ELEKTROFOREZ

Arş.Gör. Nahit GENÇER

Elektroforez nedir?

Yüklü bir molekülün iki elektrod arasına konulduğunda yüküne göre katod yada anoda göçme işine elektroforez denir.

Göç hızı

●Molekülün büyüklüğüne

●Yapısına

●Jelde kulanılan maddenin konsantrasyonuna

●İyonik kuvvete

●Uygulanan akıma bağlı olarak değişmektedir.

Kullanım amaçları

Saflaştırma

Saflık kontrolü

Moleküler ağırlığı saptama

Kalıtsal yada kalıtsal olmayan hastalık tanısı

Bir enzimin izomerlerinin saptanması

İmmünoloji ve moleküler biyoloji çalışmalarında

Elektroforez 2'ye ayrılır:

●Jel Elektroforezi

●Kağıt ve Selüloz Asetat Elektroforezi

JEL ELEKTROFOREZİ

●Jel elektroforezi makromolekülleri (nükleik asit, protein...) büyüklük, elektrik yük ve diğer özelliklerine göre ayırmada kullanılır.

●Genetik çalışmalarda ve evrimsel ilişkilerin belirlenmesinde çok önemlidir.

●Destek materyal olarak agaroz, poliakrilamid yada ikisinin karışımı kulanılır.

Kullanılan destek materyale göre jel elektroforezi 2'ye ayrılır.

● Agaroz Jel Elektroforezi

● Poliakrilamid Jel Elektroforezi(PAGE)

AGAROZ JEL ELEKTROFOREZİ

●Agaroz, bir kırmızı alg türü olan Agar agar'dan elde edilen dallanmamış zincirli bir polisakkariddir.

●Agaroz jel çok büyük porlara sahiptir.

●Moleküler ağırlığı 200 kdalton’dan büyük moleküleri ayırmada kulanılır.

●Agaroz jel genellikle %1-3 konsantrasyonlarında hazırlanır.

●DNA, lipoprotein, enzim ve immunoglobinleri ayırmada kullanılır.

●Agaroz, D-galaktoz ve 3,6 anhidro L-galaktoz içeren agarabioz ünitelerinin tekrarlanmasından meydana gelir.

Agaroz Jelin Hazırlanması

Kullanılan malzemeler

●Agaroz 50ml %1'lik●TBE(tris borat) tamponu

● 54gr Tris-base● 27,5gr Borik asit● 20ml 0,5M EDTA pH=8● Üzeri 1lt distile su ile tamamlanır.

●Agaroz yükleme boyası● %0,15 Bromfenol mavisi● %30 Sukroz

●Etidyum bromür

Uygulanması

●Agaroz, TBE tamponu içersinde ısıtılarak çözünür.

●Etidyum bromür eklenir.

●Jel kasete dökülür tarak konarak polimerleşmesi beklenir. (Hava kabarcığı olmamasına dikkat edilir.)

●Polimerleşmeden sonra tarak kaldırılır.

●Örnek, agaroz yükleme boyası ve distile su ile karıştırılarak kuyucuklara yüklenir.

●Elektrik akımı verilir.(DNA için 80V)

AGAROZ JELİN UYGULANMASI

Sonuçlar

Blotting Yöntemi

Kullanılan destek materyale göre jel elektroforezi 2'ye ayrılır.

Metin eklemek için tıklayın

● Agaroz Jel Elektroforezi

● Poliakrilamid Jel Elektroforezi(PAGE)

POLİAKRİLAMİD JEL ELEKTROFOREZİ (PAGE)

●Poliakriamid, akrilamid monomerlerinin çapraz bağlayıcı moleküller yardımıyla kovalent bağlanmasından oluşan bir polimerdir.

●Poliakrilamid jel genelikle %3-30 konsantrasyonlar arasında hazırlanır.

●Moleküler ağırlığı 5-200 kdalton arasındaki moleküleri ayırmada kullanılır.

●Protein, polipeptid, gen sekansı ve enzim analizleinde uygulanır.

Poliakrilamid, akrilamid monomerlerinin çapraz bağlayıcı moleküller yardımıyla kovalent bağlanmasından oluşur.

PAGE değişik şekillerde adlandırılır.

