EMBRİYO SEÇİMİNDE İNVAZİV

YAKLAŞIMLAR

Yard. Doç. Dr. Evrim ÜNSAL

İnvaziv Embriyo Seçim Yöntemleri

Ekspresyon Düzeyinde Seçim Yöntemleri

PGD

• Anöploidi ve Translokasyonlar

• Tek gen hastalıkları

PGS

• FISH (8-12 Kromozom değerlendirilmesi)

• Array CGH (24 Kromozom değerlendirilmesi)

İnterlökin-I (IL-I) embriyonik implantasyonda rol aldığı gösterilmiş olup bu çalışmada IL-I’in başlıca

bileşenlerinin ekspresyonunun insan embriyolarında blastomer hücrelerinde gösterilip

mRNApatternlerinin biyopsi yapılan embriyoların ileri gelişimi ile kıyaslanması amaçlanmıştır.

IL-Ira pozitif embriyoların hiçbiri blastokist aşamasına ulaşamamıştır. IL-Iβ mRNA’sı hatch olan

blastokistlerin %60’ında arrest olanların ise %83.3’ünde eksprese olmuştur.

Bu çalışmanın en önemli sonucu tek bir blastomer hücresinde birkaç farklı mRNA’nın

eş zamanlı olarak belirlenmesi teknik olarak mümkün olmuştur.

Canlı, arrest, cansız embriyolar immatur, fertilize olmamış yumurtalarda tek

hücreden RT-PCR tekniği ile apoptotik markerlara bakılmış ve çalışmanın pek çok

bulgusundan biri olarak bazı embriyolarda oluşan fragmentlerin Bax geninin yüksek

ölçüde eksprese olduğunu göstermişlerdir.

• Grubun önceki çalışmalarında BRCA1 geninde germline mutasyonları

taşıyan kadınlarda overyan cevabın düşük olduğu, yeni bir çalışmada ise

BRCA1 mutasyonu taşıyan kadınların menopoza daha erken girdikleri rapor

edilmiştir.

• Bu çalışma DNA kırıklarının tamirinin oosit rezervinin korunmasında ve

yaşlanmayla etkinliğinin düşmesi nedeniyle ovaryen yaşlanmada önemli bir

rol oynadığı hipotezi üzerine kurgulanmıştır.

• Çalışmada 24 kadının GV oositlerinde DNA kırıkları tamir genlerinin

(BRCA1-2, MRE11, RAD51) ekspresyonuna bakılmıştır.

• Tek hücreden gen ekspreyonuna bakılan bu çalışma da ekspresyon

düzeyindeki çalışmaların gelişimi bakımından güncel ve önemlidir. Ancak

tek hücre biyopsisi yaparak bazı implantasyonda görev alan bileşenlerin

incelenerek embriyo seçimi uzak bir yaklaşım olarak görünmektedir.

Sci. Transl Med 5,, 172 ra21 (2013)

Embriyo Biyopsi Yöntemleri

Zona dissection (mekanik) Lazer Asit tyrode

Lazer tekniğinin gelişmesiyle embriyonun her aşamasında hücre biyopsisi rahatlıkla

Uygulanabilir hale gelmiştir.

Eski moda mekanik ve kimyasal yöntemler hala pek çok merkez tarafından uygulanan

Etkin yöntemler olarak yerini korumakta.

•Sadece maternal genomik bilgi

•Oositteki mayoz kaynaklı anöploidiler

ve maternal genetik hastalıklar

•Yaygın kullanılan bir hücre tipi değil.

•Birkaç merkez ve legal sınırlamalar

sebebiyle bazı ülkeler tercih etmekte.

•Biyopsi edilen PB ler 3. güne kadar

saklanarak embriyonun akıbetinin

belirlenmesi üzerine incelemeye

alınabilir.

•6-8 hücreli embriyodan 1

veya 2 blastomer alınması

embriyonik kitllenin >%12.5-

25 oranında bir kayba

neden olmaktadır.

