重组 DNA 药物Recombinant DNA Drugs

三峡大学医学院 盛 德 乔

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重组 DNA 药物：应用重组 DNA 技术（包括基因工程技术和蛋白质工程技术）制造的基因重组多肽、蛋白质类治疗剂。

重组基因的表达？

克隆基因的表达 表达载体的构建 受体细胞的建立 表达产物的分离纯化

表达体系包括：表达载体

• 原核表达载体• 真核表达载体

宿主细胞• 大肠杆菌、芽孢杆菌、链霉菌（原核）• 酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞（真核）

1. 原核表达体系 (E.coli 表达体系 )

标准： 选择标志 多接头克隆位点 强启动子 翻译调控序列

E.coli 表达体系的不足： 不宜表达真核基因组 DNA ； 不能加工表达的真核蛋白质； 表达的蛋白质常形成不溶性包涵体 (inclusion body) ； 很难表达大量可溶性蛋白。

大肠杆菌表达载体的结构

除了含有与克隆载体相同的元件之外，还必须含有表达载体所需要的其它元件 :

1. 启动子 是 DNA 链上能与 RNA 聚合酶结合并起始

mRNA 合成的序列 大肠杆菌表达系统常用的启动子有： lacZ

启动子 强启动子

2. 核糖体结合位点 SD 序列（ Shine-Dalgarno sequence ） --mRNA

中用于结合原核生物核糖体的序列。 SD 序列与 AUG 之间的距离也会影响翻译

效率，一般以 5 ～ 13 个碱基为宜 表达载体都含有相应的 SD 序列及适当长

度的 SD-ATG 间隔距离

3. 终止子 基因或操纵子 3′ 的一段核苷酸序列 在表达载体中多放在多克隆位点的下游

表达载体

常用的大肠杆菌表达载体1. 非融合蛋白表达载体

表达的蛋白与天然状态下存在的蛋白在结构、功能、免疫原性方面基本一致。

2. 融合蛋白表达载体 融合蛋白（ fusion protein ）－表达的蛋白质或多

肽的 N 末端由原核 DNA 编码， C 末端由克隆的真核 DNA 编码。

这类载体 SD-ATG 间隔已固定，翻译起始信号组织合理，其表达的蛋白在其 N- 端或C- 端常融合有一段细菌的多肽或蛋白质。

pGEX 序列载体 （ Pharmacia 公司）1. GST 系统2. - 半乳糖苷酶系统3. 麦芽糖结合蛋白系统4. 蛋白 A 系统 IgG-Sepharose

表达标签 tag 常用的标签有：

GST- 谷光甘肽 -S- 转移酶， glutathione-S-transferase ）多肽 ，凝血酶（ Thrombin ）水解蛋白去掉 GST 标签

FLAG-DYKDDDDK ，专门设计用于融合蛋白质的免疫吸附纯化

HA (influenza hemagglutinin epitope-YPYDVPDYA) 流感血凝素抗原决定簇

His-C 末端、 N 末端、或内部带有 6×His 标签 (His-tagged) 的融合蛋白

c-myc (EQKLISEEDL) 方便蛋白的鉴定和纯化！

GST 纯化系统

大肠杆菌表达系统 优点：

遗传背景清楚用大肠杆菌进行遗传操作的方法非

常完善生长繁殖周期短

表达中的问题

1. 缺乏转录后加工机制，只能表达 cDNA;

2. 缺乏翻译后加工机制，不能折叠和糖基化 ;

3. 融合蛋白形成包涵体（ inclusion body ），复性后才有活性 ;

4. 很难表达大量的可溶性蛋白。

为什么建立真核表达系统？ 原核表达系统的缺陷：不能对

表达的真核蛋白进行正确的折叠和翻译后加工 !!!