●Jelin biçimlerine göre● Tüp jel elektroforezi● Slab jel elektroforezi

●Jelin konumuna göre● Dik jel elektroforezi ● Horizontal jel elektroforezi

●Jelin kimyasal bileşimine göre● Natif jel elektroforezi ● SDS'li jel elektroforezi

●Jelin gözenek dağılımına göre● Homojen jel elektroforezi● Gradient jel elektroforezi

●Jelin türüne göre● Kontinius jel elektroforezi● Diskontinius (kesikli) jel elektroforezi

Poliakrilamid jelin hazırlanması

●Jel

● Seperatör jel(ayırıcı)

● Stacking jel(toplayıcı)

●Örnek (örnek+ÖHT=5-20ul)

●Örnek hazırlama tamponu(ÖHT)

●Üst ve alt tampon

●Jel Boyaması (CBB, amido black, gümüş boyaması)

Jellerin Hazırlanması

Seperatör Gels:

Gel concentration of 12.5% in 0.25 M Tris-HCl pH 8.8

Volume Volume Reagent: (ml: TO MAKE 30 ML) (ml: TO MAKE 10 ML)40% stock*: 9.4 3.1water (distilled) 12.3 3.81 M Tris-HCl pH 8.8 7.5 2.510% SDS 0.3 0.1Peroxydisulphate 1% 0.5 0.5TEMED (added last) 20 ul 20 ul

Stacking Gels:

Gel concentration of 4.5% in 0.125 M Tris-HCl pH 6.8

Volume Volume Reagent: (ml TO MAKE 15 ML) (ml TO MAKE 10 ML)40% Acrylamide stock 1.7 1.1water 10.8 7.11 M Tris-HCl pH 6.8 1.9 1.2510% SDS 0.15 0.1Peroxydisulphate 1% 0.5 0.5TEMED (stir quickly) 20 ul 20 ul

Örnek hazırlama tamponu

●0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 4ml

●Gliserol 3,2ml

●%10 SDS 6,4ml

●2 -mercaptoethanol 1,6ml

●1% bromophenol blue 0,8ml

●Distile su 4ml

20ml

Örnekler, örnek hazırlama tamponuyla eşit oranda karıştırılır.

SDS-PAGE için örnekler önce ısıtılır, oda sıcaklığına gelince jele uygulanır.

PAGE Uygulaması

●Camların arasına spacer'lar yerleştirilmelidir.

●Seperatör jel dökülerek polimerizasyonu beklenir.

●Seperatör jel polimerize olduktan sonra stacking jel dökülür ve tarak yerleştirilir.

●Stacking jel polimerleştikten sonra tarak çıkarılır.

●Alt ve üst tamponlar doldurulur.

●Örnek ve ÖHT eşit hacimde karıştırarak kuyucuklara yüklenir.

●Elektrik akımı verilir.

SDS-PAGE

Sonuçlar

Jel boyaması

●Coomassie brillant blue

●Gümüş boyama

●Amido black

Elektroforez 2'ye ayrılır

●Jel Elektroforezi

●Kağıt ve Selüloz Asetat Elektroforezi

KAĞIT VE SELÜLOZ ASETAT ELEKTROFOREZİ

●Destek maddesi olarak selüloz kağıt şerit ve selüloz asetat şerit kullanılır.

●Küçük moleküler ağırlıklı moleküllerin MA’larının tayini, örnek karışımının saflaştırılması ve izoelektrik noktasının tayininde kullanılır.

●Klinik biyokimyada yaygın olarak kullanılmaktadır.

●Özellikle serum proteinlerinin gruplara ayrımında kullanılır.

Avantajları

●Aktivite boyaması için uygundur.

●Oldukça ucuzdur.

●Hazır olarak bulunur.

●Saydam hale getirilebilir.

●Protein boyası ile boyanabilir.

Uygulanması

●Örnek tatbikinden önce şerit tamponla ıslatılır.

●Şeritler iki ucu tampon çözeltisi ve iki elektrod ile temas edecek şekilde cihaza yerleştirilir.

●Örnek şeridin ortasına nokta yada düz bir hat şeklinde iz bırakacak şekilde uygulanır.

●Ayrılacak maddeye göre değişik süre (10-60dak) ve değişik voltaj (250-500V) uygulanır.

●Süre sonunda akım kapatılır.

Örnek görünür değilse boya (CBB) ile boyanır.