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EL UNIVERSO DE RNAs PEQUEÑOS EN PLANTAS: SU VERSATILIDAD EN LA REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN

GENÉTICA

THE SMALL RNA UNIVERSE IN PLANTS: ITS VERSATILITY IN GENE EXPRESSION REGULATION

Tzvetanka D. Dinkova y Vasti T. Juárez-González

Departamento de Bioquímica, Facultad de Química, Universidad Nacional Autónoma de México, 04510, Ciudad de México, México

[email protected]

Resumen

Los RNAs pequeños de plantas son moléculas de 19 a 27 nucleótidos que

se originan de precursores de RNA de cadena sencilla con estructura tallo-asa o

de doble cadena. Dos de las enzimas cruciales en su biogénesis son las proteínas

Dicer-like y Argonauta. Existen varios miembros de las familias de estas proteínas

en plantas, cuya función se ha especializado dependiendo de la clase de RNA

pequeño a la que se encuentran asociados. Las diferentes clases de RNAs

pequeños también muestran funciones especializadas a nivel post-transcripcional

(degradación de RNA y represión traduccional) o transcripcional (silenciamiento

génico por metilación de DNA). La gran versatilidad de sus funciones permite a las

plantas defenderse contra virus y transgenes, ejercer programas clave del

desarrollo y contender con diversos tipos de estrés biótico o abiótico. En este

trabajo se revisan las principales clases de RNAs pequeños, componentes de su

Cárdenas Monroy C, González Andrade M, Guevara Flores A, Lara Lemus R, Matuz Mares D, Molina Jijón E, Torres Durán PV. Mensaje Bioquímico, Vol. XL, 87-110, Depto. de Bioquímica, Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México. Cd. Universitaria, CDMX.,MÉXICO.,(2016). (http://bioq9c1.fmedic.unam.mx/TAB)

(ISSN-0188-137X)

mailto:[email protected]

MENSAJE BIOQUÍMICO, VOL. XL (2016)

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biogénesis y mecanismos de regulación, así como su impacto en el desarrollo,

respuesta a estrés y aplicaciones biotecnológicas en las plantas.

Palabras clave: miRNA, siRNA, Dicer-like, Argonauta, desarrollo.

Abstract

Small RNA in plants are 19-27 nucleotide molecules derived from single-

stranded hairpin-loop structured, or double-stranded RNA precursors. Dicer-like

and Argonaute are two key enzymes required for their biogenesis. Several family

members, functionally specialized depending on the small RNA class they

associate with, represent these proteins in plants. Different small RNAs also

display specialized functions at post-transcriptional (RNA degradation and

translational repression) or transcriptional (gene silencing by DNA methylation)

level. Their functional versatility accounts for anti-viral or transgene defense, key

developmental program execution, and diverse biotic or abiotic stress responses.

Here we review the main small RNA classes in plants, key components in their

biogenesis and regulatory mechanisms, as well as their impact in plant

development, stress response and biotechnological applications.

Keywords: miRNA, siRNA, Dicer-like, Argonaute, development.

¿Qué son los RNAs pequeños?

Los RNAs no codificantes de bajo peso molecular (sRNAs) se clasifican de

manera general como RNAs pequeños interferentes (siRNAs) y microRNAs

(miRNAs). La característica principal que distingue a estos dos grupos en plantas

es que la molécula precursora de los miRNAs es un transcrito de una sola cadena

que forma estructura tipo tallo-asa por apareamientos intra-moleculares, mientras

que la de los siRNAs es un RNA de doble cadena (Tabla I, [1]). También se

reporta un grupo creciente de sRNAs que aparentemente derivan de transcritos

sencillos con capacidad de formar tallo-asa, pero que no cumplen ciertas

características de los miRNAs, lo que dificulta una estricta clasificación de los

sRNAs. Aunque el origen genético de estas moléculas es diferente, varios

componentes de su ruta de biogénesis y funcionamiento se comparten (Figura 1).

Tzvetanka D. Dinkova y Juárez-González VT

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Tabla I. Clasificación de RNAs pequeños en plantas.

Clasificación acorde a Axtell, 2013 [1]. miRNA, microRNA; siRNA, RNA pequeño interferente; hc-siRNA, siRNA heterocromático; pha-siRNA, siRNA producido en fase, ta-siRNA, siRNA que actúa en trans; nat-siRNA, siRNA derivado de transcritos naturales antisentido; dsRNA, RNA de doble cadena.

La biogénesis de sRNAs involucra a las enzimas DiCer-Like (DCL) que

producen dúplex de RNA (dsRNA) de 19-27 nucleótidos dejando 2 nt colgantes en

los extremos 3’. En plantas, este dúplex se protege de degradación mediante

metilación en el 2’OH de la ribosa terminal por una metil-transferasa Hua

ENhancer 1 (HEN1) [2]. Este intermediario es reconocido por una enzima

ArGOnauta (AGO), la cual, en compañía de otras proteínas forma un Complejo de

Silenciamiento Inducido por RNA (RISC). El duplex de sRNA debe ser separado y

sólo una de las cadenas forma parte del complejo con AGO (hebra guía), mientras

que la otra cadena es removida (hebra pasajera). La función reguladora que ejerce

RISC se basa en el reconocimiento de transcritos específicos mediante un

reconocimiento RNA-RNA perfecto o parcialmente imperfecto [3]. Algunas

subclases de sRNAs requieren para su biogénesis o función a otras enzimas como

RNA polimerasas Dependientes de RNA (RDRs), algunas proteínas de unión a

dsRNA o chaperonas [4]. Por otra parte, en plantas se han identificado múltiples

miembros para las familias DCL, AGO y RDR y se ha demostrado que las


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diferentes clases y subclases de sRNAs utilizan de manera diferencial a estas

proteínas.

