Emissziós fotometria(lángfotometria)

Az emissziós fotometria alapjai

• Alkáli fémek és alkáli földfémek mérési eljárásaoldatokból, a termikus gerjesztés hatásárakibocsátott karakterisztikus hullámhosszúságúsugárzás alapján.

• A színtelen láng elszíneződik azáltal, hogy alángban található anyagok hőenergia hatására„gerjesztett” állapotba kerülnek amennyibenelektronjaik átmenetileg egy külső elektronhéjrajutnak. Amikor az elektron visszatér eredetielektronhéjára a gerjesztéssel felvett energiátfénysugárzás formájában leadja.

• A kibocsátott fény hullámhossza, így színejellemző a különböző fémekre.

• Ha egy elem a lángban atomos formában található vonalas színképet szolgáltat (pl. alkálifémekNa, K).

• Az alkáli földfémek (Ca) szélesebb alapú emissziós sávban sugároznak.• A lángnak van háttérsugárzása is.

Lángfotométer

Lángfotometriás ion meghatározások

• Na, K, Ca

• A vizsgálati anyagnak csak mintegy 1-5%-a kerül alángba (érzékenység)

• A szükséges energia nagysága függ a meghatározandóanyagtól. Túl magas hőmérsékletben az anyagokionizálódnak, az ionok nem gerjeszthetők, csak azatomok.

• Fontos a mért anyag koncentrációja a mintában, ettőlfügg a hígítás mértéke: Na-nál a hígítás 200-szoros.

• A fény emissziót egy ismert oldat koncentrációjávalhasonlítjuk össze (standard).

• A standard oldatokban az ionösszetétel hasonló kell,hogy legyen a széruméhoz

Nátrium

• A lángfotometriás meghatározásra az 589 nm-es Na-vonal szolgál

• A vizsgálathoz a szérumot erősen hígítani kell:1:200 arányban

• Normálérték: 135-145 mmol/l

• A Cl- és HCO3 mérésekkel együtt jófelvilágosítást az a plazma ozmolalitásáról

• A vese disztális tubulusban az aldoszteronfübbvényében szívódik vissza

Hipernatrémia

• Csökkent folyadékbevitel és fokozottvízvesztés

• Diabetes insipidus (centrális, renális)

• Primér és szekunderhiperaldoszteronizmus

Hiponatrémia

• Excesszív folyadékbevitel só nélkül

• Ödéma (szívelégtelenség)

• Aldoszteron hiány

• Pszeudohiponatrémia – sok lipid vagyfehérje felszaporodás a vérben

Kálium

• 97%-a intracelluláris és csak 3%-a azextracelluláris

• A disztális tubulusban a kiválasztás azaldoszteron és az aciditás függvénye:aldoszteron fokozza, az acidózis csökkentia kiválasztást a vesében

Kálium meghatározása

• Lángfotometria és ionszelektív elektródok

• Lángfotometria: 768 nm K-vonal

• Szérumból 1:20-as hígítással

• Normálérték: 3,5-5,0 mmol/l

• Már csekély hemolízis növeli a mért értéket

• Trombociták tartalmazzák, trombocitózis eseténakár 3 mmol/l-el is nőhet a mért koncentráció

Hiperkalémia

• Akut és krónikus veseelégtelenség

• Aldoszteron hiány

• Inzulin hiány

• Szívglikozid mérgezés (Na/K ATPáz gátlás)

• Acidózis (a vér pH csökkenése 0,1-el 0,4-1,2mmol/l-nyi emelkedéssel jár

• Sejtpusztulás

Hipokalémia

• Gasztrointesztinális K vesztés (pl.hasmenés)

• Aldoszteron túlprodukció

• Májcirrhosis (Aldo lebontása csökkent)

• Renális tubuláris acidózis

Kálcium

• 1%-a van az extracelluláris térben

• Plazmában: 50%-a ionizált, 40%-a fehérjéhez kötött,10%-a komplexeket alkot (citrát-, foszfát-,hidrogénkarbonát-, laktát-, stb.)

• Acidózisban csökken a fehérjéhez kötött mennyiség,ekkor még alacsony koncentráció mellett sem alakulnakki izomgörcsök

• Anyagcseréje kapcsolódik a foszfátéhoz ezért azzalegyütt kell vizsgálni mind a szérumban, mind avizeletben

• A PTH és a D3 emeli a szérum koncentrációt, akalcitonin csökkenti

A szérum kalcium szint meghatározása

• (Lángfotometria) és ion szelektív elektródokkal

• Megbízható eredményt ad az atomabszorpciósfotometria is.

