ENZİMLERENZİMLER

Prof.Dr.Emel ULAKOĞLU ZENGİN Prof.Dr.Emel ULAKOĞLU ZENGİN

İ.Ü.Cerrahpaşa Tıp Fakültesi İ.Ü.Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Biyokimya Anabilim DalıBiyokimya Anabilim Dalı

I.TANIM Enzimler, metabolizma reaksiyonlarını hızlandıran, biyolojik katalizörlerdir. Protein yapısında maddelerdir. Hücrenin gereksinimine uygun kataliz yaparlar. Hücre içindeki yerleşimleri metabolik olayların özelliğine

göre düzenlenmiştir.

II.ENZİMLERİN TIPTA KULLANIMI1.Enzim aktivitelerinin ölçümü hastalıkların tanı ve izlenmesinde kullanılır. Örn:Miyokard İnfarktüsünde: CPK (Kreatin fosfokinaz) SGOT (AST) (Serum glutamat okzalasetat transaminaz) LDH (Laktat dehidrogenaz)

2.Kalıtsal metabolik hastalıklar bazı enzimlerin incelenmesiyle ortaya çıkar. Örn:Galaktozemide: Galaktoz-1-fosfat uridil transferaz

3.Tedavi amacıyla bazı enzim preparatlarından yararlanılabilinir.

III.ENZİMLERİN İSİMLENDİRİLMESİIII.ENZİMLERİN İSİMLENDİRİLMESİ

Etkiledikleri maddelerin (substratlarının) sonuna -az- takısı eklenerek isimlendirilir. Madde Hidroliz Enzimi Nişasta(Amilon) Amilaz Yağ (Lipos) Lipaz Protein Proteaz Üre Üreaz

Bu kurala uymayanlar: Pepsin, tripsin, pityalin

Katalizledikleri reaksiyon tipine göre: oksidaz, dekarboksilaz

Günümüzde bu tür karışıklıkları önlemek amacıyla Uluslararası Biyokimya Birliğinin (IUB) Enzim Komisyonu tarafından Sistematik isimlendirme önerilmiştir. Bu sistemde her enzim, katalizlediği reaksiyon tipine ve mekanizmasına göre isimlendirilmektedir.

Günlük kullanımda önerilen kısa isme ilaveten daha detaylı sistematik ismin kullanılması öngörülmüştür.

SİSTEMATİK İSİMLENDİRMENİN TEMEL ÖZELLİKLERİ

1. Reaksiyonlar ve bu reaksiyonları katalizleyen enzimler, reaksiyon mekanizmalarına göre 6 sınıfa bölünürler. Bu sınıflarında alt sınıfları vardır.

2. Her enzimin bir kod numarası vardır (EC). Bu kod, dörtlü sayı grubu ile gösterilir.

ULUSLARARASI ENZİM SINIFLAMASININ ALTI ANA SINIFI

1.OKSİDOREDÜKTAZLAR Oksidasyon (yükseltgenme) ve redüksiyon (indirgenme) reaksiyonlarını katalizleyen enzimlerdir. Dehidrogenaz ve oksidazlar, substrat olarak, hidrojen ve elektron vericileri kullanırlar.

AYÜK + BİND AİND + BYÜK

oksido-redüksiyon

Bir molekülden H+kopararak, o molekülün yükseltgenmesini; bir başka moleküle H+’i aktararak o molekülün indirgenmesini katalizlerler.

Örnek:

CH3 CH COO־ + NAD+ CH3 C COO־ + NADH +H+

OH O

Piruvat Laktat

LDH (Laktat Dehidrogenaz)

2.TRANSFERAZLARMolekülden H+ dışında, başka grupları (C, N ve fosfor taşıyan gruplar)aktaran enzimlerdir. AB + C A + BC

Örnek:

CH2 CH COO־ + THF CH2 COO־ + THF CH2

NH3 NH3

Serin Glisin

Serin hidroksimetil transferaz

OH

3.HİDROLAZLARDeğişik bağların hidrolizini sağlayan enzimlerdir. Bağlara suekleyerek koparılmalarını katalizlerler.

AB + H2O AOH + BH

Örnek: NH2 C NH2 + H2O CO2 + 2NH3

Üreaz

O

Üre

4.LİYAZLAR C-C, C-O, C-N ve C-S bağlarını yükseltgeme ve hidroliz dışında birmekanizma ile kıran enzimlerdir. AB A + B

Örnek: CH3 C COO- CH3 CH + CO2

O

Piruvat

O

Asetaldehid

Piruvat dekarboksilaz

5.İZOMERAZLAROptik ve geometrik izomerlerin rasemizasyonunu katalizleyenenzimlerdir.

ABC ACB Molekül-içi düzenleme yaparlar.

-OOC CH C CoA -OOC CH2 CH2 C CoACH3

OO

Metil malonil CoA Süksinil CoA

Metilmalonil CoA mutaz

6.LİGAZLARYüksek enerjili fosfatların enerjisini kullanarak, karbon ile C,O,S,N

arasında bağ oluşumunu katalizleyen enzimlerdir.

A + B + ATP AB + ADP + Pİ

ATP ve benzeri trifosfatları kullanarak iki molekülü birleştirirler.

CH3 C COO- + CO2 HOOC CH2 C COO-

OATP ADP +PİO

Piruvat Oksalasetat

Piruvat karboksilaz

Sistematik İsimlendirme:Örn:ATP + D-Glukoz ADP + D-Glukoz-6-FosfatÖnerilen kısa isim: HekzokinazEnzim kodu: EC (2.7.1.1)Sistematik isim: ATP: glukoz fosfotransferazEC (2.7.1.1):İlk sayı: Reaksiyon tipini açıklar (Major sınıf)Transferaz sınıfıİkinci sayı: Alt sınıfFosfotransferazÜçüncü sayı:Alt alt sınıfHidroksil grubunun alıcı olduğu fosfotransferazDördüncü sayı:Enzim için spesifiktir. Fosfat grubunun D-glukozaaktarıldığını açıklar. Enzimin listeye girdiği seri numarasıdır.

