estrogen wirksamer substanzen„entwicklung und anwendung chemisch – analytischer verfahren zur...
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„Entwicklung und Anwendung chemisch – analytischer Verfahren
zur Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen“
Von der Fakultät für Bauingenieurwesen
der Rheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule Aachen
zur Erlangung des akademischen Grades einer Doktorin der Naturwissenschaften
genehmigte Dissertation
vorgelegt von
Angelika Stehmann
aus
Steinfurt
Berichter: Professor Dr.rer.nat. Horst Friedrich Schröder
Universitätsprofessor Dr.rer.nat. Andreas Schäffer
Universitätsprofessor Dr.-Ing. Peter Doetsch
Tag der mündlichen Prüfung: 9. Januar 2007
„Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online verfügbar.“
Inhaltsverzeichnis I
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG .....................................1
1.1 Ziel der Arbeit ............................................................................................... 2
2 KLASSIFIZIERUNG ENDOKRIN WIRKSAMER SUBSTANZEN......................................................................4
2.1 Klassifizierung nach Art der endokrinen Wirksamkeit................................... 4 2.1.1 Estrogene Wirkung ...........................................................................................4
2.1.2 Anti-estrogene Wirkung ....................................................................................4
2.1.3 Androgene Wirkung ..........................................................................................4
2.1.4 Anti-androgene Wirkung ...................................................................................5
2.1.5 Thyroide Wirkung..............................................................................................5
2.2 Klassifizierung nach Struktur........................................................................ 5 2.2.1 Natürliche und synthetische Steroide ...............................................................5
2.2.2 Xenoestrogene .................................................................................................5
2.2.3 Auswahl von EDCs ...........................................................................................6
3 ANTHROPOGENE UND BIOGENE ENTSTEHUNG ESTROGEN WIRKSAMER SUBSTANZEN.........................8
3.1 Alkylphenole................................................................................................. 8 3.1.1 Metabolismus von Alkylphenolethoxylaten .......................................................9
3.1.2 Metabolismus von Nonylphenol......................................................................10
3.2 Bisphenol A ................................................................................................ 11 3.2.1 Biologischer Abbau von Bisphenol A im aeroben Abwasserreinigungsprozess.
........................................................................................................................12
3.3 Natürliche Estrogene.................................................................................. 13 3.3.1 Metabolismus von 17�-Estradiol im menschlichen Körper ...............................14
3.4 Synthetische Estrogene ............................................................................. 15 3.4.1 Metabolismus von 17�-Ethinylestradiol..........................................................16
4 ENDOKRINE WIRKUNGEN IN DER AQUATISCHEN UMWELT ............................................................................18
II Inhaltsverzeichnis
5 VERHALTEN VON EDCS IM ABWASSERREINIGUNGSPROZESS ...............................20
5.1 Vorkommen und Elimination von endokrin wirksamen Substanzen in der
Kläranlage .................................................................................................. 20
5.2 Sorption am Schlamm................................................................................ 25
6 VERFAHREN ZUR ANALYTISCHEN BESTIMMUNG VON EDCS IN UMWELTPROBEN .............................................26
6.1 Chemisch-analytische Bestimmungsverfahren .......................................... 26 6.1.1 Extraktion........................................................................................................26
6.1.2 Abtrennung störender Matrixbestandteile (clean – up)...................................27
6.1.3 Derivatisierung................................................................................................27
6.1.4 Chromatographische Trennung und anschließende Detektion ......................28
6.2 Biologische Wirktests ................................................................................. 35
7 MATERIAL UND METHODEN ZUR BESTIMMUNG ENDOKRIN WIRKSAMER SUBSTANZEN........................37
7.1 Vorversuche ............................................................................................... 37 7.1.1 Derivatisierung mittels fluorhaltiger Reagenzien ............................................37
7.1.2 Gaschromatographische Trennung mit massenspektrometrischer Identifikation
zum Nachweis und zur Quantifizierung endokrin wirksamer Substanzen ......38
7.1.3 Qualitative und quantitative Auswertung ........................................................40
7.2 Analytische Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen aus wässrigen
Matrices...................................................................................................... 43 7.2.1 Probennahme und Probenvorbereitung..........................................................43
7.2.2 Festphasenextraktion .....................................................................................45
7.2.3 Probenaufreinigung ........................................................................................45
7.2.4 Derivatisierung................................................................................................46
7.2.5 Durchführung der GC/MS-Analyse zur qualitativen und quantitativen
Bestimmung....................................................................................................46
7.2.6 Validierung der zur Bestimmung von EDCs aus wässriger Matrix eingesetzen
Methode..........................................................................................................46
7.2.6.1 Bestimmung der Wiederfindungen..............................................................46
7.2.6.2 Reproduzierbarkeit der Bestimmungsmethode...........................................47
Inhaltsverzeichnis III
7.2.6.3 Ermittlung der Nachweis- bzw. Bestimmungsgrenzen................................48
7.3 Analytische Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen aus
Klärschlämmen........................................................................................... 50 7.3.1 Vorversuche zur Probenaufreinigung .............................................................50
7.3.2 Vorversuche zur Derivatisierung.....................................................................52
7.3.3 Probenahme und Probenvorbereitung realer Proben.....................................53
7.3.4 Herstellung von dotiertem Probematerial .......................................................53
7.3.5 Extraktion........................................................................................................54
7.3.6 Anreicherung ..................................................................................................55
7.3.7 Probenaufreinigung ........................................................................................57
7.3.8 Derivatisierung................................................................................................58
7.3.9 GC/MS-Messung und anschließende Auswertung der Ergebnisse................58
7.3.10 Validierung der zur Bestimmung von EDCs aus Klärschlämmen eingesetzten
Methode..........................................................................................................58
7.3.10.1 Bestimmung der Wiederfindungen..............................................................58
7.3.10.2 Reproduzierbarkeit der Bestimmungsmethode...........................................59
7.3.10.3 Ermittlung der Nachweis- und Bestimmungsgrenzen .................................59
7.4 Analytische Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen aus Sedimenten .
................................................................................................................... 60 7.4.1 Beschreibung des beprobten Sees Volvi ........................................................60
7.4.2 Probenahme ...................................................................................................60
7.4.3 Analysengang .................................................................................................61
7.4.4 Validierung der zur Bestimmung von EDCs aus Sedimenten eingesetzten
Methode..........................................................................................................62
7.4.4.1 Bestimmung der Wiederfindungen..............................................................62
7.4.4.2 Reproduzierbarkeit der Bestimmungsmethode...........................................62
7.4.4.3 Ermittlung der Nachweis- und Bestimmungsgrenzen .................................62
7.4.5 Analyse der realen Proben .............................................................................63
8 ERGEBNISSE.....................................................................64
8.1 Vorversuche ............................................................................................... 64 8.1.1 Massenspektren .............................................................................................66
8.1.1.1 Massenspektren der Fluorderivate der endokrin wirksamen Substanzen,
bestimmt unter EI-Bedingungen .................................................................69
8.1.1.2 Massenspektren der Fluorderivate der endokrin wirksamen Substanzen,
bestimmt unter NCI-Bedingungen...............................................................76
IV Inhaltsverzeichnis
8.1.2 Empfindlichkeit des massenspektrometrischen Detektors in Abhängigkeit des
Derivatisierungreagenzes ...............................................................................84
8.1.3 Responsefaktoren...........................................................................................85
8.2 Analytische Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen aus wässrigen
Matrices...................................................................................................... 85 8.2.1 Validierung der zur Bestimmung von EDCs aus wässrigen Matrices
eingesetzten Methode ....................................................................................88
8.2.1.1 Bestimmung der Wiederfindungen..............................................................88
8.2.1.2 Reproduzierbarkeit der Bestimmungsmethode...........................................89
8.2.1.3 Ermittlung der Nachweis- und Bestimmungsgrenzen .................................90
8.3 Analytische Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen aus
Klärschlämmen........................................................................................... 91 8.3.1 Vorversuche zur Probenaufreinigung .............................................................91
8.3.2 Vorversuche zur Derivatisierung.....................................................................95
8.3.3 Einfluss unterschiedlicher ASE – Extraktionsparameter auf die Wiederfindung
der Analyten....................................................................................................95
8.3.4 Validierung der zur Bestimmung von EDCs aus Klärschlämmen eingesetzten
Methode........................................................................................................103
8.3.4.1 Bestimmung der Wiederfindungen............................................................103
8.3.4.2 Reproduzierbarkeit der Bestimmungsmethode.........................................103
8.3.4.3 Ermittlung der Nachweis- und Bestimmungsgrenzen ...............................104
8.4 Analytische Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen aus Sedimenten .
..................................................................................................................105 8.4.1 Validierung der zur Bestimmung von EDCs aus Sedimenten eingesetzten
Methode........................................................................................................107
8.4.1.1 Bestimmung der Wiederfindungen............................................................107
8.4.1.2 Reproduzierbarkeit der Bestimmungsmethode.........................................107
8.4.1.3 Ermittlung der Nachweis- und Bestimmungsgrenzen ...............................108
8.4.2 Gehalt an EDCs in Sedimentproben des Sees Volvi ....................................108
9 DISKUSSION....................................................................117
9.1 Vorversuche ..............................................................................................117 9.1.1 Derivatisierungsverfahren.............................................................................117
9.1.2 Quantifizierungsverfahren.............................................................................118
9.2 Analytische Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen aus wässrigen
Matrices.....................................................................................................118
Inhaltsverzeichnis V
9.2.1 Bestimmung der Wiederfindungen aus Abwässern......................................119
9.2.2 Bestimmung der Nachweisgrenzen von endokrin wirksamen Substanzen aus
Abwässern ....................................................................................................120
9.3 Analytische Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen aus
Klärschlämmen..........................................................................................121 9.3.1 Bestimmung der Wiederfindungen aus Klärschlämmen...............................121
9.3.2 Bestimmung der Nachweisgrenzen von endokrin wirksamen Substanzen aus
Klärschlämmen .............................................................................................122
9.4 Analytische Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen aus Sedimenten .
..................................................................................................................122 9.4.1 Bestimmung der Wiederfindungen aus Sedimenten ....................................122
9.4.2 Bestimmung der Nachweisgrenzen von endokrin wirksamen Substanzen aus
Sedimenten...................................................................................................123
9.4.3 Belastung des Sees Volvi .............................................................................124
10 ZUSAMMENFASSUNG....................................................126
11 ANHANG ..........................................................................128
12 LITERATUR......................................................................129
13 DANKSAGUNG................................................................139
14 LEBENSLAUF..................................................................141
VI Verzeichnis der Abbildungen
VERZEICHNIS DER ABBILDUNGEN
Abbildung 2.1: Strukturformeln der ausgewählten endokrin wirksamen Substanzen ...........7
Abbildung 3.1: Aerober und anaerober Abbau von Alkylphenolethoxylaten im
Abwasserreinigungsprozess.......................................................................10
Abbildung 3.2: Metabolismus von Bisphenol A...................................................................12
Abbildung 3.3: Molekularer Mechanismus der Estrogenwirkung ........................................14
Abbildung 3.4: Metabolismus von 17�-Estradiol im menschlichen Körper.........................15
Abbildung 3.5: Metabolismus von Ethinylestradiol im menschlichen Körper ......................16
Abbildung 6.1: Reaktionsgleichung der Derivatisierung von NP mittels fluorhaltiger
Anhydride....................................................................................................28
Abbildung 7.1: Fließschema der chemischen Analytik von EDCs aus Abwässern.............44
Abbildung 7.2: Fließschema der chemische Analytik von EDCs aus Klärschlämmen........51
Abbildung 7.3: Schematische Darstellung eines ASE-Gerätes ..........................................55
Abbildung 7.4: Extraktionsapparatur...................................................................................57
Abbildung 7.5: Die Lage des Sees Volvi auf dem griechischen Staatsgebiet sowie
markante Landschaftspunkte im Umfeld des Sees sowie die
Probenahmestellen.....................................................................................61
Abbildung 8.1: Ionenstrom-Chromatogramme der Trifluor- und Pentafluorderivate,
bestimmt im EI- Modus ...............................................................................65
Abbildung 8.2: Ionenstrom-Chromatogramme der Heptafluorderivate, bestimmt im EI-
Modus .........................................................................................................66
Abbildung 8.3: Ionenstrom-Chromatogramme aller Derivate, bestimmt im NCI-Modus .....67
Abbildung 8.4: Fragmentbildung der Nonylphenolderivate unter EI-Bedingungen .............69
Abbildung 8.5: Fragmentbildung der Bisphenol A-Derivate unter EI-Bedingungen. ...........70
Abbildung 8.6: Fragmentbildung der Octylphenolderivate unter EI-Bedingungen ..............71
Abbildung 8.7: Fragmentbildung der Estronderivate unter EI-Bedingungen.......................72
Abbildung 8.8: Fragmentbildung der Estradiolderivate unter EI-Bedingungen ...................73
Abbildung 8.9: Fragmentbildung der Estriolderivate unter EI-Bedingungen .......................74
Abbildung 8.10: Fragmentbildung der Ethinylestradiolderivate unter EI-Bedingungen.........75
Abbildung 8.11: Fragmentbildung der Nonylphenolderivate unter NCI-Bedingungen ..........76
Verzeichnis der Abbildungen VII
Abbildung 8.12: Fragmentbildung der Bisphenol A-Derivate unter NCI-Bedingungen .........77
Abbildung 8.13: Fragmentbildung der Octylphenolderivate unter NCI-Bedingungen ...........78
Abbildung 8.14: Fragmentbildung der Estronderivate unter NCI-Bedingungen....................79
Abbildung 8.15: Fragmentbildung der Estradiolderivate unter NCI-Bedingungen ................80
Abbildung 8.16: Fragmentbildung der Estriolderivate unter NCI-Bedingungen. ...................81
Abbildung 8.17: Fragmentbildung der Ethinylestradiolderivate unter NCI-Bedingungen......82
Abbildung 8.18: Totalionenstrom- und Massenspurchromatogramme von Extrakten aus
Kläranlagenzuläufen ...................................................................................86
Abbildung 8.19: Totalionenstrom- und Massenspurchromatogramme von Extrakten aus
Kläranlagenabläufen...................................................................................87
Abbildung 8.20: Totalionenstrom- und Massenspurchromatogramme von
Belebtschlammextrakten.............................................................................92
Abbildung 8.21: Totalionenstrom- und Massenspurchromatogramme von
Faulschlammextrakten................................................................................93
Abbildung 8.22: Wiederfindungen der EDCs nach Reinigung an Kieselgel mit verschiedenen
Elutionslösungsmitteln ................................................................................94
Abbildung 8.23: Wiederfindungen der EDCs nach Reinigung an Florisil und
Aluminiumoxid.............................................................................................94
Abbildung 8.24: Wiederfindungen in Abhängigkeit von der Menge des verwendeten
HFBAA........................................................................................................95
Abbildung 8.25: Wiederfindungen nach Resuspendierung des Extraktes in Wasser,
Anreicherung auf C18-Material und einem Kieselgel-clean-up...................96
Abbildung 8.26: Wiederfindungen nach Kieselgel-clean-up .................................................97
Abbildung 8.27: Wiederfindungen in Abhängigkeit von der Temperatur...............................98
Abbildung 8.28: Wiederfindungen in Abhängigkeit vom Druck .............................................99
Abbildung 8.29: Wiederfindungen in Abhängigkeit von der Extraktionszeit..........................99
Abbildung 8.30: Wiederfindung in Abhängigkeit von den Extraktionscyclen ......................100
Abbildung 8.31: Wiederfindungen in Abhängigkeit von der Probemenge...........................100
Abbildung 8.32: Wiederfindungen in sterilisierten Schlämmen...........................................102
Abbildung 8.33: Totalionenstrom- und Massenspurchromatogramme von Sedimentextrakten
..................................................................................................................106
VIII Verzeichnis der Abbildungen
Abbildung 8.34: Ergebnisse der EDC-Bestimmung aus Sedimenten der Probenahmeserie A
(Frühjahr) ..................................................................................................109
Abbildung 8.35: Ergebnisse der EDC-Bestimmung aus Sedimenten der Probenahmeserie B
(Sommer) ..................................................................................................109
Abbildung 8.36: Ergebnisse der EDC-Bestimmung aus Sedimenten der Probenahmeserie C
(Herbst) .....................................................................................................110
Abbildung 8.37: Ergebnisse der EDC-Bestimmung aus Sedimenten der Probenahmeserie D
(Winter) .....................................................................................................110
Abbildung 8.38: Ergebnisse der EDC-Bestimmung aus Sedimenten der Probenahmeserie E
(Frühjahr) ..................................................................................................111
Abbildung 8.39: Ergebnisse der EDC-Bestimmung aus Sedimenten der Probenahmeserie F
(Sommer) ..................................................................................................111
Abbildung 8.40: Ergebnisse der EDC-Bestimmung aus Sedimenten der Probenahmeserie G
(Herbst) .....................................................................................................112
Abbildung 8.41: Ergebnisse der EDC-Bestimmung aus Sedimenten der Probenahmeserie H
(Winter) .....................................................................................................112
Abbildung 8.42: EI-Massenspektren der Probe A6 im Vergleich mit einer Standardlösung .....