• Normálérték: 2,2-2,6 mmol/l

• Nem megfelelően elöblített üvegedények miattfelülmérjük (a csapvíz sok kálciumot tartalmaz)

Elektrolit meghatározásokionszelektív elektródokkal

potenciometria

Ionszelektív elektródok

• Mindig tartalmazzák a mérendő iont

• Üveg vagy műanyag alapúak

• Mérő és vonatkozási elektródok

• Mérhető ionok: Na+, K+, Ca++, Cl-

• H+ szelektív elektród – pH mérés

Valinomicin – K+ érzékeny üvegelektróda

Ionizált kálcium meghatározása

• A mérőelektróda polivinilklorid membrán,amiben ioncserélőként hosszú szénláncúzsírsavakat alkalmaznak

• Normálérték: 1,1-1,3 mmol/l

• Zavaró mérési tényezők:

– Ha a minta EDTA-t tartalmaz

– A minta ionerőssége nő

Hidrogén ion meghatározáspH mérő

pH mérő elektrokémiai

sémája

az elektrokémiai változások a

fázisok felületén jelentkeznek

M – fém (metal)

ML – vonatkozási elektród

MR - mérő elektród

S – különböző fázisok

S1 – telített KCl oldat

S2 – mérendő anyag fázisa

mérendőanyag

Savak és bázisok definíciója

• Savak olyan vegyületek, melyek H+ ionokat képesek leadni(protondonátorok). A bázisok olyan vegyületek, melyek H+ ionokatképesek felvenni (protonakceptorok)

• Pufferek – gyenge savat és a hozzá tartozó bázist tartalmazzák

• Puffer-egyenlet

Henderson Hasselbach egyenlet:

[A-]

pH = pK’a + log --------

[HA]

A pK’a a gyenge sav disszociációs konstansának negatív logaritmusa.A szénsav-bikarbonát puffer esetében az értéke 6,10

[HCO3-]

pH = pK’a + log -------------- = 7,40

[H2CO3]

A vér pufferrendszerei

• Plazma hidrogénkarbonát 35%

• Vvt hidrogénkarbonát 18%

• Hbg és oxi-Hbg 355

• Plazma fehérjék 7%

• Szerves foszfátok 3%

• Szervetlen foszfátok 2%

Vér pH és sav-bázis egyensúly mérése

• A pH mérés és a sav-bázis egyensúly mérése kapillárisüvegelektróddal történik 30-100 l vér vagy puffer felszívása után

• A pCO2 mérése

– Lehet pCO2 elektróddal, ami széndioxidot érzékelő H+ elektród

– Közvetett módszer a Siggard-Andersen módszer

• A vért két különböző szén-dioxid parciális nyomású gázzal equilibrálja akészülék és méri a megfelelő pH értékeket

• Ebből kiszámíthatók: pCO2, a plazma szabad bikarbonát koncentrációja, ésa bázisfelesleg

• A pO2 mérése: Clark elektróddal: az oxigén platina elektródonredukálódik, ami potenciál változást hoz létre, ami azonos az oxigéntenzióval

• Normális vérgáz és pH értékek:

– pH 7,35-7,44

– pCO2 35-45 Hgmm

– Standard bikarbonát 22-26 mmol/l plazma

– Bázisfelesleg -2 - +2 mmol/l teljes vér

– pO2 75-100 Hgmm

Atomabszopciós fotometriaösszehasonlítva alángfotometriával

Atomabszopciós fotometria esetén afényforrás a vájt-katód lámpa, melyua. fémből készül mint amelyik fémkoncentrációját mérni akarjuk.Ez a fémre jellemző rezonanciavonalat (fotont) bocsát ki.

A rezonancia vonalnak megfelelőfotont a lángban atomossá vált fémelnyeli tehát gyengül a besugárzottfény intenzitása (fotometria)

a gyakorlatban mért fémek:- ólom- réz- aluminium- nikkel(- Mg, Ca)- a szérum Fe mérésére nemaslkalmas, mert a nyomokbanelőforduló Hbg zavar

lángfotometria

atomabsz. fotometria

Atomabszopciós fotometria

• Az atomok gázállapotba kerülnek magas hőmérsékleten

• Az abszorpció méréséhez olyan hullámhosszúságú sugárzásszükséges, amelyet a vizsgálandó elem termikusan gerjesztettállapotban kisugároz. Pl. az aluminium meghatározásáhozaluminium vájtkatódos lámpa szükséges.

