)

1. CONCEPTO Y FUNDAMENTO

Es la operación por la que se unen tejidos procedentes de plantas distintas para formar una sola planta capaz de crecer y desarrollarse como tal. El injerto está compuesto por dos partes: una parte superior que dará lugar al tronco y copa de la planta, que se llamará variedad; y una parte inferior formada por el sistema radicular, que se nombrará pie, patrón o portainjerto.

Mediante el injerto se mantienen las características genéticas, edad fisiológica y estado sanitario de la planta madre de la que procede. Por ello es un buen método para perpetuar clones, generalmente de especies frutales y ornamentales que, propagados por semilla tendrían caracteres juveniles y/o habría una dispersión genética.

Los tejidos que se sueldan cuando se ponen en contacto son los de crecimiento en grosor del tallo, (el cámbium). Una vez prendida la púa o la yema, el patrón alimenta el injerto, que se desarrolla normalmente reproduciendo con toda fidelidad los caracteres de la planta de la cual se ha sacado.

o El portainjerto: es la planta en la que se va a realizar el injerto y sobre la que se soldará la púa o yema. El portainjerto o patrón es la parte que posee las raíces.

o El injerto: es el fragmento de la variedad que se desea propagar y que se suelda en el portainjerto. El injerto es la parte aérea del ensamblaje. También es la más frágil, puesto que generalmente ya sólo se alimenta de sus propias reservas de savia.

2. OBJETIVOS DEL INJERTO

1) Sustituir las técnicas de reproducción vegetativa tales como el esqueje, el acodo simple o aéreo u otra semejante en las especies y variedades que presentan problemas de radicación porque tienen un crecimiento y por lo tanto, florecen y fructifican muy tarde.

2) Dotar a la variedad seleccionada de un aparato radical adaptado a las características del terreno.

3) Sustituir al aparato radical de una variedad sujeto a patologías específicas, por el que un portainjerto que por el contrario, sea inmune a las mismas.

4) Introducir rápidamente en el jardín y en el huerto las nuevas variedades con la ventaja de tener plantas adultas ya ambientadas.

5) Cambiar variedades con injertos en plantas adultas.

6) Producir variedades distintas en una misma planta, obviando la escasez de terreno y favoreciendo la polinización cruzada necesaria para las variedades y por lo tanto con fines productivos.

7) Reducir el vigor vegetativo que en las plantas en general y en los frutales, en particular es inversamente proporcional a la floración. Un excesivo vigor reduce la producción y retrasa su inicio de maduración.

8) Rejuvenece árboles viejos y en particular los frutales en fase productiva descendente.

)

9) Restablecer la circulación de la savia en el tallo y en las ramas obstaculizada por traumas, heridas o por la incompleta soldadura del injerto.

10) Influenciar el desarrollo de la variedad según el patrón elegido.

3. CONDICIONES PARA UN BUEN INJERTO

Para que la operación del injerto tenga éxito deben darse una serie de condiciones:

a. Compatibilidad: Las dos partes patrón e injerto deben ser afines. Más adelante ampliaremos el tema de compatibilidad.

b. Intimo contacto: Las zonas cambiales de patrón e injerto deben tener un contacto íntimo. Un buen atado será el que no oprima cortando el paso de sabia, ni se dilate permitiendo la entrada de humedad que pueda favorecer la entrada de hongos patógenos. El material utilizado habitualmente usado son las tiras de plástico. La rafia se sigue utilizando para el reinjerto, o cambio de variedad, ya que los patrones suelen ser gruesos y exigen más presión en el atado y sujeción del injerto.

c. Época adecuada: El estado vegetativo de la púa y del patrón deben ser prácticamente el mismo, en todo caso si no fuera así es preferible que la púa esté en estado vegetativo más retrasado.

d. La planta madre: Debe encontrarse en un estado sanitario y nutritivo bueno. El material debe ser de la misma variedad que deseamos propagar y ha de manifestar todas las características varietales típica de esta.

