elisa 操作技术培训指南

© 2008 IDEXX LABORATORIES, INC.

徐灵龙

质控及技术服务专员

（ 010-80489131-357 ； 13241817666 ）

ELISA 操作技术培训指南


报告内容

IDEXX 试剂盒1

操作问题分析 4

ELISA 操作 3

试剂盒的处理2


IDEXX 试剂盒 ——试剂盒的组成

包被板 (Coated Plates)

阳性对照 (Positive Control)

阴性对照 (Negative Control)

酶标抗体 (Conjugate )

底物液 (TMB Substrate)

样品稀释液 (Sample Diluent)

终止液 (Stop Solution)

浓缩洗涤液 (Wash Concentrate)

Never mix reagents from different kit lots!


移液器及吸头洗涤系统酶标仪蒸馏水或去离子水其它（加样槽、量筒等）

Maintenance & Calibrate Equipments

IDEXX 试剂盒 ——自备器材


试剂盒的处理 ——接收试剂盒

检查外包装是否完好；记录接收日期；检查批号及效期；检查内容物；使用记录；先进先出原则（ FIFO ）；试剂盒的保存。


试剂盒组分的回温；仔细阅读操作说明书；记录实验室的温度；确认反应温度；确定所用仪器的工作状态。

ELISA 操作 ——操作前的准备


ELISA 操作 ——样品的处理

样品的类型血清 /血浆样品肉汁样品乳汁样品其他样品：如蛋清、泄殖腔拭子等



样品的质量避免使用严重溶血的样品。避免使用脂状的样品。



样品的保存血清存储在 4-7 度不能超过 3-5 天，若更长时间的保存则应存放于 -20 度或更低温度。避免反复冻融样品，且冻融样品的混匀亦应注意避免剧烈震荡。样品在保存中如出现污染所致的混浊或絮状物时，应离心沉淀后再取上清进行检测。


ELISA 操作 ——样品及其它试剂的配制

样品的制备 1 ： 2 稀释 1: 5 稀释 1: 10 稀释 1: 20 稀释 1: 40 稀释 1 ： 100 稀释（两步进行） 1 ： 500 稀释（两步或三步进行）