..................................................................................................................114
Abbildung 8.43: Ergebnisse der EDC-Bestimmung aus Sedimenten der Probenahmestellen
in der Nähe der Berge..............................................................................115
Abbildung 8.44: Ergebnisse der EDC-Bestimmung aus Sedimenten der Probenahmestelle
in der Nähe des Flusses Megalo Rema...................................................115
Abbildung 8.45: Ergebnisse der EDC-Bestimmungen aus Sedimenten der
Probenahmestelle in der Nähe der Stadt Nea Madytos...........................116
Verzeichnis der Tabellen IX
VERZEICHNIS DER TABELLEN Tabelle 1.1: Relative estrogene Potenz bezogen auf 17β-Estradiol.....................................6
Tabelle 1.2: Produktion und Verbrauch von Alkylphenolen in der EU 1997.........................9
Tabelle 1.3: Verbrauch von Alkylphenolen zur Weiterverarbeitung in Deutschland 1995....9
Tabelle 1.4: Produktion und Verbrauch von Bisphenol A in Deutschland ..........................11
Tabelle 1.5: Verbrauch von Bisphenol A in Deutschland ...................................................12
Tabelle 1.6: Übersicht über die beschriebenen LOEC Werte von EDCs und deren Effekte
auf verschiedene Testorganismen..................................................................19
Tabelle 1.7: Konzentrationen von endokrin wirksamen Substanzen in Kläranlagenzu- und
–abläufen ........................................................................................................21
Tabelle 1.8: Konzentrationen von endokrin wirksamen Substanzen in Schlämmen ..........23
Tabelle 1.9: Konzentrationen von endokrin wirksamen Substanzen in Sedimenten..........24
Tabelle 1.10: Physikalische Stoffgrößen von endokrin wirksamen Substanzen ..................25
Tabelle 1.11: Übersicht über die in der Literatur vorhandenen Methoden zur Bestimmung
von EDCs aus Abwässern ..............................................................................29
Tabelle 1.12: Übersicht über die in der Literatur vorhandenen Methoden zur Bestimmung
von EDCs aus Klärschlämmen .......................................................................33
Tabelle 1.13: Übersicht über die in der Literatur vorhandenen Methoden zur Bestimmung
von EDCs aus Sedimenten.............................................................................34
Tabelle 2.1: GC/MS-Bedingungen zur Bestimmung von EDCs aus Abwässern mittels EI-
und NCI- Ionisation .........................................................................................39
Tabelle 2.2: Verwendete interne Standards .......................................................................41
Tabelle 2.3: Anreicherungsparameter ................................................................................45
Tabelle 2.4: Vorversuche zur chromatographischen Reinigung von Stadardlösungen......52
Tabelle 2.5: ASE-Extraktionsvarianten...............................................................................56
Tabelle 2.6: Probenahmezeitpunkte...................................................................................61
Tabelle 3.1: Zur Quantifizierung verwendete Ionen (m/z) der unterschiedlichen EDC-
Derivate ..........................................................................................................84
Tabelle 3.2: Massenspektrometrische Nachweisgrenzen, bestimmt im EI-Modus, in
Abhängigkeit von den verschiedenen Derivatisierungsreagenzien ................84
X Verzeichnis der Tabellen
Tabelle 3.3: Ermittelte Responsefaktoren der estrogen wirksamen EDCs bei der MS-
Detektion im EI- Modus ..................................................................................85
Tabelle 3.4: Wiederfindungen der EDCs in wässrigen Medien ..........................................88
Tabelle 3.5: Reproduzierbarkeit der Bestimmungsmethode (Matrix: Reinstwasser)..........89
Tabelle 3.6: Reproduzierbarkeit der Bestimmungsmethode (Matrix: Zulauf) .....................89
Tabelle 3.7: Reproduzierbarkeit der Bestimmungsmethode (Matrix: Ablauf) .....................90
Tabelle 3.8: Nachweis- (NG) und Bestimmungsgrenzen (BG) der Analyten sowie deren
Korrelationskoeffizienten, bestimmt aus Abwässern ......................................90
Tabelle 3.9: Wiederfindungen von E1 und E2, bestimmt zur Überprüfung des mikrobiellen
Abbaus von E2 zu E1 ...................................................................................101
Tabelle 3.10: Wiederfindungen der sieben EDCs aus Belebt- und Faulschlamm, mittels
optimierter Methodenparameter bestimmt....................................................103
Tabelle 3.11: Reproduzierbarkeit der Bestimmungsmethode (Matrix: Belebtschlamm).....104
Tabelle 3.12: Reproduzierbarkeit der Bestimmungsmethode (Matrix: Faulschlamm)........104
Tabelle 3.13: Nachweis- und Bestimmungsgrenzen der Analyten sowie deren
Korrelationskoeffizienten, bestimmt aus Belebtschlamm..............................105
Tabelle 3.14: Wiederfindungen der sieben EDCs aus Sedimenten ...................................107
Tabelle 3.15: Reproduzierbarkeit der Bestimmungsmethode (Matrix: Sediment) ..............107
Tabelle 3.16: Nachweis- und Bestimmungsgrenzen sowie Korrelationskoeffizienten der
Kalibriergeraden unterschiedlicher EDCs, bestimmt aus Sedimenten .........108
Tabelle 4.1: Gegenüberstellung der in dieser Arbeit erzielten Wiederfindungen für EDCs
aus Abwässern mit den in der Literatur berichteten Methoden
(zusammengesetzt aus den Teilschritten Festphasenanreicherung, clean-up,
Derivatisierung und GC/MS- Bestimmung)...................................................119
Tabelle 4.2: Vergleich der Nachweisgrenzen von EDCs in Abwässern mit entsprechenden
Literaturmethoden. In die Nachweisgrenzen gehen ein:
Festphasenanreicherung, clean- up, Derivatisierung und GC/MS-Bestimmung
......................................................................................................................120
Tabelle 4.3: In dieser Arbeit ermittelte Wiederfindungraten der EDCs aus Klärschlämmen
im Vergleich mit Daten aus der Literatur (Identifizierung und Quantifizierung
mittels GC/MS bzw. GC/MS/MS)..................................................................121
Verzeichnis der Tabellen XI
Tabelle 4.4: Vergleich der in dieser Arbeit ermittelten Wiederfindungsraten mit
Literaturmethoden, die zur Identifizierung und Quantifizierung der
untersuchten EDCs ebenfalls GC/MS- Methoden verwendeten...................123
Tabelle 4.5: Vergleich der Nachweisgrenzen von EDCs, bestimmt aus Sedimenten, mit in
der Literatur beschriebenen Bestimmungsmethoden, die sich aus den
Arbeitsschritten - Extraktion, clean-up, Derivatisierung und GC/MS-
Bestimmung - zusammensetzten ................................................................124
Tabelle 6.1: Im Rahmen der Erstellung dieser Arbeit verwendete Chemikalien...............128
XII Verzeichnis der Abkürzungen
VERZEICHNIS DER ABKÜRZUNGEN
AP Alkylphenol
APCI atmospheric pressure chemical ionization
APEO Alkylphenolethoxylate
ASE accelerated solvent extraction
BG Bestimmungsgrenze
BPA Bisphenol A
BPA-d16 per-deuteriertes Bisphenol A
c Konzentration (concentration)
DAD diode array detection
E1 Estron
E2 17β-Estradiol
E3 Estriol
E2ac 17β-Estradiolacetat
ECD electron capture detection
ED electrochemical detection
EDC endocrine disrupting compound
EE2 17α-Ethinylestradiol
EI Elektronenionisation
ELRA enzyme-linked receptorassay
EPA environmental protection agency
ER Estrogenrezeptor
ESI electrospray interface
eV Elektronenvolt
FD fluorescence detection
FID Flammenionisationsdetektion
GC Gaschromatograph bzw. Gaschromatographie
GC/MS Gaschromatograph gekoppelt mit einem Massenspektrometer
HFBAA Heptafluorbuttersäureanhydrid (heptafluorobutyric acid anhydride)
LOEC lowest observed effect concentration
NOEC no observed effect concentration
[M]+ Molekülion
MeOH Methanol
MS Massenspektrometer bzw. Massenspektrometrie
Verzeichnis der Abkürzungen XIII
MS/MS Tandemmassenspektrometrie
m/z Massenzahl (Masse/Ladung)
NCI negative chemische Ionisation
NG Nachweisgrenze
NP 4-Nonylphenol
4nNP 4n-Nonylphenol
NPD Stickstoff- und Phosphor-selektiver Detektor
NPEO Nonylphenolethoxylate
OP Octylphenol
OPEO Octylphenolethoxylate
PFPAA Pentafluorpropionsäureanhydrid (pentafluoropropionic acid anhydride)
PLE pressurized liquid extraction
R Responsefaktor
r2 Korrelationskoeffizient
RIC reconstructed ion chromatogram (Ionstromchromatogramm einzelner,
ausgewählter Ionen mit definiertem m/z-Verhältnis)
S/N Signal/Rausch-Verhältnis (signal to noise ratio)
SPE Festphasenextraktion (solid phase extraction)
TBT Tributylzinn
TIC total ion chromatogram (Totalionstromchromatogramm, Aufnahme aller Ionen
eines ausgewählten m/z Bereichs)
TFAAA Trifluoressigsäureanhydrid (trifluoroacetic acid ahydride)
TS Trockensubstanz
W Wiederfindung
1 Einleitung und Zielsetzung 1
1 Einleitung und Zielsetzung
In den fünfziger und sechziger Jahren des letzten Jahrhunderts wurden die ersten Fälle von
Veränderungen der endokrinen Systeme einzelner Tierspezies bekannt, die auf schädigende
Wirkungen von Chemikalien zurückzuführen waren. 1996 wurden diese durch die
Veröffentlichung des Buches „Our stolen future“ von Theo Colborn der breiten Öffentlichkeit
zugänglich gemacht (Colborn et al., 1996).
1996 wurde auf der in Weybridge, England, abgehaltenen Konferenz „European workshop
on the impact of endocrine disrupters on human health and wildlife“ unter der Federführung
der Europäischen Kommission eine Definition für endokrin wirksame Substanzen aufgestellt:
„An endocrine disrupter is an exogenous substance that causes adverse health effects in an
intact organism, or its progeny, consequent to changes in endocrine functions“ (Bei endokrin
wirksamen Substanzen handelt es sich um körperfremde Verbindungen, die in das endokrine
System eines gesunden Organismus oder das seiner Nachkommen eingreifen und zu
signifikanten Gesundheitsstörungen führen.) Davon zu unterscheiden sind potentiell endokrin
wirksame Substanzen: „A potential endocrine disruptor is a substance, that possesses
properties that might be expected to lead to endocrine disruption in an intact organism.“ (Bei
potentiell endokrin wirksamen Substanzen handelt es sich um Verbindungen, die über die
Möglichkeit verfügen, in das endokrine System eines gesunden Organismus einzugreifen zu
können.) (Europäische Kommission, 1996).
Nach dieser Weybridge-Definition gilt ein Stoff nur dann als EDC (endocrine disrupting
compound), wenn an gesunden Organismen in vivo deutliche Gesundheitsschäden als Folge
von Veränderungen endokriner Funktionen aufgetreten sind. Der alleinige Nachweis, dass
eine Verbindung einen Einfluss auf das endokrine System ausüben kann, reicht demnach
nicht für eine Einstufung als EDC aus.
Etwas umfassender ist die Definition der US-Umweltbehörde EPA (environmental protection
agency) aus dem Jahre 1997: „An environmental endocrine disrupter is defined as an
exogenous agent that interferes with the synthesis, secretion, transport, binding, action or
elimination of natural hormones in the body that are responsible for the maintenance of
homeostatis, reproduction, development, and/or behavior.“ (Unter einem in der Umwelt
relevanten endokrin wirksamen Substanz versteht man eine körperfremde Substanz, die mit
der Synthese, der Ausscheidung, dem Transport, der Bindung, der Wirkung oder dem Abbau
der natürlichen Hormone im Körper konkurriert, welche für die Aufrechterhaltung der
physiologischen Körperfunktionen, der Fortpflanzung, die Entwickung und/oder das
Verhalten verantwortlich sind.) (Crisp et al., 1997). Nach der EPA-Definition werden also alle
Chemikalien als EDCs bezeichnet, die in irgendeiner Weise auf das natürliche
2 1 Einleitung und Zielsetzung
Hormonsystem Einfluss nehmen. Im Gegensatz zur engeren Weybridge-Definition werden
auch jene Verbindungen eingeschlossen, die Änderungen der Hormonkonzentration
auslösen, die Aktivität endokriner Drüsen und Gewebe beeinflussen sowie
hormonspezifische Effekte auslösen bzw. hemmen aber keine Gesundheitsschäden
auslösen.
1.1 Ziel der Arbeit
Kommunale Abwässer werden zunehmend durch umweltrelevante Spurenstoffe belastet.
Erst die gezielte Suche („What you see depends on what you look for.“ (Erickson, 2002))
bestätigte diese Tatsache und wies Kläranlagenabläufe als Punktquellen dieser Schadstoffe
aus. Insbesondere der Eintrag von endokrin wirksamen Substanzen erscheint bedenklich, da
sie während des Klärprozesses meist nur unvollständig eliminiert werden und somit, wie
Untersuchungen mittels sensitiver und spezifischer Verfahren belegen, mit den
Kläranlagenabläufen in relevanten Konzentrationen in die Umwelt entlassen werden.
Das Ziel der Arbeit ist es:
- Auswahl von umweltrelevanten, endokrin wirksamen Substanzen, insbesondere mit
estrogem Potential. Dazu gehören sowohl Substanzen, die eine starke estrogene
Potenz besitzen als auch Substanzen mit einer geringeren estrogenen Potenz, die
aber aufgrund ihrer Anwendung bzw. ihrer Ausscheidung in großen Mengen in der
Umwelt vorkommen.
- Prüfung und Bewertung der in der Literatur vorhandenen Methoden zur quantitativen
Anreicherung und Bestimmung dieser EDCs aus Umweltmatrices auf ihre
Anwendbarkeit im Abwasserreinigungsprozess.
- Entwicklung einer simultanen Bestimmungsmethode für diese EDCs aus wässrigen
Matrices. Die Extraktion der wässigen Proben soll möglichst mittels Festphasen
durchführbar sein.
- Derivatisierung der endokrin wirksamen Substanzen mittels fluorhaltiger Reagenzien.
Dadurch wird die Flüchtigkeit der Moleküle erhöht, was die gaschromatographische
Trennung erleichtert und es werden darüber hinaus elektronegative Gruppen in die
Moleküle integriert.
- Detektion und Quantifizierung mittels substanzspezifischer Verfahren wie
Gaschromatographie in Verbindung mit der Massenspektrometrie (GC/MS).
- Vergleich unterschiedlicher Ionisierungsmethoden, wie z.B. positiver
Elektronenionisation (EI) und negativer chemischer Ionisation (NCI), im Hinblick auf
ihre Nachweisempfindlichkeit. Um eine Ionisierung mittels NCI überhaupt möglich zu
1 Einleitung und Zielsetzung 3
machen, wurden durch die Derivatisierung elektronegative Gruppen in die Moleküle
eingefügt. Die Nachweisempfindlichkeit der negativen chemischen Ionisation soll in
Abhängigkeit des Fluorgehaltes der unterschiedlichen Derivate überprüft werden.
- Entwicklung einer simultanen Bestimmungmethode für diese EDCs aus festen
Matrices wie Klärschlamm und Sediment. Die Extraktion der festen Matrices soll mit
der „accelerated solvent extraction“ (ASE) durchgeführt werden, die gegenüber der
klassischen Soxhletextraktion den Vorteil einer verkürzten Extraktionszeit und eines
geringeren Lösungsmittelbedarfs - bei gleichzeitig erschöpfender Extraktion - hat.
- Anpassung der für die wässrigen Matrices entwickelten Reinigung, Derivatisierung,
Detektion und Quantifizierung an die, durch andere Matrices verursachten
Gegebenheiten.
Die entwickelten Analysenmethoden sind zu validieren und möglichst weitgehend als
Routinemethoden zu etablieren und auf reale Proben anzuwenden
Die größte Gefahr geht von den endokrin wirksamen Sustanzen aus, wenn sie in der
Kläranlage nicht eliminiert werden und in die Oberflächengewässer gelangen. Dort können
sie Einfluss auf die vorhandenen aquatischen Lebewesen nehmen und sich durch
Adsorption an Sedimenten anreichern. Deshalb soll für die Untersuchung realer Proben nicht
der Belastungsverlauf einer Kläranlage ausgewählt, sondern ein besonders zu schützender
See identifiziert werden, dessen Sediment in regelmäßigen Zeitabständen auf den Gehalt
von EDCs untersucht werden soll.