Figura 1. Principales vías de biogénesis de sRNAs en plantas. A, Producción de miRNAs. B, Producción de siRNAs secundarios en fase (pha-siRNAs y ta-siRNAs). C, Producción de siRNAs heterocromáticos (hc-siRNAs).

microRNAs (miRNAs)

Los miRNAs derivan de precursores transcritos por la RNA polimerasa II

(pol II) a partir de los genes MIR (Figura 1A). El transcrito inicial llamado miRNA

primario (pri-miRNA), tiene cap, cola de poliA, y forma estructura secundaria.

DCL1 corta el pri-miRNA para generar un precursor más corto (pre-miRNA) con

una estructura tipo tallo-asa. El pre-miRNA es cortado nuevamente por DCL1

generando dsRNA de 21 nt, el cual es metilado por HEN1 y transportado del

núcleo al citoplasma por el exportador HASTY. En el citoplasma, el dsRNA es

separado al unirse a AGO1 o a AGO10 y una de las cadenas (miRNA*) se


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degrada. El miRNA asociado a RISC conduce al corte o represión traduccional de

sus mRNAs blanco.

siRNAs producidos en fase (pha-siRNAs)

Los siRNAs producidos en fase (pha-siRNAs) derivan de un RNA que

puede ser codificante para proteína (mRNA) o no codificante (ncRNA), el cual es

llevado a dsRNA por la acción de RDR6 y es procesado por DCL4, para generar

productos de cortes progresivos cada 21-22 nt en el dsRNA. Este tipo de corte

origina arreglos espaciados perfectos de sRNAs (sRNAs en fase). Los pha-siRNAs

son normalmente ejemplificados por la categoría de ta-siRNAs (Figura 1B)

encontrados en Arabidopsis thaliana. Sin embargo, en los últimos años los datos

obtenidos a partir de la secuenciación masiva de sRNAs en otros genomas de

plantas revelaron que diversas especies presentan una amplia variedad de pha-

siRNAs originados de loci que se denominaron PHAS, distintos a los loci que

originan a los ta-siRNAs [5, 6]. La ruta de biogénesis de pha-siRNAs y ta-siRNAs

es la misma.

En esta vía, un miRNA específico complementario a un transcrito maduro

(con cap y poliadenilado) provoca el corte del mismo mediante la acción de RISC

[7]. Los fragmentos generados se protegen por una proteína llamada Suppressor

of Gene Silencing 3 (SGS3), quien es reclutada por RISC, y se transcriben por

RDR6 para generar el dsRNA. tili ando este ds como sustrato, corta

en ase ragmentos de 2 -22 nucleótidos ue posteriormente son metilados en su

extremo 3 por HE . El t rmino en ase p ased indica ue los s s son

generados en un arreglo secuencial, comenzando a partir de un nucleótido

especifico que fue determinado por el corte inicial del miRNA. DCL2 y DCL3

muestran redundancia parcial con DCL4 en esta vía, solo que DCL3 genera

fragmentos de 24 nulcleótidos [8].

siRNAs que actúan en trans (ta-siRNAs)

Los ta-siRNAs son un grupo particular de pha-siRNAs que fue descrito

inicialmente para Arabidopsis thaliana y que es ampliamente conservado en

plantas. Los ta-siRNAs derivan de transcritos de los loci TAS y dependen de

miRNAs específicos para generar el corte que originará posteriormente el dsRNA

(Figura 1B). miR173 unido a AGO1 reconoce a TAS1 y TAS2 en Arabidopsis

thaliana, mientras que miR390 unido a AGO7 reconoce a TAS3. Una característica

particular de los ta-si s es ue pueden ejercer su unción en trans sobre

transcritos di erentes al original o en cis sobre el mismo precursor para amplificar

la señal [9].


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siRNAs derivados de transcritos naturales antisentido (nat-siRNAs)

Los nat-siRNA se reportaron por primera vez en estudios de tolerancia al

estrés en Arabidopsis thaliana [10]. Se ha propuesto que el precursor los nat-

siRNAs es una porción híbrida entre transcritos independientes formada por

complementariedad (cis-nat-siRNAs; Tabla 1). Los transcritos independientes

pueden ser originados a partir de la transcripción de las cadenas opuesta de un

mismo locus o de loci diferentes con cierta complementariedad (trans-nat-siRNAs;

Tabla 1). Solo los cis-nat-siRNAs se han identificado en plantas, mientras que los

trans-nat-siRNAs continúan siendo solo una hipótesis [1, 11]. Una vez generados

los transcritos cis-nat, uno de los cuales es producido exclusivamente bajo

condiciones de estrés, se produce la hibridación en las regiones complementarias

y una RDR puede generar un dsRNA en los sitios no apareados. El dsRNA puede

ser procesado por diferentes DCL y seguir la ruta de un siRNA canónico. Se ha

estimado que la formación de cis-nat-siRNAs puede ocurrir en alrededor del 9% de

los genes de Aabidopsis thaliana. Sin embargo, las cantidades de nat-siRNAs

observadas en estudios globales son muy bajas, lo que ha llevado a cuestionar su

presencia como grupo independiente de siRNAs [1].

siRNAs heterocromáticos (hc-siRNAs)

