eliminasi cymbidium mosaic virus pada plbs anggrek ... · lampiran 2 tahapan umum penelitian ....

36

LAMPIRAN

37

Lampiran 1. DATA SHEET : RIBAVIRIN (Bertrand 2000 dalam McEvoy 2005)

Nilai toksisitas Non-Manusia :

Rat LD50 oral 5,3 g / kg; Mouse LD50 oral 2 g /

kg; Ip Mouse LD50 0,9-1,3 g / kg; LD50 ip rat 2 g / kg.

Formula molekul : C8-H12-N4-O5

Bobot molekul : 244.20

Warna / Bentuk : Tanpa warna/ Kristal putih bubuk

Bau : Tanpa bau

Rasa : Hambar

Melting Point : 166-168 oC (aq etanol); 174-176 oC (etanol).

Kelarutan : Larut air, Sedikit larut dalam alkohol. Dalam air, 142 mg /

mL pada 25 oC

Spectral Properties : Khusus rotasi optik: -36,5 derajat di 25 o

Fitotoksisitas : 100 ppm

C / D

38

Lampiran 2 Tahapan umum penelitian

Plbs (Protocorm likes bodies) dari anggrek Dendrobium

Deteksi CyMV pada plbs anggrek Dendrobium dengan DAS-ELISA

Perbanyakan plbs yang terinfeksi (+) pada media VW

(Vacin and Went) Cair

Eliminasi CyMV dengan perlakuan antivirus Ribavirin

Positif terinfeksi CyMV

Analisis Statistik

Negatif terinfeksi CyMV

Membedakan pola pita protein pada tanaman dan plbs anggrek Dendrobium sehat atau bebas CyMV dengan tanaman dan plb anggrek Dendrobium sakit (terinfeksi CyMV) dengan Elektroforesis Gel Komposit

39

Lampiran 3 Deteksi CyMV pada plbs anggrek Dendrobium dengan DAS-ELISA (Clark&Adam 1977; BALITHI 2003)

Inkubasi selama 1 malam pada suhu 4o

atau 2jam pada suhu 37C

o

C


atau 2jam pada suhu 37C

o

C


atau 2jam pada suhu 37C Cuci kembali dengan penyangga

o

C PBST 3 x 3 menit


atau 2jam pada suhu 37C Cuci kembali dengan penyangga

o

C PBST 3 x 3 menit

Inkubasi pada suhu kamar + selama 1 jam

Coating/lapisi lubang plate dengan antibody-anti CyMV (IgG) yang dicampur dengan penyangga “coating” ( 1,59 g Na2CO3 + 2,93 g NaHCO3 + 0.20 g NaN3 + H2O s/d 1 Liter)

(1:200), tiap lubang sebanyak 100 µl.

Cuci lubang plate dengan penyangga PBS Tween (8 g NaCl + 1,2 g KH2PO4 + 2,9 g Na2HPO4.12H2O + 0,2 g KCl + 500 µl Tween 20 + H2O s/d 1 liter) menggunakan botol

semprot 3 x 3 menit (sambil dishaker). Kemudian tunggu hingga cukup kering.

Timbang sampel (plbs anggrek) 0,2 g berikut control negatif dan positif CyMV, hancurkan dalam mortar dengan penyangga ekstraksi (PBS IX; 0,10% tween 20; 20%

PVP; 0,20% BSA) dengan perbandingan 1:5 s/d 1: 10

Masukan sampel ke dalam lubang plate sebanyak 100 µl, posisi sampel disesuaikan dengan format yang telah diisi sebelumnya

Masukan antibody-anti CyMV (yang telah dilabel dengan enzim alkalin fosfatase) yang dicampur dengan ECl (20% PBS 5 x 0,02% tween 20; 20% PVP; 0,20% BSA, H2O)

(1:200) sebanyak 100 µl

Masukan penyangga substrat yang mengandung 4-nitrophenylphosphate (1mg/ml), tiap lubang 100 µl

Setelah terjadi perubahan warna menjadi kuning, hentikan reaksi dengan NaOH 3 M sebanyak 25 µl

Ukur intensitas perubahan warna (kandungan virus) dengan menggunakan Elisa Reader pada panjang gelombang 410 nm

40

Lampiran 4 Perbanyakan plbs yang terinfeksi (+) pada media VW (Vacin and Went) Cair

Plbs terinfeksi CyMV

Masukan dan lakukan kultur dalam media VW Cair

Inkubasi selama 2 bulan (18oC) sambil di shaker

Plbs siap uji eliminasi CyMV dengan Ribavirin

41

Lampiran 5 Eliminasi CyMV dengan perlakuan antivirus Ribavirin

Plbs yang akan diberi perlakuan, berukuran + 5 mm

Ditanam pada media VW padat mengandung Ribavirin 0, 10, 20, 30, 40 dan 50 ppm

Ribavirin dicampur ke dalam media steril dengan cara

difilter (saringan bakteri/milipore 0.22 µm)

Botol kultur disimpan di ruang kultur (18oC) dengan intensitas cahaya 1000 lux

Subkultur selama 18 hari pada media yang sama

Deteksi kembali CyMV dalam sampel dengan ELISA

dilakukan 3 kali

42

Lampiran 6 Pembuatan Media Vacin and Went (VW) Cair dan Padat sebanyak 1 liter.