HK

IV.ENZİMLERİN ÖZELLİKLERİIV.ENZİMLERİN ÖZELLİKLERİ

1.Enzimler protein yapısında maddelerdir:•Protein yapısına istisna olarak bazı RNA tipleri gösterilebilir. •Bunlar, fosfodiester bağlarının yıkımı ve sentezi esnasında enzim gibi davranabilirler. Katalitik etkiye sahip RNA’ya Ribozim denir. Enzimler kolaylıkla denatürasyona uğrarlar:

Denatürasyon, proteinlerin doğal yapılarının bozulması sonucunda aktivitelerinin kaybolmasıdır. Enzim denatüre olduğunda aktif bölgesi de denatürasyona uğrayarak substratını bağlayamaz, bundan dolayı da etkili olamaz.

Başlıca denatürasyona yol açan faktörler: Isı Işınlar (X ışınları, UV ışınları, vs) Çalkalama Dondurup eritme Derişik asid ve baz Alkol, eter, benzen, vs gibi organik çözücüler Üre, guanidin çözeltileri

2.Enzimler özgül moleküllerdir.

Enzimler yalnız belirli reaksiyonları katalizledikleri ve sadece substratları ile etkileştiklerinden dolayı spesifik (özgül) maddelerdir.

3.Enzimler katalitik etkinliğe sahiptir.

Enzimle katalizlenen reaksiyonların çoğu katalizlenmeyen reaksiyonlara göre 103 –108 kere daha hızlı olarak gerçekleşmektedir.

Bir enzim molekülü saniyede ortalama 100-1000 substrat molekülünün ürüne dönüşümünü sağlamaktadır.

Enzimin dönüşüm sayısı (Turnover sayısı):Enzim molekülü tarafından bir saniyede ürüne çevrilen substrat molekülü sayısıdır.

CO2 + H2O H2CO3

Karbonik anhidraz, 1 saniyede 105 molekül CO2’e, H2O’yu bağlayarak

karbonik asid oluşturur.4. Substrat-ürün dönüşümleri çift yönlü olabilmektedir.

C

Karbonik anhidraz

COH

OHH

CH2OPO3-2

Gliseraldehid-3-fosfat (G3P)

Trioz fosfat izomeraz CH2OH

C

CH2OPO3-2

Dihidroksi aseton fosfat (DHAP)

O

Bu iki madde arasındaki izomerizasyon glikoliz yolunda rastlanır. Enzim iki yöne doğru reaksiyon hızını arttırmaktadır.5.Enzim moleküllerinde aktif bölge ismi verilen özel bir boşluk ya da cep kısmı bulunur. Aktif bölgedeki aminoasidlerin yan zincirleri, substratın yapısına uyumlu, üç boyutlu bir yapı oluşturmaktadır.

Aktif bölge

Enzim Substrat Enzim-Substrat kompleksi

Aktif bölgenin substratı bağlamasıyla oluşan enzim-substrat kompleksi (ES), önce enzim-ürün kompleksine, daha sonra ise serbest enzim ve ürüne dönüşmektedir.

E + S ES EÜ E + Ü

Enzim ile substrat biribirlerine hidrojen, elektrostatik ve Van der Waals bağları gibi non kovalent (zayıf) bağlarla bağlanır.

Zayıf bağlar ve bazı kuvvetli bağlar, aktif bölgelerin aminoasidlerini biribirlerine yanaştırmada önemli rol oynarlar.

Birçok enzimin katalitik bölgesinde aşağıdaki aminoasidler yer alır:Serin, sistein, histidin, tirozin ve lizin

HisHis119

12Katalitik bölge

SS

S

S

S

SS

S

Bağlanma bölgesi

RİBONÜKLEAZ

Aktif Bölge

Bağlanma bölgesi

Katalitik bölge

RİBONÜKLEAZ: Bu enzim RNA molekülündeki nukleotidleri hidroliz yapar. Yapısı 4 disülfür bağı ile sağlamlaşmıştır. Katalitik bölgede 2 histidin kalıntısı yer alır. Histidin 12 ve Histidin 119 His 12, ribozun hidroksil grubu üzerine etki eder. His 119, ise fosforil kısmına etkilidir. Böylece molekülün 2 kısmından kırılma gerçekleşir. Molekülün taranmış kısmı ise 5 aminoasidin yer aldığı bazik bir

bölgedir. Bu bölge RNA‘yı bağlar.

Enzimlerin substrat bağlama yeri olan aktif bölgedeki aminoasidler, substratın ürüne dönüşmesini sağlayan pek çok kimyasal mekanizmayı kullanır.

Bu aminoasidlerden bazıları substratın aktif merkeze bağlanmasını, bazıları ise kataliz olayını sağlamaktadır.

Aktif merkezde yer alan iki bölgeden birincisi bağlanma bölgesi, diğeri ise katalitik bölgeyi oluşturur.

Enzim ile substrat bağlanmasında iki model ileri Enzim ile substrat bağlanmasında iki model ileri sürülmektedir.sürülmektedir.

1.Model: Anahtar-kilit modeli

2.Model: Katalitik bölgenin “uyum oluşturma modeli”

1.MODEL:Kilit anahtara olan benzerliğe dayanılmıştır.Bu modelde enzimin aktif merkezindeki bir bölge ile substrat yapılarının biribirini tamamlayıcı olmaları gerekmektedir.