4. COMPATIBILIDAD E INCOMPATIBILIDAD

4.1 COMPATIBILIDADES (influencia)

Efectos del patrón sobre la variedad. El patrón influye sobre la variedad de varias formas, entre ellas pueden citarse:

o Tamaño y hábito de crecimiento. o Precocidad de fructificación: número de años que transcurren desde el injerto

hasta que se inicia la floración y fructificación. o Intensidad de fructificación y cosecha. o Tamaño, calidad y época de maduración del fruto. o Resistencias: a frío, salinidad, clorosis, enfermedades, etc.

Efectos de la variedad sobre el patrón: Los efectos de la variedad sobre el patrón son menos conocidos, sin embargo, está comprobado que la variedad influye sobre el desarrollo, ramificación, etc., del sistema radicular.

)

A pesar de la antigüedad de la técnica y su uso cotidiano, actualmente permanecen desconocidos muchos aspectos de la fisiología del injerto como los relacionados con la posibilidad o no de que se formen uniones variedad/patrón estables.

El injerto está limitado a las dicotiledóneas y a las coníferas; en ambos casos las plantas tienen una capa de cámbium vascular que se extiende entre el xilema y floema.

Entendemos que existe afinidad o compatibilidad entre dos materiales cuando puestos en contacto el cambium de ambos es posible su soldadura para formar un solo individuo.

La unión por injerto sólo es adecuada cuando existe entre ambas plantas una cierta afinidad. Generalmente esta afinidad es mayor cuando las plantas están botánicamente más cercanas sin que existan reglas seguras. Actualmente sólo el ensayo experimental es seguro.

Patrón Variedad

Tomate Berenjena Pimiento

Tomate !!!! !!!! !

Berenjena !!!! !!!! !

Pimiento ! ! !!!!

Nicotiana xanti !!! !! !

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La experiencia demuestra que no se pueden injertar plantas que pertenezcan a familias diferentes.

Patrón Variedad

Manzano Peral Membrillero Níspero

Manzano 1 4 4 3

Peral 4 1 1 3

Membrillero 4 2-3 (!) 1 2

Espino albar - - - 2

Níspero - - - 1

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Albaricoquero Almendro Cerezo Ciruelo Melocotonero

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Albaricoquero SI NO NO SI (3) SI

Almendro NO SI NO SI SI/NO

Cerezo NO NO SI/NO (2) NO NO

Ciruelo SI SI (4) NO SI SI (1)

Melocotonero SI SI NO SI SI

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Clones de ciruelo (patrón) Injerto de melocotonero Injerto de almendro

Mirobolan B Muy incompatible Incompatible

Mirobolan Wibaut Incompatible medio compatible

Mirobolan P 1254 medio incompatible bastante compatible

Mariana 2624 ligeramente incompatible Compatible

Mirobolan 2032 Compatible Muy compatible

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De forma similar la variedad y el patrón deben tener un vigor similar, o en todo caso la variedad debe ser más vigorosa, si fuera muy diferente la unión no suele ser muy duradera. Cuando el patrón es muy vigoroso tiende a emitir rebrotes que compiten con la copa.

Una diferencia importante de vigor entre el patrón y la variedad puede producir “miriñaques” con sobrecrecimiento de uno o de otro según los casos, que con el tiempo, produce estrangulamientos de vasos conductores. Ejemplo satsuma injertada en citrange troyer y limonero verna sobre naranjo amargo.

