BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu

medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan lisrtik tergantung

pada muatan, bentuk dan ukuran. Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat

di deteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, atau pun dilakukan kuantifikasi

dengan densitometer. 

Banyak molekul biologi bermuatan listrik yang besarnya tergantung pada pH

dan komposisi medium dimana molekul biologi tersebut terlarut. Bila berada

dalam suatu medan listrik, molekul biologi yang bermuatan positif akan

bermigrasi ke elektroda negative dan sebaliknya. Banyak molekul biologis seperti

asam amino, peptida, protein, nukleotida dan asam-asam nukleat memiliki gugus

yang dapat engion sehingga bermuatan listrik, baik sebagai kation (+) atau anion

(-). Bahkan senyawa yang non polar seperti karbohidrat dapat diberi muatan.

Bila berada dalam suatu medan listrik, molekul biologi yang bermuatan

positif akan bermigrasi ke elektroda negative dan sebaliknya. Prinsip inilah yang

dipakai dalam elektroforesis untuk memisahkan molekul-molekul berdasarkan

muatanya. Oleh karena partikel sol bermuatan listrik, maka partikel ini akan

bergerak dalam medan listrik. Pergerakan ini disebut elektroforesis. Jika sistem

koloid bermuatan negative, maka partikel itu akan menuju elektrode positif

Elektroforesis dengan Agarosa merupakan metode standar untuk

memisahkan, mengidentifikasi, mengkarakterisasi dan purifikasi dari molekul

DNA/RNA. Cara pemisahan dengan elektroforesisi ini merupakan alat pendukung

yang sangat pokok dalam teknologi DNA rekombinan, dengan aplikasi yang

begitu luas baik untuk pemisahan untai tunggal atau untai ganda molekul DNA.

1.1 Rumusan masalah

1. Apa yang dimaksud dengan Elektroporesa DNA?

2. Bagaimana prinsip metode Elektroporesa DNA?

1

3. Sampel apa yang digunakan untuk Elektroporesa DNA?

4. Apa fungsi metode Elektroporesa DNA?

5. Bagaimana cara kerja Elektroporesa DNA?

6. Apa keuntungan dan kekurangan Elektroporesa DNA?

1.2 Tujuan

1. Mengetahui definisi, prinsip, fungsi dan cara kerja Elektroporesis DNA

2. Mengetahui keuntungan dan kekurangan metode Elektroporesis DNA

2

BAB II

PEMBAHASAN

A. Definisi

Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan

berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik . Medan

listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan

dipisahkan. Teknik ini digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada

pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang

bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik

dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut

akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul

tersebut tergantung pada nisbah muatan terhadap massanya serta tergantung pula

pada bentuk molekulnya. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz,

yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi

elektris lingkungan:

Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi,

dan memurnikan fragmen DNA. Pergerakan molekul terutama tergantung di

muatan yang ada pada permukaan partikel, tanda dan besarnya muatan pembawa

oleh variasi group ionogenik. Tergantung kepada kekuatan molekul listrik dan pH

dari medium dalam mengkateristik, sehingga pemisahan molekul dapat terjadi

karena efek seleksi dan medium yang sesuai.

DNA atau DeoxyriboNucleic Acid merupakan asam nukleat yang menyimpan

semua informasi tentang genetika. DNA inilah yang menentukan jenis rambut,

warna kulit dan sifat-sifat khusus dari manusia. DNA ini akan menjadi cetak biru

(blue print) ciri khas manusia yang dapat diturunkan kepada generasi selanjutnya.

Sehingga dalam tubuh seorang anak komposisi DNA nya sama dengan tipe DNA

yang diturunkan dari orang tuanya. Sedangkan tes DNA adalah metode untuk

mengidentifikasi fragmen-fragmen dari DNA itu sendiri atau secara sederhananya

adalah metode untuk mengidentifikasi, menghimpun dan menginventarisir file-file

khas karakter tubuh.

3

DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi

untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler.