Este tipo de sRNAs se origina de secuencias repetidas como los elementos

transponibles (TEs) o regiones pericentroméricas (Figura 1C). La RNA Polimerasa

IV (Pol IV), específica de plantas, transcribe en estas regiones RNAs relativamente

cortos (alrededor de 40 nucleótidos) y RDR2 genera el dsRNA a partir de este

transcrito [12]. El dsRNA generado es procesado por DCL3 en fragmentos de 24

nt (hc-siRNAs) que son metilados por HEN1. Los hc-siRNAs se unen a AGO4

quien selecciona una de las cadenas (generalmente la que fue transcrita por

POLIV) como cadena guía y el complejo es reclutado a transcritos generados por

otra RNA polimerasa específica de plantas (POLV) que transcribe en la misma

región de DNA. Asociadas a los complejos RISC guiados por hc-siRNAs actúan

metiltransferasas de DNA para silenciar la transcripción en la región de secuencias

repetidas y crear un entorno de heterocromatina [13]. Este mecanismo mediado

por hc-siRNAs se denomina metilación del DNA dirigida por RNA (RdDM) y

constituye una herramienta muy importante para el control de TEs y para la

estabilidad del genoma en las plantas.

Proteínas Dicer-like y Argonauta: estructura y función durante el

silenciamiento genético inducido por sRNAs.

Dicer-like


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Para la correcta biogénesis y funcionamiento de las vías de silenciamiento

genético inducido por sRNAs en plantas es necesaria la participación de las

proteínas Dicer-like (DCL), quienes desempeñan un papel central en el

procesamiento de los precursores de sRNAs para generar dsRNAs de 21-24 nt de

longitud. Estas proteínas pertenecen a la superfamilia RNasa III cuya función

principal es el corte endonucleolítico de RNA [14]. Se clasifican dentro de la

subfamilia de enzimas Dicer cuyos miembros contienen varios dominios

característicos: dos dominios RNasa III (RNasa IIIa y RNasa IIIb), un dominio de

unión a RNA de doble cadena (dsRBD), un dominio Piwi Argonauta Zwille (PAZ) y

un dominio DExH-box Helicasa (Figura 2). En el extremo amino se encuentra el

dominio DExH-box Helicasa, altamente conservado en las proteínas Dicer, que se

ha nombrado así por la presencia de la secuencia Asp-Glu-X-His [15]. Mutaciones

en el dominio Helicasa de DCL1 en Arabidopsis thaliana (AtDCL1) mostraron su

relevancia para el procesamiento de algunos pri-miRNAs, discriminándolos de

otros dsRNAs [11]. Sin embargo, la proteína Dicer en algunos organismos como

Giardia intestinalis, carece del dominio Helicasa y es capaz de cortar y generar

productos de dsRNAs de tamaños específicos [14].

Figura 2. Modelo estructural de Dicer-like (DCL). A, Dominios característicos de DCL1 en Arabidopsis thaliana. B, Arreglo espacial de los dominios de DCL1 para formar el centro de procesamiento de asa III y el dominio egla de separación entre P Z y asaIII. C, Ubicación del sustrato de RNA en el centro de procesamiento de DCL1.


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Para el correcto funcionamiento de las enzimas Dicer, los dominios RNasa

IIIa y RNasa IIb se pliegan para formar un dímero intramolecular con un único

centro de procesamiento que permite el corte de dos enlaces fosfodiéster en las

cadenas opuestas del dsRNA (Figura 2B y 2C). Este tipo de corte genera

productos característicos con dos nucleótidos sobresalientes en los extremos

3´OH. El centro de procesamiento de los dominios RNasa III se encuentra

separado del dominio P Z por una región conectora tipo α-hélice conocida como

el Dominio Regla. El dominio PAZ se encuentra involucrado en la unión de los

extremos 3´ del dsRNA y el posicionamiento de la molécula en el centro de

procesamiento RNasa III. Recientemente, se ha obtenido evidencia de que la

distancia entre el PAZ y el centro de procesamiento define el tamaño en los

productos de corte del dsRNA, lo cual explica por qué cada una de las proteínas

DCL en plantas genera dsRNAs con longitudes específicas. Finalmente, el

dominio dsRBD se encuentra en el extremo carboxilo terminal, adoptando una

estructura tipo binding pocket para crear una inter ase de unión entre la proteína

y el dsRNA [15].

En general, las proteínas Dicer o DCL de cada organismo conforman una

pequeña familia génica compuesta por dos, cuatro o cinco miembros. En relación

a animales y hongos, las plantas mono- y di-cotiledóneas presentan una notable

expansión de la familia DCL, reflejando una mayor versatilidad en la

implementación del silenciamiento mediante RNA en la defensa antiviral [16]. En

Arabidopsis thaliana se han identificado 4 genes correspondientes a DCL (DCL1-

4), mientras que en el arroz (Oryza sativa) y el sorgo (Sorghum bicolor) se han

identificado 5 genes. Al igual que otras proteínas relacionadas con la biogénesis

de sRNAs, las proteínas DCL parecen ser específicas para procesar un tipo

particular de dsRNA. Analizando mutaciones múltiples y puntuales en AtDCL2,

AtDCL3 y AtDCL4 se observó que estas proteínas mantienen una relación

jerárquica dada por distintas afinidades por los diversos precursores de dsRNA

(Tabla 1). La afinidad de cada parece depender del tama o del ds y de

la identidad del nucleótido en la posición del dúplex. t procesa ds

largos sin pre erencia clara por el nucleótido del extremo , mientras ue t 3

procesa preferencialmente dsRNA cortos con extremos de adenina y uracilo [17,

18].

La organización de dominios en las proteínas DCL de plantas corresponde

a la estructura general de proteínas Dicer (Figura 1). Sin embargo, DCL1, DCL3 y

DCL4 de Arabidopsis thaliana, Oryza sativa, o Populus trichocarpa presentan una

duplicación del dominio dsRBD, mientras que DCL2 solo presenta un dsRBD [16].