Membuat media VW cair Membuat media VW Padat

STOK A:

KNO3 0,525 gr; KH2PO4 0,25 gr; (NH4)2SO4 0,5 gr; MnSO4.4H2O 7,5 mg;

(dilarutkan dalam 20 ml aquades steril)

STOK B:

MgSO4.7H2O 25mg;

(dilarutkan dalam 20 ml aquades steril)

STOK C:

Na EDTA 37,5 mg; FeSO4.7H2O 27,8 mg; (dilarutkan dalam 20 ml

aquades steril panas)

STOK D:

Ca3(PO4)2 0,2 gr

(dilarutkan dalam HCl 1 N)

STOK A 20 ml + STOK B 20 ml + STOK C 20 ml + STOK D 20 ml + 150 ml air kelapa + 20 gr sukrosa

Ditambahkan aquades hingga volume 1 liter

Diukur pH hingga 5,2 dengan penambahan sedikit demi sedikit

NaOH 3 M

STOK A 20 ml + STOK B 20 ml + STOK C 20 ml + STOK D 20 ml + 150 ml air kelapa + 20 gr sukrosa

Ditambahkan aquades hingga volume 1 liter

Diukur pH hingga 5,2 dengan penambahan sedikit demi sedikit

NaOH 3 M

Ditambahkan 7 gr agar dan panaskan hingga mendidih

43

Lampiran 7 Membedakan pola pita protein tanaman dan plbs anggrek Dendrobium sehat atau bebas CyMV dengan tanaman dan plbs anggrek Dendrobium sakit (terinfeksi CyMV) dengan Elektroforesis Gel Komposit

Cara membuat gel:

Prosedur:

Agarose 0,5% dan aquades dicampurkan dalam wadah I, dipanaskan dalam microwave

Acrylamid:bis 2% dan TBE 3x dicampurkan dalam wadah II, dipanaskan dalam inkubator

(water bath) 100oC selama 1 menit

Ditambahkan 200 µl APS 10% Ditambahkan 30 µl TEMED

Setelah hangat kuku,dicampurkan kedua larutan tersebut, diaduk sebentar, kemudian dicetak dalam casting (pencetak gel).

1 g daun/plbs digerus dalam 1 ml buffer ekstraksi

Diinkubasi 10 menit pada suhu 50 oC (water bath)

Disentrifus 12.000 rpm selama 10 menit.

Diambil supernatan, sebelum dipakai disimpan di suhu 4 oC

100 µl supernatan tiap sampel yang sudah dicampur dengan 20 µl loading buffer (sample buffer 6x) dan Marker protein dipanaskan pada suhu 95 oC

selama 5 menit lalu didinginkan selama 15 detik dan dimasukan ke dalam sumur gel

Running dilakukan selama ± 3,5 jam pada voltase 50

Pewarnaan dengan Amidobalck (0,1 g Amidoblack dilarutkan dalam 100 ml asam asetat 7%)

Penentuan BM (bobot molekul) CyMV

44

Lampiran 8 Deteksi CyMV pada plbs anggrek Dendrobium untuk perlakuan zat antivirus Ribavirin

Jenis Plbs Dendrobium Ulangan Absorbansi Hasil Uji

D. Sonia 1 0,00 -

2 0,01 -

3 0,00 - D. Jayakarta 1 0,09 +

2 0,07 +

3 0,08 + D. Polisema 1 0.01 -

2 0,00 -

3 0.01 - Kontrol positif subkultur 3 = 0.17 ; Kontrol negatif = 0.10 Sampel dikatakan positif (+) terinfeksi CyMV jika nilai absorbansinya sama dengan atau lebih besar dari dua kali nilai absorbansi kontrol negatif (Sutula 1986)

45

Lampiran 9 Hasil uji DAS-ELISA terhadap plbs anggrek D. Jayakarta selama tiga kali subkultur

Sub kultur

Konsentrasi Ribavirin

(ppm)

Hasil Uji DAS-ELISA %

bebas CyMV

Ulangan Absorbansi pada 410 nm Hasil uji

1 2 3 1 2 3

1

0 0.13 0.15 0.13 + + + 0 10 0.2 0.22 0.22 + + + 0 20 0.18 0.18 0.19 + + + 0 30 0.19 0.21 0.21 + + + 0 40 0.18 0.17 0.17 + + + 0 50 0.17 0.14 0.17 + + + 0