DNA terdapat pada nukleus, mitikondria, dan kloroplas. Perbedaan ketiganya

adalah DNA nukleus berbentuk linier dan berasosiasi sangat erat dengan protein

histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak

berasosiasi dengan protein histon. Selain itu DNA mitokondria dan kloroplas

memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu.

Sedangkan DNA nukleus memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orangtua.

Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot tidak memiliki protein histon

dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linier dan memiliki

protein histon.

DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang anti pararel dengan

komponen-komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat dan

pasangan basa. Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan

bersifat herediter pada seluruh sistem kehidupan. Genom adalah set lengkap dari

materi genetik (DNA) yang dimiliki suatu organisme dan terorganisasi menjadi

kromosom. DNA juga dapat diisolasi, baik pada manusia maupun tumbuhan.

DNA manusia dapat diisolasi melalui darah. Komponen darah yang diisolasi yaitu

sel darah putih, karena memiliki nukleus dimana terdapat DNA didalamnya.

B. Prinsip Elektroporesis DNA

Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA

berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang

biasa digunakan antara lain agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan

untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga

20.000 pasang basa (bp).

Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi

melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran

molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA

dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi

fragmen-fragmen molekul DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui

4

ukurannya. Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar

ultraviolet setelah terlebih dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan larutan

etidium bromid. Cara lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel direndam di

dalam larutan etidium bromid sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet.

C. Sampel Elektroforesis DNA

Hampir semua sampel biologis tubuh dapat digunakan untuk sampel tes

DNA, tetapi yang sering digunakan adalah darah, rambut, usapan mulut pada pipi

bagian dalam (buccal swab), dan kuku.Sampel DNA yang digunakan bisa dari inti

sel maupun mitokondrianya. Namun yang paling akurat adalah inti sel karena inti

sel tidak bisa berubah. Biasanya yang digunakan adalah sampel darah karena lebih

gampang. Tapi sel darah yang di ambil adalah sel darah putih, bukan sel darah

merah, karena sel darah merah tidak mempunyai inti sel.

Untuk kasus-kasus forensik, sperma, daging, tulang, kulit, air liur atau sampel

biologis apa saja yang ditemukan di tempat kejadian perkara (TKP) dapat

dijadikan sampel tes DNA. Kita tidak perlu mengambil banyak. Bahkan, jika

hanya ditemukan puntung rokok, maka yang diperiksa adalah DNA inti sel yang

terdapat dalam epitel bibir karena ketika rokok dihisap dalam mulut, epitel dalam

bibir ada yang tertinggal di puntung rokok. Epitel ini masih menggandung unsur

DNA yang dapat dilacak. Hal ini karena bercak sperma, rambut, dan bercak darah

bisa diisolasi DNA-nya dan bisa diperbanyak jutaan kali dan kemudian bisa

diperiksa untuk identifikasi.

Untuk kasus pemerkosaan, yang diperiksa spermanya tetapi yang lebih utama

adalah kepala spermatozoanya yang terdapat DNA inti sel didalamnya. Sedangkan

jika di TKP ditemukan satu helai rambut maka sampel ini dapat diperiksa asal ada

akarnya. Namun untuk DNA mitokondria tidak harus ada akar, cukup potongan

rambut karena diketahui bahwa pada ujung rambut terdapat DNA mitokondria

sedangkan akar rambut terdapat DNA inti sel.

DNA yang biasa digunakan dalam tes ada dua yaitu DNA mitokondria dan

DNA inti sel. Perbedaan kedua DNA ini hanyalah terletak pada lokasi DNA

tersebut berada dalam sel, yang satu dalam inti sel sehingga disebut DNA inti sel,

5

sedangkan yang satu terdapat di mitokondria dan disebut DNA mitokondria.

Untuk tes DNA, sebenarnya sampel DNA yang paling akurat digunakan dalam tes

adalah DNA inti sel karena inti sel tidak bisa berubah. DNA dalam mitokondria

dapat berubah karena berasal dari garis keturunan ibu yang dapat berubah seiring

dengan perkawinan keturunannya. Tetapi karena keunikan dari pola pewarisan

DNA mitokondria menyebabkan DNA mitokondria dapat dijadikan sebagai marka

(penanda) untuk tes DNA dalam upaya mengidentifikasi hubungan kekerabatan

secara maternal.

