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原 著

増菌培養か らキレ ックス樹脂 を用 いたPCR法 による

サルモネ ラ直接検 出法

大阪府立公衆衛生研究所,公 衆衛生部,微 生物課

小林 一 寛 田 口 真 澄 勢戸 和 子

(半成6年5月9目 受付)

(平成6年6月1日 受理)

Key words: PCR, Salmonella, rapid detection,

Chelex, phoE gene

要 旨

サ ルモ ネ ラは急性 胃腸 炎 や食 中毒 の主 要 な病 原菌 で あ る.本 菌 を迅 速,正 確 に検 出す る ことは食 品製

造 業 や臨床 検査 室 で は大 切 な こ とで あ る.本 研 究 で はpolymerasechainreaction(PCR)法 に よって

サル モ ネラ を検 出す るた めにphosphate-limitation-inducibleoutermembraneporeprotein(PhoE)

を制御 す るPhoE遺 伝 子 か らプ ライマ ー を作 成 して使 用 した.

Selenite-Brilliant-Green(SBG)培 地 増菌 後 の培地 をChelex樹 脂 で抽 出 したDNAをtemplateと し

てPCR法 を実 施 すれ ば,数 個 のサ ルモ ネ ラで陽性 の結 果が 得 られ た.こ の高感 度 なPCR法 で は4QCで

1～16カ 月保存 した糞便,125検 体 か ら従 来 の培養 法 陽性,62検 体 に比 べ て1.2倍(73検 体)が 陽性 で あっ

た.

これ らの結 果 か ら,増 菌 培地 のChelex抽 出法 を利 用 したPCR法(E-Chx)は,食 品 や環 境等 の多 数

の検体 か らサ ル モネ ラ を検 出 す るの に有 用 であ る と考 える.

序 文

Salmonellaは 下痢症 および細菌性食 中毒の主

要な原因菌であ り,腸 炎で入院 した患者 の10～

15%1),食 中毒 で は発生件 数 の25%(患 者 数 の

19%)を 占めている2).ま た,輸 入感染症 において

も19.5%～24.3%が 下痢の原因 となっている3).

さらに本菌 には菌血症や敗血症等の全身性感染

症,あ るいは膿瘍や関節炎等多彩な臨床像を呈す

る血清型が存在する4)5).

本菌感染の確定は培養による方法が一般的であ

るが,推 定原因食や保菌者検索など,患 者糞便以

外の検査材料の場合には増菌培養が不可欠であ

る.こ のため結果を得 るまでには最低で も3日 を

必要 とし,行 政的,臨 床的にも問題が多い.さ ら

に分離培養にはかな り選択性の強い培地が用いら

れていることもあってSalmonellaの 発育が抑制

されたり,単 独集落が見 られないな ど操作上の問

題 もあ りSalmonella陰 性 とされることもある.

下痢症患者,食 中毒発生時あるいは食品の検査に

おいてSalmonellaを 迅速 に検 出することが必要

であり,菌 血症や敗血症などの全身感染症の場合

も同様である.そ こで本菌の増菌の段階で迅速,

簡便 に検出す るためSalmonellaの 代謝に関与 し

ている特異的な外膜 タンパク(ポ リン)産 生の制

御 遺 伝 子 で あ るPhoE遺 伝 子6)を標 的 と して

polymerasechainreaction法(PCR)を 行 い,

日常検査への応用を試みた.

材料 と方法

1.使 用菌株 と糞便材料

散発下痢症 由来のSalmonella保 存菌株(25血別刷請求先:(〒537)大 阪市東成区中道1-3-69

大阪府立公衆衛生研究所 小林 一寛

平成6年10月20日

1204 小林 一寛 他

Table 1 Salmonella and non-Salmonella strains examined and PCI

confirmation results

*1; The bacterial suspension after heating at 100•Ž for 10min was tested by

inoculating directly into a PCR mixture which contained a pair of primers

for the phoE gene.