4.2 INCOMPATIBILIDADES

La unión por injerto sólo es adecuada cuando existe entre ambas plantas una cierta afinidad. Generalmente esta afinidad es mayor cuando las plantas están botánicamente más cercanas sin que existan reglas seguras. La experiencia demuestra que no se pueden injertar plantas que permanezcan a familias diferentes. Dentro de la misma familia el éxito es más fácil entre plantas de una misma especie que entre plantas de un mismo género y que entre dos plantas de géneros diferentes, aunque siempre existen algunas excepciones. Por ello vamos a distinguir distintos tipos de incompatibilidades:

Aquellos casos en que los síntomas se translocan a través de un intermediario, es decir, que la presencia de un injerto intermedio de compatibilidad reconocida con patrón y variedad no evita los síntomas. A este tipo de incompatibilidad se denomina normalmente TRASLOCADA. Las combinaciones que presentan este tipo de incompatibilidad no tienen solución en la práctica por lo que deben evitarse: ejemplo típico es el almendro o melocotonero injertados sobre mirabolano.

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El empleo de un intermediario, compatible con la variedad y con el patrón, no evita la incompatibilidad.

Casos en los que los síntomas de desavenencia se localizan en la unión del injerto. A este tipo se le denomina incompatibilidad LOCALIZADA. Este tipo de incompatibilidad se presenta con alguna frecuencia dando lugar a roturas por la unión del injerto. Las superficies presentan un aspecto muy característico.

Existen casos en los que existe una diferencia importante de crecimiento bien del patrón o de la variedad, lo que puede producir miriñaque, lo que significa que ese excesivo desarrollo bien de la variedad o del patrón producirá un estrangulamiento de los vasos conductores. Este efecto puede evitarse utilizando madera intermedia.

5. TÉCNICAS Y MATERIALES PARA LA REALIZACIÓN DEL INJERTO.

5.1 MATERIALES PARA LA REALIZACIÓN DEL INJERTO.

a. Elementos de corte: sierras, navajas, hendidores, injertador, tijeras…, etc. Siempre deben estar muy bien afilados para que los cortes san limpios y fácil de realizar. En ciertos casos se requiere desinfección (lejía, alcohol, etc.), para evitar posibles infecciones entre plantas.

b. Elementos para atado: plástico elástico, gomas, pinzas, etc. De dimensiones y resistencias acordes con el tipo de injerto. Su finalidad es que haya la máxima

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unión entre patrón y variedad, además de impedir que entre suciedad, agua, aire, etc.

5.2 ELECCIÓN DE LA VARIEDAD, PATRÓN Y MADERA INTERMEDIA.

La variedad a injertar se elegirá tras un estudio del mercado de frutos, plantas ornamentales, hortalizas, etc; además se tendrá en cuenta el clima y médios técnicos de los que se dispone.

El patrón se elegirá entre los que se adapten sobre todo al tipo de suelo que se dispone (salinidad, sequía, encharcamiento, etc), producción, precocidad, tamaño del fruto y resistencia o tolerancia a agentes patógenos.

Antes de elegir la variedad y patrón tenemos que tener en cuenta los posibles problemas de incompatibilidades, para poder cambiar de patrón, variedad o poner madera intermedia.

5.3 RECOLECCIÓN, PREPARACIÓN Y ALMACENAMIENTO DE INJERTOS.

Los injertos se deben recolectar de árboles madre que sean de la variedad deseada (autenticidad varietal) y que exista constancia de ello, especialmente en el caso de profesionales viveristas. Además deben estar libres de virus y de otras plagas o enfermedades que se pueden transmitir por el injerto o que afectan al vigor de éste.

La época de recolección puede ser en el momento de realizar el injerto o en otro momento. Generalmente para los injertos que se han de realizar en primavera cuando la mayoría de las yemas están recién brotadas y no se pueden aprovechar, los injertos se recolectan en invierno, antes de la brotación y se almacenan en frigorífico (5-10ºC según la especie y 80-90 % HR) hasta su empleo. Los injertos que se realizan en agosto-septiembre (dormidos) pueden ser recolectados directamente de las ramas del árbol madre ya que éstos suelen estar bien dotados.