4 2 Klassifizierung endokrin wirksamer Substanzen
2 Klassifizierung endokrin wirksamer Substanzen
Inzwischen sind mehrere hundert Substanzen unterschiedlicher Struktur und Herkunft
bekannt, die eine endokrine Wirkung zeigen. Dementsprechend handelt es sich um keine
einheitliche Substanzklasse.
Es gibt zwei Möglichkeiten diese Vielfalt der endokrinen Substanzen zu gliedern. Zum Einen
ist eine Klassifizierung nach Art der endokrinen Wirkung möglich, zum Anderen lassen sie
sich nach ihrem strukturellen Aufbau bzw. ihrer Herkunft unterteilen.
2.1 Klassifizierung nach Art der endokrinen Wirksamkeit
2.1.1 Estrogene Wirkung
Estrogen wirksame Substanzen sind Substanzen, die eine ähnliche Wirkung hervorrufen wie
das weibliche Geschlechtshormon 17β-Estradiol, d.h. der Estrogenrezeptor wird aktiviert. Zu
dieser Gruppe gehören Substanzen wie z. B. 17α-Ethinylestradiol (EE2), Diethylstilboestrol,
4-Nonylphenol (NP) und Bisphenol A (BPA).
2.1.2 Anti-estrogene Wirkung
Durch Substanzen mit anti-estrogener Wirkung wird der Estrogenrezeptor blockiert und die
Wirkung natürlicher estrogener Substanzen kann sich nicht mehr voll entfalten. Die anti-
estrogene Wirkung kann entweder direkt durch Hemmung der Bindung von Estrogenen an
den Estrogenrezeptor verursacht sein, oder indirekt durch Beeinflussung des Metabolismus
oder der Biosynthese von Estrogenen oder der Estrogenrezeptoren. Zu den anti-estrogenen
Substanzen gehören z.B. die polycylischen aromatischen Kohlenwasserstoffe (Tran et al.,
1996).
2.1.3 Androgene Wirkung
Androgene wie Testosteron bewirken die Ausprägung der männlichen
Geschlechtsmerkmale. Wirkungen von Testosteron und anderen androgen wirkenden
Substanzen in der Umwelt sind bisher kaum bekannt und nur wenig untersucht. Zur Wirkung
des Tributylzinnkations (TBT) wurden die meisten Untersuchungen durchgeführt (Oehlmann
et al., 1996).
2 Klassifizierung endokrin wirksamer Substanzen 5
2.1.4 Anti-androgene Wirkung
Analog zu der anti-estrogenen Wirkung tritt hier eine Hemmung des androgenen Rezeptors
auf. Diese Wirkung wird für einige Pestizide und PAKs (Sultan et al., 2001) beschrieben.
2.1.5 Thyroide Wirkung
Substanzen mit einer thyroiden Wirkung beeinflussen die Bildung und die Wirkung des
Schilddrüsenhormons Thyroxin. Diese Wirkung wird z. B. für das Organophosphorpestizid
Dimecron beschrieben (Thangavel et al., 2005).
2.2 Klassifizierung nach Struktur
Die EDCs stellen strukturell keine homogene Stoffklasse dar, sondern unterscheiden sich
sehr stark in ihrer chemischen Struktur, was sich wiederum auf die Wirkung niederschlägt.
Es kann von einer stärkeren Wirkung ausgegangen werden, je höher die Wechselwirkung
der endokrin wirksamen Substanz mit dem Estrogenrezeptor ist. Die meisten der bisher
identifizierten Chemikalien enthalten mindestens einen Phenolring, wie z.B. Alkylphenole
oder Bisphenole, andere dagegen besitzen keine aromatischen Strukturen, wie z.B.
Tributylzinn.
2.2.1 Natürliche und synthetische Steroide
Steroidhormone weisen von ihrer Struktur her ein Steroidgerüst auf und unterscheiden sich
nur in ihren funktionellen Gruppen. Hierzu zählen die natürlichen Hormone Testosteron und
17β-Estradiol, dessen Metabolite Estron und Estriol, sowie synthetisch hergestellte Hormone
wie 17α-Ethinylestradiol und Mestranol, die Hauptbestandteile von Kontrazeptiva sind.
2.2.2 Xenoestrogene
Bei den Xenoestrogenen handelt es sich vorwiegend um Industriechemikalien und ihre
Abbauprodukte, die wie ihr Name sagt, eine estrogene Wirkung besitzen. Sie sind, wie in
Tabelle 2.1 ersichtlich, um mehrere Größenordnungen weniger wirksam als Steroidhormone,
doch werden sie meist in großen Mengen produziert, so dass trotz der niedrigeren
Wirksamkeit ein Effekt zu erwarten ist. Haupteintragsweg von Xenoestrogenen in die Umwelt
ist der Eintrag über das Abwasser. Die wichtigsten Xenoestrogene sind Alkylphenole und
6 2 Klassifizierung endokrin wirksamer Substanzen
Bisphenole. Beim Nonylphenol, als wichtigstem Vertreter der Alkylphenole ist die endokrine
Wirksamkeit sowohl von der Stellung der Seitenkette (para > meta > ortho) (Routledge and
Sumpter, 1997) als auch von der Verzweigung der Seitenkette abhängig. Die endokrine
Wirksamkeit ist bei Anwesenheit eines tertiären C-Atoms größer als bei Anwesenheit von
sekundären C-Atomen. Am schwächsten ist die endokrine Wirksamkeit bei einer
unverzweigten Seitenkette. Die größte Aktivität wird bei einer einzelnen tertiären
Verzweigung zwischen dem sechsten und achten C-Atom beobachtet, wenn sich die
Seitenkette in para-Position befindet. Dabei hat das Alkylphenol in der räumlichen
Ausdehnung die größte Ähnlichkeit mit der Steroidstruktur (Routledge and Sumpter, 1997).
Tabelle 2.1: Relative estrogene Potenz bezogen auf 17β-Estradiol
Substanz relative estrogene Potenz (Hefezellassay)
Quelle
17β-Estradiol (E2) 1,0 Gaido et al., 1997, Schultis et al., 2004
17α-Ethinylestradiol (EE2) 0,78 Schultis et al., 2004
Diethylstilbestrol 0,64 Gaido et al., 1997
Estron (E1) 0,22 Schultis et al., 2004
Estriol (E3) 0,0036 Gaido et al., 1997
Dihydro-Testosteron 0,0005 Gaido et al., 1997
4-Nonylphenol (NP) 0,0002 Gaido et al., 1997
Bisphenol A (BPA) 0,000067 Gaido et al., 1997
β-Sitosterin 0,0000045 Gaido et al., 1997
Testosteron 0,0000044 Gaido et al., 1997
Methoxychlor 0,0000002 Gaido et al., 1997
o,p´-DDT 0,000000125 Gaido et al., 1997
o,p´-DDD 0,000000067 Gaido et al., 1997
o,p´-DDE 0,000000042 Gaido et al., 1997
2.2.3 Auswahl von EDCs
Für diese Arbeit wurden aus der Fülle der endokrin wirksamen Substanzen estrogen
wirkende Stoffe, namentlich die Xenoestrogene 4-Nonylphenol (NP), Octylphenol (OP) und
Bisphenol A (BPA) das natürliche Steroidhormon 17β-Estradiol (E2), dessen Metabolite
Estron (E1) und Estriol (E3) sowie das am häufigsten in Kontrazeptiva verwendete
synthetische Hormon 17α-Ethinylestradiol (EE2) ausgewählt. Bei den ausgewählten Stoffen
handelt es sich einerseits um Industriechemikalien (NP, OP, BPA), andererseits sind die
natürlichen Steroidhormone und deren Metaboliten endogener Natur und werden vom
2 Klassifizierung endokrin wirksamer Substanzen 7
Menschen ausgeschieden. Die Kontrazeptiva werden nach bestimmungsgemäßer
Anwendung ebenfalls vom Menschen ausgeschieden. Daher ist für diese Stoffe eine hohe
Umweltrelevanz zu erwarten. Die Strukturen der ausgewählten sieben Verbindungen sind in
Abbildung 2.1 dargestellt.
OH
CH3 OH
H
HH
OH
CH3 OH
H
HH
OH
CH3
H
HH
O
OH
CH3 OH
H
HH
OH
H19C9 OH
CH3
CH3OH OHH17C8 OH
17ß-Estradiol (E2)Estron (E1) Estriol (E3)
Nonylphenol (NP) Bisphenol A (BPA)Octylphenol (OP)
natürliche Steroidhormone
synthetische Steroidhormone
Xenoestrogene
17α-Ethinylestradiol (EE2) Abbildung 2.1: Strukturformeln der ausgewählten endokrin wirksamen Substanzen
8 3 Antropogene und biogene Entstehung estrogen wirksamer Substanzen
3 Anthropogene und biogene Entstehung estrogen wirksamer Substanzen
3.1 Alkylphenole
Bei den Alkylphenolen handelt es sich um phenolische Derivate, die am aromatischen Ring
eine oder zwei Alkylgruppen tragen. Alkylphenole dienen hauptsächlich als
Zwischenprodukte für die Herstellung von Phenolharzen, von Ethoxylaten, d.h. von Stoffen
mit tensidischer Wirkung, sowie von antioxidativ wirkenden Additiven. Aus dieser ca. 130
Einzelverbindungen umfassenden Substanzgruppe zeigen Nonylphenole und Octylphenole
endokrine Effekte. Unter Nonyl- bzw. Octylphenolen werden Alkylphenole mit einem C9- bzw.
C8-Alkylrest verstanden. Der Alkylrest kann unterschiedlich verzweigt sein. Technisches
Nonylphenol stellt synthesebedingt eine Mischung verschiedener Isomerer dar.
In Europa werden hauptsächlich drei Methoden zur Synthese von Nonylphenol angewendet
(EU, 2002).
1. Phenol und Nonen, als Isomerengemisch, reagieren in einem Batchprozess in
Gegenwart eines Katalysators zu Nonylphenol. Als Katalysator wird Montmorillonit
und Phosphorsäure verwendet.
2. Phenol und Nonen, als Isomerengemisch, reagieren in Gegenwart eines sulfonierten
Ionenaustauscherharzes in einem Batchprozess zu Nonylphenol.
3. Phenol und Nonen, als Isomerengemisch, reagieren in Gegenwart von einem
Festbettionenaustauscherharzes in einem kontinuierlichen Prozess zu Nonylphenol.
In der EU wurden so 1997 ca. 73.500 Mg Nonylphenol produziert (Tabelle 3.1). Der Anteil an
in Deutschland verarbeiteten NP betrug 1995 14.000 Mg (Tabelle 3.2).
Mittels zweidimensionaler Gaschromatographie in Verbindung mit der Massenspektrometrie
(GC X GC/MS) sind bisher 102 Komponenten des technischen Gemisches identifiziert
worden (Ieda et al., 2005). Moeder et al. haben 2006 mittels zweidimensionaler
Gaschromatographie in Verbindung mit time of flight Massenspektrometrie 40 Isomere im
technischen Nonylphenolgemisch identifizieren können.
Die Nonylkette weist unterschiedliche Verzweigungen auf und kann am Phenolring in p- oder
in o-Stellung stehen. Die p-o-Normalverteilung liegt im technischen Nonylphenol bei 9:1.
Para-, d.h. 4-Nonylphenol ist der Hauptbestandteil von technischem Nonylphenol, mit einem
geringen Anteil des bedeutungslosen Nebenprodukts 2-Nonylphenol. Es enthält daneben in
geringen Mengen u.a. Dinonylphenol. Der größte Teil der NPs dienen in der EU als
Zwischenprodukt für die Herstellung von Ethoxylaten, die z.B. als Wasch- und
Reinigungsmittel, Emulgatoren für Pflanzenschutzmittel, als Hilfsmittel und Additive in der
3 Antropogene und biogene Entstehung estrogen wirksamer Substanzen 9
Textil- und Lederindustrie, der Papier- und Zementindustrie und in der chemischen
Reinigung eingesetzt werden (EU, 2002). Die Verbrauchsstruktur hat sich gegenüber Ende
der 80er Jahre (BUA) deutlich verändert, da der Anteil, der zur Ethoxylierung verwendet wird,
wegen eines weitgehenden Verzichts auf Verwendung von Alkylphenolethoxylaten in Wasch-
und Reinigungsmitteln deutlich zurückgegangen ist. In nächster Zukunft ist eine weitere
Verminderung zu erwarten, wenn die Richtlinie 2003/53/EG, welche der Reduzierung von
Nonylphenol und Nonylphenolethoxylaten dient, vollständig umgesetzt sein wird. Diese
gestattet in den meisten Anwendungsbereichen nur noch eine Verwendung sowohl von NP
als auch von NPEO in Konzentrationen bis zu 0,1 Massenprozent.
Von besonderer Bedeutung sind in diesem Zusammenhang die Alkylphenolethoxylate
(APEO), von denen fast ausschließlich Nonylphenol- und Octylphenolethoxylate zum Einsatz
kommen. Sie sind wassergängig und werden unter aeroben bzw. anaeroben Bedingungen
leicht zum Alkylphenol abgebaut.
Tabelle 3.1: Produktion und Verbrauch von Alkylphenolen in der EU 1997 (EU, 2002)
Nonylphenol [Mg] Produktion 73.500
Export 3.500
Import 8.500
Verbrauch zur Weiterverarbeitung (Produktion + Import – Export)
78.500
Tabelle 3.2: Verbrauch von Alkylphenolen zur Weiterverarbeitung in Deutschland 1995 (Leisewitz et al., 1997)
Verarbeitungsbereich Alkylphenole [Mg] Nonylphenol [Mg] Verarbeitungsmenge insgesamt 20.000 14.000
zu Alkylphenol-Ethoxylat 13.500 11.500
zu Alkylphenol-Harz 4.500 1.800
zu Antioxidantien, Additiven etc. 2.000 800
3.1.1 Metabolismus von Alkylphenolethoxylaten
Beim biologischen Abbau von Alkylphenolethoxylaten während des
Abwasserreinigungsprozess entsteht, wie in Abbildung 3.1 zu sehen ist, sowohl unter
aeroben als auch unter anaeroben Verhältnissen Alkylphenol. Dieses ist im Vergleich zu den
Ausgangsprodukten stärker endokrin wirksam (Ahel et al., 1994). Während des aeroben
Abbaus entstehen zunächst kürzerkettige Alkylphenoxycarbonsäuren und kurzkettige
10 3 Antropogene und biogene Entstehung estrogen wirksamer Substanzen
Alklyphenolethoxylate, bevor die Ethoxylatkette entfernt ist und das entsprechende
Alkylphenol entsteht. Beim anaeroben Abbau der Alkylphenolethoxylate wird aus der
Ethoxylatkette direkt ein Ethoxylatrest nach dem anderen durch eine β-Oxidation entfernt, bis
das Alkylphenol entstanden ist.
R OO
Hn
R OO
Hn
R OO
Hn
R OH
R OH
OHR OO
O
n
+ +
n=1-40 (APnEO)
n= 0,1 (AP1EC, AP2EC)
n= 0,1 (AP1EO, AP2EO)
n= 0,1 (AP1EO, AP2EO)
AP
AP
aerober Abbau anaerober Abbau
anaerober Abbau
Abbildung 3.1: Aerober und anaerober Abbau von Alkylphenolethoxylaten im Abwasserreinigungsprozess (Ahel et al., 1994)
3.1.2 Metabolismus von Nonylphenol
Über den weiteren Metabolismus von Nonylphenol ist bisher wenig bekannt. Bisher wurde
meistens nur die biologische Abbaubarkeit bestimmt. Unter aeroben Bedingungen wird NP
(c = 8,33 mg/L, 47 Tage) in Belebtschlamm bei einer Temperatur von 28 °C vollständig
abgebaut, bei niedrigeren Temperaturen sinkt die Abbaubarkeit auf 13 – 86 % (Tanghe et al.,
1998). Unter anaeroben Bedingungen wird NP (c = 5 mg/L) erst innerhalb von 84 Tagen, bei
einer Halbwertzeit von 23,9 Tagen vollständig abgebaut. Dabei wurde ebenfalls eine
Temperaturabhängigkeit festgestellt (Chang et al., 2005). Über welche Zwischenstufen die
Metabolisierung verläuft, ist bisher weitestgehend unbekannt. Eine allgemein akzeptierte
Hypothese ist, dass der NP-Abbau über eine Oxidation am Ring mit nachfolgender
3 Antropogene und biogene Entstehung estrogen wirksamer Substanzen 11
Ringöffnung läuft, ähnlich dem Metabolismus anderer aromatischer Substanzen (Corvini et
al., 2004, Tanghe et al., 1999). Bei Metabolismusuntersuchungen von Telscher et al., 2005
an einem definierten NP-Isomer in einem Schlamm-Boden-Gemisch wurde die Bildung einer
NO2-Verbindung beobachtet.