清 型)86株 とSalmonella以 外 の 菌 種(属)42株 を

用 い(Table1),加 熱 法 に よっ てPCRの 特 異性 を

検 討 した.

検 査 材 料 か らの 翫lmonelhzの 迅 速 検 出 と従 来

の培 養 法 に よ る検 出 は,採 便 時 の 培 養 検 査 でSal-

monel如 陽 性 の下 痢 症 患 者 糞 便(食 中毒 あ る い は

散 発 下 痢 症);78検 体 と 陰 性 の47検 体 をCary-

.Blair培 地(栄 研)で40Cに 保 存 した(1～16カ 月)

もの を用 い た.

2.培 養 法 に よ る検 出

常 法 に従 い,糞 便 を10mlのSelenite-Brilliant.

Green(SBG)培 地 に接 種 し,vortexし た の ち,

42℃,20時 間 増 菌 培 養 を行 い,1エ ー ゼ をMLCB

寒 天(MLCB)培 地(日 水)に 塗 抹 した.37℃ 一

夜 培 養 後TSI,LIM確 認 培 地 に 釣 菌 し てSal,

mone磁 を 同 定 し た.

感染症学雑誌 第68巻 第10号

PCR法 によるサルモネラの迅速検 出 1205

Fig. 1 Preparation of a template DNA by Chelex

extraction

*1; Chelex -100, sodium form resin (Bio-Rad) wasused. *2 ; Thermolyne, type 17600 (USA), was

used.

3.被 検DNA液 の 調 製

Salmonellaか ら のDNAはTryptosoyaagar

(TSA)培 地 発 育 菌 を直 接 蒸 留 水 に 浮 遊 し,沸 騰 水

中 で10分 加 熱 し た 上 清 の10μ1をtemplateに し

た7).

糞 便 材 料 か ら の 被 検DNAは 培 地 そ の も の と

Walshら8)が 報 告 したChelex-100,Sodiumform

(Bio-Rad,Richmond)抽 出 法 を少 し変 更 し て微 量

DNAの 抽 出 法 に よ っ てtemplateを 調 製 し た

(Fig.1).す な わ ち 糞 便 を接 種 し,vortexし た 後

10分 間 静 置 し た 増 菌 培 養 前 のSBG培 地 か ら

PCRに よ っ て5厩monelhzを 検 出 し た(Direct

法).こ のDirect法 で はSBGの 静 置 後 の 上 清;1

mlを 遠 心 沈 澱 し た 沈 渣 に100μ1の 蒸 留 水 を 加 え

1000C,10分 加 熱 し,10μ1をtemplateと す る方 法

(D-Spr法)とSBG;500μ1に10%Chelex液;

500μ1を 加 えvortexし,560C,30分 振 盈(110回/

分)処 理 後 遠 心 した.上 清 を少 量(約50μ1)残 し,

さ らに950C,5分drybath(Thermolyne,Type

17600,IA,USA)で 加 熱 した.加 熱 後 す ぐにvor-

texし,こ の遠 心 上 清 の10μ1をtemplateと して

PCRを 行 う方 法(D-Chx)の2法 でPCRを 実 施 し

た.

増 菌(Enrichment)法 は42℃,20時 間 培 養 後 の

SBG;500μ1を1.5m1の サ ン プ リン グ チ ュ ー ブ に

と り,Direct法 と 同 様 の 遠 心 沈 渣 の 加 熱 に よ り

DNAを 抽 出 す る 方 法(E-Spr)と,500μ1を 同 量

の10%Chelex液 で 処 理 す る 方 法(E-Chx),

Tryptosoyabroth(TSB);5rnlに 糞 便 を接 種 し,

37℃,4時 間 培 養 後Chelex処 理 す る 方 法(T-

Chx)の3法 に よ っ てDNAを 調 製 し た.ま た

SBGか らMLCB分 離 培 養 後 シ ン グ ル コ ロ ニ ー

が 認 め られ ず,H2S産 生 が 認 め られ た 濃 厚 発 育 部

を 生 食 水 に 浮 遊 後 再 分 離 とChelex処 理 し て

PCRを 行 っ た(M-Chx).