Se elegirá la rama o vareta adecuada al tipo de injerto, generalmente ramas de 1 año o menos. Si tiene hojas se quitarán inmediatamente, al igual que si tiene espinas. Se recortan las varetas a un longitud adecuada para su manejo y se desechan los trozos que sean muy delgados o muy gruesos o que no tengan yemas bien desarrolladas. A continuación se envuelve en telas limpias húmedas y se llevan al lugar de injerto. Si se han almacenado conviene realizar una desinfección con fungicida de amplio espectro.

5.4 PRÁCTICAS DE CULTIVO ADECUADAS PARA EL ÉXITO DEL INJERTO.

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Si el tipo de injerto requiere levantar la corteza para llegar al cambium en la variedad o en el patrón esto se logra mejor, además que sea la época del año adecuada, si previamente (7-10 días) se realiza un riego a las plantas madres y al patrón (árbol receptor) de los injertos para activar los pasos de savia. Cuando se injertan árboles viejos es conveniente realizar un tratamiento con fungicida sistémico (Fosetil-Al) para evitar posibles exudaciones gomosas por las heridas realizas al realizar el injerto. Una vez realizado el injerto no se deben realizar riegos aéreos, ya pueden producir posibles pudriciones o ataque de hongos en el injerto, lo que haría fracasar la práctica realizada.

5.5 ÉPOCA DE REALIZACIÓN DEL INJERTO.

a. A ojo velando u ojo vegetante, cuando se realizan en primavera o principios de verano y la yema se desarrolla en pocas semanas. Si en verano si hay un poco de madera bajo de la yema, se llama chip o June bud.

b. A ojo dormido, cuando se realizan al finalizar el verano. Las yemas injertadas brotarán en la siguiente primavera, tras invernar soldadas al patrón.

5.6 REALIZACIÓN Y TIPOS DE INJERTOS.

INJERTOS DE YEMA

5.6.1.- Injerto de escudo o escudete o “T”

Se corta la corteza del patrón en forma de “T”, se levantan los dos lados de ésta con la parte de la navaja especial para ello y nunca con el filo, para evitar que se astille el leño.

La yema se cortará insertando el filo de la navaja por la parte superior de ésta y se descenderá paralelamente a la estaca hasta que la parte inferior de la yema, donde se cortará clavando el cuchillo.

Una vez extraída la yema se sacará la pequeña porción de madera que queda debajo de ella, siempre que resulte fácil de realizar.

Cuando ya tenemos el patrón y la yema preparados se procederá a introducir la yema entre la corteza y el leño del patrón, procurando que la yema quede al exterior. A continuación se atará la zona del injerto, pero sin cubrir la yema. A veces el corte sobre el pie se hace de forma de “T” invertida, esta variante presenta ventajas en aquellas especies que cuando se les daña la corteza tienen tendencia a exudar goma. En el caso de la “T” invertida la goma se acumularía en la parte inferior del injerto, ya que es la zona de más herida; mientras que en la “T” la goma se acumula en la parte superior pudiendo llegar a ahogar la yema.

)

5.6.2.- Injerto de plancha o parche.

En el patrón se extirpa una porción de corteza rectangular y se le sustituye por una porción de corteza con yemas (normalmente 2). Se intentará que la porción de de corteza con yemas procedente de la variedad sea un poco más grande que el rectángulo realizado en el patrón, con la finalidad de que la parte de la variedad quede por de bajo de la corteza sobre la que injertamos. Se sujetará bien y se atará. Es un tipo de injerto que se puede realizar cuando el patrón tiene una corteza más gruesa que la variedad.

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Escudo procedente de la variedad

INJERTOS DE PÚA

Son aquellos en que la variedad está constituida por una porción entera de brote provisto de una o más yemas. Al igual que el injerto de yema, conviene que el patrón esté en situación vegetativa más avanzada que la púa a injertar. Se utiliza en aquellos casos que interesa injertar árboles adultos por distintos motivos: cambiar de variedad una plantación, introducir variedades polinizadoras…restaurar partes de un árbol…También se utiliza para injertar árboles jóvenes.