+

a b c

Enzim

Substrata b c

ES kompleksi

Kilit-anahtar modeli

a b c

2. MODEL: Katalitik bölgenin “Uyum-oluşturma” modelidir. Başlangıçta enzim ve substrat biribirlerine uygun değildirler. Ancak substrat enzimin aktif bölgesine yaklaştıkça, enzim buna uymaktadır. Substrat, enzimde biçimsel değişiklik meydana getirir.

Substrat

Enzim

a b c

a

bc

a b c

ES kompleksi

+

6.Bazı enzimler, enzimatik reaksiyon için gerekli olan bir non-protein kofaktör ile birleşirler. Sıklıkla karşılaşılan kofaktörler arasında metal iyonları (Zn2+,Fe2+,Cu2+, Mn+2 …vs) ve koenzim olarak adlandırılan bir organik molekül, genellikle vitamin türevleri (NAD+, FAD,CoA..gibi) yer alır.

Koenzimlerin pek çoğu genellikle B grubu vitaminlerden türevlenmektedir.

Kofaktörle birleşik durumda olan ve katalitik aktivite gösteren enzim holoenzim olarak bilinmektedir.

Holoenzimin protein kısmına apoenzim adı verilir.

Apoenzim kofaktörün yokluğunda biyolojik aktivite gösteremez.

Protein kısmına sıkıca bağlı olan koenzime prostetik grup denir.

Kofaktörü metal iyonu olan bazı metalloenzimler:

Kofaktör Enzim

Fe2+ Katalaz, peroksidazCu2+ Sitokrom oksidaz, tirozinazMg2+ Fosfohidrolaz, fosfotransferazMn2+ ArginazZn2+ Alkol dehidrogenazMo2+ Ksantin oksidaz

Metal iyonları substrat bağlanmasını ve katalizi kolaylaştırır. Aşağıdaki 4 form da, metal iyonları ile katalizlenen enzimatik reaksiyonlar için geçerlidir.

Enz S M M Enz S

Enz M S Enz

Substrat-köprü kompleksi

Enzim-köprü kompleksi

Metal-köprü kompleksi

M

SSiklik metal-köprü kompleksi

KOENZİMİ VİTAMİN OLAN BAZI ENZİMLER:Enzim Vitamin Koenzim Katalizlenen reaksiyonDekarboksilaz B1 vitamini TPP (Tiamin pirofosfat) ………………...R-CO-COOH (Tiamin) RCHO + CO2

(Dekarboksilasyon)Dehidrogenaz B2 vitamini FMN(Flavin mononukleotid ve…………..Hidrojen (Riboflavin) FAD Flavin adenin dinükleotid) transferi

Transaminaz B6 vitamini Pridoksal fosfat ……………….Amino asidlerden aldığı (Pridoksal) -NH2 grubunu α-keto asidlere transfer eder.

Karboksilaz Biotin Biotin …………………………α-keto asidlere CO2 ‘i bağlar(Karboksilasyon)

Transformilaz Folik asid THF…………………………… -CHO, -CH2 OH, -CH3

(Tetrahidrofolat) gruplarının transferi

Transmetilaz B12 vitamini Kobamid…………………………-CH3 grubu transferiİzomeraz koenzim

7. Enzimler hücrenin metabolik gereksinimlerine uygun şekilde aktive veya inhibe edilerek ürün oluşum hızı kontrol edilebilir. Bu olaya enzim aktivitesinin düzenlenmesi denir.

8. Enzimler enerji türlerini biribirine dönüştürürler. Mitokondrideki küçük moleküller içinde bulunan serbest enerji, ATP enerjisi şekline dönüşür. Kasta ise ATP enerjisi, kasılma esnasında mekanik enerjiye dönüşür.

9. Enzimler tranzisyon (geçiş) durumunu stabilize ederek reaksiyonları hızlandırırlar. Moleküllerin reaksiyona girebilmeleri için enerji tüketilmektedir. Substrat ürüne dönüşürken tranzisyon (geçiş) durumundan geçer. S T* Ü

Tranzisyon durumu, S ve Ü’nün serbest enerjisinden çok daha yüksek enerjiye sahiptir.

Reaksiyon tranzisyon durumundan itibaren başlar.

Enerji düzeyinin tepe noktasında bulunan yüksek enerjili geçiş ürünleri daha sonra son ürüne dönüşmektedir.

Enzimlerin yokluğunda, tranzisyon durumuna ulaşabilen çok az sayıda molekül, ürüne dönüşebilmektedir.

Reaksiyon hızı ise, bu yüksek enerjiye sahip moleküllerin sayısı tarafından belirlenmektedir.

Ea = Aktivasyon enerjisi

Ea1 = Enzimle katalizlenmemiş reaksiyonun aktivasyon enerjisi

Ea2 = Enzimle katalizlenmiş reaksiyonun aktivasyon enerjisi

Ea1

Ea2

Ü

SBaşlangıçdurumu

Bitiş durumu(ürünler)

Ea

∆GOrtama salınan serbest enerji

T*

Serb

est e

nerj

i

Reaksiyon akış yönü

Bir kimyasal reaksiyon ortama enerji salıyor ise, tranzisyon durumuna geçebilmesi için, önce aktivasyon enerjisinden enerji borç alır, sonra bu enerjiyi sarfeder. Sarfedilen enerjiden geri kalanı ise ortama serbest enerji şeklinde salınır. Ea= Tranzisyon durumu serbest enerjisi – substrat serbest enerjisi

Aktivasyon enerjisi düşük olan reaksiyonların hızı yüksek olmaktadır.

“ Enzimle katalizlenen reaksiyonlarda, enzimler aktivasyon enerjisini azaltarak reaksiyonları hızlandırırlar. Böylece enzim ve substratı, tranzisyon enerjisi daha düşük olan yeni bir reaksiyon yolu oluşturur.”

