ansiolítico en diferentes situaciones experimentales de estrés

(Figueiredo y col., 2002; Mediratta y col., 2003), y en este estudio decrementó de

manera significativa los niveles de CORT. Por lo tanto, su efecto protector sobre la

ejecución en la prueba de memoria espacial del Laberinto Acuático de Morris, puede

relacionarse con su papel anti-glucocorticoide y su impacto en la reducción de los

niveles de CORT.

De otro lado, en los sujetos expuestos a DHEA, los grupos estresados no

mostraron cambios significativos en comparación con la condición VEHI, mientras que

el grupo control tuvo una reducción importante en el número de cruces con la

plataforma. Esto sugiere que la DHEA, a pesar de generar una inhibición sobre los

niveles de CORT, no tiene un efecto protector sobre la memoria en el hipocampo

afectado por hacinamiento o ruido ultrasónico, y además, que ante la ausencia de

estrés, genera un decremento en la habilidad de memoria espacial, efecto que además

debe ser independiente de los niveles de CORT, pues estos se vieron ihibidos en los

sujetos con implante de DHEA. Diamond y col., (1999) encontraron algo similar, al

observar que la DHEA no potencializaba los cambios electrofisiológicos necesarios

para la memoria espacial en el hipocampo de ratas sometidas a estrés, sin embargo,

contrario a los resultados del presente experimento, este mismo estudio mostró que en

la situación sin estrés, la DHEA si promovió dichaactividad electrofisiológica.

63

Aunque en general la DHEA se ha relacionado con el aumento de la memoria y

el aprendizaje (Wang y col., 2001), Wolf y col., (1998) encontraron un decremento en la

ejecución de pruebas de memoria declarativa (función hipocampal) en humanos, lo

cual contradice también la idea de un efecto directo anticorticoide o antiestrés sobre las

funciones de memoria mediadas por el hipocampo. Además, Breuer y cols., (2002)

encontraron que en mujeres ancianas los niveles de DHEA tenían una relación inversa

con las habilidades cognoscitivas en diferentes test de memoria, lo que sugiere que

este tipo de hormonas pueden tener un efecto distinto que en las poblaciones jóvenes,

tal vez en relación a un mecanismo relacionado con estrés. Por último, los efectos de

los neuroesteroides en lo re ferente a aprendizaje y memoria en respuesta al estrés se

extienden a áreas como la li beración de acetilcolina y la alteración de sistemas

monoaminérgicos (Maurice y col., 2001) los cuales pueden tener un efecto importante,

pero que no fueron evaluadas en este estudio.

Conducta exploratoria.

El campo de agujeros fue diseñado para medir la conducta exploratoria de ratas y

ratones. La parte central del campo de agujeros funciona de manera similar al área

central de la prueba de campo abierto; en ella las ratas con mayor ansiedad prefieren

la zona periférica a la central, al parecer con el propósito de resguardarse, aunque este

comportamiento también puede indicar un déficit de atención (Lordi y cols., 2000). Por

lo tanto, para este estudio era de esperarse que los animales efectuaran una menor

cantidad de visitas centrales, en comparación con las periféricas, lo cual depende de

las situaciones previas a las que hayan estado expuestos. Por otro lado, el tiempo de

movilidad refleja la excitabilidad de los individuos, variable que puede verse afectada

por los niveles de estrés (de Kloet y cols., 2000).

En este estudio, los puntajes obtenidos para tiempo de movilidad e inmovilidad,

visitas centrales y periféricas, así como distancia y velocidad del recorrido, no

mostraron diferencias significativas entre ellas. Sin embargo, los grupos con implante

64

DHEA pasaron una mayor cantidad de tiempo en el áre a central de la tabla de agujeros en

comparacón con las ratas VEHI y PROG. Este incremento se asocia normalmente a

estados ansiolíticos, pero en este caso no puede atribuirse la causa a dicha variable, ya

que el bajo impacto del factor grupo y de la interacción, hacen este efecto independientede

las condiciones de estrés, además, el grupo de PROG también mostró niveles reducidos

de CORT, y sin embargo los sujetos no incrementaron el tiempo de permanencia en la

zona central. Una explicación alternativa tiene que ver con sistemas de atención a

estimulación novedosa, proceso también asociado con el hipocampo. Lordi y cols, (2000)

sugieren que la disminución del tiempo en la zona central, puede estar en relación con un

decremento en los niveles de atención, mientras que Wolf y col., (1998) encontraron que la