哺乳动物细胞表达系统

2. 真核表达体系 真核细胞：酵母、昆虫、哺乳类动物细胞 优点：可表达克隆的 cDNA 及真核基因组

DNA 可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分区域积累

缺点：操作技术难、费时

真核表达载体真核表达载体的功能元件

1. 原核 DNA 序列2. 启动子3. 增强子4. 剪接信号5. 终止信号和加 poly(A ）信号6. 筛选标记新霉素抗性基因 neor 胸苷激酶基因 tk

真核表达载体的种类 质粒型载体

pcDNA 系列 Invitrogen 公司产品pCMV-HA Clontech 公司产品

病毒型载体逆转录病毒载体腺病毒载体昆虫杆装病毒载体

表达载体 pcDNA4 的物理图谱

转染 —— 将表达载体导入真核细胞的过程 方法：

• 磷酸钙转染• DEAE葡聚糖介导转染• 电穿孔 • 脂质体转染 （ Lipofectamine invitrogen 公司产品 ,实验室常用）

• 显微注射 • 转染（病毒载体）

外源基因在真核细胞中的表达方式

1. 依表达时间长短 瞬时表达（一过性表达） 不整合 稳定表达 筛选

2. 表达方式 分泌表达，非分泌表达 融合表达，非融合表达

瞬间表达 Transient expression : 外源基因不整合到宿主染色体中，不能复制，在细胞中的表达时间较短 (2-3 天 ) ，转染的方法相对简单，耗时较少，适用快速分析 .

稳定表达 Stable expression : 外源基因整合到宿主染色体 , 需要筛选，可获得稳定表达的细胞株，可复制，并可以稳定传代，耗时长，不易成功 .

哺乳动物细胞表达体系 CHO 细胞表达系统 ： CHO 细胞表达系统能准确进行转录后重组蛋白的加工修饰，表达的糖基化蛋白在分子结构和生物学活性方面与天然蛋白十分接近。 CHO 细胞属于成纤维细胞，很少分泌自身的内源蛋白，而表达的外源产物是胞外分泌的，这样便于产物的下游分离纯化；在 CHO 细胞内重组基因能高效扩增和表达； CHO 细胞贴壁生长，且具有较高的耐受剪切和渗透压能力，可以进行悬浮培养。

幼仓鼠肾（ BHK ）细胞表达系统

哺乳动物细胞表达体系优点： 一是哺乳动物细胞能够表达人或哺乳动物的蛋

白质；二是哺乳动物细胞可对表达的蛋白质进行正确折叠、组装和糖基化等加工，生产有生物活性的产品。

真核基因表达应注意的问题：1. 载体必须是表达载体2. 目的基因不能有内含子3. 克隆过程中不能改变其 ORF

基因工程细胞因子类药物1

基因工程肽类激素药物2

重组溶血栓药物3

基因工程酶类药物4

基因工程蛋白质类药物

重组可溶性受体和黏附分子5

细胞因子是指机体细胞合成和分泌的小分子多肽类因子，它们具有调节机体的生理功能和免疫功能，因而有可能利用基因工程技术进行生产，用于治疗肿瘤、感染、免疫低下、造血功能障碍等疾病。目前已研制成功或正在研制的基因工程细胞因子类药物主要有促红细胞生成素 (EPO) 、集落刺激因子 (CF) 、干扰素（ IFN ）、白细胞介素 (IL) 、肿瘤坏死因子 (TNF) 、趋化因子、生长因子（ GF ）和凝血因子（ F ）等。

基因工程细胞因子类药物

基因重组人促红细胞生成素（ eryth

ropoietin,EPO ） EPO 是一种主要由肾脏和中枢神经系统等部位合

成分泌的多功能糖蛋白激素 , 是作用于红系祖细胞的造血生长因子，对神经元的许多功能也具有重要的调控作用。

EPO 是最早发现并首先运用于临床的造血生长因子， 1985年成功表达了重组人促红细胞生成素(rhEPO) 。 rhEPO 成为当前研究开发最成功的基因工程药物。

促细胞生成素的生物学作用

EPO 主要通过促进骨髓中红系祖细胞的存活、增殖和分化以调控红细胞的生成。 促进系祖细胞的增殖、分化和成熟 调控神经元部分功能 对细胞内钙浓度也有明显的调节作用

人促红细胞生成素基因重组 天然的 hEPO 制品一般是从贫血病患者尿中提取

的，所以药源极为匮乏，不能满足需要。因此，在 20世纪 80年代就开始 rhEPO 的研究，从胎儿肝中克隆出 hEPO 基因 , 并研制成功 rhEPO 。1985年美国 FDA 批准 rhEPO 作为治疗肾性贫血的药物。

