esperimenti con organi isolati - e-l.unifi.it · intestino (dosaggio qualitativo) 1. agonisti e...
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LA SPERIMENTAZIONE
1. Modelli semplificati (cellule in coltura, esperimenti
in vitro, organi isolati studi di binding)
2. Modelli complessi (esperimenti in vivo)
1+2. Informazioni fondamentali per l’uso clinico
di un farmaco, ma influenzato da assorbimento,
farmacocinetica e meccanismi riflessi.
PERCHE’ SI UTILIZZA QUESTO TIPO DI
TECNICA NELLA FARMACOLOGIA
SPERIMENTALE?
•Per identificare il tipo e l’ordine di grandezza di
risposta che si ha per una sostanza sconosciuta
•Per poter quantificare l’effetto farmacologico di
una sostanza
•Per consentire la previsione di un possibile
effetto terapeutico
Esiste una notevole corrispondenza tra i recettori
isolati nell’animale e quelli dell’uomo
L’isolamento di un organo permette di eliminare le
variazioni delle influenze circolatorie ed ormonali.
Viene però mantenuta la divisione fisiologica in
compartamenti del tessuto (il vascolare, l’interstiziale,
l’intracellulare).
Si può pensare che le risposte ai farmaci ottenute
nell’animale siano predittive di quelle dell’uomo
DA DOVE PROVIENE UN ORGANO ISOLATO?
• Da animali di laboratorio sani o da animali con
patologie spontanee o indotte chirurgicamente o
farmacologicamente
• Dall’uomo come ”by products” di procedure
chirurgiche o mediante la rapida acquisizione post-
mortem
Un tessuto in vitro non è un tessuto in vivo, è quindi opportuno
modificare i sali della soluzione fisiologica per mantenere il
preparato nella condizione più adeguata.
CARATTERISTICHE DI
UN ORGANO (o TESSUTO) ISOLATO
Devono avere alcuni requisiti fondamentali:
capacità a rimanere vitali
stabilità
omogeneità anatomica
Composizione del sangue
[Il sangue può essere considerato come un tessuto connettivo, formato da cellule sospese in una matrice fluida, chiamata plasma
Ha una azione principalmente di trasporto: ossigeno, le sostanze nutritizie, metaboliti, ormoni, ecc]
• H2O
• Soluti organici
• Elettroliti
• Proteine – Albumina
– Globuline
– Fibrinogeno
•Piastrine
•Eritrociti
•Leucociti –Neutrofili
–Eosinofili
–Basolfili
–Linfociti
–Monociti
siero PLASMA
ELEMENTI
CELLULARI granulociti
leucociti linfoidi
Principale composizione del plasma
• Cationi
– Na+, K+, Ca 2+, Mg 2+,
• Altri minerali
– ferro, rame, iodio in tracce;
• Anioni
– Cl-, fosfati, solfati, bicarbonati, proteine, acidi organici
• Proteine
– albumina, globuline, fibrinogeno
• Azoto non proteico
– urea, ac. urico, creatinina, creatina, sali di ammonio
• Sostanze nutritizie
– H20 (90%)
– glucosio, ac. lattico, aminoacidi, colesterolo, fosfolipidi, lecitina
• Gas
– N2, O2 (2%), CO2 (60%)
Soluzioni fisiologiche per organi isolati
(isotoniche con il plasma)
“Fisiologica” è l’attributo che si associa a numerose
soluzioni saline
Soluzione salina (isotonica) NaCl 0.9% = ……… g/l
MW (NaCl) = 23 + 35.5 = 58.5
154 mmol/l
pH = 7 (6.8 a 37°C)
Plasma normale
Na+ = 145 mmol/l
Cl- = 110 mmol/l
pH = 7.4
Soluzioni saline di perfusione per tessuti isolati (mmoli/litro)
Ringer anfibi
Krebs
ileo stim
musc.schel.
Tyrode
cuore
ileo
Ringer
Tyrode
Locke
De Jalon
utero
Reiter
NaCl 111.0 118.0 137.0 154.0 154.0 115.0
KCl 1.87 4.69 2.68 5.63 5.63 4.7
MgSO4 --- 1.18 1.05 --- --- 1.2
NaH2PO4 0.04 --- 0.42 --- --- ---
KH2PO4 --- 1.2 --- --- --- 1.2
Glucosio 11.0 11.0 5.6 5.6 2.8 10.0
NaHCO3 4.8 25.0 11.5 6.0 6.0 25.0
CaCl2 1.08 2.52 1.8 1.08 2.7 1.8
Gas aria 95% O2
5% CO2
O2
O2 95% O2
5% CO2
95% O2
5% CO2
SOLUZIONI FISIOLOGICHE
per organi isolati
La soluzione fisiologica deve:
assicurare un adeguato apporto di sostanze nutritive
apporto di O2 (?)
temperatura 37°C (?)