DHEA potencia las tareas relacionadas con la atención. Es entonces posible suponer que

la DHEA haya incrementado los procesos atencionales que dirigen la conducta

exploratoria, de manera que las ratas pasaran una mayor cantidad de tiempo en el área

central. Sin em bargo, habría que sugerir, que este efecto se limita a factores atencionales,

pues la conducta exploratoria, es decir el número de agujerso visitados, en el área central

y periférica fue igualmente distribuída en todas las situaciones estresantes y los diferentes

implantes.

También se observaron diferencias importantes en la cantidad de visitas totales. El

ruido, pero no el hacinamiento, incrementó de manera significativa la cantidad de visitas

totales y este efecto fue revertido por la PROG y la DHEA. Este efecto no puede atribuirse

a un componente motor, ya que los tiempos de movilidad e inmovilidad fueron iguales para

todas las ratas. Por el contrario, puede decirse que está relacionado con un factor de

estrés, ya que las ratas bajo condiciones de ruido tuvieron niveles de CORT más altos en

comparación con las de hacinamiento. En la mayoría de estudios de estrés, se ha

reportado disminución de la conducta exploratoria tanto con el uso de modelos de estrés

agudo y no social (Boranic y cols., 1982; Hessing y cols., 1993; Csermely y cols., 1995;

Takeda y cols., 1999; Tsuji y cols., 2000; Adamec, 2001; Aioi, 2001), como con diferentes

modelos de estrés social en distintas especies (Manuck y cols., 1991; Heinrichs y cols.,

1994; Boissy y cols., 1998; Meerlo y cols., 1999; Habib y cols., 2000; McCabe, 2000;

Kovach y cols., 2001). Sin embargo, un estudio de Osborn

65

y col. (1998), mostró un incremento de la exploración en ratas sometidas a tratamiento

con CORT.

Es necesario aclarar, que la mayoría de estos experimentos evaluan la

exploración utilizando el laberinto elevado en cruz y el laberinto de campo abierto, los

cuales miden principalmente niveles de ansiedad, y no la conducta exploratoria por si

misma. Es probable que la diferencia en estos resultados se deba a que el campo de

agujeros evalúa un rango de dimensiones más amplio y ofrece un ambiente novedoso

más enriquecido que las otras pruebas. Aunque el ca mpo de agujeros no había sido

hasta ahora probado para evaluar el efecto de la CORT sobre la conducta exploratoria,

es posible observar que en otros intentos por medir el comportamiento exploratorio en

circunstancias diferentes, como la exposición a un ambiente novedoso con ratas

desconocidas, la CORT generó un incremento en el nivel de exploración (Haller y col.,

1997). Por este motivo, el efecto inhibitorio de la PROG y la DHEA puede entonces

atribuirse a sus efectos ansiolíticos a través de la reducción de los niveles de CORT, al

menos en lo que respecta a la conducta exploratoria.

Astrocitos

El efecto más evidente en las células astrocitaria s fue la fuerte inhibición que

ejerció la DHEA sobre la población y la transformación de los astrocitos en todas las

condciones experimentales y en todas las áreas anal izadas. Tal efecto inhibitorio de la

DHEA sobre la proliferación astrocitaria y la expresión de GFAP ha sido previamente

reportado in vitro (Bolota y col., 1987) e in vivo (Hoyk y col., 2004), de manera que los

presentes resultados encajan en el marco experimental que relaciona la DHEA con las

células astrocitarias.