Spontan reaksiyon Kimyasal katalizör varlığındaki reaksiyon Spesifik enzim

Tranzisyon durumu

Başlangıç durumu

Bitiş durumu∆G kalo

riE

a

V.ENZİMLERİN KATALİZ HIZINA ETKİ EDEN FAKTÖRLER

Kataliz Hızı, birim zamanda oluşan ürün ya da kaybolan substratmiktarıdır.

Enzimle katalizlenen reaksiyonların hızını etkileyen faktörler:

1.Enzim Konsantrasyonu

2.Substrat Konsantrasyonu

3.Sıcaklık

4.pH

1.ENZİM KONSANTRASYONU

Enzimle katalizlenen reaksiyonlarda substrat konsantrasyonu yüksek miktarlarda ise, reaksiyonun başlangıç hızı (Vİ),enzim konsantrasyonu ile

doğru orantılı olarak artmaktadır.

Rea

ksiy

on h

ızı

Vİ

Enzim konsantrasyonu

2.SUBSTRAT KONSANTRASYONUEnzimle katalizlenen bir reaksiyonun hızı (V), ortamda enzim konsantrasyonunun sabit olması koşuluyla, substrat konsantrasyonu ile [S] birlikte hızla artar ve maksimal hız (Vmax) değerine varıncaya kadar artış devam eder. Ancak Vmax’ta substrat konsantrasyonu ne kadar artarsa artsın, kataliz hızı artmaz.

Yüksek substrat konsantrasyonlarında reaksiyon hızının yavaşlaması, enzim üzerindeki substrat bağlama bölgelerinin doygunluğa ulaşmasını

göstermektedir.

VMAX

[S]VO

V

Enzimlerin çoğu Michaelis-Menten Kinetiği gösterirler.

Belli sıcaklıkta ve sabit enzim konsantrasyonunda, bu kinetiğe uyan enzimler, değişen substrat konsantrasyonu ile başlangıç hızı (VO) arasında hiperbolik bir eğri çizerler (A).

Buna karşılık allosterik enzimlerde, bu eğri sigmoidal özellik taşımaktadır (B).

A

B

VMAX

VO [S]

3.SICAKLIKKimyasal reaksiyonlarda ısının artması moleküllerin hareketini arttırarak reaksiyon hızının da artmasına yol açar.Reaksiyon hızının sıcaklık ile artışı, belli bir enerji düzeyini aşabilecek

molekül sayısı ile ilgilidir.Bu durum, enzimlerle katalizlenen reaksiyonlar için de geçerlidir.

“Enzimle katalizlenen bir reaksiyonda sıcaklığın yükselmesi reaksiyon hızını arttırmaktadır.”

Ancak enzimler protein yapısında maddeler olduklarından, belirli bir ısı derecesinden itibaren (genelde 45ºC) enzimin denatürasyonu söz konusu olacağından, reaksiyon hızında da bir azalma meydana gelecektir.

Optimum Temperatür:Optimum Temperatür: Enzimin en iyi etkilediği ısı derecesidir. Bu ısı derecesi, reaksiyon hızını maksimal arttırırken, daha ilerisinde enzimin denatürasyonuna yol açar.

“Enzim etkinliği düşük ısıda az, tepe noktasında en fazla, sıcaklık arttığında ise hızla düşer.”

Genellikle, başlangıçta sıcaklığın her 10 ºC artışı, reaksiyon hızının ikikatına çıkmasını sağlamaktadır.

reak

siyo

n hı

zı (v

)

O O

50

100

dena

türe

olm

amış

prot

ein

yüzd

esi

20 30 40 50 60

sıcaklık (ºC)

Enzim aktivitesinde,optimum temperatür 2 faktörle belirlenmektedir (Kırmızı eğri).

Reaksiyon hızı, gerek spontan gerekse katalizör varlığında, sürekli olarak artar (mavi eğri).

Belirli bir ısı derecesinden sonra, enzim proteini denatüre olur (siyah eğri).

Termik İnaktivasyon:Enzim çözeltisi hazırlandıktan sonra enzim aktivitesi ölçülür (Eo). Daha

sonra çözelti termostata konarak her 2-3 dakikada bir ısı derecesi arttırılırve çözeltiden bir kısım alınarak aktivite ölçülür (E). Isıtma süresi arttıkçaaktivitede giderek azalma gözlenir. İnaktivasyon, zamanın logaritmikfonksiyonudur.

30ºC

45ºC

55ºC

60ºC

zaman(dak)

EEo

Log

4.pHEnzimatik reaksiyonlar ortamın H+ iyonu konsantrasyonundankolaylıkla etkilenirler.

Enzim etkinliğinin en yüksek olduğu pH , optimum pH’dır. Her enzimin etki ettiği pH farklıdır.

enzi

mat

ik a

ktiv

ite

pH

a

b

4 5 6 7 8 9 10

Enzimler pH değişikliklerine bağlı olarak başlıca 2 tip aktivite eğrisigösterirler: a) Dar sınırlar içinde etkiyi gösteren çan eğrib) Geniş sınırlar içinde etkiyi gösteren plato eğri

Çoğunlukla enzimlerin optimum pH’ı 5-8 arasında değişmektedir. Maksimum aktiviteyi

pH= 2’de gösterir. Nötral

pH’da çalışan enzimler

asidik ortamda denatüre olurlar.E

nzim

atik

akt

ivite

pH

Optimum etki

4 6 8 10 12 TRİPSİN

Alkali ortamda en iyi etkiyi gösterir.

Optimum etki

pH

PEPSİN

2 3 4 5 6 7

pH değişikliklerinin enzimatik aktivite üzerindeki etkileri aşağıdaki faktörler tarafından belirlenmektedir.

1. Ortamın çok yüksek ve çok düşük pH düzeyleri, enzimin denatürasyonuna yol açarak, yapısında geri dönüşümsüz değişiklikler yapar.