2

0 0.12 0.11 0.14 + + + 0 10 0.07 0.09 0.08 + + + 0 20 0.09 0.11 0.1 + + + 0 30 0.12 0.15 0.13 + + + 0 40 0.12 0.17 0.22 + + + 0 50 0.22 0.21 0.2 + + + 0

3

0 0.24 0.29 0.25 + + + 0 10 0.27 0.27 0.19 + + - 33.33 20 0.13 0.21 0.21 - + + 33.33 30 0.13 0.15 0.18 - - - 100 40 0.15 0.11 0.1 - - - 100 50 0.13 0.14 0.19 - - - 100

keterangan: kontrol positif subkultur 1 = 0.15 ; kontrol negatif = 0.05

kontrol positif subkultur 2 = 0.16 ; kontrol negatif = 0.03 kontrol positif subkultur 3 = 0.17 ; kontrol negatif = 0.10 Sampel dikatakan positif (+) terinfeksi CyMV jika nilai absorbansinya sama dengan atau lebih

besar dari dua kali nilai absorbansi kontrol negatif (Sutula 1986)

47

Lampiran 11 Analisis statistika data hasil penelitian

Transformasi data % Bebas CyMV berdasarkan arcsin transformation (Gomez&Gomez, 1976)


(ppm)

Data % Bebas CyMV Transformasi Data % Bebas CyMV Subkultur 1 Subkultur 1

Ulangan total rata-

rata Ulangan

total rata-rata 1 2 3 1 2 3

0 0 0 0 0 0 1.28 1.28 1.28 3.84 1.28 10 0 0 0 0 0 1.28 1.28 1.28 3.84 1.28 20 0 0 0 0 0 1.28 1.28 1.28 3.84 1.28 30 0 0 0 0 0 1.28 1.28 1.28 3.84 1.28 40 0 0 0 0 0 1.28 1.28 1.28 3.84 1.28 50 0 0 0 0 0 1.28 1.28 1.28 3.84 1.28


(ppm)


Ulangan total rata-

rata Ulangan


0 0 0 0 0 0 1.28 1.28 1.28 3.84 1.28 10 0 0 0 0 0 1.28 1.28 1.28 3.84 1.28 20 0 0 0 0 0 1.28 1.28 1.28 3.84 1.28 30 0 0 0 0 0 1.28 1.28 1.28 3.84 1.28 40 0 0 0 0 0 1.28 1.28 1.28 3.84 1.28 50 0 0 0 0 0 1.28 1.28 1.28 3.84 1.28


(ppm)


Ulangan total rata-

rata Ulangan


0 0 0 0 0 0 1.28 1.28 1.28 3.84 1.28 10 0 0 100 100 33.33 1.28 1.28 88.72 91.28 30.43 20 100 0 0 100 33.33 88.72 1.28 1.28 91.28 30.43 30 100 100 100 300 100 88.72 88.72 88.72 266.2 88.72 40 100 100 100 300 100 88.72 88.72 88.72 266.2 88.72 50 100 100 100 300 100 88.72 88.72 88.72 266.2 88.72

Keterangan: Transformasi menggunakan rumus

Nilai 0% disubstitusi dengan 1/(4n) Nilai 100% disubstitusi dengan [100 - 1/(4n)]

n = banyaknya plbs per perlakuan

48

Hasil analisis ANOVA % Bebas CyMV subkultur 1 Source DF SS MS F P konsentrasi ribavirin 5 0.0000000 0.0000000 * * Error 12 0.0000000 0.0000000 Total 17 0.0000000 S = 0 R-Sq = *% R-Sq(adj) = *% subkultur 2 Source DF SS MS F P konsentrasi ribavirin 5 0.0000000 0.0000000 * * Error 12 0.0000000 0.0000000 Total 17 0.0000000 S = 0 R-Sq = *% R-Sq(adj) = *% subkultur 3 Source DF SS MS F P konsentrasi ribavirin 5 22512 4502 5.30 0.008 Error 12 10194 850 Total 17 32707 S = 29.15 R-Sq = 68.83% R-Sq(adj) = 55.84%

49

Hasil uji Duncan % Bebas CyMV pada setiap subkultur

Konsentrasi

Ribavirin (ppm)

% Bebas CyMV Subkultur 1 Transformasi Data Data Asli

Rata-rata Uji Duncan Rata-rata Uji Duncan

0 1.28 a 0 a 10 1.28 a 0 a 20 1.28 a 0 a 30 1.28 a 0 a 40 1.28 a 0 a 50 1.28 a 0 a

Konsentrasi

Ribavirin (ppm)