4.プ ラ イ マ ー の 作 成

Spieringsら6)の 報 告 したSalmonella,PhoE遺

伝 子 検 出 用 プ ラ イ マ ー を少 し変 更 したAL-5(5'

agcgccgcggtacg99taata)とAL-8(5'tcgtcattaat-

gccataacgt)を 合 成 した(AppliedBiosystems).

この プ ラ イ マ ー で 増 幅 され るDNA断 片 は361bp

で あ る.

5.PCR法

TaqDNApolymerase(Cetus);1.3μ1,10×

buffer(Cetus);25μ1,dNTPmix(Wakoh);2.5

μ1,aqdest;110μ1,2μMに 調 製 した プ ラ イ マ ー,

AL-5とAL-8;各5μ1のPCR液 を15μ1とFig.1

に 従 っ て 調 製 し たtemplate;10μ1を 混 合 し,

mineraloilを 加 え て,DNAThermalCycler

(Cetus)で92℃,50s;55℃,60s:72℃,60sを30

回 反 復 し,そ の 後72。C,5分 加 熱 して 完 全 に伸 長

させ た.PCR後1.5μ1を1.3%の ア ガ ロ ー ス ゲ ル

で電 気 泳 動 し,エ チ ジ ウ ム ブ ロマ イ ド染 色 後 紫 外

線 で 観 察 した.

平成6年10月20日

1206 小林 一寛 他

6.PCRの 検 出 限 界 の検 討

Salmone磁 陽 性 が 確 認 さ れ た 任 意 の4検 体 を

常 法 に従 いSBG培 地 で42℃,20時 間培 養 し,生 理

的食 塩 水(生 食 水)で10倍 階 段 希 釈 を行 った.各

希 釈 液;500μ1をChelex処 理 し てtemplateを

調 製 しPCRを 行 い,MLCB培 地 で の 生 菌 数 を 求

め る こ とに よっ て 行 っ た.

成 績

1.PCRの 特 異 性 の検 討

SubgenusIIIを 含 む す べ て のSalmonella;86

株 は標 的 と したDNA断 片 が 確 認 さ れ た が,non-

Salmonella株;42株 で は1株 も標 的DNA断 片

は認 め られ な か った(Tablel).

2.糞 便 か ら の5溜monellaの 検 出

培 養 法 で は125検 体 中62検 体(49.6%)か らSal-

mone磁 を検 出 で き た が,PCRで は培 養 法 陽 性 の

60検 体 とPCRの み で 陽 性 の13検 体 を含 め 合 計73

Table 2 Comparison of conventional culture

method and PCR method for the detection of

Salmonella

*1; Conventional culture method (One loopful of enrich -

ment culture from SBG broth was streaked onto

MCLB plate.)*2; Detection by E-Chx method as shown in Fig. 1.*3 ; These 2 samples were tested 3 times by the E-Chx

method with the same SBG medium after enrichment.*4 ; Eight of 13 samples were included 3 of lysinde -

carboxylase-negative and 5 of H2S non-producing

strains.

Table 3 Detection of Salmonella using various PCR method

* 1 ; See footnote in Table 2.

*2 ; The supernatant method was used 10,u1 of SBG medium heated for 10min. at

100•Ž (D-Spr), and D-Chx method was directly used 10,u1 of the Chelex

extracts from the medium of pre-enrichment culture.

*3; A 500/11 of SBG medium was done centrifugation. Fifty ,al (10x concentrated)

of distilled water was added to the precipitate and the mixture was then

heated in a boilling water bath for 10min. After centrifugation the 10,u1 of

supernatant was used for PCR (E-Spr) . The E-Chx method was shown in Fig.

1.

*4; Eight samples were included with atypical character of Salmonella as shown

in Table 2.