En la población astrocitaria de CA3 y DG, asi como en la transformación

astrocitaria de CA1, CA3 y DG, pudo observarse un impacto significativo del factor

grupo, pues con el implante VEHI, la cantidad de astrocitos registrados fue menor en

las condiciones de estrés, en comparación con el control. Aunque un papel excitatorio

de la CORT sobre los astrocitos haya sido descrito en algunos experimentos in vitro

66

(Rozovsky y col., 1995; Melgani y col., 1997) e in vivo (Bjorklund y col., 1985), la

mayoría de la evidencia experimental se encuentra en coherencia con el presente

estudio, en cuanto a que la CORT tiene efectos inhibitorios sobre las células

astrocitarias (Crossing y col., 1997; Laping y col., 1994; Nichols y col., 1990;

O’callaghan y col., 1991), particularmente con la implementación de estrés crónico de

intensidad media (Rithcie y col., 2004) y de manera específica para el hipocampo

(Maurel y col., 2000).

Ante los efectos inhibitorios del estrés, la PROG no mostró un efecto protector,

lo cual contradice los resultados de (Crossing y cols., 1999), quienes revirtieron con

PROG y DHEA la inhibición astrocitaria producida con CORT. A pesar de haber logrado

una reducción de los niveles de CORT, en este estduio la PROG no impidió la

inhibición astrocitaria, esto sugiere que la inhibición de las células astrocitarias en el

grupo de PROG puede estar asociada a su efecto directo sobre los astrocitos, pues

ellos son los principales productores de PROG en el SNC (Zwain y Yen, 1999) y se ha

demostrado que la hormona tiene un efecto inhibitorio sobre la proliferación y la

transformación de estas células (Jung y col., 1992; Ciriza y col., 2004; Grossman y col.,

2004; Dhebaili y col., 2005). También podría suponerse que el efecto de la inhibición

esta relacionado con la interacción entre PROG y los niveles del glucocorticoide que se

alcanzaron previamente a la reducción por parte de la progesterona, ya que algunos

estudios in vitro que estudiaron los efectos de CORT y PROG sobre cultivos de

astrocitos han reportado que el resultado puede ser totalmente opuesto dependiendo

de la cantidad, densidad y tipo de células presentes, y por lo tanto se hipotetiza que la

presencia de células con receptores a las hormonas, que compiten por los ligandos

presentes, pueden determinar en que dirección reaccionan los astrocitos (Bohn y col.,

1994; Rozovsky y col., 1995).

Finalmente, fue posible observar que además de la falta de protección, la PROG

mostró decrementos importantes en la transformaciónde los astrocitos en condiciones

control, esta alteración de la PROG podria ser explicada por el impacto inhibitorio que

67

tiene la hormona sobre los astrocitos, descrito anteriormente, y ha sido objeto de

reportes similares, por parte de otros experimentos en los cuales el grupo control tuvo

efectos secundarios (Mediratta y col., 2003).

Microglia.

De manera similar a lo observado en los astrocitos, la DHEA inhibió la

inmunorreactividad de astrocitos en el hipocampo en todas las condiciones

experimentales de estrés. Las células contabilizadas fueron tan pocas que se decidió

excluirlas del análisis estadísitico por el sesgo q ue podrían producir. La inhibición de

DHEA sobre las células de microglia también ha sido demostrada in vitro (Yang y col.,

2000; Wang y col., 2001) e in vivo (Tomas-Camardiel y col., 2001).

De manera general, en las ratas con implate VEHI, pudo observarse una

reducción significativa de la reactividad y la población microglial en el grupo de

hacinamiento, esto sugiere un efecto inhibitorio de los corticosteroides sobre la

población y transformación microglial, que ha sidoobservado en otros estudios (Wang y

col., 1998; Moga y col., 2005; Nichols y col., 2005). No existe evidencia experimental

directa que permita explicar el hecho de que los sujetos expuestos a ruido con altos

niveles de CORT no mostraron una inhibición de la reacción microglial. Sin embargo,

con base en experimentos en los que se ha observado un rol excitatorio de los

corticosteroides sobre la microglia (Tanaka y cols., 1997; Gonzalez-Perez y col., 2001;

Gonzalez’Castaneda y col., 2002) es posible hipotetizar que el elevado nivel de

corticosteroides haya generado paralelamente un desequilibrio sobre el medio ambiente

neuronal y que la microglia se haya activado en consecuencia para compensar tal

efecto, de manera que al ser evaluada, el decremento inicial queda compensado y no

se observan cambios aparentes. Asi mismo (Brooke y Sapolsky 2002), han reportado

también efectos bidireccionales de los glucocorticoides sobre la reacción microglial;

inhibición para estrés agudo yexcitación para estrés crónico. Estos resultados sugieren

que los niveles de estrés generados por el hacinamiento tuvieron un rol inhibitorio sobre

la población y la transformación microglial del hipocampo,

68

mientras que el alto nivel de estrés generado por ruido pudo haber estimulado las

células microgliales y compensado el efecto.