2. Apoenzim ile koenzim arasındaki bağlar etkilenir.

3. Bir protein olan enzimin yapısındaki amino ve karboksil gruplarının iyonizasyon durumu, ortamın pH değerine bağlı olarak değişir. Aktif bölgedeki iyonizasyon değişikleri, enzim-substrat reaksiyonunu ve buna bağlı olarak katalizi bozar.

Örnek:Katalitik aktivite için ortamdan H+ iyonu kazanılması gerekiyor ise, moleküldeki amino gruplarının protonlaşması gibi:

- NH2 -NH3+

Alkali pH ‘da proton kaybı olacağından, verilen örnekte enzimatikaktivite hızı düşer.

4. Büyük çoğunlukla pH değişikliklerinden substratın da iyonizasyon durumu etkilenir.

H+

VI.ENZİM KİNETİĞİ

Reaksiyon Hızı (v):Enzim etkisiyle birim zamanda kaybolan substrat miktarı veya oluşan ürün miktarı ile ölçülür.

Enzim Moleküler Aktivitesi: Optimum reaksiyon şartlarında, 1 molekül enzim tarafından 1 dakikada ürüne dönüşen substrat miktarıdır.

Spesifik Enzim Aktivitesi:mg protein başına düşen enzim ünite sayısıdır.

Enzim Ünitesi: Optimal şartlarda, 1 dakikada 1 mikromol (μmol) substratı ürüne dönüştüren enzim miktarıdır.

Enzimlerin katalizledikleri reaksiyonlarda genel kimyasal reaksiyon kinetikleri geçerlidir.Michaelis ve Menten isimli araştırmacılar, enzimlerle gerçekleşen reaksiyonlar için basit bir tanımlama yapmışlardır.Enzim kinetiklerinin kantitatif analizleri için geliştirilen bu model, tek substratlı reaksiyonlar için geçerlidir.

E + S ES E + Ü

k1, k2 ve k3 : reaksiyonların hız sabitleri

k1

k2

k3

Tersinir olarak sabit bir hızla (k1) substratla [S] birleşen enzim [E], önce enzim-substrat [ES] kompleksini oluşturur. [ES] kompleksi daha sonra başlıca 2 akıbete uğrayabilir:

1. Sabit bir hızla (k2) yeniden E ve S’a dönüşür.

2. Yahut k3 sabit hızıyla ürün [Ü] oluşurken enzim de serbestleşerek ilk yapısını kazanır.

ES oluşum hızı = k1[E] [S]

ES yıkılım hızı = (k2 +k3) [ES]

Reaksiyon hızı ile substrat konsantrasyonu arasındaki ilişkiyi tanımlayanMichaelis-Menten denklemi kurulurken aşağıdaki varsayımlar gözönünealınmıştır:

1. Substrat konsantrasyonu [S], enzim konsantrasyonun [E]’dan çok daha fazladır. Böylece belirli bir zamanda enzime bağlı olan substrat miktarı ihmal edilebilir.

2. Reaksiyonun denge durumunda ES kompleksinin oluşum ve yıkılım hızları biribirine eşittir.

Reaksiyonun denge durumunda : k1 [E] [S] = [k2 + k3] [ES] (1)

[ES] = (2)

[E] [S] k2 + k3

k1

k2 + k3

k1

Km

Michaelis-Menten denklemi hiperbolik bir eğrinin denklemidir.

Km

[S] (mol/L)

V

VMAX

2

VMAX

0

Rea

ksiy

on h

ızı

VMAX :

• Katalizin ulaşabileceği en yüksek hız değeridir.

• Enzim bölgeleri substrat ile tam doygunluğa geçince VMAX’a

ulaşılır.

Km : (Michaelis-Menten Sabiti)

• En yüksek hız (VMAX) değerinin yarısına ulaşmak için gerekli substrat

miktarıdır.

• Ortamda bulunan tüm enzim moleküllerinin aktif bölgelerinin yarısını dolduran substrat miktarıdır.

• Km değerini tam olarak bulabilmek için farklı konsantrasyonlarda

substrat kullanılmalıdır.

• Km , bir enzime ve substratına özgüldür.

• Enzimin substratına ilgisini (affinitesi) ni yansıtır.

• Km , enzim-substrat ilişkisinde bir ölçüdür.

• Km’i düşük olan bir enzim, substratına yüksek ilgi (affinite) gösterir.

• Enzim, aşağı substrat konsantrasyonunda doyar. • Tersine büyük KM , enzimin substratına düşük ilgisini tanımlamaktadır.

• Km = mol/L olarak ifade edilir.• Bir çok enzim için bu değer 10-3 – 10-5 mol/L arasında değişir. Km =

k2 + k3

k1(mol/L)

Enzim a’nın küçük Km ‘i, enzimin substrata ilgisinin yüksek olduğunu yansıtır.

Enzim b’nin büyük Km’i, enzimin substrata olan ilgisinin az olduğunu yansıtır.

[S]

V

a

b

Kma Kmb

VMAX

2

VMAX

Rea

ksiy

on h

ızı

Vmax

2

vmax

Km

[S]

Yüksek substrat konsantrasyonlarında

[S] > Km reaksiyon hızı sıfırıncı basamaktır-yani,

substrat konsantrasyonundan bağımsız ve sabittir.

Düşük substrat konsantrasyonunda

[S] < Km, , reaksiyon hızı

birinci basmaktır-yani, substrat

konsantrasyonuylaorantılıdır.

o

[S]= Km : Substrat Kmdeğerine eşitse, başlangıç hızı,maksimal hızın yarısına eşittir. Vi = Vmax

2

Belirli bir andaki kataliz hızı: Vo = Michaelis-Menten Eşitliği

Michaelis-Menten denklemi hiperbolik bir eğrinin denklemidir.

Bu denklem tersine çevrildiğinde düz eğri elde edilir.