5.6.3.- Injerto de hendidura

Se realiza un corte transversal al patrón previamente decapitado, donde se insertarán una o dos púas. La púa se modela con dos cortes en la base a bisel, quedando muy afiladas. Posteriormente se ata.

)

5.6.4.- Injerto de incrustación.

En el patrón se hace una hendidura radial, donde se colocará la púa. La púa queda formada por una larga cuña lateral.

5.6.5.- Injerto inglés.

Al patrón y a la variedad se le hacen los mismos cortes. Se cortan a bisel y después se les hace un corte en sentido inverso pero con orientación paralela al primer corte. Así se forma un lengüeta en ambas partes, que al hacer el injerto se entrecruzarán aumentando mucho la superficie de zona cambial en contacto y, por lo tanto, sus probabilidades de éxito. Para llevar a término este tipo de injerto, el patrón y la púa deberán un diámetro similar.

5.6.6.- Injerto lateral

La hendidura se realiza lateralmente sobre el patrón, sin la decapitación de éste, y se le inserta una púa cortada a bisel por los dos laterales.

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INJERTOS DE APROXIMACIÓN

Injertos en los que tanto el árbol como la variedad permanecen enraizados mientras el injerto no se haya soldado. Una vez verificada su soldadura, la variedad se separa de sus raíces.

5.6.7.- Injerto simple

Se extrae una porción igual de corteza y algo de madera en ambas partes donde se desea la unión, se ponen en contacto y se atan.

Injerto por aproximación

5.6.8.- Injerto inglés

Las muescas que se practican en cada una de las partes son iguales a las descritas anteriormente en el injerto inglés de púa. La única diferencia es que en este caso el patrón y la variedad están enraizados.

5.7 REALIZACIÓN DEL INJERTO, TIPO ADECUADO.

El injerto se realiza generalmente en el campo, aunque a veces se realiza en taller. Antes de realizar el injerto, se prepara el patrón quitando las hojas de la zona de injerto, lo que se hace, generalmente, con tijeras de podar. De forma inmediata se efectúa el injerto, haciendo cortes limpios, poniendo en contacto íntimo ambas zonas de cambium y atando, a continuación, con una cinta elástica. Cuando se cubra el injerto con cinta elástica, hay que ser precavidos cuando los injertos son de yema, ya que si el injerto se realiza en época de mucho calor, la cinta puede actuar sobre la yema aumentando la temperatura y escaldandola; sin embargo si el injerto lo realizamos a ojo velando es conveniente cubrir también las yemas.

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5.8 CUIDADOS POSTERIORES

Generalmente se debe mantener una ligera humedad en el suelo, lo que facilita el agarre del injerto.

A los 20-25 días aproximadamente, se quitan las ligaduras para comprobar prendimiento (en injertos de púa se debe esperar más). En caso afirmativo se hace una incisión anular por encima del injerto de yema (no es preciso en los de púa), que abarque un 75% del diámetro a fin de evitar la bajada de auxinas y, por tanto, estimular la brotación del injerto a esta práctica se le denomina cotana.

El patrón a medida que vaya creciendo la variedad se irá recortando. A veces conviene entutorar el joven brote si no se sostiene por sí mismo o para que crezca verticalmente.

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7+,%)IF)T&$.1-.1-%;%$&'(F)0#/3&41)&()4&3.1F)

1. MICROPROPAGACIÓN

La micropropagación es un conjunto de técnicas especiales de cultivo de tejidos, que consisten en producir plantas a partir de porciones muy pequeñas de ellas, de tejidos o células cultivadas asépticamente en un tubo de ensayo o en otro recipiente en que se puedan controlar estrictamente las condiciones del ambiente y la nutrición. La capacidad de ciertos tejidos ve-getales, así como de varios órganos de plantas (tallos, flores, raíces, embriones, polen, tejidos, etc.), de crecer de manera más o menos indefinida, se ha utilizado durante muchas décadas en los laboratorios científicos como un instrumento de investigación por genetistas, botánicos o fitopatólogos.