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Esta duplicación parece tener una función importante, ya que al mutar uno de los

dominios dsRBD de AtDCL1 las plantas presentan infertilidad y defectos en la

biogénesis de la mayoría de los miRNAs [19].

Argonauta

Una vez generados los duplex de sRNAs por las proteínas DCL es

necesaria su asociación a una proteína Argonauta (AGO), quien conformará el

complejo efector del silenciamiento genético mediado por sRNAs. La familia de

proteínas AGO se identificó en plantas mediante análisis de genética reversa para

genes involucrados en el desarrollo. AGO1 de A. thaliana (AtAGO1) es el miembro

fundador, cuya mutante nula presenta fenotipos pleiomórficos, como hojas en

forma tubular parecidas a los tentáculos de un molusco argonauta, de ahí el

nombre [20]. La familia de proteínas AGO se puede dividir en el clado Argonauta,

conformado por las proteínas similares a AGO1 de A. thaliana y el clado PIWI,

cuyos miembros son homólogos a la proteína Piwi de Drosophila melanogaster y

se han identificado predominantemente en línea germinal de animales [21]. En

plantas, la familia AGO se ha expandido a lo largo de la evolución con numerosas

duplicaciones y pérdidas. En algas verdes se han identificado 3 miembros,

mientras que en musgos y plantas con flor se ha expandido a 7 y 10 o más

miembros, respectivamente [22]. Análisis filogenéticos han agrupado a las

proteínas AGO de plantas en 3 clados: el clado I está conformado por AGO1,

AGO5 y AGO10; el clado II se encuentra conformado por AGO2, AGO3 y AGO7; y

AGO4, AGO6, AGO8 y AGO9 conforman el clado III [23].

Todas las proteínas AGO se caracterizan por la presencia de los dominios

PAZ, PIWI y MID (Figura 3A), y se han identificado en todos los organismos

eucariontes, con excepción de Saccharomyces cerevisiae [24]. La organización de

los dominios catalíticos y de unión a RNA juegan un papel crucial en el

reconocimiento específico de sRNAs [25]. Mediante cristalografía de Rayos X de

AGO a apartir de Thermus thermophilus (TtAGO) y Pyrococcus furious (PfAGO) se

determinó que la proteína posee una estructura bilobular (Figura 3). El lóbulo PAZ

se encuentra compuesto por el extremo amino y el dominio PAZ, mientras que el

lóbulo PIWI se encuentra conformado por los dominios MID y PIWI. La interacción

del sRNA con AGO conforma un complejo binario, para el cual es necesario que el

dominio MID ancle el extremo 5´ del sRNA mediante un bolsillo de unión, mientras

que el dominio PAZ reconoce los 2 nucleótidos sobresalientes del extremo 3´ del

dúplex de sRNA [26, 27]. Para la selección de la cadena guía se obsreva la regla

de asimetría , donde la cadena del dúplex de s con menor estabilidad

termodinámica en el extremo 5´ será la elegida. La identidad de los nucleótidos


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también es importante para la elección, dependiendo de cada AGO en particular.

Por ejemplo, el dominio MID de atAGO1 se encuentra asociado a miRNAs que

contienen 5´U pero también permite la unión de miRNAs con 5´C. El dominio MID

censa u tipo de s puede cargarse en cada una de las GOs, debido a la

presencia de un asa rígida (Asa de especificidad de nucleótidos), la cual genera

puentes de hidrógeno especí icos con el mononucleótido ’ [28].

Cuando el complejo AGO/sRNA reconoce a un RNA blanco por

complementariedad, se forma el complejo ternario. En este complejo, el

apareamiento entre el RNA blanco y el sRNA comienza desde el extremo 5´del

sRNA que permanece unido al dominio MID, propiciando un cambio

conformacional en el dominio PAZ liberar el extremo 3´ del sRNA permitir la

propagación del apareamiento sRNA-RNA (Figura 3B; [26]). Este proceso se

conoce como nucleación y permite posicionar al RNA en el sitio activo del dominio

PIWI que adopta una estructura tipo RNasa-H y es el responsable de la actividad

catalítica endonucleasa de las proteínas AGO. La presencia de dos cationes

divalentes unidos al motivo DDH en el dominio PIWI (Asp-Asp-X, donde X

generalmente es un ácido aspártico o histina) propicia el corte en el RNA blanco

de sRNA. Sin embargo, aunque una AGO tenga este motivo no necesariamente

realizará el corte endonucleolítico de sus blancos, ya que tambien puede generar

la represión traduccional de sus blancos mediante mecanismos que aun no son

bien entendidos [23, 27].

Figura 3. Modelo estructural de Argonauta (AGO). A, Dominios característicos de AGO1 en Arabidopsis thaliana. PAZ y PIWI se encuentran conservados en todas las AGO, mientras que los MID y Gly solo están presentes en algunos miembros de la familia en plantas. B, Funcionamiento del complejo AGO-sRNA en el reconocimiento de su RNA blanco de silenciamiento (Modificado de [29]).