Düz eğrinin (doğru) çizilmesi ile Km ve VMAX değerlerinin duyarlı bir biçimde belirlenmesi kolaylaşmaktadır.

Bu doğru ayrıca enzim inhibitörlerinin etki mekanizmalarının saptanmasında da kullanılır.

VMAX [S]

[S] + Km

1

VoKm + [S]

VMAX [S]

1Vo

Km

VMAX [S] +

[S]VMAX [S]

1Vo

Km

VMAX

X1[S]

+ 1

VMAX

1

[S]1

Vo

arasında bir grafik çizilirse, doğrunun y eksenini ile1

VMAX

,

x eksenini ise - 1Km

değerinde kestiği görülür.

Doğru denklemi y = ax +b

Lineweaver-Burk eğrisidenklemi

(Çift-resiprok eğrisi)

Lineweaver-Burk çift-resiprok Eğrisi

1V0

1VMAX

1 Km

1[S]

Km

VMAX

Eğim

..

Km Değerinin Bilinmesinin Önemi

Enzimlerin Saflaştırılması Dokularda enzim aktivitesinin saptanması İlaç imalatında Enzim inhibitörlerinin belirlenmesi

VII.ENZİM AKTİVİTESİNİN İNHİBİSYONU

Enzimle katalizlenen bir reaksiyonun hızını azaltan ya da engelleyen maddeye inhibitör adı verilir. İnhibitör, bir molekül yada iyon olabilir.

Enzim katalizinin engellenmesi olayına ise inhibisyon denir.

Enzim Katalizinin İnhibisyonu (engellenmesi)

1. Enzimlerin yapısal özelliklerinin ve katalitik aktivitelerinin incelenmesinde önemli rol oynar.

2. Hücre içindeki metabolik yolların belirlenmesinde yol gösterir.

3. Biyolojik sistemlerin temel kontrol mekanizmasını oluşturur.

4. Pek çok ilaç ve zehirli bileşik tarafından ortaya çıkabilir.

Enzimlerin inhibisyonu; reversibl (tersinir, geriye dönüşümlü) veya

irreversibl (tersinmez, geriye dönüşümsüz) olarak iki grupta incelenir.

1-Geriye dönüşümlü (reversibl) inhibisyonlar:

Bu tip inhibisyonlarda substrat konsantrasyonunun ya dainhibitöre oranla enzim konsantrasyonunun arttırılması ileenzim inhibitör ilişkisi tersine çevrilebilmektedir.

a)Yarışmalı (kompetitif) inhibisyon:

İnhibitör (İ) enzimin aktif bölgesine substratla (S) yarışarak bağlanmaktadır.

İnhibitör molekülünün yapısı substratınkine benzediğinden dolayı enzim ile inhibitör kolaylıkla bağlanırlar, ancak ürün oluşamamaktadır. Bu tip inhibitörler, enzime asıl substratın bağlanmasını engelleyen maddelerdir.

Bu tür inhibisyonda Vmax’a ulaşmak için daha fazla substrat gereklidir.

Ortamda substrat moleküllerinin arttırılmasıyla enzimin inhibitöre olan ilgisi azalmakta ve inhibisyon ortadan kalkmaktadır.

E +S ES E + Ü ES, İ bağlayamaz.+ Eİ, Ü oluşturamaz.İ Eİ VMAX DEĞİŞMEZ.

Km

Kompetitif İnhibisyon

Km Km

Yarışmalı İnhibitör ile

İnhibitörsüz

VMAX 2

VMAX

[S]

Yarışmalı inhibitör ile

1Km

inhibitörsüz

1[S]

1Vo

1Km

1VMAX

Rea

ksiy

on h

ızı (

Vo)

İnhibitör varlığında VMAX değişmez, buna karşılık Km

değişir. İnhibitör varlığında Km değeri büyür, enzimin substrata olan ilgisi

azalmıştır. Km büyümüştür. Çünkü 1 küçülmüştür ve Km (eğrinin VMAX

eğimi) büyümüştür.

Km

Bir molekülün, belirli bir enzimin inhibitörü olup olmadığı,yahutinhibisyonun tipi, kinetik analizlerle ortaya konulur!

• Metanol zehirlenmesinin tedavisinde yarışmalı inhibisyondan faydalanılır.

• Metanol, alkol dehidrogenaz etkisiyle FORMALDEHİD’e dönüşür.

• Formaldehid körlüğe yol açar.

• Etanol, alkol dehidrogenaza bağlanmada metanol ile yarışır. Böylece formaldehid oluşumu yarışmalı olarak engellenir.

• Metanol zehirlenmesinde damar-içi etanol uygulanır.

b)Yarışmasız (nonkompetitif) İnhibisyon: Substratla yapısal benzerliği olmayan inhibitör, substratla aynı

bölgeye bağlanmaz. Yarışmasız inhibitör, ya serbest enzime ya da ES kompleksine

bağlanarak reaksiyonu yavaşlatır. Substrat konsantrasyonu arttırılarak inhibisyon ortadan

kaldırılamaz.

E +S ES E +Ü VMAX

Km DEĞİŞMEZ

Eİ + S EİS Ü

+İ

+İ

Nonkompetitif İnhibisyon

Km

Yarışmasız İnhibitör

İnhibitörsüz

VMAX 2

VMAX

[S]

Yarışmasız inhibitör

inhibitörsüz

1[S]

1Vo

1Km

1VMAX

VMAX

2

1VMAX

c)Yarışmasız (unkompetitif) inhibisyon: İnhibitör, ES kompleksine bağlanır. İnhibitör bağlandığında ürün oluşumu sonlanır. E +S ES E + Ü + İ EİS Ü VMAX

Km

Unkompetitif İnhibisyon

KmKm

Unkompetitif inhibitör VMAX

2

VMAX

[S]

1Km

1[S]

1Vo

1Km

1VMAX

İ

1VMAX

½ VMAX

2- Geriye dönüşümsüz (tersinmez, irreversibl inhibisyon):

Bu tip inhibisyonlarda aktif bölgeye kovalent olarak bağlanan inhibitör, enzim yapısını bozduğu için geriye dönüş olmamaktadır.