3.2 Bisphenol A
4,4‘-Bisphenol A (BPA) kann durch sauer oder alkalisch katalysierte Kondensation von 2 mol
Phenol mit 1 mol Aceton hergestellt werden. Großtechnisch erfolgt die Herstellung nur in
sauer katalysierter Reaktion, da in Gegenwart von Alkali die Bildung von Nebenprodukten
stark zunimmt. Die Produktionsmenge in der Bundesrepublik Deutschland betrug 1995 ca.
210.000 Mg (Tabelle 3.3). Berücksichtigt man den Export von 25.000 Mg und den Import von
5.000 Mg, ergibt sich ein Gesamtverbrauch von etwa 190.000 Mg (Leisewitz et al., 1997).
Damit gehört BPA zu den in Synthesen am häufigsten eingesetzten Chemikalien.
Tabelle 3.3: Produktion und Verbrauch von Bisphenol A in Deutschland (Leisewitz et al., 1997)
Menge Bisphenol A 1995 [Mg] Produktionskapazität 240.000
Produktion 210.000
Import 5.000
Export 25.000
Verbrauch 190.000
Bisphenol A wird in der Bundesrepublik Deutschland fast ausschließlich als Zwischenprodukt
eingesetzt. (Tabelle 3.4) Es stellt in der Kunststoffindustrie eine bedeutende
Ausgangskomponente für die Erzeugung von Polycarbonaten und Epoxidharzen dar.
Polycarbonat-Kunststoffe sind sehr stabile Verbindungen, die sich durch hohe Zähigkeit,
Wärmeformbeständigkeit und elektrisches Isolationsvermögen auszeichnen. Sie sind
transparent und praktisch farblos. Polycarbonate eignen sich daher in vielen
Anwendungsbereichen als Konstruktionswerkstoff. Epoxidharze auf BPA-Basis werden z. B.
für Zahnfüllungen und Innenlackierung von Metallverpackungen eingesetzt. Unter sonstigen,
mengenmäßig relevanten Verwendungen von Bisphenol A sind seine Bromierung zu dem als
Flammschutzmittel verwendeten Tetrabrombisphenol A, sein Einsatz als Entwicklersubstanz
in Thermopapieren sowie die Verwendung als Stabilisator (PVC- und Gummi-Additiv) zu
erwähnen (Leisewitz et al., 1997).
12 3 Antropogene und biogene Entstehung estrogen wirksamer Substanzen
Tabelle 3.4: Verbrauch von Bisphenol A in Deutschland (Leisewitz et al., 1997)
Verbrauchssektor Bisphenol A [Mg] Prozent [%]
Polycarbonate 133.000 70,0
Epoxidharze 56.000 29,5
Sonstige Verwendungen 700 0,5
Insgesamt 190.000 100
3.2.1 Biologischer Abbau von Bisphenol A im aeroben Abwasserreinigungsprozess
In einer japanischen Studie mit drei verschiedenen Belebtschlämmen und 40 Flusswässern
(Ike et al., 2000) wurde festgestellt, dass ein Belebtschlamm aus einer industriell mit BPA
belasteten Kläranlage in der Lage war, BPA innerhalb von 24 h vollständig zu mineralisieren.
Die beiden anderen Schlämme kommunaler Herkunft benötigten hierzu 48 bzw. 56 h. BPA
wurde in den Flusswässern, die stärker verschmutzt waren, besser abgebaut, als in den
leichter verschmutzen. Wobei eine komplette Mineralisierung nur in 6 der 40 Wässer zu
beobachten war. Die entstehenden Abbauprodukte sind bisher nicht untersucht.
CH3
CH3
OH OH
OHOH
CH3OH
CH3
OH OH
CH2OH
OHOH
CH3
HO
OH
CH3O
OH
O OH
OH
OH
OHO CH2OHO
OH
CH3
OH OH
COOHOH
OH OH
CH2OH
+
+
+CO2 Biomasse
BPA
85 %15 %
Abbildung 3.2: Metabolismus von Bisphenol A (Lobos et al., 1992; Spivack et al., 1994)
3 Antropogene und biogene Entstehung estrogen wirksamer Substanzen 13
Eine Untersuchung mittels des gramnegativen Bakteriums MV1 (Lobos et al.; 1992, Spivack
et al., 1994) zeigt den in Abbildung 3.2 dargestellten Weg. Dabei existieren zwei alternative
Abbauwege, einen Hauptweg und einen Nebenweg. BPA wird hauptsächlich unter Bildung
der Intermediate 4-Hydroxyacetophenol und 4-Hydroxybenzoesäure zu Kohlendioxid und
Biomasse abgebaut bzw. umgebaut, während ein geringerer Teil zum Triol oxidiert wird.
3.3 Natürliche Estrogene
Natürliche Estrogene sind weibliche Geschlechtshormone, die hauptsächlich im Ovar sowie
in geringen Mengen auch in der Nebenniere und in den Hoden gebildet werden. Das
Folikelhormon 17β-Estradiol (E2) ist unter den Estrogenen dabei von besonderer Bedeutung.
Zu den wesentlichen Zielorganen körpereigener Estrogene gehören die Brustdrüsen und die
Gebärmutter, wo sie Wachstumsprozesse stimulieren. Eine erhöhte Exposition dieser
Organe durch antrophogene Estrogene kann möglicherweise von toxikologischer Bedeutung
sein. Besonders kritisch für eine umweltbedingte Estrogeneinwirkung ist die Embryonalphase
und die Kindheit, in der nur ein geringer endogener Estrogenspiegel vorliegt, und in der der
Organismus empfindlich auf äußere Einflüsse reagiert. Erhöhte Estrogenspiegel führen zu
Fehlfunktionen in der Gebärmutterschleimhaut, zu gestörten Zyklen und einer geringeren
oder fehlgesteuerten Fruchtbarkeit. In einer repräsentativen Studie mit 73 Frauen lag die
normale tägliche Ausscheidung von Estrogenen bei 106 µg/d E3, 14 µg/d E2 und 32 µg/d E1
(D’Ascenzo et al., 2003).
Die Wirkung der steroidalen Sexualhormone wird durch spezifische Rezeptoren, die zur
Gruppe der Steroidhormonrezeptoren gehören, vermittelt. Diese Rezeptoren befinden sich
im Inneren der Zelle. Die Steroidhormone gelangen durch Diffusionsvorgänge ins Zellinnere
und binden an die inaktive Form des Rezeptors, entweder im Zytoplasma oder im Zellkern
(Abbildung 3.3). Durch die Bindung des Hormons verändert der Rezeptor seine
Tertiärstruktur und wird aktiviert. Dabei werden bestimmte am Rezeptor angelagerte
Eiweißmoleküle (Heat-Shock-Proteine) abgestoßen, und der Bereich des Rezeptors, der sich
danach an die Desoxyribonukleinsäure (DNA) anlagert, wird frei. Im Zellkern lagert sich der
Rezeptor mit seiner DNA-Bindungsdomäne an bestimmte Stellen der DNA, den sog.
Response Elements (ERE = estrogen response element) an. Durch die Bildung des
aktivierten Rezeptor-Hormonkomplexes an die DNA wird die Transkription eines bestimmten
Gens stimuliert und die Neusynthese von Proteinen gestartet. Die klassische Wirkung von
Steroidhormonen besteht demnach in einer Änderung der Genexpression.
14 3 Antropogene und biogene Entstehung estrogen wirksamer Substanzen
Abbildung 3.3: Molekularer Mechanismus der Estrogenwirkung (Schlumpf et al., 1996); SR = Steroidrezeptor; Hsp = Hitzeschockprotein; ERE= estrogen responsive element; F = Fremdkörper
3.3.1 Metabolismus von 17β-Estradiol im menschlichen Körper
17β-Estradiol wird im menschlichen Körper überwiegend zu Estron und teilweise zu Estriol
hydroxyliert, mit Glucuronsäure oder Sulfat verestert oder methoxyliert, um so als Konjugate
über die Niere ausgeschieden werden zu können (Abbildung 3.4) (Bolt, 1979; Xu et al.,
2005). Die Konjugate sind weniger wirksam als die freien Estrogene. Estron wird
hauptsächlich als Estron-3-Sulfat und nicht als Glucuronid ausgeschieden (Schlumpf et al.,
1996).
3 Antropogene und biogene Entstehung estrogen wirksamer Substanzen 15
OH
OH
H
HH
OH
OH
H
HH
OH
OH
H
HH
O
OH
OH
H
HH
O
OH
H
HHOH
O
H
HHOH
O
OMe
H
HHOH
OH
O
H
HHOH
OH
OH
H
HHOH
OH
MeO
H
HHOH
OH
O
H
HH
OH
OH
OH
H
HH
O
OH
MeO
H
HHMeO
OH
H
HHOH
OH
OMe
H
HHOH
OH
OH
O
17ß-Estradiol
Estriol
Estron
16a-Hydroxyestron2-Hydroxyestron
Konjugation (Glucoronierung und Sulfatierung)
Ausscheidung (Urin)
4-Hydroxyestron
2-Hydroxyestron-3-methylether
2-Hydroxyestradiol 4-Methoxyestron
17-Epiestron
2-Methoxyestron
2-Methoxyestradiol4-Methoxyestradiol
16-Epiestriol16-Ketoestradiol
Abbildung 3.4: Metabolismus von 17β-Estradiol im menschlichen Körper (Bolt, 1979; Xu et al., 2005)
3.4 Synthetische Estrogene
Der Hauptteil der heutzutage hergestellten synthetischen Estrogene entfällt auf das 17α-
Ethinylestradiol (EE2), welches zur Kontrazeption eingesetzt wird und Hauptbestandteil der
sogenannten „Anti-Baby-Pille“ ist. In Deutschland werden jährlich ca. 50 kg EE2 (persönliche
Mitteilung Schering AG) produziert. Nach bestimmungsgemäßer Anwendung wird
überschüssiges EE2 mit dem Urin ausgeschieden. EE2 wird während der
Abwasserbehandlung nicht oder nur zum Teil entfernt und gelangt so in die
Oberflächengewässer. Durch Bioakkumulation verbleibt EE2 im Fettgewebe der Fische und
stellt somit eine zunehmende Gefährdung dar. Der Gehalt an EE2 in Regenbogenforellen,
16 3 Antropogene und biogene Entstehung estrogen wirksamer Substanzen
die unterhalb von Kläranlagenabläufen gehalten wurden, ist 104–106-fach höher als im
umgebenen Wasser (Larsson et al., 1999).
3.4.1 Metabolismus von 17α-Ethinylestradiol
Das synthetische Steroidhormon 17α-Ethinylestradiol (EE2) liegt im Plasma überwiegend als
3-Sulfat vor. Im Gegensatz zum natürlichen E2 ist beim EE2 der oxidative Angriff am 17-C-
Atom durch die Ethinylgruppe blockiert. Diese wurde eingeführt, um die pharmakologische
Wirkung von EE2 bei oraler Aufnahme zu gewährleisten und es vor einer enzymatischen
Spaltung im Magen zu schützen. Dadurch bedingt, sorgt die Ethinylgruppe bei nicht
resorbiertem EE2 für eine hohe Persistenz in der Umwelt.
OH
CH3 OH
H
HHOH
CH3 OH
H
HH
OH
OH
CH3 OH
H
HH
OH
Glc-O
CH3 OH
H
HH
OH
CH3 OH
H
HH
OCH3
O
CH3 OH
H
HHCH3
OH
CH3 OH
H
HHOS
O
OO
4-Hydroxy-EE2 17a-Ethinylestradiol (EE2)
2-Hydroxy-EE2EE2-3-Sulfat
EE2-3-Glucuronid
2-Hydroxy-3-methoxy-EE22-Methoxy-3-Hydroxy-EE2
D-Homoestrogene
16ß-Hydroxy-EE2
Estron bzw. Estradiol
6ß-Hydroxy-EE2
weitere Konjugation
Ausscheidung (Urin)
-
Abbildung 3.5: Metabolismus von Ethinylestradiol im menschlichen Körper (Bolt, 1979; Guengerich, 1990)
3 Antropogene und biogene Entstehung estrogen wirksamer Substanzen 17
Die wichtigste oxidative Metabolisierungsreaktion ist die 2- Hydroxylierung. Das 2-
Hydroxyethinylestradiol wird vor der Ausscheidung durch den Urin hauptsächlich sulfatisiert
und glucoronidiert (Bolt, 1979; Guengerich, 1990) oder durch das Enzym Catechol-O-
methyltransferase methoxyliert (Bolt, 1973). Eine direkte Glucuronidierung von EE2 wurde
ebenfalls beobachtet. Die Hydroxylate und Konjugate sind, ähnlich wie die Konjugate von
E2, weniger endokrin wirksam. Selten treten Hydroxylierung an der 4, 6α- und 6β-Position,
Bildung eines D-Ring-Homoestrogens und der Verlust der Ethinylgruppe auf. Eine 16α-
Hydroxylierung wie bei E2 wird nicht beobachtet, vermutlich spielt dort die Bildung des
Estrons als Vorläufer eine wichtige Rolle (Guengerich, 1990). Der Metabolismus von EE2 ist
in Abbildung 3.5 schematisch dargestellt.
18 4 Endokrine Wirkungen in der aquatischen Umwelt
4 Endokrine Wirkungen in der aquatischen Umwelt
Es wurden bereits in verschiedenen in vivo Studien mit unterschiedlichen Tierspezies wie der
Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss) (Thorpe et al., 2001), dem Japankärpfling
(Oryzias latipes) (Nozaka et al., 2004) und dem Zebrafisch (Danio rerio) (Segner et al., 2003;
Thorpe et al., 2003) endokrine Effekte festgestellt. Die physiologischen Auswirkungen der
estrogenen Substanzen auf die aquatischen Lebewesen und die Wirkschwellen-
konzentrationen waren unterschiedlich. Die lowest observed effect concentration (LOEC) für
die einzelnen Stoffe variierten je nach Entwicklungsstand und Geschlecht des Individuums
sowie nach Testsystem und Expositionsdauer. So wurden neben dem Anstieg des
Vitellogeninlevels, einem Eidotterprotein, das normalerweise nur von weiblichen Tieren
gebildet wird, teilweise Veränderungen in den Gonaden und eine Behinderung der
Spermatogenese beobachtet. In manchen Fällen kam es zu einer Reduktion oder totalen
Hemmung des Hodenwachstums (Metcalfe et al., 2001). Tabelle 4.1 gibt eine Übersicht über
die Wirksamkeit der endokrin wirksamen Substanzen in verschiedenen in vivo Tests.
Dabei fällt auf, dass steroidale estrogen wirksame Substanzen eine lowest observed effect
concentration zeigen, die ca. eine 10er Potenz niedriger ist, als die der Xenoestrogene. Die
Steroide liegen alle im unteren ng/L-Bereich. Eine Ausnahme bildet nur Estriol, das mit
einem LOEC von 0,75 µg/L (Metcalfe et al., 2001) einen relativ hohen LOEC zeigt. Die
Xenoestrogene NP und BPA liegen dagegen im µg/L-Bereich, OP sogar im mg/L-Bereich.
Damit ist die Gefahr, die von Xenoestrogenen ausgeht, wesentlich geringer, als die Gefahr,
die von Steroiden ausgeht. Allerdings werden Xenoestrogene in erheblich größeren Mengen
produziert und in die Umwelt freigesetzt, so dass sich die endokrine Wirkung aufsummiert.
Die meisten biologischen Testsysteme untersuchen, in wieweit die Substanzen einzeln in der
Lage waren, einen endokrinen Effekt zu stimulieren. Mischungen sind mit wenigen
Ausnahmen bisher noch nicht betrachtet worden. Rajapakse et al. und Silva et al. fanden
2002 heraus, dass bei einer Mischung von Estradiol und Xenoestrogenen die Wirkung
wenigstens additiv war, wenn sie nicht sogar potentiert wurde. Selbst unterhalb der no
observed effect concentration (NOEC) jeder einzelnen Komponente, ist die Mischung
effektiver, als es die simple Addition der Effekte der einzelnen Substanzen vermuten ließe.
Für die Zukunft wäre es nicht nur wünschenswert größere Bandbreiten von Mischungen zu
betrachten, um ein möglichst reales Abbild der Wirkungen zu erhalten, sondern auch durch
Wahl verschiedener Testspezies die nicht unerheblichen Unterschiede in der endokrinen
Wirkung zu untersuchen.