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En Arabidopsis thaliana, AtAGO1 se une a la gran mayoría de los miRNAs y

pha-siRNAs, posee actividad de corte y media las funciones de estos sRNAs in

vivo. AtAGO1 y AtAGO10 se han implicado en la represión traduccional de

mRNAs blancos de miRNAs. AtAGO7 se asocia preferencialmente a un único

miRNA, miR390, quien conduce a la producción de ta-siRNAs. AtAGO4, AtAGO6 y

AtAGO9 conforman el grupo AGO4 que está relacionado a modificaciones

epigenéticas, en particular silenciamiento de transposones y secuencias repetidas

mediante la vía RdDM. Los miembros del grupo AGO4 se asocian

preferecialmente con los hc-siRNAs y su expresión varía a lo largo del desarrollo y

en distintos tejidos. Cada miembro del grupo se asocia preferencialmente a ciertos

loci del genoma y atAGO9 se ha visto involucrada en el proceso de

gametogénesis femenina, lo que sugiere una especialización de los miembros del

grupo AGO4 de Arabidopsis thaliana. Finalmente, AtAGO2 parece estar

involucrada en mecanismos de respuesta antiviral y de reparación de daño al DNA

de doble cadena (DSB) mediante la generación de sRNAs inducidos por daño al

DNA de doble cadena (diRNAs). Se ha hipotetizado que el complejo efector

AGO2/diRNA contribuye a la reparación del DNA sirviendo como proteína de

andamiaje para el reclutamiento de proteínas relacionadas con el proceso [28, 30,

31].

Mecanismos de silenciamiento por miRNAs

Inicialmente, se planteaba una clara distinción entre los niveles de

regulación ejercidos por miRNAs en plantas y animales. Sin embargo, recientes

estudios genéticos y bioquímicos demostraron que, en ambos tipos de

organismos, el silenciamiento por miRNAs puede involucrar tanto represión

traduccional como degradación de los mRNA blancos [32, 33]. Para que haya

silenciamiento es necesario que el miRNA asociado a AGO reconozca una región

complementaria en el m blanco, denominada semilla Figura 4). Esta región

es mucho menor en extensión para miRNAs de animales (posición 2-7) que de

plantas (posición 2-13). En animales, normalmente los nucleótidos en las

posiciones 10-11 del miRNA se encuentran desapareados lo que impide que AGO

ejerza su actividad de corte sobre el mRNA, mientras que en plantas para la

mayoría de miRNAs existe apareamiento en esta región, lo que favorece el corte

sobre el mRNA (Figura 4).


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Figura 4. Mecanismos de silenciamiento mediados por miRNAs. La extensión de complementariedad entre miRNA y RNA blanco difiere entre plantas y animales; solo en plantas AGO promueve corte endonucleolítico del blanco de miRNA. En animales, la proteína GW182 que interacciona con la proteína de unión a poliA (PABP) promueve tanto la represión traduccional, como degradación del RNA por deadenilación. En plantas, además del corte y degradación de RNA, AGO también puede promover represión traduccional por un mecanismo aún desconocido.

El mecanismo de acción de RISC depende en gran medida de las proteínas

que interaccionan con AGO. Una proteína rica en Glicinas y Triptófanos (GW182)

se une a AGO y a otras proteínas que interrumpen el inicio de la traducción

dependiente de ’-Cap [32]. Estos complejos promueven la deadenilación del

mRNA y lo llevan a cuerpos de procesamiento (P-bodies) para degradación. En

plantas, se conoce poco sobre la interacción de AGO con proteínas que pudieran

afectar el inicio de la traducción o llevar a deadenilación el mRNA blanco de

miRNA. En estudios genéticos en Arabidopsis thaliana se ha implicado a genes

involucrados en la organización del citoesqueleto (KTN), cuerpos de

procesamiento (VCS) y a una carboxipeptidasa anclada al sistema

endomembranal (AMP1) en la inhibición de la traducción por miRNAs [34].

Asimismo, en estudios bioquímicos se ha demostrado que AGO1 y AGO10 están

involucradas en la inhibición traduccional de mRNAs blancos de miRNAs [33, 34].

En plantas no se han encontrado proteínas ortólogas a GW182, por lo que se


99

piensa que la inhibición traduccional pudiera ser mediada por mecanismos

diferentes.

Control de elementos transponibles (TEs)

En plantas, los hc-siRNAs participan en el silenciamiento transcripcional de

secuencias repetidas, en particular de transposones (TEs) mediante el mecanismo

epigenético de RdDM. La acción de las RNA polimerasas específicas de plantas

Pol IV y Pol V ha sido sujeta a intensa investigación en los últimos años

estableciendo que estas enzimas son generalmente reclutadas a regiones con

cierto grado de metilación para transcribirlas y producir hc-siRNAs que servirán

para establecer un estado de heterocromatina en el promotor de los

retrotransposones [12, 35]. Se cree que Pol IV es reclutada al DNA por Sawadee

Homeodomain Homologue HH uien reconoce la metilación de lisina en la

histona 3 (H3K9me) y a la lisina 4 no metilada de la histona 3 (H3K4). Pol IV

también se asocia con RDR2 promoviendo la obtención de dsRNA quien será

sustrato de DCL3 para generar los hc-siRNAs de 24 nt y llevarlos a AGO4, AGO6

o AGO9 (específica de tejidos reproductivos). Recientemente se ha propuesto que

estas AGOs no son completamente redundantes, pudiendo distinguir entre hc-

siRNAs dependiendo de los loci y del tejido de la planta [36]. Los hc-siRNAs de 24

nt asociados a AGO4 reconocen por complementariedad a transcritos que Pol V

genera en las mismas regiones del genoma reclutada por SU(Var)3-9 Homologue

2 (SUVH2) o SUVH9 (Figura 5). En este proceso se establece interacción entre

AGO4 y Pol V y se propone que AGO4 también recluta a la metiltransferasa de

DNA Domains Rearranged Methyltransferase 2 (DRM2) quien es capaz de

establecer metilación de novo en las citocinas en todos los contextos (CG, CHG y

CHH, donde H es A, C o T) [37].