La inhibición de la microglia observada en el hacinamiento de VEHI, no fue

revertida con el implante de PROG. A pesar de que la hormona disminuyó los niveles

de CORT, las células microgliales no mostraron cambios en su respuesta de inhibición.

Aunque el impacto del factor implante fue significativo solo de manera limítrofe para

algunas de las áreas evaluada, este resultado puede obedecer al efecto directo que

tiene la PROG sobre la microglia, pues ha sido reportada la inhibición de esta hormona

sobre la transformación microglial (Ganter y col., 1992; Fujita y col., 1996; Garcia-

Estrada y col., 1999).

69

CONCLUSIONES

Actividad gonadal.

- Los neuroesteroides progesterona y dehidroepiandosterona inhibieron el

incremento de corticosterona en ratas, después de 10 días de estrés por hacinamiento

o ruido ultrasónico.

- El ruido resultó el factor estresante más potente.

Comportamiento.

- La progesterona ejerció efectos neuroprotectores frente a las alteraciones en la

memoria espacial, generadas por el estrés en las ratas mostrando efectos ansiolíticos;

reflejados en la conducta exploratoria.

- Por el contrario, la dehidroepiandrosterona no mostró efectos benéficos en las ratas

estresadas y en las controles disminuyó la habilidad de memoria espacial.

Análisis Celular.

- La progesterona y la DHEA inhibierón la poblacióny reactividad astrocitaria, en las

regiones cerebrales analizadas de los animales estresados.

- En los animales con la influencia de progesterona se observó una población

microglial disminuida en todas las regiones analizadas del cerebro de ratas estresadas

por hacinamiento, sin variación de la morfología.

70

PERSPECTIVAS Y LIMITACIONES

Un vez concluido este trabajo se propone continuar con la línea de investigación,

utilizando estresores a temprana edad en roedores castrados e intactos,

(aproximadamente de un mes) como el ruido ultrasónico, hacinamiento o la presencia

de un predador, y aplicar después de esto pruebas de comportamiento para evaluar

aprendizaje y memoria espacial, así como citoarquitectura glial y neuronal (al 50% de

los animales de experimentación). Después de un mes, volver a someter a los mismos

estresores al resto de la población experimental, así como a las mismas pruebas para

evaluar la respuesta a la exposición temprana del estrés.

Con lo anterior podemos plantear un modelo experimental para el estudio de las

consecuencias de estrés en la población infantil que continuamente se ve sometida a

diferentes tipos de estresores (principalmente ruido y hacinamiento) en etapas muy

tempranas de su vida y que posteriormente pueden modificar su capacidad

cognocitiva.

Una de las limitaciones en este trabajo, fue no haber podido identificar la

microglia en los grupos de animales que fueron implantados con DHEA, en donde se

utilizaron diferentes marcadores, entre ellos; anticuerpos monoclonales anti-OX-42,

receptor de complemento C3Rbi para marcar selectivamente las células de la microglia

entre todas las otras células gliales del SNC, consiste en la utilización de este Ac, -

antagonista del CR3, (Flaris 1993). Este Ac es utilizado para identificar alteraciones en

la distribución y morfología de las células de microglia, después de una lesión cerebral,

en el caso de daño isquémico,estos Ac OX-42 identifican una condición

inmunorreactiva de células de microglia morfológicamente transformadas, que se

observan bastante arborizadas y sus procesos son semejantes a los que típicamente

se distinguen en la microglia en reposo, (McRae 1998). Después de modificar la

concentración del Ac primario, y el tratamiento previo desenmascararte no resultaron lo

efectos esperados, ya que no se observó ningún tipo de marcaje.

71

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