•Mozaisizm

•Birden fazla hücreyi inceleme şansı

•Embriyo hasarlanmasının az olması

•Daha az lethal kromozomal monozomi ve

kaotik anomali gözlenir

•Mozaisizm (trofoektodermde görülen

mozaisizm ihtimali ICM ile aynıdır

(Evsikov et al 1998)

•Düşük ADO oranına sahip olması

•Hatch olmuş embriyolara

uygulanabilmesi

nedeniyle incelenen embriyo sayısının

azlığı

•6 gün transferi ya da dondurma

yapılması

gerekliliği

•Blastokist aşamasına gelebilen embriyo

sayısının azlığı

•Genetik testin uygulanabilmesi için sınırlı

bir zaman kalması

•Polar body’ler embriyonun

ileri gelişiminde işlevsiz

olduğundan bu hücrelerin

biyopsisinden embriyo

etkilenmez

•Tüm PGD endikasyonlarına

uygulanabilir

•Maternal ve paternal genetik

bozukluklar test edilebilir

•Genetik testlerin uygulanması için

zaman tanır

•Kryoprzervasyon gerektirmez

?

• Biyopsi embriyoyu hasarlar mı?

• Bir veya iki blastomer biyosisi yapılarak PGD uygulanmış IVF bebeklerinde uzun dönem olumsuz etkiler görülüyor mu?

?

• Klivaj aşamasındaki embriyonik hücreler farklılaşmış hücreler midir?

• Farklılaşma tam olarak hangi aşamada olmaktadır

?

• Her bir klivaj aşaması blastomerleri eşit gelişim potansiyeline mi sahiptir ya da bazıları embriyonik gelişimde daha önemli bir rol mü oynamaktadır?

PGT ve Embriyo Gelişimi

• Erken klivaj embriyolarında bulunan

blastomer hücreleri totipotent tir.

• İnsan embriyolarında dört hücreli bir

embriyonun her bir hücresi birer

blastokist oluşturabilir (Johnson et al

1995)

• Herbir blastomerin RNA’ları arasında

fark olmadığı tespit edilmiştir.

• 4-10 hücre aşamasındaki blastomerler

farklılaşmamış hücreler olup bunlarda 1

ya da 2 hücre almak embriyonun

gelişimini etkilemez.

• Ayrıca yeni bazı çalışmalarla 2 yaş

civarındaki PGD bebeklerinin kontrol

bebeklerle perinatal bulgularının benzer

olduğu ortaya koyulmuştur

Semin Reprod Med 2012;30:259–266

•Sadece maternal genomik bilgi

•Oositteki mayoz kaynaklı anöploidiler

ve maternal genetik hastalıklar

•Yaygın kullanılan bir hücre tipi değil.

•Birkaç merkez ve legal sınırlamalar

sebebiyle bazı ülkeler tercih etmekte.

•Biyopsi edilen PB ler 3. güne kadar

saklanarak embriyonun akıbetinin

belirlenmesi üzerine incelemeye

alınabilir.

•6-8 hücreli embriyodan 1

veya 2 blastomer alınması

embriyonik kitllenin >%12.5-

25 oranında bir kayba

neden olmaktadır.

•Mozaisizm

•Birden fazla hücreyi inceleme şansı

•Embriyo hasarlanmasının az olması

•Daha az lethal kromozomal monozomi ve

kaotik anomali gözlenir

•Mozaisizm (trofoektodermde görülen

mozaisizm ihtimali ICM ile aynıdır

(Evsikov et al 1998)

•Düşük ADO oranına sahip olması

•Hatch olmuş embriyolara

uygulanabilmesi

nedeniyle incelenen embriyo sayısının

azlığı

•6 gün transferi ya da dondurma

yapılması

gerekliliği

•Blastokist aşamasına gelebilen embriyo

sayısının azlığı

•Genetik testin uygulanabilmesi için sınırlı

bir zaman kalması

•Polar body’ler embriyonun

ileri gelişiminde işlevsiz

olduğundan bu hücrelerin

biyopsisinden embriyo

etkilenmez

•Tüm PGD endikasyonlarına

uygulanabilir

•Maternal ve paternal genetik

bozukluklar test edilebilir

•Genetik testlerin uygulanması için

zaman tanır

•Kryoprzervasyon gerektirmez

•Blastokist biyopsisi

hızlı ve güvenilir PGT metotları geliştiğinde

6. gün fresh embriyo transferlerinin artması ile

rutin biyopsi yöntemi olarak kullanılabilir hale gelecektir.

Yaş ortalaması 36 olan 119 kadına 127 taze blastokist transfer edilmiş ve

implantasyon oranı %41 olarak kaydedilmiştir. 146 blastokist dondurulmuş, 27’si

Çözülmüştür ve bu grupta da %26 implantasyon oranı saptanmıştır.