Figura 5. Metilación de DNA dirigida por RNA (RdDM). En el modelo más aceptado para los hc-siRNAs, elementos transponibles (TE) que muestran cierto grado de metilación reclutan a la RNA pol IV y RNA pol V mediante SHH1 (reconoce H3K9 metilada) y SUVH2/9 (reconoce citosina metilada), respectivamente. Las polimerasas transcriben en


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los loci de TEs, la primera para generar el precursor de hc-siRNAs (ver Figura1C), la segunda para reclutar a los complejos hc-siRNA-AGO4 y otras proteínas como la metiltransferasa DRM2, con el objeto de reforzar la metilación en el locus e inducir el silenciamiento transcripcional. (Modificado de [13]).

Desde hace muchos años, se sabe que la actividad de los transposones en

plantas está sujeta a encendido y apagado en dependencia de las fases de

desarrollo y de las condiciones ambientales [38]. El mecanismo de RdDM favorece

el silenciamiento epigenético de los TEs y su herencia transgeneracional. Sin

embargo, como acabamos de describir, su establecimiento requiere de un estado

pre-metilado en el . n TE activo, de inserción relativamente reciente en el

genoma, re uiere de metilaciones iniciales ue permitan marcarlo en el genoma

para el reconocimiento de la maquinaria RdDM. Recientemente, se ha propuesto

que sRNAs que actúan a nivel post-transcripcional (miRNAs, pha-siRNAs, ta-

siRNAs y otros siRNAs) de 21-22 nt o de 24 nt pueden ser los promotores de esta

metilación inicial y la conexión con el silenciamiento posteriormente establecido a

nivel transcripcional [13].

miRNAs en el desarrollo

El papel crucial de los miRNAs en el desarrollo de plantas se evidenció en

Arabidopsis thaliana mediante la observación de alteraciones fenotípicas en

mutantes de la vía de su biogénesis [4, 39]. La mutante dcl1 muestra letalidad

embrionaria indicando que la producción de miRNAs es requerida para la

viabilidad de la planta. Aunque la mutante nula ago1 es viable, la planta presenta

fenotipos drásticos en desarrollo, y una mutante doble ago1/ago10 es letal,

sugiriendo que AGO10 podría suplir de manera parcial la función de AGO1 en la

vía.

Los mRNAs blanco de varios miRNAs son factores transcripcionales que

participan en etapas particulares del desarrollo como la morfogénesis de hojas,

identidad floral, polaridad de órganos y embriogénesis. Entre los ejemplos más

conocidos se encuentran los genes SPL (Squamosa Promoter binding-Like),

blanco de la familia miR156, que regulan el cambio de la fase vegetativa a la

reproductiva, tamaño de órganos y etapas tempranas de la embriogénesis [40-42].

Los factores transcripcionales MYB y GAMYB, blanco de la familia miR159, que

participan en los procesos de floración, fertilidad masculina y germinación [43, 44],

y factores que participan en la respuesta a auxinas, blancos de varios miRNAs o

de ta-siRNAs [39]. De estos últimos, miR164 regula a factores transcripcionales de

la familia NAC (N , T 2 y importantes para el establecimiento de


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límites entre órganos [45], miR160 y miR167 regulan a miembros de la familia de

factores transcripcionales que actúan en respuesta a auxina (ARF) [46] y

miR165/166 tienen como blanco a factores con homodominio de cierre de leucina

(HD-ZIP) de la clase III que participan en el establecimiento de la identidad abaxial

y polaridad en las hojas [47]. Los ta-siRNAs derivados de TAS3 tienen como

blanco también a los factores ARF y regulan el desarrollo y polaridad de órganos

[48, 49]. En la floración de Arabidopsis thaliana, se ha evidenciado un papel muy

importante para miR172 cuyo blanco es APetala2 (AP2), un gen clase A del

sistema ABC que determina identidad floral, y otros genes AP2-like implicados en

el tiempo de floración [50, 51].

Mutantes que sobreexpresan cualquiera de los miRNAs involucrados en

desarrollo muestran fenotipos miméticos a las mutantes nulas o de pérdida de

función de sus genes blanco evidenciando que el papel inhibitorio de estas

moléculas es responsable de la regulación de estos genes involucrados en el

desarrollo de Arabidopsis thaliana [43, 45, 52]. Por otra parte, la expresión de

transgenes con sitos alterados de reconocimiento por los miRNAs en las mutantes

sobreexpresoras de miRNAs es capaz de restablecer el fenotipo normal de

desarrollo. Dada la relevancia que tiene el mecanismo de regulación por miRNAs,

dos de las enzimas clave de esta ruta están a su vez reguladas por miRNAs

(DCL1 por miR162; AGO1 por miR168) estableciendo una retroalimentación

negativa en la regulación de su vía de biogénesis [52, 53].

Aunque la mayoría de los estudios sobre el papel de miRNAs en desarrollo

se han realizado en la planta modelo Arabidopsis thaliana, se sabe que muchos de

estos miRNAs y los sitios complementarios en sus genes blanco se encuentran

evolutivamente conservados en las angiospermas, gimnospermas, helechos,

musgos y otras briofitas [54].

miRNAs en respuesta a estrés

Las plantas como organismos sésiles se enfrentan frecuentemente a una

variedad de condiciones ambientales adversas. Por ello han desarrollado

mecanismos sofisticados de defensa que les permiten contender con el estrés. A

la fecha, se ha demostrado la participación de diferentes miRNAs en varios tipos

de estrés en Arabidopsis thaliana y otras especies de plantas [55-57].

Curiosamente, en este caso solo algunos de los miRNAs identificados son

conservados en diversas especies de plantas, mientras que otros son

característicos solo para cierto linaje o incluso especie-específicos. Entre las

familias conservadas se encuentran miR395, miR397, miR398, miR399 y miR408.