Sinir gazlarından DIPF (diizopropil fosfofluoridat) asetilkolin isimli nörotransmittörü parçalayan asetilkolin esteraz’ ın tersinmez inhibitörüdür.

Asetilkolin bir sinir hücresindeki uyarıyı diğer bir hücreye aktaran maddedir.

Bu etkisi sona erdikten sonra, asetilkolin esteraz tarafından hidrolize uğrar.

Asetilkolin esteraz’ın aktif bölgesinin DIPF tarafından tersinmez inhibe edilmesi hidroliz olayını engeller ve bunun sonucunda felç meydana gelir.

Tarımda kullanılan insektisidler (böcek öldürücüler) de asetilkolin esterazın tersinmez engelleyicisidir.

Birçok insektisidin bileşiminde bulunan fosforlu organik yapı aktif bölgesinde serin amino asidini içeren enzimlerle geriye dönüşümsüz inhibisyon yapar.

Kurşun zehirlenmesi

Kurşun, proteinlerin yapısında yer alan sistein isimli aminoasidin sülfhidril grubuyla (-SH) kovalent bağlar oluşurur.

Hemoglobin sentezinde, protoporfirin isimli maddeye Fe+2 girişini katalizleyen ferrokelataz ve yine bu sentezde yer alan δ-aminolevülinat dehidraz isimli enzimler kurşunun geri dönüşümsüz inhibisyonuna duyarlı enzimlerdir.

3-Bazı ilaçlar da enzim inhibitörü olarak etki ederler. Penisilin ve amoxicillin gibi yaygın olarak kullanılan

antibiotikler,bakteri duvarı sentezine ait enzimleri inhibe ederek etki gösterirler.

ACE (angiotensin-konverting enzim) inhibitörleri (captopril, enapril gibi) kan basıncını düşüren ilaçlardır.

Bu etkilerini, angiotensin I’i vazokonstriktör (damar büzücü) etkili angiotensin II’ye çeviren ACE’yi bloke ederek gösterirler.

Angiotensin I Angiotensin II

ACE

Angiotensin -konvertingenzim (Damar büzücü etkili)

captopril, enapril (inhibitör etki gösteren ilaçlar)

VIII. ENZİM AKTİVİTESİNİ DÜZENLENMESİ Bir metabolik yolun belli bir hızda ve yönde ilerleyebilmesi içinkontrol altında tutulması gerekir, bu da enzimlerin sayesinde olur.

Enzim aktivitesi 2 şekilde kontrol edilebilir:

1-Enzimin mutlak (absolü) miktarının değişimi

2-Enzimin katalitik etkinliğinin değişimi

1-ENZİMİN MUTLAK MİKTARININ DEĞİŞİMİ

Organizma varolan enzim miktarını, enzim sentez hızlarını değiştirerek düzenleyebilir.

Enzim proteinin sentezi ihtiyaca göre artabilir (indüklenme) ya da azalabilir (represyon, baskılanma).

İndüksiyon ile enzim sentezi artar, represyon ile enzim sentezi azalır.

Derepresyon ile enzim sentezi baskıdan kurtulup tekrardan artar.

Enzim sentezi indükleyici bir maddeye cevap olarak tetiklenebilir. Escherichia coli isimli mikroorganizma glukozun bulunduğu ortamda

glukozu kullanır.

Ancak bir disakkarid olan laktozu, β-galaktozidaz isimli enzimi bulunmadığından dolayı galaktoz ve glukoza hidrolizleyemez.

Ortamdan glukoz çıkarılıp yerine laktoz ilave edildiğinde, mikroorganizma laktozu kullanır hale gelir.

Laktoz (indüktör) protein yapısında olan β-galaktozidazın sentezlenmesini indüklemiştir.İndükleyici maddelerin çoğu, enzimlerin substratlarıdır.Ancak substrata yapısal bakımdan benzeyen bileşikler de indükleyicimadde olabilirler fakat substrat olamazlar!

Salmonella isimli mikroorganizma histidin bulunan ortamda, kendisi histidin sentezleyemez ( represyon, baskı altına alma).

Histidin korepresör’dür, yani kendi sentezi ile ilgili enzimlerin sentezini engellemektedir.

Histidin represyon etkisini bir proteine bağlanarak yapar.

Bu proteine aporepresör denir.

Aporepresör-korepresör, enzim sentezini kontrol altına alır.

Ortamdan histidin çıkarılması yahut bu maddenin tükenmesi, enzim biosentezinin tekrardan başlamasını sağlar (derepresyon, baskının ortadan kaldırılışı).

2-ENZİMİN KATALİTİK ETKİNLİĞİNİN DEĞİŞİMİ

1. Enzim molekülünün aktivasyon-inhibisyonu (Allosterik enzimler)

2. Kovalent Modifikasyon

3. Zimojen Aktivasyonu

1.ALLOSTERİK ENZİMLER Allosterik “başka yere ait” anlamına gelir.

Aktif bölgeleri dışında bir yere nonkovalent olarak bağlanan efektör (modülatör) isimli moleküller tarafından düzenlenirler. Allosterik efektörün enzime bağlanması sonucunda, enzimin substratına olan ilgisi değişir. Efektör, enzim aktivitesini inhibe ettiğinde negatif efektör, aktiviteyi arttırdığında pozitif efektör denir.

HIZ DÜZENLEYİCİ ENZİMLERİN ÇOĞU ALLOSTERİK ENZİMLERDİR.

Birden fazla alt üniteden meydana gelmişlerdir (oligomerik enzimler).