Estas técnicas se emplean para multiplicar plantas asexualmente en forma rápida, eficiente y en grandes cantidades. La micropropagación se utiliza para multiplicar o propagar plantas nuevas, tales como aquellas creadas por ingeniería genética, mutagénesis o mejoramiento genético. Se utiliza también la micropropagación para obtener plantas libres de enfermedades (tales como virosis) u obtener grandes cantidades de plantas que no se propagan eficientemente.

Los tipos de explantes que se pueden usar para llevar a cabo la micropropagación, pueden ser:

" Órganos: Meristemos, Ápices, Yemas axilares y Nudos, Raíces, Anteras y Polen, Hojas, Embriones.

" Células: Callo y suspensiones celulares. " Protoplastos: Un protoplasto vegetal puede definirse como: «La parte de la célula

vegetal que está delimitada e incluida dentro de la pared celular y que puede ser plasmolisada y aislada por eliminación mecánica o enzimática de la pared celular. El protoplasto es por lo tanto una célula desnuda, rodeada por su membrana plasmática, potencialmente capaz de regenerar la pared celular, crecer y dividirse».

A estos métodos se les ha denominado colectivamente cultivo de tejidos, una expresión que en ocasiones se usa como sinónimo de micropropagación. Los procedimientos de cultivo de tejidos utilizan un sistema de producción in vitro que requiere instalaciones de tipo laboratorio y técnicas asépticas similares a las empleadas para cultivar hongos, bacterias y otros microorganismos (autoclave para esterilizar, cámara o cabina de flujo laminar, cámara de cultivo con temperatura, etc.).

La propagación de las plantas superiores por medio de las técnicas de cultivo celulares in-vitro, iniciadas en la década de los años cincuenta, ha conocido un gran auge y desarrollo a partir de los setenta, produciéndose anualmente millones de plantas con estas técnicas. En material de

)

tipo forestal no se ha usado hasta el momento de forma masiva o comercial, nada más que a escala de experiencias y en todo caso en especies endémicas, raras o amenazadas de extinción.

Tanto por la complejidad de las instalaciones que tienen que estar montadas de forma muy completa y perfecta, así como por la necesidad de especialización que debe tener el viverista-micropropagador hacen que su uso sea por el momento muy restringido, en el ámbito forestal. De todas formas, estimamos que en un futuro, y para plantas de difícil reproducción por semilla (siempre que no sea de forma masiva), se aplicará este método, dadas las siguientes ventajas:

- Velocidad de propagación. - Eliminación de enfermedades y organismos patógenos. - Rentabilidad en algunas especies. - Reducción del banco de plantas madre. - Conservación prolongada. - Revigorización y rejuvenecimiento. - Independencia de ciclos estacionales. - Permite propagar plantas estériles.

Sin embargo tiene algunos inconvenientes, que debemos reseñar, como son:

- Baja rentabilidad en muchas especies. - Dificultades en la aclimatación al ambiente natural. - Rejuvenecimiento a veces no deseado. - Variación genética no deseada. - Las raíces obtenidas in vitro a veces no son funcionales. - La capacidad regenerativa se acaba perdiendo.

)O$/8+5"4,N2%&.%Técnico manipulando material en cabina de flujo laminar

La propagación in-vitro se basa en los mismos principios que la multiplicación vegetativa tradicional (en la capacidad de diferenciación de las células vegetales), en un medio sintético y estéril.

)

El buen resultado de la multiplicación in-vitro depende de cuatro factores que se deben controlar y afinar al máximo:

a. Estado óptimo de la planta madre b. Esterilidad del material de partida

c. Pulcritud en la limpieza de las instalaciones y esterilidad en las manipulaciones d. Establecimiento de un correcto equilibrio entre los distintos componentes del

medio cult.