corretta composizione ionica
pH costante
osmolarità costante
CONCENTRAZIONI DI ALCUNI ELETTROLITI (mM) E DELLE PROTEINE
(g/100 ml) NEL PLASMA DI ALCUNE SPECIE
Uomo Ratto Porcellino d’India
Na+ 150 151 145
K+ 3.6 5.9 7.4
Cl- 102 110 105
Ca2+ 2.4 2.5 2.2
proteine 7.0 6.3 5.4
Variabile: CONCENTRAZIONE IONICA
Miscela di acido debole e della sua base coniugata:
la sua funzione è quella di minimizzare la
variazione di pH
Perché una coppia coniugata possa essere
considerata come un tampone
di rilevanza fisiologica:
a) pKa = pH fisiologico + 1
b) sufficiente capacità tampone
Variabile: SOLUZIONE TAMPONE
Variabile: TEMPERATURA
• Variabile fisiologica
• Influenza la risposta basale di un tessuto
• Influenza la risposta a farmaci
• Influenza il pH della soluzione
Esempi:
– Utero di ratto femmina
– T basse = ridotto consumo di ossigeno tissutale
Strumentazione base
per organi isolati e perfusi
non stimolati
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bagnetto a camicia
bombola di oxicarb
ciclotermo (temperatura 32-37°C)
trasduttore
amplificatore
registratore
Strumentazione: BAGNETTI
A camicia:
• E’ un bicchiere di vetro con una camicia intorno
alla quale circola acqua calda a 37° C.
• E’ il più usato poiché è possibile montare una
serie di bagnetti in parallelo.
• In questo tipo i bagnetto il tessuto è
completamente immerso nel liquido.
A cascata:
• Utile per determinare l’emivita di alcune
sostanze (es: NO)
• Si possono utilizzare tessuti (organi) diversi
• Si possono inibire i recettori di un tessuto
rispetto ad altri
TRASDUTTORI DI FORZA
(apparecchi leva)
Il tessuto nel bagnetto è collegato ad un
apparecchio leva (trasduttore).
Tramite il trasduttore si rileva
la reattività del tessuto.
SEGNALE ELETTRICO
Trasduttore isotonico collegato
ad ileo di cavia (esempio 1)
L’ileo isolato di cavia collegato al trasduttore
isotonico ed immerso in un bagnetto:
l’ileo si muove spontaneamente
Si somministra ACh e, poiché ci sono recettori
muscarinici, il tessuto si contrae:
l’ileo si accorcia = il trasduttore si abbassa
Trasduttore isometrico collegato
ad ileo di cavia (esempio 2)
L’ileo isolato di cavia collegato al trasduttore isometrico ed
immerso in un bagnetto:
l’ileo rimane fermo
Si somministra ACh, ma non si ha accorciamento,
trattandosi di una leva imperniata, però il tessuto reagisce lo
stesso
La reazione del tessuto si trasduce in una forza che il
tessuto esercita sulla leva.
Il movimento del trasduttore è convertito
in potenziale elettrico che può essere
amplificato e registrato come il
movimento della penna su un
registratore a carta
COSA LEGGIAMO SUL REGISTRATORE?
Nel trasduttore isotonico si ha una variazione di
lunghezza (il registratore registra un’ampiezza e
l’unità di misura è in mm)
Nel trasduttore isometrico non si hanno
variazioni di lunghezza ma avremo una
variazione di forza e l’unità di misura è il
grammo.
A COSA SERVE L’AMPLIFICATORE?
• Per segnali di piccola o piccolissima intensità
• Per segnali di grandezza maggiore
Registrazione e interpretazione del segnale
Ridurre interferenza di segnali estranei
Ileo isolato
• Specie : Guinea pig (rat)
• Tipo di preparato: si misura l’attività contrattile di segmenti di ileo registrati in condizioni isometriche.
• Quali molecole si valutano: farmaci attivi sui recettori muscarinici, istaminergici, serotoninergici, nicotinici, per la bradichinina e la colecistochinina e farmaci ad effetto spasmolitico o spasmogenico muscolare.
• Molecole di riferimento: Atropine, BaCl2, Bradykinin, Carbachol, Cholecystokinin, Hexamethonium, Histamine, LTD4, Nicergoline, Nicotine, Papaverine, Pyrilamine, Serotonin.
duodeno + digiuno + ileo = tenue
Nello spessore della parete di tutto il tubo digerente vi sono numerosissimi gangli situati nella sottomucosa (Plesso di Meissner) e tra lo strato longitudinale e quello trasversale della tonaca muscolare (Plesso di Auerbach) che regolano le varie funzioni dell'apparato digerente.
Struttura del tratto gastrointestinale
ESPERIMENTI CON LA MUSCOLATURA
LISCIA INTESTINALE
• Innervazione parasimpatica (a mediazione
colinergica
– Plesso mienterico di Auerbach
– Plesso submucoso di Meissner
• Innervazione simpatica (inibisce i movimenti
peristaltici, a mediazione adrenergica)
– Fibre lungo le arterie
Controllo della funzione gastrointestinale
Sistema simpatico inibisce le
secrezioni ed eccita la
contrazione degli sfinteri
(risposta di attacco-fuga)
Sistema parasimpatico eccita
la contrazione e la motilita’
intestinale
Principali preparati di intestino “in vitro”
• Ileo terminale di cavia (metodo di Magnus, 1904)
• Long strip = fibre muscolari longitudinali di ileo con plesso mienterico di Auerbach (metodo di Paton e Vizi, 1968)
• Ileo terminale di cavia (metodo di Trendelenburg, 1917)
• Sacculus del colon di cavia (metodo di Botting)
• Digiuno di coniglio con stimolazione elettrica periarteriale (metodo di Finkleman, 1930)
• Duodeno di ratto
• Ileo di topo
• Intestino di pesciolino rosso
Tracciato tipo: effetto di dosi crescenti di acetilcolina
su ileo di cavia isolato e perfuso secondo Magnus
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