0 1.28 a 0 a 10 1.28 a 0 a 20 1.28 a 0 a 30 1.28 a 0 a 40 1.28 a 0 a 50 1.28 a 0 a

Konsentrasi

Ribavirin (ppm)



0 1.28 a 0 a 10 30.43 ab 33.33 ab 20 30.43 ab 33.33 ab 30 88.72 b 100 b 40 88.72 b 100 b 50 88.72 b 100 b

Keterangan : Angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata pada taraf uji Duncan 5%

50

Transformasi data % Hidup plbs berdasarkan arcsin transformation (Gomez&Gomez, 1976)

Konsentrasi

Ribavirin (ppm)

Data % Hidup plbs Transformasi Data %Hidup plbs Subkultur 1 Subkultur 1

Ulangan total rata-

rata Ulangan


0 100 100 100 300 100 88.72 88.72 88.72 266.2 88.72 10 100 100 100 300 100 88.72 88.72 88.72 266.2 88.72 20 100 100 100 300 100 88.72 88.72 88.72 266.2 88.72 30 100 100 100 300 100 88.72 88.72 88.72 266.2 88.72 40 100 100 100 300 100 88.72 88.72 88.72 266.2 88.72 50 100 100 100 300 100 88.72 88.72 88.72 266.2 88.72

Konsentrasi

Ribavirin (ppm)


Ulangan total rata-

rata Ulangan


0 100 100 100 300 100 88.72 88.72 88.72 266.2 88.72 10 100 100 100 300 100 88.72 88.72 88.72 266.2 88.72 20 100 100 100 300 100 88.72 88.72 88.72 266.2 88.72 30 100 100 100 300 100 88.72 88.72 88.72 266.2 88.72 40 100 100 100 300 100 88.72 88.72 88.72 266.2 88.72 50 100 100 50 250 83.33 88.72 88.72 45 222.4 74.15

Konsentrasi

Ribavirin (ppm)


Ulangan total rata-

rata Ulangan


0 100 100 100 300 100 88.72 88.72 88.72 266.2 88.72 10 100 100 100 300 100 88.72 88.72 88.72 266.2 88.72 20 100 100 100 300 100 88.72 88.72 88.72 266.2 88.72 30 100 100 66.67 266.7 88.89 88.72 88.72 54.94 232.4 77.46 40 100 66.67 66.67 233.3 77.78 88.72 54.94 54.94 198.6 66.20 50 100 100 66.67 266.7 88.89 88.72 88.72 54.94 232.4 77.46

Keterangan: Transformasi menggunakan rumus

Nilai 0% disubstitusi dengan 1/(4n) Nilai 100% disubstitusi dengan [100 - 1/(4n)]

n = banyaknya plbs per perlakuan

51

Hasil Analisis ANOVA % Hidup plbs Anggrek D. Jayakarta

subkultur 1

Source DF SS MS F P Konsentrasi Ribavirin 5 0.0000000 0.0000000 * * Error 12 0.0000000 0.0000000 Total 17 0.0000000 S = 0 R-Sq = *% R-Sq(adj) = *% subkultur 2 Source DF SS MS F P Konsentrasi Ribavirin 5 531 106 1.00 0.458 Error 12 1274 106 Total 17 1805 S = 10.30 R-Sq = 29.41% R-Sq(adj) = 0.00% subkultur 3 Source DF SS MS F P Konsentrasi Ribavirin 5 1268 254 1.33 0.315 Error 12 2282 190 Total 17 3550 S = 13.79 R-Sq = 35.71% R-Sq(adj) = 8.93%

52

Hasil Uji Duncan % Hidup plbs Anggrek D. Jayakarta pada setiap subkultur


(ppm)

% Hidup plbs Subkultur 1 Transformasi Data Data Asli


0 88.72 a 100 a 10 88.72 a 100 a 20 88.72 a 100 a 30 88.72 a 100 a 40 88.72 a 100 a 50 88.72 a 100 a

Konsentrasi

Ribavirin (ppm)


Rata-rata Uji Duncan Rata-rata Uji Duncan 0 88.72 a 100 a

10 88.72 a 100 a 20 88.72 a 100 a 30 88.72 a 100 a 40 88.72 a 100 a 50 74.15 a 83.33 a

Konsentrasi

Ribavirin (ppm)


Rata-rata Uji Duncan Rata-rata Uji Duncan 0 88.72 a 100 a

10 88.72 a 100 a 20 88.72 a 100 a 30 77.46 a 88.89 a 40 66.20 a 77.78 a 50 77.46 a 88.89 a

Angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata pada taraf uji Duncan 5%

eliminasi cymbidium mosaic virus pada plbs anggrek ... · lampiran 2 tahapan umum penelitian ....

Documents