4 Endokrine Wirkungen in der aquatischen Umwelt 19
Tabelle 4.1: Übersicht über die beschriebenen LOEC Werte von EDCs und deren Effekte auf verschiedene Testorganismen
EDC Testorganismus LOEC Effekt Referenz NP Juvenile Regenbogenforellen
(Oncorhynchus mykiss) 6,1 µg/L Anstieg des
Vitellogeninlevels Thorpe et al., 2001
BPA Juvenile Zebrafische (Danio rerio)
375 µg/L Anstieg des Vitellogeninlevels
Segner et al., 2003
OP Japankärpfling (Oryzias latipes)
64,1 mg/L Anstieg des Vitellogeninlevels
Nozaka et al., 2004
E1 Juvenile Regenbogenforellen (Oncorhynchus mykiss)
44 ng/L Anstieg des Vitellogeninlevels
Thorpe et al., 2003
E2 Juvenile Regenbogenforellen (Oncorhynchus mykiss) Juvenile Regenbogenforellen (Oncorhynchus mykiss)
4,7 ng/L 9 ng/L
Anstieg des Vitellogeninlevels Anstieg des Vitellogeninlevels
Thorpe et al., 2001 Thorpe et al., 2003
E3 Japankärpfling (Oryzias latipes)
0,75 µg/L Verweiblichung
Metcalfe et al., 2001
EE2 Juvenile Zebrafische (Danio rerio) Juvenile Regenbogenforellen (Oncorhynchus mykiss)
1,67 ng/L 0,1 ng/L
Anstieg des Vitellogeninlevels Anstieg des Vitellogeninlevels
Segner et al., 2003 Thorpe et al., 2003
20 5 Verhalten von EDCs im Abwasserreinigungsprozess
5 Verhalten von EDCs im Abwasserreinigungsprozess
5.1 Vorkommen und Elimination von endokrin wirksamen Substanzen in der Kläranlage
Im Menschen werden die Estrogene meist renal zu polareren Verbindungen degradiert und
mit dem Urin als Glucuronid oder Sulfat ausgeschieden. Diese Substanzen haben zwar ein
geringeres endokrines Potential als die Ausgangssubstanzen, aber durch die β-
Glucuronidase coliformer Bakterien werden die Glucuronide bereits auf dem Weg in die
Kläranlage wieder in ihre unkonjugierte, und damit potentere, Form zurückverwandelt
(D’Ascenzo et al., 2003; Desbrow et al., 1998).
E2 wird während des Klärprozesses zu E1 metabolisiert, welches im Kläranlagenablauf in
größeren Konzentrationen vorkommt als E2. E1 selber wird hauptsächlich als Sulfat
ausgeschieden, das persistenter ist als die Glucuronide (Baronti et al., 2000). Das Estron-3-
Sulfat wird erst im Laufe des biologischen Reinigungsprozesses gespalten, so dass nur ein
unvollständiger Abbau des Estrons möglich ist.
Aufgrund der Persistenz von EE2 und seiner niedrigen Wirkschwelle ist auf EE2 im
Abwasserreinigungsprozess ein besonderes Augenmerk zu legen.
Im Gegensatz zu den Steroidhormonen werden die Xenoestrogene NP, OP und BPA
unmetabolisiert in die Kläranlagen eingetragen, oder im Fall von NP und OP entstehen sie
erst teilweise während des Abwasserreinigungsprozesses durch Abbau der entsprechenden
Ethoxylate (siehe Abschnitt 3.1.1).
Neben den menschlichen Ausscheidungen sind auch Industrieabwässer Quellen endokrin
wirksamer Substanzen. In den Kläranlagen werden die endokrin wirksamen Substanzen
mineralisiert oder aber nur teilweise abgebaut oder am Klärschlamm adsorbiert. Ein Großteil
aber wird nicht ausreichend entfernt und gelangt so über die Kläranlagenabflüsse in die
Oberflächengewässer – teilweise sogar noch in ökologisch relevanten Konzentrationen.
In den Gewässern werden sie an Suspenser oder im Sediment adsorbiert. Durch
Strömungen kann es zu einer Resuspendierung kommen. Einen Überblick über das
Vorkommen von EDCs in Kläranlagenzu- und –abläufen (Tabelle 5.1), in Schlämmen
(Tabelle 5.2) und Sedimenten (Tabelle 5.3) ist in den folgenden Tabellen zu sehen.
Die Konzentrationen von endokrin wirksamen Substanzen in Kläranlagenzu- und –abläufen
(Tabelle 5.1) sind abhängig vom Untersuchungsort und –zeitpunkt sehr unterschiedlich.
Insbesondere hat sich der Gehalt an Nonylphenol seit Ende der 90er Jahre deutlich
verringert. So wiesen Snyder et al., 1999 noch bis zu 37.000 ng/L Nonylphenol in einem
Kläranlagenablauf in den USA nach. 2005 wiesen Lee et al. in kanadischen
5 Verhalten im Abwasserreinigungsprozess 21
Kläranlagenabläufen nur noch bis zu 3.210 ng/L und damit ungefähr eine 10er Potenz
weniger Nonylphenol nach. Dieser Rückgang wird wahrscheinlich durch einen
weitestgehenden Verzicht auf Nonylphenolethoxylate in Wasch- und Reinigungsmitteln
verursacht. Eine Abhängigkeit der weiteren sechs endokrin wirksamen Substanzen vom
Untersuchungsort bzw. –zeitpunkt ist nicht zu sehen.
Auffällig ist, dass für EDC-Gehalte in Kläranlagenzuläufen wesentlich weniger Daten
vorliegen als für EDC-Gehalte in Kläranlagenabläufen. Dies ist wahrscheinlich darin
begründet, dass die zugrunde liegenden analytischen Methoden nicht in der Lage waren,
das, in Vergleich zu den Abläufen, erhöhte Matrixaufkommen in den Zuläufen zu bewältigen.
Tabelle 5.1: Konzentrationen von endokrin wirksamen Substanzen in Kläranlagenzu- und –abläufen
Analyt Konzentration
Kläranlagenzulauf [ng/L]
Konzentration Kläranlagenablauf
[ng/L]
Land
Referenz
NP 25.000–33.000
82.000 57.640 10.000
2.720–25.000
16.000 171–37.000
331–956 <1.000–33.000
12.000 650
1.000 426–4.926 320–3.210
USA USA
Deutschland USA
Spanien Spanien Japan USA
Kanada
Rudel et al., 1998 Snyder et al., 1999
Spengler et al., 1999 Hale et al., 2000
Petrovic et al., 2001 Planas et al., 2002 Onda et al., 2003
Drewes et al., 2005 Lee et al., 2005
BPA 94–150
10.000–37.000 193–2.440
550
210–2.400
20–55 83,1–126
n. d.–2.500 31–223 18–702
140 n. d.–50 20–450
USA Deutschland Österreich
Kanada Deutschland
Japan USA
Kanada
Rudel et al., 1998 Spengler et al., 1999 Fürhacker et al., 2000
Lee et al., 2000 Fromme et al., 2002
Onda et al., 2003 Drewes et al., 2005
Lee et al., 2005
OP 200–740
3.900
380–3.560
150 n. d.–673
1.200 n. d.–180 10–470
USA USA
Spanien USA
Kanada
Rudel et al., 1998 Snyder et al., 1999 Petrovic et al., 2001 Drewes et al., 2005
Lee et al., 2005 n. d. = non detectable (nicht nachweisbar)
22 5 Verhalten von EDCs im Abwasserreinigungsprozess
Fortsetzung Tabelle 5.1: Konzentrationen von endokrin wirksamen Substanzen in Kläranlagenzu- und –abläufen
Analyt
Konzentration Kläranlagenzulauf
[ng/L]
Konzentration Kläranlagenablauf
[ng/L]
Land
Referenz
E1
25–132 1,6–18
54,9-76,6 44 51
7,3–75
19–78 8–52
1,4–76 <0,4–47
n. d.–16,8 2,5–82
<1 17 16
0,5–8,6 0,6–50,4
1–96 <1–54
GB Niederlande Deutschland
Italien ?
Deutschland Italien Japan
Deutschland USA
Kanada Kanada
Desbrow et al., 1998 Belfroid et al., 1999
Spengler et al., 1999 Baronti et al., 2000
Ferguson et al., 2001 Andersen et al., 2003 D’Ascenzo et al., 2003
Onda et al., 2003 Joss et al., 2004
Drewes et al., 2005 Servos et al., 2005
Lee et al., 2005
E2
4,0–25 0,77–6,4 12,2–19,5
11 37
4,9–11
2,4–26 3–22
2,7–48 <0,6–12
0,477–3,66 n. d.–4,4 0,41–3,5
<1 1,6 0,8
<0,5–1,0 <0,6–6
0,2–14,7 <1–2
GB Niederlande
USA Deutschland
Italien ?
Deutschland Italien Japan
Deutschland USA
Kanada Kanada
Desbrow et al., 1998 Belfroid et al., 1999 Snyder et al., 1999
Spengler et al., 1999 Baronti et al., 2000
Ferguson et al., 2001 Andersen et al., 2003 D’Ascenzo et al., 2003
Onda et al., 2003 Joss et al., 2004
Drewes et al., 2005 Servos et al., 2005
Lee et al., 2005
E3 24–188 72 580
0,44–18 2,3 3,6
<1–4,9
Italien Italien Japan USA
Baronti et al., 2000 D’Ascenzo et al., 2003
Onda et al., 2003 Drewes et al., 2005
EE2
4,0–13 6,2–10,1 0,7–5,2
n. d.–7,0 <0,2–7,5
n. d.–0,759 n. d.–2,0 n. d.–1,7
<1 <0,5 <0,7
GB Niederlande
USA Deutschland
Italien Deutschland Deutschland
USA
Desbrow et al., 1998 Belfroid et al., 1999 Snyder et al., 1999
Spengler et al., 1999 Baronti et al., 2000
Andersen et al., 2003 Joss et al., 2004
Drewes et al., 2005 n. d. = non detectable (nicht nachweisbar)
5 Verhalten im Abwasserreinigungsprozess 23
Bei einem Vergleich der Konzentrationen von endokrin wirksamen Substanzen im Abwasser
mit den in Tabelle 4.1 beschriebenen LOEC-Werten, wird ersichtlich, dass von den
untersuchten Abwässern zwar keine akute Gefahr ausgeht, dennoch liegen die
Konzentrationen in kritischen Bereichen. Im Sinne des vorsorglichen Umweltschutzes ist es
deshalb wichtig, die Konzentrationen von endokrin wirksamen Substanzen in
Kläranlagenabläufen weiter zu verringern.
Die meisten Daten für den Gehalt an endokrin wirksamen Substanzen in Klärschlämmen
(Tabelle 5.2) liegen für Nonylphenol vor. Durch die relativ hohe Lipophilität des Nonylphenols
wird Nonylphenol bevorzugt am Schlamm adsorbiert. Dies schlägt sich in den gefundenen
hohen Konzentrationen nieder. Durch die Komplexizität der Matrix verursacht, war es erst
einer Arbeitsgruppe um Ternes und Andersen gelungen, Estron, Estradiol und
Ethinylestradiol in Klärschlämmen nachzuweisen. Estriol ist bisher in Klärschlämmen noch
nicht untersucht worden.
Tabelle 5.2: Konzentrationen von endokrin wirksamen Substanzen in Schlämmen
Analyt
Konzentration Schlamm [µg/kg TS]
Land
Referenz
NP 255.600–823.500 41.100–470.000
243.900 25.000–600.000
172.000 <125–4.590
GroßbritannienKanada Taiwan Spanien Spanien
Deutschland
Sweetman, A.J., 1994Lee et al., 1995 Lin et al., 1999
Petrovic et al., 2000 Petrovic et al., 2001 Meesters et al., 2002
BPA 197–12.500 4–1.363
<125–780
Kanada Deutschland Deutschland
Lee et al., 2000 Fromme et al., 2002 Meesters et al., 2002
OP 910–9.200 7.500
Kanada Spanien
Lee et al., 1995 Petrovic et al., 2001
E1 16–37 22,8–27,8
Deutschland Deutschland
Ternes et al., 2002 Andersen et al., 2003
E2 5–49 4,9–5,4
Deutschland Deutschland
Ternes et al., 2002 Andersen et al., 2003
E3 noch nicht untersucht
EE2 2–17 <1,5
Deutschland Deutschland
Ternes et al., 2002 Andersen et al., 2003
Da ein Teil der endokrin wirksamen Substanzen bereits durch Mineralisation oder Adsorption
am Schlamm aus dem Abwasser entfernt wird, sind die Konzentrationen von endokrin
wirksamen Substanzen in Sedimenten (Tabelle 5.3) insgesamt niedriger als in Schlämmen.
24 5 Verhalten von EDCs im Abwasserreinigungsprozess
Da Sedimente während des analytischen Prozesses einfacher zu händeln sind als
Schlämme, liegen für Sedimente bereits mehr Daten vor. Auch Estriol wurde von Mibu et al.,
2004 bereits untersucht. Es konnte allerdings nicht nachgewiesen werden.
Tabelle 5.3: Konzentrationen von endokrin wirksamen Substanzen in Sedimenten
Analyt
Konzentration Sediment [µg/kg TS]
Land
Referenz
NP <5–12.400 10–259
17.000–1.378.000 <1–1.040 <15–590 27–430 n. d.–46
2–5 11,8–21.000
44–567
USA Deutschland Deutschland
Korea Spanien
Deutschland Japan
GroßbritannienJapan Italien
Hale et al., 2000 Bolz et al., 2001
Heemken et al., 2001 Khim et al., 2001
Petrovic et al., 2001 Stachel et al., 2003
Kawahata et al., 2004 Liu et al., 2004
Mibu et al., 2004 Vitali et al., 2004
BPA <0,5–15 66.000–343.000
<1–53,5 <10–40 10–380 n. d.–13
5–9
Deutschland Deutschland
Korea Spanien
Deutschland Japan
Großbritannien
Bolz et al., 2001 Heemken et al., 2001
Kim et al., 2001 Petrovic et al., 2001 Stachel et al., 2003
Kawahata et al., 2004 Liu et al., 2004
OP <0,5–8 <1–120 <10–204
2–12
Deutschland Korea
Spanien Großbritannien
Bolz et al., 2001 Kim et al., 2001
Petrovic et al., 2001 Liu et al., 2004
E1 11,9 3–7
<0,05–3,5 0,16–1,17
Spanien Großbritannien
Japan Australien
Lopez de Alda et al., 2002Liu et al., 2004
Mibu et al., 2004 Braga et al., 2005
E2 2–4 n. d.
0,22–2,48
GroßbritannienJapan
Australien
Liu et al., 2004 Mibu et al., 2004 Braga et al., 2005
E3 n. d. Japan Mibu et al., 2004
EE2 22,8 n. d. 2–12
< 0,05–0,5
Spanien Japan
GroßbritannienAustralien
Lopez de Alda et al., 2002Mibu et al., 2002 Liu et al., 2004
Braga et al., 2005 n. d. = non detectable (nicht nachweisbar)
5 Verhalten im Abwasserreinigungsprozess 25
5.2 Sorption am Schlamm
Wenn man das Verhalten von endokrin wirksamen Stoffen während der
Abwasserbehandlung erklären will, muss man die Sorption an Schlamm ebenfalls mit
einbeziehen. Die meisten bisherigen Untersuchungen beziehen sich allerdings auf die
Konzentrationen in der Wasserphase. Studien über den Verbleib im Schlamm oder Sediment
scheiterten bisher meist noch an der unzureichenden chemischen Analytik. Somit ist keine
gleichzeitige Bilanzierung für alle sieben, in dieser Arbeit untersuchten, endokrin wirksamen
Substanzen über den gesamten Abwasserreinigungsprozess möglich.
Betrachtet man die log KOW- und die log KOC-Werte der einzelnen Substanzen (Tabelle 5.4),
wird deutlich, dass insbesondere NP, OP und EE2 eine starke Neigung zur Sorption an
Schlamm haben.