研制 rhEPO 的主要环节包括 : 获得人促红细胞生成素基因和建立重组人促红细胞生成素的有效表达系统等。

hEPO 基因由 5 个外显子（共 582bp ）和 4 个内含子（共 1562bp ）组成。外显子共编码 193个氨基酸，包括组成信号肽的 27 个氨基酸。

经人促红细胞生成素 cDNA 的克隆及其核苷酸序列的测定。

利用 PCR 技术扩增 EPO 基因：人胎肝中提取总mRNA →RT-PCR 技术克隆 hEPO 基因。 (cDNA)

将 cDNA插入真核表达载体，转入哺乳动物细胞表达。

重组人促红细胞生成素的表达系统 为了获得分子结构和生物学活性与天然 EPO 相似的 rhEPO ，选用哺乳动物细胞表达系统，如中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞表达系统、非洲绿猴肾细胞 COS7 表达系统、幼仓鼠肾（ BHK ）细胞表达系统。目前国内外首选 CHO 细胞表达系统用来表达生产 rhEPO 。

昆虫细胞表达系统、乳腺表达系统

促红细胞生成素临床应用 肾功能衰竭所致的贫血：这种病只有靠连续输血维持生命，但输血又使病人面临病毒感染和血过量的危险。 EPO 有刺激红细胞生成，免去慢性肾衰竭病人的输血。

癌性贫血：肿瘤引起的贫血或接受化疗、放疗所引起的贫血。

结缔组织病贫血：类风湿性关节炎和红斑狼疮所致的贫血。

骨髓增生异常综合征贫血：促进骨髓造血状况改善。

基因工程肽类激素药物 肽类激素是由内分泌腺或内分泌细胞产生

和分泌的生物活性物质，经血液循环，局部弥散到相应的组织和细胞与受体特异结合发挥其调节作用，参与机体的生长、发育、生殖等多种生命活动过程。人生长激素、重组人胰岛素、重组人降钙素、

重组人胰高血糖素和重组人胰高血糖素样肽 -1

重组合成胰岛素

胰岛素与糖尿病：

胰岛素的发现对改变糖尿病患者的命运及揭示糖尿病的病因及相关影响因素意义重大。

胰岛素的结构

人胰岛素的一级结构胰岛素的两个肽链分别为

21 个氨基酸组成的 A链和 30 个氨基酸组成的 B 链，氨基酸排列有种属差异。

胰岛素的合成方法

方法一：分别合成 A 链和 B 链法 1 9 7 8 年，美国国立医学中心的有关专家用基因重组法进行人胰岛素的合成，即让大肠杆菌分别产生胰岛素的 A 链和 B链，再用化学方法将两者连结起来。

分别合成人胰岛素 A 链、 B 链的人工基因，（把甲硫氨基酸基因引入其中，以色氨酸合成酶基因作为启动子）制备 A 链和 B 链的质粒。

游离的 A 链、 B 链进行初步纯化

将两者混合，在二硫代苏糖醇存在下形成二硫链，合成了 “ 生物合成的 人 胰 岛 素 (BHI) ”