102

Para estas familias se ha observado que también sus genes blancos propuestos o

demostrados experimentalmente se encuentran conservados entre diferentes

especies. En cambio, para las familias características de un linaje o de una

especie los genes blancos y secuencias complementarias se encuentran poco

conservados [58].

La mayor parte de los estudios se han enfocado a la identificación de

miRNAs cuya expresión varía en respuesta a un reto en particular [59]. En

Arabidopsis thaliana, un análisis de sRNAs en respuesta a deshidratación, frío,

salinidad o presencia de ácido abscísico (ABA), hormona señalizadora para

diversos tipos de estrés, encontró que, dependiendo del estrés, unos miRNAs

incrementan su expresión, mientras otros bajan [55]. Por otra parte, algunos

miRNAs pueden tener rol en múltiples tipos de estrés. Por ejemplo, miR398

modifica su expresión en déficit hídrico, déficit de cobre, infección por patógenos y

estrés por calor entre otros [59]. Sus genes blanco son la Cu/Zn Superóxido

Dismutasa 1 y 2 (CSD1, CSD2) [60], una Chaperona de Cobre para la Superóxido

dismutasa (CCS1) [61] y la subunidad V de la Citocromo c OXidasa (COX5b-1)

[62]. Las superóxido dismutasas son muy importantes para contender con el

aumento de especies reactivas de oxígeno (ROS) durante el estrés oxidativo, lo

que concuerda con la disminución de miR398 en este tipo de estrés.

mi 3 y mi 8 participan en la omeostasis de cobre y estr s ídrico,

salino o por frío [59, 63]. Los blancos de miR397 y miR408 en Arabidopsis thaliana

incluyen a transcritos que codifican para proteínas de unión a cobre como lacasas

y plantacianina [64]. Su expresión aumenta en estrés por frío y déficit de cobre.

Entre otros miRNAs relevantes en respuesta a estrés, se encuentra miR395 cuyo

blanco en Arabidopsis thaliana es la ATP sulfurilasa (APS) quien participa en el

metabolismo de sulfato [65] y miR399 que inhibe la expresión de una enzima

conjugadora de ubiquitina (UBC) y favorece la acumulación de Pi mediante la

estabilización del transportador PHO2 [66].

Muchos de los miRNAs conservados que participan en diversas etapas del

desarrollo de la planta, también se reportaron en los escrutinios de bibliotecas de

miRNAs con expresión modificada por diversos tipos de estrés. Tal es el caso de

miR156, miR159, miR172, miR168 y otros [67, 68]. Aunque para muchos otros

miRNAs involucrados en estrés, no se conoce con certeza el mecanismo de

regulación, se ha abierto el camino de exploración experimental mediante la

predicción bioinformática de genes blancos.


103

Aplicaciones biotecnológicas

La versatilidad de la acción ejercida por los diferentes tipos de sRNAs en

plantas los ubica en el centro de las investigaciones básicas y aplicadas de estos

organismos. El uso de miRNAs artificiales (a-miRNAs) o ta-siRNAs sintéticos (syn-

ta-siRNAs) posibilita el estudio funcional de múltiples genes en plantas [69, 79]. Se

han desarrollado herramientas bioinformáticas confiables para su diseño con el

objeto de un apagado eficaz de los genes blanco [71]. Estas herramientas también

pueden ser utilizadas para obtener resistencia a virus en cultivos de interés

agrícola [72]. Dado el impacto que pueden tener los miRNAs en la respuesta a

diversos tipos de estrés, se ha establecido que forman parte de la respuesta

inmune de la planta y tanto miRNAs o pha-siRNAs particulares, como los

componentes de su ruta de biogénesis se consideran como bio-marcadores

potenciales para la resistencia a patógenos o estrés [73].

Por otra parte, el uso de sRNAs en el mejoramiento agrícola implica la

obtención de plantas transgénicas y la presencia de efectos colaterales propios de

la respuesta de la planta al método utilizado. De hecho, la existencia del

silenciamiento mediado por RNA fue descubierto en un intento de obtener plantas

transgénicas de Petunia sobre-expresoras de una enzima en la ruta del color

morado de las flores [74]. Es por ello que es importante estudiar el impacto que los

métodos biotecnológicos pueden tener en la respuesta de las vías de diferentes

clases sRNAs en las especies de plantas con relevancia agrícola. En este sentido,

nuestro grupo de trabajo se ha dedicado en los últimos años a investigar el papel

de los sRNAs en el proceso de embriogénesis somática de maíz [28, 75, 76].

La embriogénesis somática es un proceso alterno a la embriogénesis

cigótica donde las c lulas som ticas, bajo ciertas condiciones de inducción,

pueden generar c lulas embrionarias y regenerar plantas [77]. a embriog nesis

som tica se induce generalmente mediante un estímulo con itoreguladores ue

causan des-di erenciación de las c lulas del explante, activación de la división

celular, y cambio en el patrón de expresión gen tica Figura 6). Una vez

establecida la proliferación del tejido des-diferenciado con potencial embriogénico

(callo embriogénico), este se puede mantener por tiempo relativamente

prolongado en cultivo para posteriormente inducir la regeneración de plantas. a

embriog nesis som tica es importante en la biotecnología vegetal para la

propagación clonal de plantas con ciclo de vida largo y para la trans ormación

gen tica. En el maíz, la capacidad embriog nica parece estar limitada a la

utili ación de embriones e in lorescencias u ojas en estado meristem tico como

explante inicial y es altamente dependiente del genotipo [78].