El ambiente de cultivo deberá presentar una serie de características:

- Luz, no la necesita para la fotosíntesis, sino para regular el proceso de iniciación de brotes y raíces. El periodo diario de luz generalmente es de 16 horas.

- Temperatura generalmente alrededor de 25ºC

Otra cosa que caracteriza a la propagación in-vitro y la diferencia de los demás sistemas de propagación es el medio nutritivo, que estará formado por:

- Sales inorgánicas, distintas composiciones - Sustancias orgánicas - Carbohidratos: sacarosa. - Vitaminas: tianina, inosital, aminoácidos. - Reguladores de crecimiento: Auxinas, citoquininas, giberelinas y complejos orgánicos.

Dentro del proceso de micropropagación se pueden diferenciar varias fases o etapas:

I. Desinfección de las yemas de la planta y/o desinfección de semillas II. Introducción del material seleccionado in Vitro III. Multiplicación de brotes IV. Enraizamiento V. Aclimatación

Esta secuencia de etapas abarca el ciclo completo de la multiplicación de plantas in vitro y puede ser aplicada a diferentes especies vegetales.

Preparación de la planta madre

Para poder establecer el cultivo en condiciones de asepsia, se deben obtener explantos con un nivel nutricional y un grado de desarrollo adecuado. Para obtener estos explantos es recomendable mantener a las plantas madre, es decir la planta donante de yemas, durante un período que puede oscilar entre unas semanas o varios meses en un invernadero bajo condiciones controladas. En ese ambiente se cultiva la planta en condiciones sanitarias óptimas y con un

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control de la nutrición y riego adecuados para permitir un crecimiento vigoroso y libre de enfermedades.

Desinfección del material vegetal

Una vez elegida la planta madre, se extraerán los fragmentos a partir de los cuales se obtendrán los explantos. Los explantos pueden ser yemas, trozos de hojas, porciones de raíces o semillas. Antes de extraer los explantos se hará una desinfección de los fragmentos de planta madre para eliminar los contaminantes externos. Los contaminantes más comunes son los hongos y las bacterias que habitan en forma natural en el ambiente. Una vez desinfectado el material vegetal, se debe mantener en condiciones de asepsia. A efectos de obtener tales condiciones, se trabaja en cabinas de flujo laminar para extraer los explantos a partir del material vegetal. Estos explantes se introducirán en un tubo de cultivo conteniendo medio de cultivo para poder controlar la sanidad y la viabilidad, luego de realizar la desinfección del material con hipoclorito de sodio (agua clorada comercial), pura o diluída durante un período de 5 a 15 minutos, seguido por 3 a 4 enjuagues en agua esterilizada.

)O$/8+5"4,N2%6.%Explantes de Marantha contaminados (a) por una deficiente desinfección y quemados (b) por exceso%

Introducción del material in vitro

Luego de la desinfección superficial, las semillas o las yemas dependiendo del material seleccionado, se ponen en medio de cultivo estéril. En un período de una semana o quince días, comienza el proceso de germinación o regeneración de nuevos tejidos vegetales, iniciando el ciclo de cultivo in vitro.

)O$/8+5"4,N2%=.%Fitotron o cámara de cultivo%

)

Multiplicación de los brotes

Durante esta fase se espera que los explantes que sobrevivieron las fases anteriores originen brotes (de procedencia axilar o adventicia) con varias hojas. En la base de cada hoja hay una yema que se desarrollará luego de ser puesta en contacto con el medio de cultivo. Periódicamente estos nuevos brotes se deben subcultivar en un nuevo medio mediante divisiones y resiembras en tubos de cultivo u otros recipientes adecuados. Estas operaciones se realizan en la cámara de flujo laminar o en un lugar aislado que nos permita mantener las condiciones de asepsia. De esta forma aumenta el número de plantas en cada repique o división de las plantas. El número de plantas que se obtiene dependerá de la especie vegetal y de las condiciones del medio de cultivo. El número de plantas que se obtiene por la vía de la micropropagación permite alcanzar incrementos exponenciales, considerando que todos los factores que afectan el crecimiento hayan sido optimizados.