Tabelle 5.4: Physikalische Stoffgrößen von endokrin wirksamen Substanzen
Analyt Molmasse [g/mol]
log KOW log KOC Referenz
NP 220,36 3,28-4.48 4,7-5,6 Rippen, 1998 ; Seleka et al., 1999
BPA 228,29 3,4 2,50-3,18 Staples et al., 1998
OP 206,33 4,12 3,91 Ahel et al., 1993, Ferguson et al., 2001
E1 270,38 3,43 3,5 Lai et al., 2000
E2 272,39 3,94 3,5 Lai et al., 2000
E3 288,39 2,81 3,5 Lai et al., 2000
EE2 296,41 4,15 3,8 Lai et al., 2000 log KOW = Octanol – Wasser – Verteilungskoeffizient
log KOC = organic carbon – Wasser – Verteilungskoeffizient im Boden
26 6 Verfahren zur analytischen Bestimmung von EDCs in Umweltproben
6 Verfahren zur analytischen Bestimmung von EDCs in Umweltproben
6.1 Chemisch-analytische Bestimmungsverfahren
Um Xenoestrogene und Steroidhormone in Spurenkonzentrationen im Abwasser chemisch-
analytisch detektieren und quantifizieren zu können, sind sehr empfindliche instrumentelle
Nachweismethoden mit aufwendiger Probenvorbereitung erforderlich. Die Art der
Probenvorbereitung ist aufgrund der Komplexität der Matrix und der geringen Konzentration
der Analyten in der Probe von großer Bedeutung. Dabei bestehen die Bestimmungs-
methoden meist aus den Teilschritten Extraktion, Abtrennung störender Matrixbestandteile,
Derivatisierung und chromatographische Trennung mit anschließender Detektion.
Die Tabellen 6.1–6.3 geben einen Überblick über die derzeit in der Literatur vorhandenen
Methoden zur Bestimmung von endokrin wirksamen Substanzen aus Abwässern,
Klärschlämmen und Sedimenten.
In den folgenden Abschnitten werden diese beschriebenen Bestimmungsmethoden,
eingeteilt in ihre Teilschritte, näher beschrieben.
6.1.1 Extraktion
Zur Anreicherung von EDCs aus flüssigen Proben wird häufig eine flüssig/flüssig-Extraktion
mit Dichlormethan (Wahlberg et al.; 1990, Shin et al., 2001; Rinken, 2002; Cathum et al.,
2001) oder Ethylacetat (Mol et al., 2000) angewendet oder auf den Gebrauch
unterschiedlicher Festphasen zurückgegriffen. Am häufigsten wird dazu eine C18-Festphase
(Pendersen et al., 1999; Mol et al., 2000; Kojima et al., 2005; Jeannot et al., 2002; López de
Alda et al., 2000; Bolz et al., 2000; Ingrand et al., 2003; Spengler et al., 1999) oder
verschiedene Polymerphasen wie Oasis HLB (Quintana et al., 2004; Jeannot et al., 2002;
Laganà et al., 2004; Komori et al., 2004; Hernando et al., 2004), SDB-RPS (Inoue et al.,
2002) und PLRP-s (López-Roldán et al., 2004) verwendet.
Zur Extraktion aus Klärschlämmen oder Sedimenten werden abhängig von den
nachzuweisenden Analyten verschiedenste Methoden eingesetzt. Für NP zeigt die
Wasserdampfdestillation (Sweetman, 1994) gute Ergebnisse, sollen aber gleichzeitig BPA
und OP mit extrahiert werden, wird meist auf eine Soxhletextraktion mittels Cyclohexan
(Naassner et al., 2002) oder Dichlormethan (Chalaux et al., 1994, Li et al., 2003, Hale et al.,
2000) zurückgegriffen. In neueren Verfahren wird die sogenannte accelerated solvent
6 Verfahren zur analytischen Bestimmung von EDCs in Umweltproben 27
extraction (ASE) angewendet. Dieses Verfahren ist in der Literatur zusätzlich unter der
Bezeichnung pressurized liquid extraction (PLE) bekannt. Dieses Verfahren hat gegenüber
der Soxhletextraktion den Vorteil in wesentlich kürzerer Zeit und mit höherer
Extraktionsausbeute durchführbar zu sein. Als Lösungsmittel wird hier
Ethylacetat/Ameisensäure (Meesters et al., 2002) oder Dichlormethan (Li et al., 2003; Hale
et al., 2000) verwendet.
In der einzigen bisher beschriebenen Methode zur Bestimmung von Steroidhormonen aus
Schlämmen wird eine Ultraschallextraktion mit einer Folge von unterschiedlichen
Lösungsmitteln verwendet (Ternes et al., 2002).
6.1.2 Abtrennung störender Matrixbestandteile (clean – up)
Bei den Methoden zur Bestimmung endokrin wirksamer Stoffe aus Abwässern werden
meistens keine zusätzlichen Maßnahmen zur Abtrennung störender Matrixbestandteile
durchgeführt. In einigen Fällen wird Kieselgel (Quintana et al., 2004, Cathum et al., 2001;
Spengler et al., 1999) oder Florisil (Ingrand et al., 2003) verwendet.
Bei Schlämmen und Sedimenten dagegen ist aufgrund der größeren Menge mit extrahierter
Matrix immer eine Reinigung notwendig. Dabei reicht die Bandbreite von Adsorbentien wie
Aluminiumoxid (Chalaux et al., 1994; Meesters et al., 2002) oder modifiziertem Kieselgel
(Ferguson et al., 2000) bis zu aufwendigen aparativen Methoden mittels Gelpermeations-
chromatographie (GPC) (Ternes et al., 2002; Hale et al., 2000) oder präparativer HPLC
(Sweetman, 1994).
6.1.3 Derivatisierung
Eine Derivatisierung wird meist dann durchgeführt, wenn sich hochauflösender GC-
Methoden, die eine unzersetze Flüchtigkeit der Analyten voraussetzen, anschließen.
Dadurch werden die Moleküle flüchtiger und stabiler. Eine Reihe verschiedener
Derivatierungsreagenzien lassen sich dafür einsetzen. Entweder erfolgt eine Silylierung
mittels unterschiedlicher Reagenzien (Quintana et al., 2004; Mol et al., 2000; Jeannot et al.,
2002; Spengler et al., 1999; Hernando et al., 2004; Ternes et al., 2002; Li et al., 2003) oder
eine Acetylierung mit fluorhaltigen Reagenzien (Rinken, 2002; Croley et al., 2000; Chalaux et
al., 1994; Wahlberg et al., 1990; Kojima et al., 2005; Cathum et al., 2001). Als Beispiel ist in
Abbildung 6.1 die Acetylierung von NP zu sehen. Die dabei ablaufende Reaktion stellt eine
Veresterungsreaktion dar.
28 6 Verfahren zur analytischen Bestimmung von EDCs in Umweltproben
H19C9 OH
O
O O
OH19C9 Ac+
F(2x+1)Cx CxF(2x+1)
+
x=1-3
Ac2O AcOH
Ac2O =
Abbildung 6.1: Reaktionsgleichung der Derivatisierung von NP mittels fluorhaltiger Anhydride
In einer weiteren Studie wurde eine Methylierung mittels Phenyltrimethylammoniumhydroxids
(Bolz et al., 2000) durchgeführt.
6.1.4 Chromatographische Trennung und anschließende Detektion
Für die Spurenanalyse der endokrin wirksamen Substanzen erfolgt die chromatographische
Trennung entweder mittels gaschromatographischer oder flüssigchromatographischer
Verfahren in Verbindung mit massenspektrometrischer und/oder tandemmassen-
spektrometrischer, d.h. letztendlich, mittels substanzspezifischer Detektion. Einige wenige
Methoden nutzen auch nicht substanzspezifische Detektionsverfahren wie die
Flammenionisationsdetektion (FID) (Hale et al., 2000), die electron capture detection (ECD)
(Wahlberg et al., 1990; Chalaux et al., 1994) oder die Bestimmung mittels eines
Stickstoff/Phosphor selektivem Detektors nach Derivatisation mit Bromacetonitril (Shin et al.,
2001). In Verbindung mit der HPLC wurde auch eine Fluoreszenzbestimmung beschrieben
(Naassner et al., 2002).
6 Verfahren zur analytischen Bestimmung von EDCs in Umweltproben 29
30 6 Verfahren zur analytischen Bestimmung von EDCs in Umweltproben
6 Verfahren zur analytischen Bestimmung von EDCs in Umweltproben 31
32 6 Verfahren zur analytischen Bestimmung von EDCs in Umweltproben
6 Verfahren zur analytischen Bestimmung von EDCs in Umweltproben 33
34 6 Verfahren zur analytischen Bestimmung von EDCs in Umweltproben
6 Verfahren zur analytischen Bestimmung von EDCs in Umweltproben 35
6.2 Biologische Wirktests
Eine weitere Möglichkeit endokrin wirksame Substanzen nachzuweisen, ist die Verwendung
biologischer Wirktests. Dabei werden allerdings die endokrin wirksamen Substanzen nicht
als Einzelsubstanz identifiziert und quantifiziert, sondern als Summe der Wirkungen der
Einzelsubstanzen erfasst. Dazu können entweder in-vitro Testsysteme oder in-vivo
Testsysteme verwendet werden.
In-vitro Testsysteme:
In-vitro Verfahren zum Nachweis endokriner Stoffe nutzen zelluläre und subzelluläre
Systeme. Soto et al. (1995) entwickelten beispielsweise den als „E-Screen“ bekannten
Assay, der auf der estrogensensitiven Brustkrebszelllinie MCF-7 basiert. In diesem Test wird
die Veränderung der Zellzahl nach einer Induktionszeit von vier bis sechs Tagen erfasst. Zu
den zellulären in-vitro Verfahren zählen auch Reportergen-Assays. Hierzu werden
rekombinate Zelllinien eingesetzt, die sowohl den Hormonrezeptor exprimieren als auch den
Teil der Signaltransduktion enthalten, die mit einem estrogeninduzierbaren Reportergen
verknüpft ist. Die Messungen erfolgen über die Ermittlung von Reporterenzym-Aktivitäten,
z.B. von Luciferase oder ß-Galactosidase. Subzelluläre Testverfahren nutzen die Bindung
von Analyten an Hormonrezeptoren. Eine gängige Variante sind die radioaktiven
Rezeptorassays. Dabei konkurriert der zu messende Analyt mit einem radioaktiv markierten
Liganden um die Bindungsstelle des Rezeptors. Die Rezeptoren stammen entweder aus
Gewebeextrakten von Säugetieren oder werden rekombinant hergestellt. Das einfachste
subzelluläre Testsystem zum Nachweis estrogener Wirkstoffe ist der enzyme-linked
receptorassay (ELRA) (Seifert et al., 1999) bei dem der Estrogenrezeptor (ER) als
Bindungsprotein für estrogene Wirkstoffe eingesetzt wird. Hier konkurrieren die estrogenen
Wirkstoffe der Probe mit einem Beschichtungskonjugat (Estradiol-Rinderserumalbumin) um
die freien ER-Bindungstellen. Gemessen wird die Menge des an die Festphase gebundenen
Rezeptors; sie lässt sich mit Hilfe eines rezeptorspezifischen Antikörpers erfassen. In einem
weiteren Inkubationsschritt wird dieser Antikörper von einem Sekundärantikörper, der mit
dem Enzym Peroxidase gekoppelt ist, erkannt. Der Umsatz eines Farbstoff- oder
Lumineszenzsubstrats durch dieses Enzym kann im Plattenphotometer detektiert werden.
Bei diesem Verfahren kann wie bei den radioaktiven Rezeptorassays nicht zwischen
Agonisten und Antagonisten unterschieden werden. Allerdings wird die Summe aller
rezptorbindenden Substanzen richtig wiedergegeben, so dass der Assay für das
Umweltmonitoring gut geeignet ist. Nicht erfasst werden Substanzen, die in die
36 6 Verfahren zur analytischen Bestimmung von EDCs in Umweltproben
Estrogensynthese oder den –abbau eingreifen, sowie Effekte, die durch Veränderungen der
Estrogen-Signal-Transduktionskette entstehen (Hock et al., 2000).
In-vivo Testsysteme:
In-vivo Testsysteme zeichnen sich durch ihre große Aussagekraft aus, haben aber auch alle
Nachteile typischer Biotestverfahren: Lange Testdauer, ggf. über Tage oder Wochen, sowie
hohe Streuungen aufgrund der Inhomogenität des biologischen Materials. Zudem benötigen
in-vivo Testsysteme Versuchstiere. Die am häufigsten eingesetzten Methoden zur in-vivo
Erfassung estrogener Wirkstoffe nutzen Veränderungen vom Uterusgewicht bei Säugetieren
(Laws et al., 2000). Eine weitere Methode ist die Erfassung von Biomarkern als Indikatoren
für eine Estrogenexposition. Das bekannteste Beispiel ist der Nachweis von Vitellogenin,
einem, normalerweise nur von weiblichen Tieren gebildetem Eidotterprotein, bei männlichen
Fischen. Das Vorhandensein dieses Proteins gilt als sicherer Hinweis für eine
Estrogenexposition (Thorpe et al., 2001; Segner et al., 2003).
7 Material und Methoden zur Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen 37
7 Material und Methoden zur Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen
7.1 Vorversuche
Bevor die ausgewählten endokrin wirksamen Substanzen (Nonylphenol, Bisphenol A,
Octylphenol, Estron, 17β-Estradiol, Estriol und 17α-Ethinylestradiol) aus verschiedenen
Matrices isoliert und quantifiziert werden konnten, wurden zunächst in Vorversuchen eine
optimierte Derivatisierungsweise, eine gaschromatographische Trennmethode und die
Parameter zur massenspektrometrischen Detektion entwickelt.
7.1.1 Derivatisierung mittels fluorhaltiger Reagenzien
Die zu bestimmenden Analyten sind relativ polar und nur bedingt flüchtig. Deshalb ist es
nicht möglich, sie alle gleichzeitig ohne Vorbehandlung direkt gaschromatographisch zu
trennen. Durch eine für alle sieben Komponenten verwendbare Derivatisierung sollte die
Flüchtigkeit erhöht werden. In dieser Arbeit wurde eine Acetylierung mittels fluorhaltiger
Anhydriden gewählt. Da sich die Empfindlichkeit von Detektoren in Abhängigkeit des
Fluorgehaltes stark verändern kann, wurde die Derivatisierung mit den unterschiedlich stark
fluorierten Reagenzien Trifluoressigsäureanhydrid, Pentafluorpropionsäureanhydrid und mit
Heptafluorbuttersäureanhydrid getestet.
Dazu wurde eine sich in einem verschließbaren Glasröhrchen befindende Standardlösung
der sieben EDCs, gelöst in Aceton, zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wurde, unter der
Modifizierung der Methode von Choi et al. (1998) in 200 µL Acetonitril wieder aufgenommen
und mit 30 µL des jeweiligen Derivatisierungsreagenzes versetzt. Das Glasröhrchen wurde
dann verschlossen und zur Reaktion bei 60 °C in einen Metallblock-Thermostaten (Barkey,
Bielefeld) gestellt. Nach 30 min wurde die Reaktion durch Abblasen des überschüssigen
Derivatisierungsreagenzes und des Lösungsmittels im Stickstoffstrom bei 60 °C
unterbrochen. Die Dämpfe wurden mit Hilfe einer VakuUsog Saugpumpe (Gerhardt,
Königswinter) abgesaugt.
Um zu überprüfen, welche Derivate empfindlicher detektiert werden können, wurde eine
Stammlösung aus einer Mischung der sieben EDCs von je 20.000 ng/mL in Aceton
hergestellt. Aus dieser wurde durch Verdünnung mit Aceton eine Konzentrationsreihe mit
Konzentrationen von 0,2; 2; 20; 200; 2000 und 20.000 ng/mL hergestellt. Aus den
Ergebnissen wurde wie unter Abschnitt 7.2.6.3 genauer beschrieben, die jeweiligen
38 7 Material und Methoden zur Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen
Nachweisgrenzen bestimmt. Die Ergebnisse für die einzelnen Derivate wurden miteinander
verglichen.
7.1.2 Gaschromatographische Trennung mit massenspektrometrischer Identifikation zum Nachweis und zur Quantifizierung endokrin wirksamer Substanzen
Für die Identifizierung und Quantifizierung der ausgewählten EDCs wurde eine
gaschromatographische Trennungsmethode in Verbindung mit massenspektrometrischer
Detektion entwickelt. Für jede Substanz wurden zunächst einzeln die charakteristischen
Massenfragmente (m/z) ermittelt. Im Anschluss wurde die chromatographische Trennung
optimiert. In Tabelle 7.1 sind die optimierten Geräte- und Methodenparameter aufgeführt. Um
die Moleküle zu ionisieren wurde sowohl die positive Elektronenionisation (EI) als auch die
negative chemische Ionisation (NCI) verwendet und die Ergebnisse verglichen. Die
Ionisierungsparameter sind in Tabelle 7.1 einander gegenübergestellt.
Bei der Elektronenionisation wird die verdampfte Probe in der Ionenquelle mit einem Strahl
thermischer Elektronen der kinetischen Energie von 70 eV beschossen. Durch diese
Ionisation werden hauptsächlich Radikalkationen M+• (Molekülionen) gebildet (Cammann,
2001). Bei der Elektronenionisation wird generell Energie im Überschuss an die zunächst
gebildeten Molekülionen abgegeben. Dadurch kommt es zu zahlreichen Bindungsbrüchen.