*5; Number in [ ] shows a false positive (•}) sample. This sample was not

amplified by re-examination of PCR.

*6; The PCR method using Tryptosoya broth after enrichment culture for 4 hours

at 37•Ž of a fecal sample.

*7; A Chelex-treated suspension of bacterial harvests from a H2S-producing part

on MLCB agar plate surface was used as a template for PCR.

感染症学雑誌 第68巻 第10号

PCR法 によるサルモネラの迅速検 出 1207

検 体(58.4%)か らSalmonellaが 確 認 さ れ た

(Table2).2検 体 は培 養 法 の み で 検 出 され て お

り,翌 日 に 同 じSBGか らE-Chxを 実 施 し た が す

べ て 陰 性 で あ っ た.

PCRで は培 養 の た め 糞 便 を10mlのSBGに 接

種 し固 形 物 を沈 澱 させ た培 地 を遠 心 沈 澱(15,000

rpm,5分)後,直 接 煮 沸 した 上 清 でPCRし た

D-SprとChelex処 理 後 のD-Chxは そ れ ぞ れ28

検 体,34検 体 に つ い て 行 っ た が4検 体(14.3%),

8検 体(23.5%)がsalmonelhl陽 性 で 培 養 法 よ り

低 率 で あ っ た(Table3).一 方 増 菌 培 養 後 のSBG

加 熱 上 清 のE.Sprは24検 体 中 培 養 法 と 同 じ9検

体(37.5%)が 陽 性 で あ っ た.ま たE-Chxは125検

体 中73検 体(58.4%)が 陽 性 で培 養 陽 性 の62検 体

(49.6%)よ り11検 体 の 陽 性 増 が認 め られ た.迅 速

性 を考 慮 して 行 っ た糞 便 のTSB増 菌 法(T-Chx)

は14検 体 中2検 体(14.3%)でD-Sprと 同様 の 結

果 で あ っ た.

選 択 分 離 培 地 を使 用 す る 日常 検 査 で シ ン グ ル コ

ロ ニ ー が 認 め られ ず 再 分 離 培 養 が必 要 に な る こ と

は し ば し ば遭 遇 す る こ とで あ る が,MLCB平 板 上

でSalmonelhl集 落 の 発 育 が 少 な い か,釣 菌 が で

きな い検 体 つ い てH、S産 生 部 の 濃 厚 発 育 部 を 生

食 水 に浮 遊 し,こ の菌 液 のChelex処 理 後 のPCR

(M-Chx)で は28検 体(5溜mone砺 陽性;2検 体)

Table 4 Comparison of culture and Enrichment-

PCR methods

*1 ; Salmonella were detected (+) or not

detected ().

Table 5 Comparison of culture and M-Chx method

*1; See footnote in Table 3.

Table 6 Level of detection using E-Chx method

*1; Salmonella viable count per 0 .5m1 of SBG medium after enrichment. Serial

dilution of overnight SBG medium cultures of the fecal samples were made in

sterile physiological saline. A 500,u1 aliquot of each dilution was added to the

500,0 of 10% Chelex suspension. Also, a 0.lml from each dilution was strea-

ked onto MCLB agar plate and grown overnight at 35•Ž to determine the

number of cfu in each dilution.

*2; Ten jul of the Chelex-extracts from 500,u1 of each dilution was used for PCR.

*3; A degree (3+ to 1+) of positive reaction and negative reaction (—) using

PCR (E-Chx) method. The•}indicates a weak positive reaction.

*4 ; Result of Salmonella isolation from MLCB agar plate . The (+) indicates a

Salmonella detective tube, and (—) shows a Salmonella negative tube.

平成6年10月20日

1208 小林 一寛 他

中15検 体(53.6%)がSalmonella陽 性 とな っ た.