• A gerjesztő és a rezonanciasugárzás hullámhossza azonos

• A fotometriához hasonlóan itt is fénygyengülést mérünk

• Ólom meghatározás: ólommérgezés gyanúja

• Réz meghatározás: Wilson kór gyanúja

• Aluminium meghatározás: veseelégtelenségben felhalmozódik éslerakódik a szövetekben. Alumíniumot tartalmazó gyógyszerszedése tilos (pl. foszfátkötő gyógyszerek)

Fluoriméter

fluoreszcencia

foszforencencia„quenching”spontánleépülés

excitáció

emisszió

fluoreszcencia

• Excitációs (gerjesztő) fény versus emissziós(másodlagos) fény – mindkettő jellemző avizsgált molekulára

• A másodlagos fény hullámhossza mindignagyobb a gerjesztő fényénél

• A másodlagos fény intenzitása egyenesenarányos az anyag koncentrációjával

Fluorimetriás módszerekalkalmazása a klinikai kémiában

• Ott alkalmazzák, ahol nem áll rendelkezésremegbízható fotometriás tesz, mert nagyonérzékeny a szennyeződésekre (ionok,detergensek).

– Porfirinek: uro- kopro- protoporfirinek

– Katecholaminok: adrenalin, noradrenalin

• Fluoreszcencia immun-meghatározások

Coulometria

• A reakcióhoz a titráló ionokat elektromos árammalgeneráljuk, pl. a Cl- ion koncentráció meghatározásáhozezüst elektródáról Ag+ ionokat. Tehát a fogyottelektromos töltés mennyiségét mérjük

• A generált titráló anyag felszabadításához szükségeselektromos áram mennyisége (tötése) mérhető

• A Cl- ion meghatározására használják szérumból,vizeletből és liquorból. A Cl- ion koncentrációja aszérumban: 98-110 mmol/l

• Az Ag+ ion a brómot és a jodidot is precipitálja, de ezekmennyisége a testnedvekben elhanyagolható

• A vvt-től gyorsan el kell választani a szérumot (plazmát)mert a hidrokarbonát ion a vvt-ből Cl- ionra cserélődik kiés csökken a szérum Cl- ion tartalma

A cerebrospinális folyadékés a lumbálpunkció

Anatómia ésfiziológia

Az agyat és agerincvelőt 3 rétegveszi körül:- dura mater- bolyhos arachnoidea- pia mater

• A CSF plazma ultrafiltrátum, a fehérjék 80%-a transzudátum, míg 20%-ahelyben képződik

• A CSF tiszta folyadék, kb. 140 ml. Naponta 500 ml képződik, ennek70%- a plexus chorioideusokban, 30%-a a kapillárisokból és ametabolikus vízből származik

• BBB (vér-agy gát), BCB (vér-CSF gát)

• CSF összetétel: vvt nincs, pár fehérsejt, a fehérjék az ultrafiltrációnakmegfelelően molekulaméretükkel fordított arányban vannak, glukózkonc. a vér 60%-a

A CSF eltérései

Mikroszkópos vizsgálat

• Nagyszámú leukocita figyelhető meg fertőzés ésmalignitás esetén

• A neutrofilek magas aránya (>800/ml) bakteriálismeningitisre utal

• Mononukleáris sejtszaporulat jellemző a krónikusmeningitisre, vírusos meningoencephalitisekre, részbengyógyult bakteriális meningitisre, krónikus gyulladásra ésmalignus meningeális infiltrációra

• Vvt szubarachnoideális vérzésre vagy traumára utal. Axanthochromia megerősíti a szubarachnoideális vérzésgyanuját.

A CSF eltérései

glukóz

• Lényegesen csökken (<1mmol/l) akut bakteriálismeningitisben és meningitis tuberculosában

• Enyhébb glukóz szint csökkenés észlelhető vírusosinfekcióknál, részben gyógyult bakteriális meningitisnél,és malignus meningitisben

összfehérje

• Emelkedett ha sejtszaporulat van

• Ha nincs sejtszaporulat és mégis emelkedett:gyulladásos neuropátiák, CSF elfolyási zavar

Speciális vizsgálatok

• Oligoklonális csíkok – IgG fokozottkoncentráció

• Polimeráz láncreakció (polymerase chainreaction, PCR): herpes simplex,tuberkulózis

• Antigén immundetektálása pl. bakteriálismeningitis, ha a tenyésztés negatív

• Spektrofotometria – vérbomlástermékeinek mérése

Az LP gyakorlati kivitele