Es entstehen relativ komplexe Massenspektren mit zahlreichen Fragmenten, aber häufig
ohne Molekülion. Das auf diese Weise erhaltene Fragmentierungsmuster, welches aufgrund
der charakteristischen Bindungungsenergien der Atome in einem definierten Molekül
zustande kommt, kann zur Identifikation der gesuchten Substanzen genutzt werden. Dies
läuft nach folgendem Schema ab:
M + e- → M+• + 2 e-
M+• → F+1+ N1
M+• → F+2+ N2 etc.
M = Molekül
M+• = Molekülion
e- = Elektron
F = Fragment
N = neutrales Fragment
7 Material und Methoden zur Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen 39
Tabelle 7.1: GC/MS-Bedingungen zur Bestimmung von EDCs aus Abwässern mittels EI- und NCI- Ionisation
Einstellung EI NCI Scan Time 1,76 s 0,82 s
electron multiplier voltage 1100 V 1700 V
Reaktionsgas - Methan
Autosampler Finnigan MAT A 200 S, San Jose, USA
Temperatur Injektor 250 °C
Trägergas Helium
Druck 40 cm/s konstant
Injektionsvolumen 2 µL (split 1:10)
Spülen der Spritze vor der Injektion mit Hexan 3 x 10 µL
Spülen der Spritze von der Injektion mit Probenmaterial
3 x 10 µL
Spülen der Spritze nach der Injektion 4 x 10 µL
Gaschromatograph Finnigan MAT, GCQ - Gaschromatograph
Säule Valcobond VB-5 fused silica; l =60 m; i.d. = 0,25 mm; Filmdicke = 0,25 µm
Temperaturprogramm 80 °C (3 min); 10 °C/min auf 280 °C (7 min)
Massenselektiver Detektor Finnigan MAT, GCQ – Massenspektrometer (ion Trap)
Tuning-Reagenz Perfluortributylamin (PFTBA)
Temperatur Transferline 275 °C
Temperatur Ionenquelle 200 °C
Detektionsmodus Full-Scan; Massenbereich 30 - 1000
Software zur Ergebnissauswertung XcaliburTM Version 1.2
emission current 250 µA
solvent delay 8 min
electron engergy 70 eV
Die negative chemische Ionisation stellt eine wesentlich sanftere Methode zur Ionisation dar.
Sie fragmentiert die zu untersuchenden Substanzen nicht oder nur geringfügig. Sie erzeugt
vor allem die häufig für eine Molmassenbestimmung gewünschten Molekülionen. Die
Ionisation erfolgt mit Hilfe eines Reaktantgases, meist Methan. Dieses wird zunächst ionisiert
und reagiert dann, durch Übertragung von Elektronen, mit den zu bestimmenden
Substanzen, wie in den folgenden Reaktionsgleichungen zu sehen ist.
CH4 + e- → CH4+• + 2 e-
CH4 + e- → CH3+• + e- + H- etc.
M + e- → M-
40 7 Material und Methoden zur Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen
Insbesondere für Substanzen mit einer hohen Elektronenaffinität, wie man sie z. B. bei
halogenhaltigen Substanzen findet, kann der NCI-Modus sehr selektiv und sensitiv sein
(Thermo Quest Finnigan, 1999).
7.1.3 Qualitative und quantitative Auswertung
Die graphische Auswertung erfolgt entweder als total ion chromatogram (TIC) oder als
reconstructed ion chromatogram (RIC). Beim TIC erfolgt die Auswertung über den gesamten
Massenbereich, während beim RIC nach der Messung gewünschte Massenfragmente
vorgegeben werden, deren Massenspuren dann selektiv angezeigt werden.
Die qualitative Identifizierung der Analyten erfolgte anhand der Retentionszeiten und anhand
evtl. erzeugter charakteristischer Massenfragmente (m/z). Zunächst wurden die
charakteristischen Fragmente, die für jedes Molekül spezifisch und selektiv sind, im EI-
Modus unter Verwendung des Full Scan–Modus bestimmt. Dabei wurden Scans über einen
m/z-Bereich von 30–1000 aufgenommen, so dass das gesamte Massenspektrum (Molekül-
und Produktionenspektrum) erkennbar war. Die quantitative Auswertung erfolgte meist mit
Hilfe der beiden signalintensivsten Massenfragmente. Die Intensität der Peakflächen dieser
Fragmentionen wurde im RIC-Modus bestimmt.
Zunächst sollte festgestellt werden, ob eine quantitative Auswertung mittels internem
Standard, der vor jeglichem Aufarbeitungsschritt zugegeben wird, möglich ist. Auf diese
Weise lassen sich die meisten Fehler bei der Probenaufbereitung korrigieren. Dazu gehören
Volumenfehler und Analytverluste bei der Aufarbeitung der Proben, Fehler bei der
Probenaufgabe (z.B. Dosierfehler oder Undichtigkeiten) werden kompensiert, Zersetzungen
im Trennsystem werden berücksichtigt und Schwankungen der Detektoranzeige werden
korrigiert. Der interne Standard kompensiert die möglichen Verluste durch Adsorption an
Glaswänden, Einschluss in Matrixbestandteile, Verluste beim Einengen mit Stickstoff etc.
während des gesamten Analysengangs. Das Prinzip besteht darin, dass zu der zu
analysierenden Probe vor der Aufarbeitung eine definierte Konzentration einer als „interner
Standard“ dienenden Substanz zugefügt wird. Idealerweise sollte dieser den zu
bestimmenden Verbindungen möglichst ähnlich sein bzw. sich bei der Aufarbeitung und
chromatographischen Trennung sehr ähnlich wie diese verhalten, aber in der Probe auf
keinen Fall vorhanden sein und sich sauber von den Analyten trennen lassen. Hier bieten
sich insbesondere die mittels Stabilisotopen markierten deuterierten (2H) bzw. 13C-markierten
Homologen der Analyten an.
Da bei der Messung die Konzentration an zugegebenem internem Standard bekannt ist,
kann die Konzentration der zu bestimmenden Substanzen über die Verhältnisse der
Peakflächen berechnet werden. Der Detektor-Response (Intensität des Signals in Bezug zur
7 Material und Methoden zur Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen 41
injezierten Konzentration) kann jedoch für verschiedenartige Substanzen, selbst wenn sie
sich nur durch Isotopensubstitution unterscheiden, ggf. unterschiedlich sein. Dieser
Unterschied muss bei der Berechnung berücksichtigt werden. Dazu wird eine
Kalibrationslösung analysiert, die den internen Standard und die zu bestimmenden
Substanzen in definierten Konzentrationsverhältnissen zueinander enthält. Mit Hilfe der
erhaltenen Signale errechnet man den „Responsefaktor“ R, der das Verhältnis der
Peakfläche des internen Standards zur Peakfläche des Analyten beschreibt (Cammann,
2001).
xISTD
xISTD
FccFR
××
= Gleichung 1
R = Responsefaktor
ISTDF = Peakfläche interner Standard
xc = Konzentration zudotierter Analyt
ISTDc =Konzentration zudotierter interner Standard
xF = Peakfläche Analyt
Im Idealfall verhält sich der Analyt während des Analysengangs genauso wie der interne
Standard, so dass der Responsefaktor bei 1 liegt. In der Realität weicht der Wert aber
meistens von 1 ab. Wichtiger als ein Wert nahe 1 ist allerdings, dass der Responsefaktor
über mehrere Messungen konstant bleibt. Die für die einzelnen Analyten verwendeten
internen Standards sind in Tabelle 7.2 aufgelistet.
Tabelle 7.2: Verwendete interne Standards
Analyt interner Standard 4-Nonylphenol 4n-Nonylphenol
Octylphenol 4n-Nonylphenol
Bisphenol A Bisphenol A-d16
17β-Estradiol 17β-Estradiol-17-acetat
Estron 17β-Estradiol-17-acetat
Estriol 17β-Estradiol-17-acetat
17α-Ethinylestradiol 17β-Estradiol-17-acetat
Unter Verwendung eines internen Standards lässt sich die Konzentration der Analyten in der
Probelösung mit Hilfe folgender Gleichung (Cammann 2001) berechnen:
42 7 Material und Methoden zur Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen
RF
cFcISTD
ISTDxx ×
×= Gleichung 2
xc = Konzentration Analyt
xF = Peakfläche Analyt
ISTDc = Konzentration interner Standard
ISTDF = Peakfläche interner Standard
R = Responsefaktor
Sind die Schwankungen des Responsefaktors zu hoch, wird statt des internen
Standardverfahrens, die Quantifizierung mittels eines externen Standards gewählt. Dabei
analysiert man zum einen die Probe und separat dazu eine Lösung mit definierten
Konzentrationen an den zu bestimmenden Substanzen („Standardlösung“). Durch Vergleich
der Peakflächen in der Standardlösung und in der Probenlösung lassen sich die Gehalte in
der Probe errechnen. Unter der Voraussetzung, dass gleiche Probenvolumina injiziert
wurden, wird die Probenkonzentration im linearen Bereich der Messkurve nach folgender
Gleichung (Cammann 2001) berechnet:
STD
STDxx F
cFc ×= Gleichung 3
xc = Konzentration Analyt
xF = Peakfläche Analyt
STDc = Konzentration externer Standard
STDF = Peakfläche externer Standard
Bei der Quantifizierung mittels externem Standard ist es besonders wichtig, sehr exakt zu
arbeiten, um die nun möglichen Fehlerquellen, welche durch interne Standards kompensiert
werden, auszuschließen. Nach höchstens fünf Proben ist eine neue Standardlösung zu
injizieren, um eine evtl. Veränderung der Empfindlichkeit des Analysengerätes zu
berücksichtigen.
Sowohl bei der Quantifizierung mittels internem als auch externem Standard müssen
zusätzlich die individuellen Anreicherungs- oder Verdünnungsfaktoren berücksichtigt werden.
7 Material und Methoden zur Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen 43
7.2 Analytische Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen aus wässrigen Matrices
Die simultane chemische Analytik der ausgewählten sieben endokrin wirksamen Substanzen
setzt sich aus sieben verschiedenen Schritten zusammen, deren Fließschema in
Abbildung 7.1 gezeigt ist und die im Folgenden näher erläutert werden.
7.2.1 Probennahme und Probenvorbereitung
Die Proben wurden der Abwasserreinigungsanlage Aachen Soers entnommen. In dieser wird
überwiegend kommunales Abwasser in einer Mischwasserbehandlung zusammen mit dem
anfallenden Regenwasser gereinigt. Dazu kommt ein zusätzlicher Anteil an industriellem
Abwasser. Die Abwasserreinigung besteht aus einer mechanischen Reinigung, einer
biologischen Reinigung, einer weitergehenden Reinigung und einer Schlammbehandlung. Im
Anschluss wird der Ablauf in den Vorfluter, die Wurm, abgeschlagen (Stadt Aachen, 1998).
Die Proben wurden grundsätzlich in mit Aceton gereinigte Glasgefäße (4 Liter) gefüllt. Vor
Ort wurden die Probenahmegefäße zunächst mit einem kleinen Teil der Probe konditioniert,
die dafür verwendete Probenmenge wurde verworfen. Für eine qualifizierte Stichprobe
wurden 5 Probenaliquote in äquidistanten Zeitabständen innerhalb von 10 min in dasselbe
Probenahmegefäß gefüllt und gut geschüttelt (DIN 38402-11 (DEV A11)). Mit 15%-iger
Salzsäure wurde die Probe auf einen pH von 4-5 angesäuert, um eine mögliche bakterielle
Umsetzung der EDCs während des Transportes und der Anreicherung zu verhindern. Die
Proben wurden, wenn möglich, unmittelbar nach Eintreffen im Labor aufgearbeitet. War eine
direkte Aufarbeitung nicht möglich, wurden die Proben kühl (< 4°C) und dunkel gelagert. Die
Aufarbeitung erfolgte maximal einen Tag später, da ansonsten Veränderungen des
Probenmaterials nicht mehr auszuschließen waren.
44 7 Material und Methoden zur Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen
Festphasenextraktion an C18-Material
Elution mit Aceton
Reinigung an Kieselgel
Elution mit Aceton/Pentan (2:1), trocknen
Derivatisierung mittels Heptafluorbuttersäureanhydrids
GC/MS-Detektion
Probenahme (500 mL Zulauf bzw.
1000 mL Ablauf)
Abbildung 7.1: Fließschema der chemischen Analytik von EDCs aus Abwässern
7 Material und Methoden zur Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen 45
7.2.2 Festphasenextraktion
Zur automatischen Anreicherung der EDCs wurde eine Festphasenextraktion (solid phase
extraction – SPE) durchgeführt. Dazu wurde eine Zymark Autotrace SPE Workstation
(Hopkinton, USA) verwendet. Als SPE-Material wurden Octadecyl- (C18)-SPE-Säulen (J.T.
Baker, Niederlande) (Korngröße 47 - 60 µm, aktive Oberfläche 320 - 350 m2/g,
Kohlenstoffbelegung 7 %) verwendet. Entsprechend der zu extrahierenden Abwassermenge
wurden Säulenfüllungen von 500 und 1000 mg C18-Material verwendet.
Die Konditionierung der SPE Phase erfolgte bei einer Fließgeschwindigkeit von 2 mL/min
zuerst mittels 6 mL Aceton, im Anschluss mit 6 mL Methanol und zum Schluss mit 6 mL
demineralisiertem Wasser (Millipore). Um eine Verblockung des Festphasenmaterials zu
vermeiden wurden die Proben vor der Anreicherung durch einen Glasfaserfilter (∅ 150 mm,
Macherey Nagel, Deutschland) filtriert. Im Anschluss an die Konditionierung wurden die
Proben, 500 mL Zulauf, bzw. 1000 mL Ablauf mit einer Fließgeschwindigkeit von 15 mL/min
auf die Kartuschen geladen. Nachdem die Proben aufgebracht waren, wurden die
Kartuschen im Stickstoffstrom für 30 min getrocknet. Die Analyten wurden mit einem Fluss
von 2 mL/min mit 3 x 2 mL Aceton wieder eluiert. Das Eluat wurde bei 60 °C im Metallblock-
Thermostat im Stickstoffstrom auf ca. 0,5 mL eingeengt. Das SPE-Material wurde verworfen.
Die Anreicherungsparameter sind in Tabelle 7.3 zusammengestellt.
Tabelle 7.3: Anreicherungsparameter
Parameter Fließgeschwindigkeit [mL/min]
Volumen [mL]
Zeit [min]
Konditionierung 2 Aceton 6 Methanol 6
demineralisiertes Wasser 6
3 3 3
Anreicherung 10 Zulauf 500 Ablauf 1000
34 67
Trocknung 30
Elution 2 Aceton 3 x 2 3
7.2.3 Probenaufreinigung
Das eingeengte Eluat der Festphasenextraktion wurde manuell auf eine mit 1000 mg
Kieselgel gefüllte Säule (J.T. Baker, Niederlande) (Korngröße 47–60 µm, aktive Oberfläche
535 m2/g) gegeben, die zuvor dreimal mit je 1 mL Aceton/Pentan (2:1) konditioniert worden
war. Nachdem das Eluat auf das Kieselgel aufgezogen war, wurden die Analyten mit dreimal
46 7 Material und Methoden zur Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen
2 mL der gleichen Aceton/Pentan-Mischung eluiert. Das Eluat wurde in verschließbaren
Glasröhrchen aufgefangen und zur Trockene eingeengt. Das zur Reinigung eingesetzte
Säulenmaterial wurde verworfen.
7.2.4 Derivatisierung
In den Vorversuchen (siehe Abschnitt 7.1.1) hatte sich gezeigt, dass die Verwendung von
Heptafluorbuttersäureanhydrid (HFBAA) als Derivatisierungsreagenz bei der MS-Detektion
und der Quantifizierung die besten Ergebnisse lieferte (siehe Abschnitt 8.1.2). Deshalb
wurde HFBAA auch für die Derivatisierung der EDCs aus wässrigen Matrices verwendet.
Dazu wurde der mittels clean-up an Kieselgel (Abschnitt 7.2.4) gereinigte und im
Stickstoffstrom bis zur Trockene eingeengte Probenextrakt in 200 µL Acetonitril wieder
aufgenommen und mit 30 µL HFBAA versetzt. Nach 30 min Reaktionszeit bei 60 °C
Reaktionstemperatur wurde die Derivatisierung durch Abblasen im Stickstoffstrom
unterbrochen und der Rückstand in mindestens 100 µL Aceton wiederaufgenommen und
konnte so für die GC/MS-Analyse eingesetzt werden.
7.2.5 Durchführung der GC/MS-Analyse zur qualitativen und quantitativen Bestimmung
Die eingesetzen Parameter zur GC/MS-Analyse im EI-Ionisierungsmodus und die qualitative
sowie quantitative Auswertung sind in den Abschnitten 7.1.2 und 7.1.3 beschrieben.