Çoğunlukla metabolik yolun ilk basamağına etki ederler.

Enzim moleküllerinin üzerinde bir katalitik, bir de düzenleyici bölge bulunur. Düzenleyici bölgeye efektör, nonkovalent olarak bağlanır.

SUBSTRATKATALİTİK BÖLGE

II.

I.İNHİBİTÖR(negatif efektör)

DÜZENLEYİCİ BÖLGE

AKTİVATÖR(pozitif efektör)

İki alt birimli bir enzimin 1. alt ünitesine efektörün bağlanması sonucunda, 2. alt birimin substrat bağlanması etkilenmektedir.

Efektör, 2. alt birime substrat bağlanmasını hızlandırabilir ya da yavaşlatabilir.

Bu olaya kooperativite adı verilir. Ortamda bulunan allosterik aktivatör enzimin etkinliğini arttırır, allosterik inhibitör ise enzimin etkinliğini azaltır. Allosterik enzimlerde, substrat ile hız arasındaki hiperbolik eğri, sigmoidal karakter kazanır. Bu grafik lineer olarak çizildiğinde ise kırık şekil alır. Böyle bir grafik enzimin 2 veya daha fazla alt üniteden meydana

geldiğini gösterir.

V

Sigmoidal eğri

S

kırık eğri

1/V

1/S

Substratın kendisi aktivatör ya da inhibitör olarak davrandığında homotropik etki denir.

Bu olaya 4 altüniteden meydana gelmiş enzimlerde rastlanır.

Bir allosterik enzim kendi substratından başka bir efektör tarafından aktive ya da inhibe edilmekte ise heterotropik etkiden bahsedilir.

Bir ara ürün veya son ürün de enzim etkinliğinin düzenlenmesinde görev yapabilir. Bu ürün kullanılmıyor birikiyor ise, bu yolda görevli 1. veya 2. enzimi

“negatif feed back” başa tepki şeklinde inhibisyona uğratır.

A B C D

D’nin konsantrasyonu, sentezlendiği kadar tüketilmediğinden dolayıartacak olursa, metabolik yoldaki ilk enzim inhibe olur.

Düzenleyici enzimler sayesinde son ürünün birikimi engellenmiş olur!

E1 E2 E3

Hız düzenleyici enzim

Feed back İnhibisyon

2. KOVALENT MODİFİKASYONA UĞRAYAN SİSTEMLER

Bazı enzimlerin katalitik etkileri kovalent modifikasyonlarla değişebilir.

Aktivitelerinde kovalent modifikasyona uğrayan enzimler biribirine dönüşebilen enzimlerdir. Bu enzimler iki aktivite halinde bulunurlar: Yüksek ve düşük aktivite

En sık rastlanan modifikasyon şekli, enzim molekülünün yapısındaki belirli serin, treonin veya tirozin isimli aminoasidlere bir fosfat grubunun eklenmesi veya bir fosfat grubunun çıkarılmasıdır.

Bazı enzimlerde fosfoenzim, bazılarında ise defosfo enzim şekil daha aktif olabilmektedir.

Metabolik yolun gereksinimine uygun olarak, fosfor grubununenzime ilavesi ya da enzimden ayrılması sonucunda, enzim iki faklışekilde çalışmaktadır.

Enzim

serinOH

Enzim

serin O-P-O-

O

O-

Fosforilasyon

Defosforilasyon

Glukoz Glikojen

Glikojen sentataz

Glikojen fosforilaz

Glikojen sentataz

Glikojen fosforilaz

Defosfo şekil (aktif)

Fosfo şekil (inaktif)

Fosfo şekil (aktif)

Defosfo şekil (inaktif)

Organizmanın glukoza gereksinimi olduğu esnada, glikojen sentatazfosforillenerek aktivitesini kaybeder. Aynı esnada glikojen fosforilazbir fosfat grubu bağlayarak aktif şekle dönüşür. Bu sayede depomaddesi glikojenden glukoz sağlanmış olur.

Fosforilasyon ve defosforilasyon sırası ile protein kinaz ve proteinfosfataz ismi verilen enzimler tarafından gerçekleştirilmektedir. Buenzimler ise hormonal ve sinirsel kontrol altında tutulmaktadır.

Aktif sentataz İnaktif fosforilaz

İnaktif sentataz Aktif fosforilaz

Aktif sentataz İnaktif fosforilaz

İnaktif sentataz Aktif fosforilaz

P P

KİNAZ

FOSFATAZP P

Kinaz ve Fosfataz isimli enzimler kovalent modifikasyonun reversibl (geri dönüşebilir) oluşunu sağlayan enzimlerdir.

Enzim-Serin Enzim-Serin O-PO3-2

Kinaz

Fosfataz

ATPMg+2

ADP

H2OPi

Mg+2

ENZİMİN KOVALENT MODİFİKASYONU

3.ZİMOJEN AKTİVASYONU

Hücre dışında görev yapan bazı enzimler, bulundukları yere zarar vermemeleri için aktif olamayan öncül moleküller şeklinde sentez edilirler. Bu moleküllere proenzim veya zimojen adı verilmektedir.

Zimojen aktivasyonu bir veya birkaç peptid bağının koparılması (yarılması, kırılması) ile olur.

Pankreasta sentezlenen tripsinojen (inaktif) etki gösterdiği barsaklara salgılandığında peptid bağları kırılır ve aktif şekle dönüşür.

Tripsinojen Tripsin (İnaktif) (Aktif)

Kimotripsinojen Kimotripsin (İnaktif) (Aktif)

Kan plazmasında:

Fibrinojen Fibrin(İnaktif) (Aktif)

Enterokinaz

Tripsin Proteinlerdeki aromatik aminoasidleri ayırır.(Tirozin,fenilalanin,triptofan)

Trombin