Düşük ve ikiz oranının düşük olması, yüksek implantasyon oranı

sayesinde tek embriyo transferi için daha uygun olması trofoektoderm biyopsisini

ön plana çıkarmaktadır

PGD-PGS

• İnvitro embriyolarda biyopsi yapılmış hücrelere iki farklı

sebeple genetik test uygulanmaktadır

1. Ailenin genetik hastalıklı (mendelyan ya da

kromozomal bozukluklar) çocuğa sahip olma

olasılığı yüksekse…(PGD)

2. IVF embriyolarının test edilmesi. (PGS)

• Bugünkü imkanlarla PGS ile sadece anöploidileri

tarayabilmekteyiz.

• Bazı ya da tüm kromozomlar monozomi, trizomi,

tetrazomi ya da pentazomi yönünden kontrol

edilip sadece iki kopya kromozom taşıyan öploid

embriyolar transfer edilir.

• Dünya üzerinde pek çok merkez PGS’i

– İleri anne yaşı

– Tekrarlayan IVF başarısızlıkları

– Tekrarlayan gebelik kayıpları sebepli olarak önermektedir

• ASRM, ESHRE ve BFS,FISH tekniği ile yapılan PGS

uygulamasının canlı doğum oranlarını arttırmayacağı

görüşünde birleşmekteler.

– Mozaisizm : biyopsi ile alınan hücre embriyonun tümünü

yansıtmamaktadır. (özellikle klivaj aşamasındaki embriyo)

– Sınırlı sayıda kromozomun bakılabilmesi değerlendirilmeyen

kromozomlara ait önemli bilgilerin atlanmasına neden olmaktadır.

– Klivaj aşamasındaki biyopsinin embriyonun canlılığını

etkileyebilmektedir…

Polar body ve trofoektoderm hücreleri kullanıldığında

uygulamanın daha az invaziv olduğu görüşü hakim olmuştur.

Mikrogen Genetik Tanı Laboratuvarı 2011-2013

24 Sure Hasta Dataları

STD: 0.34 STD: 0.15

anükleer blastomer,

uygun olmayan tüpe koyma

amplifikasyon olamama

Yeni Nesil Sekanslama

• Ayrıntılı genetik testler; mikroarray analizi

ve tüm-genom sekanslanması……

• Ayrıntılı genetik testlerle embriyo hakkında

bidiklerimizde köklü değişiklikler yapacak

ve embriyo seçimindeki opsiyonlarımızı

arttıracaktır.ancak genetik alanındaki

ilerlemeler IVF ile ilgili tekniklerin gelişimi

ile sınırlanmaktadır. (Vitrifikasyon ve in-

vitro oosit maturasyonu)

• Maastrich Üniversitesi’nde PGD alanında uzman kişilerin davet

edilerek yapıldığı panelde embriyo testinde ileri yaklaşımlarla ilgili

dört ana husus konu alınmıştır.

1. Anöploidi taramasının belirli hastalıklar için yapılan PGD

uygulamasına eklenip eklenmeyeceği,

2. Aynı anda birden fazla Mendelian hastalığın PGD ve PGS

kapsamında bakılabileceği bir tarama yapılma ihtimali,

3. Multifaktöriyel hastalıklar için de embriyo taraması yapma

ihtimalimiz olacak mı?

4. Preconception Carrier Testing (PCS) IVF tedavisine alınacak tüm

hastalara uygulanmalı mı?

Limitasyonlar; • İleri anne yaşı

– Kromozom anomalili olmayan embriyo sayısı son

derece sınırlıdır.

• De novo mutasyonlar

– Genetik geçişin ebeveynlerin en az birinden geldiği

bilinmelidir.

1997’de vizyona giren GATTACA filminde

Özel görevler için yetiştirilen yeni süper

insan ırkı yüzünden, normal yollardan

dünyaya gelmiş insanlar işsiz kalmakta

ve ikinci plana itilmektedir.

Morfolojik kirterlere göre embriyo seçimi ve PGS ile

embriyo seçimini kıyaslamada bazı sınırlamalar vardır.

1. Dondurulmuş çözülmüş embriyoların taze

embriyolarla birlikte değerlendirilmesi

2. Embriyo transfer sayısındaki farklılık (Morfolojik seçimle: 2.4 embriyo, PGS ile 1.8 embriyo

transferi)

3. Morfolojik seçimle embriyo transfer günü

2-3 iken PGS ile 4-5. gün olması

4. Gruplar arasında farklı stimülasyon

protokollerinin uygulanmış olması

• Klinik IVF’te hastaya özgü tedavi planı

oluşturmak esastır.