)O$/8+5"4,N2%?.%Explantes de Begonia formando callo organogénico (a) y Yema de Marantha desarrollada en medio base (b)%

Elección de un medio de enraizamiento de los explantes

Para enraizar los explantos se utilizan principalmente plantas individuales de un tamaño aproximado de 2 cm. Los brotes obtenidos durante la fase de multiplicación se transfieren a un medio libre de reguladores de crecimiento o que solo contenga hormonas del tipo de las auxinas. Algunas especies de plantas no necesitan pasar por esta etapa y emiten sus raíces en el mismo medio de cultivo donde desarrollan yemas nuevas, por lo tanto el proceso de multiplicación y enraizamiento transcurren en forma simultánea.

)

O$/8+5"4,N2%P.%Explantes de Begonia desarrollando sistema radicular%

)

Aclimatación de los explantos enraizados

Los explantos recién enraizados son muy sensibles a los cambios ambientales, de manera que el éxito o el fracaso de todo el proceso depende de la aclimatación. En esta etapa las plantas sufrirán cambios de diferente tipo que permitirán la adaptación de las mismas a vivir en condiciones naturales. En el momento en que se extraen los explantos o plantas enraizados de los frascos, están poco adaptados a crecer en un invernáculo, ya que estos explantes han enraizado y crecido en ambientes con una humedad relativa muy elevada y generalmente tienen estomas (estructuras responsables de regular la transpiración y pérdida de agua en la planta) que no son completamente funcionales frente a descensos de la humedad relativa, y por lo tanto demasiado lentos para evitar la desecación del explante. Por otra parte, crecer en ambientes tan húmedos también suele implicar la falta de una cutícula con cera bien desarrollada, que representa la barrera física para evitar la perdida de agua a lo largo de toda la superficie de la planta. Las plantas enraizadas, deben ser aclimatadas a las condiciones de humedad del invernadero disminuyendo progresivamente la humedad relativa e incrementando progresivamente la intensidad de luz. Estas plantas se plantarán en contenedores (almacigueras) cubiertos por un plástico, para mantener la humedad relativa elevada. La elección de un sustrato con buenas características físicas, es clave para el éxito de esta etapa. Para el trasplante, elegimos un sustrato suelto, poroso, con mezcla de arena turba, cáscara de arroz quemado, para permitir un desarrollo y crecimiento de raíces muy rápido. Las mezclas son diferentes y muy variadas de acuerdo a la especie con la que estamos trabajando. Despuéss de retirar cuidadosamente el agar de las raíces para evitar dañarlas, las plantas se enjuagan y se colocan en almacigueras con la mezcla de sustratos seleccionada y cubiertos con nylon. Todos los días se debe controlar el nivel de humedad en las almacigueras. Si es necesario, se aplica un riego con una pulverizadora manual, para mantener un ambiente húmedo a nivel del sustrato. A los 15 días del trasplante, se puede comenzar a levantar la cobertura de nylon en las horas de menor calor (temprano en la mañana o en la última hora de la tarde). Al comienzo las plantas se dejan media hora por día destapadas. A la semana siguiente se dejan destapadas durante una hora. Al mes del trasplante, se dejan tapadas durante la noche y si hay crecimiento de nuevas hojas, las plantas pueden permanecer destapadas. Las condiciones del cultivo in vitro, generan cambios en algunos aspectos anatómicos y fisiológicos de las plantas, por esta causa, durante la aclimatación, los cambios deben ser muy graduales, para minimizar el estrés y tener mayor tasa de supervivencia.