3.培 養 法 と増 菌 後 のPCR法 の比 較

培 養 法 とE-Spr,E-ChxはE-Sprを 実 施 した24

検 体 に つ い て比 較 した.3法 陽 性 が8検 体,培 養

法 とE-Chx,E-SprとE-Chx陽 性 が そ れ ぞ れ1検

体,E-Chxの み陽 性 が1検 体 で そ れ ぞ れ の合 計 で

はE-Chx;11検 体(45.8%),E-Spr;9検 体

(37.5%),培 養;9検 体(37.5%)が 陽性 で あ っ

た(Table4).ま たM-Chxと 培 養 法 の 比 較 で は,

Salmonella陽 性 の15検 体 の う ち 両 法 共 に 陽 性 が

2検 体 で,PCRの み で13検 体 検 出 し て い る

(Table5).

4.E-Chx法 の検 出 感 度

被 検 検 体 のSBG増 菌 後 のSalmonella生 菌 数

は1mlあ た り103～104個 で あ った.そ の 生 食 水 希

釈 液 の500μlをFig.1に 従 っ てChelex処 理 し て

調 製 したtemplateに よ るPCR(E-Chx)で は103

～104倍 希 釈 液 で も陽 性 で あ っ た.こ れ は計 算 上 数

個 のSalmonellaで 検 出 で き る こ と を表 し て い る

(Table6).

考 察

下 痢 症 あ るい は食 中毒 発 生 時,各 種 食 品 あ るい

は 環 境 材 料 か ら のSalmonella検 出 は迅 速,正 確

に 実 施 す る こ とが 必 要 で あ り,食 品 の 流 通 上 か ら

も きわ め て 重 要 な こ とで あ る.こ れ まで の検 出 法

は急 性 期 の 患 者 糞 便 の よ う に菌 数 が 多 い場 合 の ほ

か は,前 培 養 や 増 菌 培 養 が 必 須 の ス テ ップ とな り

結 果 を得 る まで に時 間 が か か る こ とが 指 摘 さ れ て

い る.こ の た め迅 速 検 出 法 と して モ ノ ク ロ ナ ー ル

抗 体 を使 用 した 酵 素 抗 体 法 が 開発 され 市 販 キ ッ ト

も み られ て い る9)～12).一 方 遺 伝 学 的 検 査 法 に は

DNA-DNAハ イ ブ リダ イ ゼ ー シ ョ ン法(Hbr)が

行 わ れ て い るが 検 出 の た め に は103～104個 のSal-

monellaが 必 要 とい わ れ て い る13)14).食 品 や 環 境

材 料 あ るい は保 菌 者 検 索 の糞 便 中 に含 まれ て い る

Salmonellaは1gあ るい は1ml中 に そ れ ほ ど多 数

が み られ な い こ とか らHbr法 で も検 体 か ら直 接

検 出 す る こ とは実 際 に は 困 難 と思 わ れ る15)16).そ

こ で 本 研 究 で は少 数 のSalmonellaを 検 出 す るた

めPCRを 用 い た.検 査 材 料 か ら直 接Salmonella

が 検 出 で き る か ど うか は検 体 中 に存 在 す る細 菌 を

如何にしてその方法の検出レベルまで集菌できる

かによる.そ の方法 としてできるだけ多量の検体

を検査する方法あるいはメンブランフィルターや

遠心沈澱によって集菌するな どが考 えられるが,

検体数が多い場合には操作に多 くの労力が必要で

あった り,集 菌によって反応のインヒビターも増

加するなどの不都合がある.そ こで著者 らは微量

のDNA抽 出と金属 イオンな どのPCR阻 害物質

を除去でき,多 数の検査材料にも簡便に応用でき

るChelex-100を 使用す る方法8)を用いた.し かし

なが らこの方法によって も直接法(D-Chx)で は培

養陽性の20検 体中8検 体(40.0%)し か検出でき

なかった.こ れはChelex処 理液 を用いる本PCR

法の検出感度が数個である(Table6)こ とを考え

る と糞便 中のSalmonellaが 少な くPCRの ため

に処理 したSBG;500μl中 にSalmonellaが 含 ま

れなかった ものと思われ るが,DNase,protease

あるいは他の何 らかのPCR阻 害物質の残存 によ

る可能性 も否定できない.