洗涤液的配制

对照的处理（是否需要稀释）


ELISA 操作 ——移液技术

检查移液器的滴头。取样量要严格。要避免加在孔壁上部，不可溅出。要减少第一个样品和最后一个样品加入到板内的时间差距。应记住在取每一个样品前必须更换吸头。


ELISA 操作 ——孵育反应

孵育反应是影响测定结果的一个重要因素，这一步也是 ELISA 实际操作中容易出现问题的地方。

过夜孵育时应保证反应板的密封。

室温孵育时，应保证温度在 20-25℃之间，不应超过 25℃。避免把反应板放在阳光下或空调风口处。

37℃孵育时应保证足够的反应时间。


ELISA 操作 ——控制反应时间

多块板的操作板之间的适当的时间间隔每块板一个计时器


ELISA 操作 ——反应板的洗涤

手工洗板洗板之前标记每个板条彻底甩掉孔中液体，在吸水纸上拍干加入下一试剂前避免孔干燥

洗板机洗板检查设备的性能清洗和保持核对内容物以确定洗涤剂的数量


参照酶标仪厂家的说明书。

选择恰当的波长，一般为 450nm或 650nm，使用 630nm和 620nm会使对照和样品值都下降，但不影响结果。

在加入终止液后要尽可能早地进行读数（提前打开酶标仪并设计好模板）

使用 Xchek进行读数和数据管理。

ELISA 操作 ——读板及数据管理


IDEXX 实验室操作规范

操作人：操作时间：

试剂盒种类：批号：效期：

待检样品说明（或检验目的）：

加样顺序：

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A 　　　　　　　　　　　　

B 　　　　　　　　　　　　

C 　　　　　　　　　　　　

D 　　　　　　　　　　　　

E 　　　　　　　　　　　　

F 　　　　　　　　　　　　

G 　　　　　　　　　　　　

H 　　　　　　　　　　　　


IDEXX 实验室操作规范

操作过程记录：I　操作前准备：　　　1）所有试剂盒组分是否回温充分（是 /　否）；　　　2）记录实验室温度（ ___　℃）；　　　3）确认孵育反应温度（ ___　℃和 /或 ___　℃）；如为 37℃，请提前打开温箱； 4）仪器（酶标仪、温箱、洗板机等）的工作状态。II　试剂准备：　　　1）洗涤液的配制 : 毫升浓缩液 +　　　　　　　　　　毫升纯净水 ;　　　2）样品的稀释：第一步：微升血清 +　　　　　　　　　　微升样品稀释液 ; 第二步：微升血清 +　　　　　　　　　　微升样品稀释液（或不需要） ; 第三步：微升血清 +　　　　　　　　　　微升样品稀释液（或不需要） ;　　　　3）对照是否需要稀释（是 /　否），如需稀释，稀释比例为（）。

III　操作步骤：1.加入对照及样品（对照 :____微升；样品 :____微升）；2.第一次孵育（时间 :____:____—____:____）；3.第一次洗涤（次数 :___次；体积 :　____微升）；4.加入酶标抗体（ ____微升）；5.第二次孵育（时间 :____:____—____:____）；6.第二次洗涤（次数 :___次；体积 :　____微升）；7.加入底物（ ____微升）；8.显色（时间 :____:____—____:____）；9.加入终止液终止反应（ ____微升）。


正确的操作

良好的仪器

优质的试剂

充分准备

ELISA 操作 ——必要条件！！！


报告内容

血清学检测1

操作问题分析 4

ELISA 操作 3

试剂盒的处理2


O.D.值偏高：实验室温度水质洗涤酶标仪读数孔内气泡底物溶液……

常见问题分析

O.D.值偏低：温度孵育时间洗涤试剂盒对照品稀释试剂……

操作常见问题分析



孵育洗涤对照与样品不同批次

无颜色产生板内重复性低板间重复性低

试剂添加

样品是否加入

酶标记物

操作时间过长洗涤不稳定抗体分布不均多道移液器



导致不正常实验结果的常见因素：

温度（试剂、孵育以及实验室）

不同批次的试剂混用

水质好坏

酶标仪问题

试剂污染

用错了试剂瓶

终止液有结晶

读数时样品板孔有气泡

不明原因……


孔内有气泡存在会严重的影响结果！！！

0.077 0.057 0.058 0.08 0.058 0.068 0.051 0.055 0.072 0.054

NC Neg Neg Neg Neg NC Neg Neg Neg Neg

0.059 0.111 0.156 0.049 0.074 0.057 0.095 0.141 0.045 0.058

NC Neg Neg Neg Neg NC Neg Neg Neg Neg

1.258 0.075 0.121 0.057 0.054 1.223 0.062 0.108 0.053 0.047

PC Neg Neg Neg Neg PC Neg Neg Neg Neg

1.247 0.118 0.137 0.065 0.073 1.206 0.094 0.12 0.061 0.062

PC Neg Neg Neg Neg PC Neg Neg Neg Neg

0.142 0.265 0.097 0.115 0.075 0.13 0.204 0.087 0.093 0.068

Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg

0.127 0.487 0.059 0.067 0.073 0.115 0.228 0.054 0.062 0.067

Neg Pos! Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg

0.078 0.188 0.06 0.077 1.283 0.071 0.159 0.044 0.07 1.157

Neg Neg Neg Neg Pos! Neg Neg Neg Neg Pos!

0.165 0.149 0.363 0.063 1.279 0.137 0.116 0.078 0.062 1.223

Neg Neg Sus* Neg Pos! Neg Neg Neg Neg Pos!

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