104

Figura 6. Embriogénesis somática y regeneración de plantas (ejemplificado para maíz). Se representa esquemáticamente la inducción de tejido des-diferenciado en presencia de fitoreguladores y oscuridad a partir de embriones inmaduros; el establecimiento y proliferación de callos embriogénicos capaces de regenerar plantas completas retirando los fitoreguladores y en presencia de luz y la propuesta de un rol crucial para las diversas rutas de RNAs pequeños en plantas en los eventos moleculares que ocurren durante este proceso.

Análisis globales o particulares de sRNAs durante las diferentes etapas de

embriogénesis somática de varias especies de plantas han encontrado expresión

diferencial de ciertos miRNAs y sus mRNA blanco demostrados o predichos [79-

82]. Muchos de los sRNAs regulados diferencialmente durante este proceso

corresponden a miRNAs relacionados a desarrollo o respuesta a estrés. Esto

muestra correspondencia con la reprogramación genética y los cambios

fisiológicos drásticos que tienen lugar en la inducción de callos embriogénicos y la

regeneración de plantas. Por otra parte, el principal fitoregulador utilizado en el

proceso son las auxinas, las cuales como se mencionó arriba, incluyen a varios

miRNAs y ta-siRNAs en la regulación de sus vías de señalización. La exploración

intensa del papel de los sRNAs en la embriogénesis somática tiene por objeto

relacionar su función con la capacidad embriogénica de los explantes y genotipos,

así como con la eficiencia en la regeneración de plantas [76, 82].


105

Aunque los esfuerzos se han centrado por ahora en los miRNAs, otras

clases de sRNAs como los hc-siRNAs pueden tener un papel importante en la

reprogramación epigenética y la capacidad de responder al estímulo con auxinas

[83, 84]. En este sentido, en la embriogénesis somática inducida a partir de

embriones inmaduros de la variedad sintética mexicana VS-535 (raza Tuxpeño)

hemos encontrado cambios importantes en la metilación de TEs durante la

inducción, coincidentes con cambios en la expresión de componentes de la vía

RdDM (Figura 6; [28, 85]). Una vez establecida la proliferación de callos

embriogénicos en VS-535, se presentan pocos cambios en la metilación de TEs o

en la expresión de componentes de la vía RdDM por al menos 18 meses de

subcultivo. Sin embargo, en subcultivos prolongados (2 años o más) se

observaron cambios en la metilación de ciertos TEs [85] y disminución fuerte en la

expresión de ciertos miRNAs [75]. Esto podría asociarse a las variaciones

estocásticas no deseadas que frecuentemente se observan en las plantas

regeneradas por embriogénesis somática, tanto en maíz como en otras especies

[86]. Un objetivo a futuro será determinar el tiempo óptimo de permanencia de los

callos embriogénicos en subcultivo, en dependencia del fin con que se utilizan y de

las modificaciones epigenéticas que sufren.

Conclusiones

Las plantas han jugado un papel importante en el entendimiento de la

función de los RNAs no codificantes en eucariontes. La presencia de múltiples

miembros de cada una de las familias de proteínas que participan en la biogénesis

y acción de sRNAs propicia una amplia versatilidad en los mecanismos de

regulación ejercidos por estas moléculas. Los miRNAs son componentes cruciales

de redes regulatorias en el desarrollo, respuestas a estrés, e incluso en

modificaciones epigenéticas. Los hc-siRNAs ayudan a preservar la estabilidad del

genoma y mantienen el control epigenético sobre los elementos transponibles. Los

pha-siRNAs y ta-siRNAs, a su vez controlados por miRNAs específicos, participan

en la inmunidad de las plantas, la defensa antiviral, el establecimiento de polaridad

y tamaño de órganos, así como en el control epigenético. Las tecnologías masivas

de secuenciación han revelado que hay otros sRNAs que no pueden ubicarse

dentro de los grupos mencionados y cuya función se desconoce hasta el

momento. Aún dentro de los grupos de miRNAs, pha-siRNAs y hc-siRNAs,

permanece abierto un largo camino de estudios para comprender sus funciones en

las plantas, particularmente en aquellas que representan un interés agronómico.

Asimismo, la producción biotecnológica masiva y la transformación genética de

plantas, se verán ampliamente favorecidas con el conocimiento de los


106

mecanismos moleculares mediados por sRNAs que operan en el proceso de

embriogénesis somática.

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110

Semblanza de la Dra. Tzvetanka Dimitrova Dinkova

Estudió la Licenciatura en

Bioquímica en la Facultad de Biología de

la Universidad de la Habana, Cuba.

Realizó estudios de doctorado en Ciencias

Bioquímicas en la Facultad de Química de

la UNAM y obtuvo el premio Weizmann a

la mejor tesis doctoral en Ciencias

Naturales. Posteriormente, reali ó una

estancia Posdoctoral en el departamento

de io uímica y iología olecular de

Louisiana State University Health

Sciences Center – Shreveport, LA, USA.

Actualmente trabaja como Profesor Titular

B en la Facultad de Química de la UNAM,

es Investigador Nacional Nivel I y miembro

de la Academia Mexicana de Ciencias.

Imparte varios cursos en el área de la Genética y Biología Molecular a nivel de

licenciatura y posgrado. Ha dirigido 8 tesis de licenciatura, 9 de maestría y 3 de

doctorado. Ha publicado 26 artículos de investigación y 6 capítulos en libros. Sus

publicaciones cuentan con más de 320 citas. Ha participado en numerosos

congresos nacionales e internacionales y ha sido invitada a impartir conferencias y

seminarios en diferentes foros académicos en el país y en el extranjero. Su tema

de investigación actual es la regulación de la expresión genética mediada por

factores de traducción y RNAs pequeños en los procesos del desarrollo y

respuesta a estrés en plantas.

el universo de rnas pequeÑos en plantas:...

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