増菌法ではSBGの 場合42℃,20時 間培養が必

要であるが,よ り迅速なTSBの4時 間培養後同

様 にChelex処 理 してPCRを 行 った が,D-Chx

よりも結果が悪 くD-Sprと 同じ結果であった.こ

の両法で陽性の検体 はSalmonellaが 比較的多数

であった ことが培養結果で確認されたことから,

急性期 の患者 等Salmonella数 が多 い場合 に は

PCR阻 害物を除去できるD-Chxは 有効 と考えら

れる.2段 階PCRに よらない場合,こ れまでの と

ころPCRを 考 えたSalmonella数 増加 法 は増 菌

培養が最 も簡便な方法である.今 回実施 した糞便

中の食 中毒原性Salmonellaに つ いてはSBG培

地 の42℃,一 夜培養で1mlあ た り104程度 に達 し

た.こ の菌数では本PCRの500μlを 使用すれば培

養陽性の検体 は確実に検出可能である結果が得 ら

れた.さ らに増菌後のSBGをChelex処 理 した後

のPCRで はより多数の陽性結果が得 られ,培 養

法の1.2倍 の検出が認められた.こ れは本研究 に供

した保存糞便 は採便時の培養で78検 体が陽性で

あった ことを考 える と,保 存 中にSalmonellaが

著しく減少したか,Salmonellaの 生物活性が低下

しているため,強 い抑制剤を含むSBGやMLCB

感染症学雑誌 第68巻 第10号

PCR法 によるサルモネラの迅速検出 1209

培 地 で の発 育 が 強 く抑 制 さ れ た こ とに よ っ て,1

白 金 耳 の 塗 抹 に よ る 日 常 検 査 法 で は 検 出 で き な

か っ た もの と考 え られ た.

PCRに よ るSalmonella検 出 法 は これ まで に い

くつ か 報 告 が み られ る.Rahnら17)はSalmonella

の上 皮 細 胞 へ の 侵 入 性 に 関 与 す るinvA遺 伝 子 を

検 出 す る方 法 を行 った が,Salmonella株 か らの結

果 の み で,実 際 の検 査 か らの も の で は な い.ま た

Salmonella被 検 株 中 にinvA陰 性 株 を 認 め て い

る.ま たWidjojoatmodjoら18)は 著 者 ら と同 様 に

2ヵ 月 間,4℃ 保 存 後 の 糞 便 を 材 料 に し,Sal-

monellaに 共 通 した モ ノ ク ロ ナ ー ル 抗 体(Sero-

groupA～E)を 結 合 した マ グ ネ ッ トを用 い て 集 菌

す る 方 法 でPCRを 阻 害 す る物 質 を除 去 で き,糞

便 か らの 検 出 は105cfu/mlに な っ た こ と を報 告 し

て い る.さ ら にPCR産 物 をサ ザ ン ドッ トHbrす

る こ と に よっ て10倍 検 出 感 度 を 上 昇 さ せ て い

る19).し か し な が ら集 菌 の た め に 使 用 す るSal.

monellaの 抗 体 は 多 種 類 準 備 す る こ とが 必 要 で,

そ の 作 成 は 容 易 で は な く,抗 体 の 含 まれ な いSal-

monellaは 検 出不 可 能 で あ る.