分别引入大肠杆菌 K12 ，并使其增殖

方法二：通过合成人胰岛素原的方法

即先合成人胰岛素的前体，即胰岛素原，再用酶切除 C 肽而制备人胰岛素。

A链

C 肽 B

链

合成人胰岛素原的 DNA

引入大肠杆菌 K-1 2 株，生成与色氨酸合成酶相连的人胰岛素原

以溴化氰切断、 纯化

在 β-巯基乙醇存在下使胰岛素原分子折叠，在正确的位置 形成二硫键

精制

用胰蛋白酶切断 C 肽、用羧肽酶 B 除去 B链 C 端残留的精氨酸，即生成胰岛素

影响分离纯化的主要因素1.产物活性、纯度和杂质2.产物表达形式和表达水平3.产物本身的分子特性4.产物的用途和需求量

基因工程药物的分离纯化

基因工程药物的质量控制 与传统药品生产的区别

利用活细胞作为表达系统，产品为蛋白质，具有复杂的分子结构．

产品的制备过程中，药物容易发生变化． 参与人体的生理调节作用，极微量就可产生显著效应，在性质或剂量上不能有任何偏差．

因此，必需要严格控制药品质量，确保产品安全有效。

分泌量极低而生理药理活性极高

具有细胞和组织特异性

多数细胞因子具有多功能性

细胞因子间存在复杂的相互作用

具有低免疫原性

基因工程药物的特点

基因工程药物的质量要求A. 提供表达体系及工程菌的详细资料。B. 提供培养方法，纯化方法、除去微量杂质的方法等。

C. 要求进行理化鉴定，包括产品的特征、纯度及与天然产品的一致性。

D. 要求进行外源核酸和抗原检测E. 与天然产品进行生物活性或效力试验的比较F. 进行动物毒性试验G. 要有足够的对人体的安全性资料H. 必须经过临床试验，以评价其安全性和有效性。

1)原材料的控制：　　　表达载体和宿主细胞　　　克隆基因的序列

2)生产的控制：　　　原始细胞库　　　有限代次的生产　　　连续培养生产　　　分离纯化

基因工程药物的质控要点

目的蛋白质的含量测定产物杂质检测

宿主细胞蛋白、病素和细菌等微生物、热原质、内毒素、致敏原及 DNA等

终产品的质量控制 产品的鉴定：

方法：电泳法、免疫学分析法、受体结合试验和高效液相色谱法等

内容：氨基酸成分分析、肽图分析、蛋白质浓度及分子量测定、蛋白质二硫键分析

纯度分析

生物活性测定：

安全性评价：

稳定性考察：

产品一致性的保证：

体内生物活性测定：根据目的基因产物的 生物学特性，建立适合的生物学模型体外生物活性测定：细胞培养计数法等

除一般安全性要求外，还要根据基因工程产品本身的结构特性，进行某些药物动力学和毒理学研究。

对纯度、分子特征和生物学效价等多方面进行综合评价

几种常见基因重组药物 重组人胰岛素（ rh-Insulin ）

本品是最早上市（ 1982年）的基因重组药物。我国以大肠菌或酵母菌为工程菌的生产也已获得成功。本品减少了动物胰岛素的过敏反应。

重组人生长激素（ rh-GH ）促进长骨的软骨生长区而增加长度，增加肌细

胞数目和体积等作用而促进生长。

重组人干扰素（ rh-IFNs ） 调节机体免疫防御功能，增加 NK 细胞、 TC 细胞杀伤力；增强巨噬细胞吞噬活动；直接抑制及杀伤肿瘤细胞。具有抗病毒、抗肿瘤的效应。

重组人白细胞介素 -2 （ rh-IL-2 ） 促进 T 细胞、 NK 细胞增殖，增强其杀伤活性；促进

Β 细胞增殖及分泌免疫球蛋白；促进巨噬细胞分泌 TNF ，增强其杀伤活性；诱导产生 LAK 及 TIL 细胞。用于肾癌、黑色素瘤、膀胱癌、结肠癌、肺癌以及非何杰金氏淋巴瘤、癌性胸腔积液等肿瘤疾病的治疗。

重组人肿瘤坏死因子（ rh-TNF ） 直接杀伤肿瘤作用最强的生物活性因子，可引起肿瘤

组织出血性坏死，并增强机体抵抗力，提高射线抑制肿瘤细胞的增殖能力。用于各种肿瘤治疗。

重组人促红细胞生成素（ rh-EPO ） 为促进红细胞生成的造血因子，其主要功能是促进肝

细胞分化为原红细胞，加速幼红细胞的分裂增殖，促进网织细胞的成熟释放及血红蛋白的合成。用于治疗实施血透患者伴发的肾性贫血，再生障碍性贫血，多发性骨髓瘤，骨髓发育不良综合征等。