D. Fungsi Elektroforesis DNA

Elektroforesis berfungsi untuk berbagai macam kegiatan,

antara lain membandingkan gen homolog dari spesies yang

berbeda, mengetahui susunan sekuens berbagai genom,

DNA finger printing, mengetahui ada atau tidaknya gen-gen

penyebab kelainan genetik atau penyakit tertentu, mendeteksi

lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau jaringan tertentu,

mengetahui aktivitas gen selama perkembangan berbagai tipe sel

organisme atau aktivitas gen sebelum dan sesudah diberi

perlakuan tertentu, mempelajari evolusi di tingkat molekular,

mengetahui variasi genetik dalam populasi natural di alam,

menentukan atau mengidentifikasi berat molekul fragmen DNA.

Elektroporesis gel memiliki komponen yang berbeda-beda fungsinya, yaitu

sebagai berikut:

1. Comb, digunakan untuk mwmbentuk well pada gel agarosa

2. Tray, digunakan untuk setakan gel agarosa

3. Chamber: digunakan sebagai wadah gel agarosa

4. Sumber listrik, digunakan untuk memberi arus saat proses elektroforesis

Fungsi alat dan bahan yang digunakan dalam praktikum elektroforesis gel agarosa ini yaitu :

1. Buffer elektroforesis yang terdiri dari TAE memiliki daya ion dalam larutan sebagai penghantar listrik.

2.  Loading dye berfungsi sebagai pemberat agar tidak keluar dari sumuran.

6

3. Etidium bromida sebagai pewarna DNA yang akan menyisip di sela-sela basa nukleotida.

4.  UV transiluminator untuk visualisasi pewarnaan DNA didalam gel agarosa.

5. Aquades sebagai pelarut6.  Baki gel agarosa sebagai cetakan gel agarosa7. TAE : Trisbase sebagai buffer sesuai dengan pH8. Asam Asetat Glasial sebagai elektrolit gram9. EDTA (Etylen Diamine Tetra Asetic Acid) sebagai pe-non aktif DNA10. Sisir elektroforesis untuk membuat sumuran pada gel agarosa11. Tangki elektroforesis untuk running DNA12. Mikropipet untuk mengambil dan menghomogenkan sampel DNA dan

loading dye13.  Kertas Parafilm untuk tempat menghomogenkan sampel DNA dan

loading dye14. Sarung tangan untuk melindungi terkena DNA-se yang dapat merusak

DNA

E. Cara Kerja Elektroforesis DNA

1.  Gel agarose dibuat (telah dilakukan oleh asisten) dengan campuran 2 gr

agarose + 200 ml 1x TBE, dididihkan dan ditambahkan etidium bromida

2 mL dicampur dengan baik, kemudian dituangkan ke dalam cetakan yang

telah disiapkan dengan combnya dan dibiarkan sampai mengeras.

2. Gel dimasukkan kedalam electrophoresis chamber dan ditambahkan

larutan running buffer serta etidium bromida.

3. Sampel DNA hasil PCR dicampurkan dengan loading bufferkemudian

dimasukkan ke dalam well pada gel dengan menggunakan mikropipet.

4. Marka DNA dimasukkan.

5. Penutup electrophoresis chamber dipasang dan power supplydinyalakan.

6. Setelah pewarna bergerak sampai bagian ujung gel, gel dikeluarkan dan

dilihat dengan sinar UV.

F. Keuntungan Dan Kekurangan

7

Agarosa memiliki beberapa kelebihan seperti mudah didapat, harganya relatif

murah, tidak bersifat toksik, serta memiliki pori yang kecil. Agarosa merupakan

polisakarida yang diekstrak dari rumput laut. Hasil dari elektroforesis gel agarosa

akan menunjukkan warna biru dari loading dye pada posisi paling depan

kemudian plasmid DNA berwarna orange terang.

8