食 品 の 検 査 で はCanoら20)はChelex処 理 し て

S.TyphimuriumのIS200遺 伝 子 検 出 のPCRを

行 った 後,蛍 光 色 素 ラベ ル プ ロー ブ とHbrさ せ る

こ と に よ っ て 高 感 度 にSalmonellaを 検 出 し て い

る.こ の 方 法 で もS.AgonaとS.Arizonaeに 陰

性 の も の が み られ て い る.ま たJonesら21)はSal-

monellaに 特 異 的 なDNA結 合 タ ンパ ク を制 御 す

るhns遺 伝 子 を標 的 に,カ キ を ホ モ ゲ ナ イ ズ した

検 体 をChelex処 理 し,さ ら に60℃,1時 間 加 熱

後,遠 心 上 清 か ら ク ロ ロ ホ ル ム で精 製 したDNA

をtemplateに して 行 い,ポ リメ ラ ー ゼ 反 応 の 阻

害 物 質 の 影 響 が な くな っ た 結 果,Salmonella;40

個 以 下/gの 感 度 で 検 出 が 可 能 で あ っ た こ と を報

告 して い る.い ず れ に して も これ らの 方 法 は,検

体 か ら直 接 検 出 す る た め に増 幅 さ れ たDNA断 片

を ア ガ ロ ー ス電 気 泳 動 で な くプ ロ ー ブ を 用 い た

Hbrな ど で 高 感 度 に 検 出 す る ス テ ップ やSal-

monellaの 集 菌 あ る い はPCR阻 害 物 質 の 除 去 の

た めDNA精 製 ス テ ップ が 必 要 で さ らに時 間 と労

力 が必 要 で あ る.

こ こで 述 べ たE-Chxは 臨 床 材 料 か らの 検 出 も

目的 と した こ とか ら,S.TyphiやS.Paratyphi A

を 含 む こ とが で き る だ け 多 数 のSalmonellaを 検

出 で き,脱 落 が あ る プ ラ ス ミ ドで は な い 染 色 体 上

のpkoE遺 伝 子 検 出 の プ ラ イ マ ー を採 用 した.チ

フ ス性 疾 患 患 者 あ る い は治 療 開 始 後 の患 者 等 の 材

料 で は投 薬 やSalmonellaに 対 す る抗 体 の 作 用 や

殺 菌 因 子 に よ る影 響 の た め感 染 菌 も少 数 に な っ て

お り増 菌 培 養 が 必 須 で,Salmonellaの ダ メ ー ジ も

あ っ て増 菌効 果 が 少 な く培 養 法 で は長 期 間 の培 養

に よ っ て も検 出 困 難 な こ と も多 い.今 回 は糞 便 の

みか らの検 出 法 に つ い て 述 べ た が種 々 の増 菌 培 地

か ら のChelex処 理 に よ るPCRは い ろ い ろ な 臨

床 材 料 の場 合 に も応 用 で き る もの と考 え られ る.

謝辞 本研究実施 に際 し,大阪府立公衆衛生専門学校生,

梅原比 呂子氏 の精力的な協力に対 し感謝いたします.

文 献

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平成6年10月20日

1210 小林 一寛 他

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Polymerase Chain Reaction (PCR) Method for the Detection of Salmonella by

Using Chelex Resin after Enrichment Culture

Kazuhiro KOBAYASHI, Masumi TAGUCHI & Kazuko SETOLaboratory of Microbiology, Division of Public Health,

Osaka Prefectural Institute of Public Health

Salmonella has been implicated as a important pathogen associated with acute gastroenter-

itis or food borne diseases in humans. Rapid and accurate diagnostic tests for Salmonella are

needed by both the food industry and clinical laboratories. A pair of oligonucleotide primers from

the phoE gene was used to develop a polymerase chain reaction (PCR) procedure to detect

Salmonella spp.

When Chelex-extracted DNA from the SBG enrichiment culture were used as templates for

the PCR amplification (E-Chx), the positive results were obtained with a few cells of Salmonella.

This highly specific and sensitive technique gave an efficiency of 1.2 times (73 samples were

positive) when tested against conventional culture method (62 samples were positive) using 125

fecal samples stored at 4•Ž for 1-16 months.

Based on the results obtained in this study, it appears that the enrichement-PCR method

(E-Chx) using Chelex-extracted DNA described here can be useful to screen a large number of

samples such as foods or environmental specimens for contamination of Salmonella.

感染症学雑誌 第68巻 第10号