• PGS

– yüksek sayıda embriyosu

– beşin üzerinde tekrarlayan gebelik kayıpları

– Anöploidi öyküsü olan

– İleri anne yaşı olgularında (>41)

• PGS bu hasta grupları için ardışık embriyo

skorlaması ile kombine edilerek

uygulanmalıdır.

• Prospektif, randomize olarak eşleştirilmiş kontrollü

çalışma..

• Blastomer ve trofoektoderm biyopsilerinin

embriyoyu hasarlanmasındaki etkileri

araştırılmıştır.

• Klivaj transferi:

+ biyopsi : %30.4

- biyopsi : %50

• Blastokist transferi:

+ biyopsi : %51

- biyopsi : %54

• İleri anne yaşı olgularında PGS için en uygun hücre

kaynağı hangisidir? Polar body, blastomer, trofoblast….

• Aynı embriyoya ait polar body, blastomer, trofoblast

hücreleri ardışık olarak CGH yöntemiyle taranmıştır.

• İleri anne yaşı olgularında PGS’in doğum oranlarını

arttırdığı düşünülmektedir. Ancak canlı doğum

oranlarındaki etkisini ortaya koyan bir çalışma

bulunmamaktadır. Bu durumun iki ana sebebi olabilir;

– FISH tekniği gibi sitogenetik araştırma metodları

az sayıda kromozomların sadece kopya sayısı

varyasyonlarını belirleyebilmektedir ve tek

hücrelere uygulandığında ciddi miktarda

kromozom tanısal hata oranına yol açmaktadır.

– Hücre aşaması ve kullanılan hücre tipi her zaman

embriyonun kromozom kopya sayısını

yansıtmamaktadır.

• Mayotik segregasyon sırasındaki farklı geçişler polar body analizi sonucu

farklı tanı koymaya neden olabilir. Bu nedenle her iki polar body’nin ardışık

değerlendirmesi gerekmektedir.

– Sadece1. polar body hücrelerinin incelenmesi, ikinci mayoz bölünmedeki dengelenmeler

nedeniyle hatalı tanıya neden olabilmektedir.

– Blastokist aşamasında ciddi oranda dişi mayotik anöploidilerinde düzelme görülmektedir.

– Mitotik ve erkek kaynaklı anöploidilerin yüksek oranda gözlenmesi

Polar body analizindeki limitasyonlardır.

• 3. günde IVF embriyolarının %60’ının en az bir hücresi anormal yapıdadır. Bu

embriyoların çoğu mozaik yapıdadır.

• CGH çalışmaları sonrasında

– klivaj aşamasındaki embriyoların %30’unda mayotik hatalar bulunduğu

– 29-50 yaşındaki kadınlarda blastokist aşamasındaki embriyoların %56’sı

kromozom bozukluğu göstermektedir. (ortalama 38 yaş)

• FISH ve CGH teknikleri birlikte uygulandığında

– Blastokistlerde görülen anöploidi oranı %58 olarak bulunmuştur.

• Polar body biyopsisi planlanan hasta gruplarında birinci polar body ile birlikte ikinci

polar body nin de test edilmesi gerekmektedir.

• Aşama I: Oosit ve embriyolar arasındaki karyotipik korelasyon

• Aşama II: en fazla 2 seçilmiş öploid balstokist transferinin IVF implantasyon

potansiyelini ve devam eden gebelik oranlarını ne ölçüde etkiliyor?

Tek gen hastalıkları tarama protokolü

# OBJ SAYI

1 Toplam vaka sayısı 30

2 Gebelik + 5

3 Gebelik - 6

4 Sonuç bilinmeyen 18

5 ET iptali 4

6 İncelenen Embriyo 228

7 Normal Homozigot 57

8 Taşıyıcı (Heterozigot) 77

9 Mutant (Homozigot) 64

10 HLA Uyumlu Embriyo 35

11 Normal/Taşıyıcı HLA

Uyumlu

30

12 Embryo Transfer 29

Prof Dr Volkan Baltacı

Msc. Fatma Akyiğit

Msc Pelin Çelikkol

Bio Mehmet Comart

İrfan Atmaca

Teşekkürler