7.2.6 Validierung der zur Bestimmung von EDCs aus wässriger Matrix eingesetzen Methode
Um die entwickelte Methode zur Bestimmung der ausgewählten endokrin wirksamen
Substanzen zu validieren, wurden die Wiederfindungen der Analyten, die Reproduzierbarkeit
der Bestimmungsmethode sowie die Nachweis- und Bestimmungsgrenzen der EDCs
ermittelt.
7.2.6.1 Bestimmung der Wiederfindungen
Um die Wiederfindungen der Analyten zu bestimmen wurde entmineralisiertes Wasser
(Millipore) sowie der Zulauf zur Kläranlage und der Ablauf der Nachklärung der Kläranlage
Aachen Soers mit den zu bestimmenden Analyten dotiert. Das Probenvolumen des
7 Material und Methoden zur Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen 47
entmineralisierten Wassers und des Ablaufs der Nachklärung betrug jeweils 4000 mL, das
mit 400 µL einer Stammlösung, gemischt aus den sieben EDCs, dotiert wurde. Die
Stammlösung enthielt ca. 100 µg/mL eines jeden Analyten, gelöst in Aceton. Es wurden
dreimal je 1000 mL wie oben beschrieben aufgearbeitet. Das Endvolumen der Probenlösung
vor Injektion in das GC/MS-System betrug 1000 µL.
Zur Bestimmung der Wiederfindung im Zulauf der Kläranlage wurden 2000 mL Zulauf mit
200 µL Stammlösung dotiert. Davon wurden dreimal 500 mL aufgearbeitet und ebenfalls auf
ein Endvolumen von 1000 µL angereichert. Parallel dazu wurde von der jeweiligen Matrix
eine Blindprobe aufgearbeitet, der nur die entsprechende Menge Aceton ohne EDCs
zugesetzt worden war. Der dadurch erhaltene Blindwert wurde von dem Probenwert
subtrahiert. Die mathematische Berechnung der Probenkonzentration folgt Gleichung 3. Die
Wiederfindung ergibt sich aus Gleichung 4.
100)(×
−=
dotiert
bx
cccW Gleichung 4
W = Wiederfindung [%]
xc = bestimmte Konzentration [µg/mL]
bc = Konzentration Blindwert [µg/mL]
dotiertc = zudotierte Konzentration [µg/mL]
Aus den drei bestimmten Werten wurde der Mittelwert gebildet.
7.2.6.2 Reproduzierbarkeit der Bestimmungsmethode
Unter der Reproduzierbarkeit einer Methode versteht man die „Wiederholbarkeit von
Messgrößen unter gleichen Bedingungen über die Zeit“ (Gottwald 1995). Die
Reproduzierbarkeit ist also eine Angabe, wie groß der Fehler einer Bestimmungsmethode
ist. Mathematisch lässt sich dies, als absolute Zahl, durch die Standardabweichung (s)
(Gleichung 5) ausdrücken.
( )1
2
−
−= ∑
nxx
s i Gleichung 5
s = Standardabweichung
ix = Messwert
x = Mittelwert über alle Messungen
n = Anzahl der Messungen
48 7 Material und Methoden zur Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen
Zur relativen Beurteilung, wird der Variationskoeffizient (V) verwendet (Gleichung 6).
%100×=xsV Gleichung 6
V = Variationskoeffizient in %
s = Standardabweichung
x = Mittelwert über alle Messungen
Um die Reproduzierbarkeit der Messergebnisse aus wässrigen Proben zu gewährleisten
wurden je 1000 mL demineralisiertes Wasser, Zulauf und Ablauf der Nachklärung mit ca.
20 µg der Substanzen dotiert und wie beschrieben aufgearbeitet. Die Proben wurden auf ein
Volumen von 1000 µL gestellt. Jede Probe wurde fünfmal gaschromatographisch getrennt
und die Inhaltstoffe massenspektrometrisch im EI- Modus detektiert. Die Reproduzierbarkeit
wurde aus den Mittelwerten der Peakflächen der EDC-Signale bestimmt.
7.2.6.3 Ermittlung der Nachweis- bzw. Bestimmungsgrenzen
Als Nachweisgrenze (NG) einer Methode wird der kleinste Messwert bezeichnet, bei dem die
Analyten gerade noch nachgewiesen werden können. Die Bestimmungsgrenze (BG) einer
Methode ist der kleinste Messwert, bei dem die Analyten noch quantifiziert werden können.
Für die Berechnung der NG und der BG der Analysenmethode wurde die
Kalibriergeradenmethode der DIN 32654 (1994) herangezogen. Dafür wurden
Kläranlagenzu- und -ablauf mit je 6 äquidistanten Analytkonzentrationen im Bereich der
Nachweisgrenze dotiert und versucht, die entsprechende Konzentrationen zu bestimmen.
Die Nachweisgrenzen der EDCs wurden nach folgender Gleichung berechnet:
xfx Q
xnm
tsNG2
:011++××= α Gleichung 7
f = n – 2 Freiheitsgrade
0xs = Verfahrensstandardabweichung
α:ft = Quantil der t-Verteilung für ƒ Freiheitsgerade mit einem Signifikanzniveau α
von 0,05
m = Anzahl der Messungen an der Analysenprobe
n = Anzahl der Messungen der Kalibrierproben
x = arithmetisches Mittel der Gehalte aller Kalibrierproben
xQ = Summe der Abweichungsquadrate von x bei der Kalibrierung.
7 Material und Methoden zur Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen 49
Für die Bestimmungsgrenze (BG) galt entsprechend:
( )x
NGfx Q
xxknm
tskBG2
:011 −×++×××= α Gleichung 8
f = n – 2 Freiheitsgrade
k = relative Ergebnisunsicherheit zur Charakterisierung der BG
(k = 3 angenommen, was einer Ergebnisungenauigkeit von 33,3 %
entspricht)
0xs = Standardabweichung des Verfahrens
α:ft = Quantil der t-Verteilung für ƒ Freiheitsgerade mit einem Signifikanzniveau α
von 0,05
m = Anzahl der Messungen an der Analysenprobe
n = Anzahl der Messungen der Kalibrierproben
NGx = Nachweisgrenze
x = arithmetisches Mittel der Gehalte aller Kalibrierproben
xQ = Summe der Abweichungsquadrate von x bei der Kalibrierung.
Gleichzeitig wurde in diesem Schritt die Linearität der Kalibriergeraden durch Bestimmung
der Korrelationskoeffizienten überprüft. Dieser wird wie folgt berechnet:
2
22
2
)()())((
⎟⎟
⎠
⎞
⎜⎜
⎝
⎛
−−∑
−−∑=
FFccFFccr
nn
nn Gleichung 9
2r = Korrelationskoeffizient
nc = Konzentration Analyt Nr. n (n = 1 - 6)
c = arithmetisches Mittel aus n Konzentrationen
nF = Peakfläche Analyt, verursacht durch Konzentration n
F = arithmetisches Mittel aus n Peakflächen
50 7 Material und Methoden zur Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen
7.3 Analytische Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen aus Klärschlämmen
Die chemische Analytik von EDCs aus Klärschlamm setzt sich aus den in Abbildung 7.2
übersichtsweise dargestellten Schritten zusammen, die im Folgenden näher erläutert
werden.
7.3.1 Vorversuche zur Probenaufreinigung
Da die Matrixeffekte der Schlammextrakte höher waren, als die der untersuchten Abwässer,
mussten für die vollständige Extraktion der EDCs aus Klärschlämmen noch effizientere
Extraktionsverfahren eingesetzt werden.
Aus diesem Grunde wurde zunächst 1 mL einer Standardlösung mit einer Konzentration von
ca. 20 µg/mL der ausgewählten EDCs, gelöst in Aceton, an verschiedenen Adsorbentien
(Tabelle 7.4) getestet und die Wiederfindungen bestimmt. Es sollte untersucht werden, ob
durch Vergrößerung der Adsorbensmenge bereits eine Auswirkung auf die Wiederfindung
der Analyten zu spüren war. Die Wiederfindungen wurden dann mit den Ergebnissen der
bisher für wässrige Matrices verwendeten Reinigung verglichen.
Da keine vorgefertigten chromatographischen Säulen käuflich zu erwerben waren, wurden
diese manuell gepackt. Dazu wurden Glassäulen mit einem Innendurchmesser von 1 cm
verwendet. Unten war die Glassäule mit einer Glasfritte (Porendurchmesser G0) versehen.
Auf diese wurde zunächst 1 cm Natriumsulfat gefüllt, dann das Adsorbens mit der
Lösungsmittelmischung eingeschlämmt, die auch später zur Elution genutzt wurde. Den
Abschluss bildete wiederum eine 1 cm dicke Schicht aus Natriumsulfat. War die
Laufmittelfront bis auf die Oberfläche des Natriumsulfates abgesunken, wurde die
Standardlösung aufgebracht. Nachdem diese bis auf die Oberfläche des Natriumsulfates
gesunken war, wurde das Elutionsmittel aufgebracht und eine Tropfgeschwindigkeit von ca.
1 Tropfen/s eingestellt. Die genaue Kombination der einzelnen Parameter ist in Tabelle 7.4
aufgeführt. Die Reinigungsleistung der unterschiedlichen Adsorbentzien in Verbindung mit
verschiedenen Elutionsmitteln wurde durch Bestimmung der Wiederfindungen der
zudotierten Analyten bestimmt.
7 Material und Methoden zur Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen 51
Zentrifugieren, gefriertrocknen,
mahlen
ASE-Extraktion
Probennahme ca. 5 L
Klärschlammsuspension
Anreicherung an
C18-Festphasenmaterial
Elution mit Aceton
Elution mit Aceton/Pentan (2:1), trocknen
Reinigung an Kieselgel
Derivatisierung mittels Heptafluorbuttersäureanhydrids
n
Abbildung 7.2: Fließschema der chem
GC/MS-Detektio
ische Analytik von EDCs aus Klärschlämmen
52 7 Material und Methoden zur Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen
Tabelle 7.4: Vorversuche zur chromatographischen Reinigung von Stadardlösungen
Probe Nr.
Adsorbens Menge [g]
Elutionsmittel (v/v)
Volumen [mL]
1 Kieselgel 5 Ethylacetat/Toluol 3 + 1
30
2 Kieselgel 5 Ether/Methanol/ Ameisensäure 1 + 1 + 0,05
20
3 Florisil 5 Ethylacetat/Toluol 3 + 1
30
4 Florisil 5 Ether/Methanol/ Ameisensäure 1 + 1 + 0,05
20
5 Aluminiumoxid 5 Ethylacetat/Toluol 3 + 1
30
6 Aluminiumoxid 5 Ether/Methanol/ Ameisensäure 1 + 1 + 0,05
20
7 Kieselgel 5 Aceton/Pentan 3 + 1
30
8 Kieselgel 5 Aceton/Pentan 2 + 1
30
9 Kieselgel 5 Aceton/Pentan 2 + 1
50
10 Kieselgel 5 Aceton/Pentan 1 + 1
30
11 Kieselgel 5 Aceton/Pentan 1 + 2
30
12 Kieselgel 5 Aceton/Pentan 1 + 3
30
13 Kieselgel 1 Aceton/Pentan 2 + 1
6
7.3.2 Vorversuche zur Derivatisierung
Um zu überprüfen, ob die für die wässrigen Proben verwendete Menge
Derivatisierungsreagenz von 30 µL ausreichend ist, oder ob durch die höheren
Konzentrationen an Matrix Interferenzen in Form von Mehr- oder Minderbefunden auftraten,
wurde ein Schlammextrakt mit je ca. 20 µg/mL der verwendeten EDCs, in Aceton gelöst,
dotiert. Die weitere Aufarbeitung erfolgte nach dem in Abschnitt 7.2.4 beschriebenen
Schema. Nur die Derivatisierung wurde mit unterschiedlichen Mengen
Derivatisierungsreagenz (20, 30, 40, 50, 60 und 70 µL) durchgeführt. Die Reaktionszeit und
–temperatur wurden bei 60 °C und 30 min belassen. Nach GC/MS-Detektion wurden die
7 Material und Methoden zur Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen 53
Wiederfindungen der EDCs bestimmt. Die Menge des Derivatisierungsreagenzes mit der
höchsten Wiederfindung wurde für die weitere Derviatisierung des Probematerials
verwendet.
7.3.3 Probenahme und Probenvorbereitung realer Proben
Der Kläranlage Aachen Soers wurden jeweils je 20 Liter Belebt- und
Faulschlammsuspension entnommen. Zur Sedimentation wurde die Klärschlammsuspension
für 1–3 h stehen gelassen. Das überstehende Abwasser wurde dekantiert und verworfen.
Die verbleibende Suspension aus Abwasser und Schlamm wurde in
Metallzentrifugenbehälter überführt und für 10 min bei 2000 U/min zentrifugiert (Heraeus
Christ GmbH, Osterode). Der Überstand wurde verworfen. Um einen mikrobiellen Abbau der
endokrin wirksamen Substanzen zu verhindern wurde den entwässerten Schlammproben
direkt nach der Zentrifugation 0,1 % Natriumazid zusetzt. Die Suspension wurde in den
folgenden 30min mehrfach manuell geschüttelt und im Anschluss auf - 86 °C gekühlt und
gefriergetrocknet. Konnten die Proben nicht direkt weiter bearbeitet werden, wurden die mit
Natriumazid stabilizierten Proben dunkel und kühl (< 4 °C) gelagert und innerhalb der
nächsten zwei Wochen weiterverarbeitet.
7.3.4 Herstellung von dotiertem Probematerial
Um eine Methode zur Analytik von EDCs aus Klärschlämmen zu entwickeln, musste
zunächst dotiertes Material mit bekannter Konzentration der EDCs hergestellt werden, da
kein Referenzklärschlamm mit allen sieben EDCs käuflich zu erwerben war. Die Herstellung
folgte weitgehend dem von Meesters et al. (2002) publiziertem Verfahren.
Die Probenahme und die Probenvorbereitung wurde bereits unter 7.3.3 beschrieben. Nach
der Zentrifugation wurde von den Abwasserschlammkonzentraten, für die Bestimmung des
Trockensubstanzgehalts (TS), eine geringe Menge abgenommen und in Aluminiumschalen
bei 105 °C im Trockenschrank (Memmert, Deutschland) bis zur Gewichtskonstanz
getrocknet. Aus den Massen vor und nach der Trocknung wurde der vorläufige
Trockensubstanzgehalt bestimmt.
Das verbleibende Abwasserschlammkonzentrat wurde auf je zwei 2 Liter Glasflaschen
verteilt. Um einen vorzeitigen biologischen Abbau der zu betrachtenden EDCs zu verhindern,
wurde die Biocenose möglichst weitgehend abgetötet. Zu diesem Zweck wurden zum einen
je 2 Glasflaschen mit Belebt- bzw. Faulschlammkonzentrat mit 0,1 % Natriumazid und drei
Wolframcarbidkugeln versetzt. Während der folgenden 30 min wurde die Suspension
mehrfach durch manuelles Schütteln durchmischt. Zum anderen wurden je 2 Glasflaschen
54 7 Material und Methoden zur Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen
mit Belebt- bzw. Faulschlammkonzentrat für 15 min bei 120 °C sterilisiert. Jeweils eine
Flasche des mit Natriumazid abgetöteten Belebt- bzw. Faulschlammkonzentrats sowie je
eine Flasche des autoklavierten Belebt- bzw. Faulschlammkonzentrats wurden mit der
gewünschten Menge der zu bestimmenden EDCs, gelöst in Aceton, dotiert. Diese Menge
wurde auf den angenommenen Trockensubstanzgehalt bezogen. Nach der Bestimmung des
TS durch Gefriertrocknung erfolgte später die genaue Berechnung der durch Zugabe
erzielten EDC-Gehalte. Die übrigen Flaschen mit Belebt- bzw. Faulschlamm wurden zur
Bestimmung der Blindwerte genutzt und nur mit der entsprechenden Menge Aceton dotiert.
Um eine gründliche Durchmischung der Schlammkonzentrate zu gewährleisten und um den
Analyten die Chance zu geben an der Matrix zu adsorbieren oder in Bakterienzellen
eingelagert zu werden, wurden die Flaschen 24 h auf einem Überkopfschüttler (Gerhardt,
Königswinter) durchmischt und dabei homogenisiert. Durch diese Prozedur sollten die
natürlichen Vorgänge der Adsorption soweit wie möglich nachvollzogen werden. Im
Anschluss wurde das noch feuchte Schlammkonzentrat zur Gänze gefriergetrocknet (Christ
Alpha 1 + 4, Heraeus Christ GmbH, Osterode) und in einer Kugelmühle (Retsch, Haan) bei
50 Umdrehungen/s 30 min lang gemahlen und homogenisiert. Durch Bestimmung der Masse
vor und nach der Gefriertrocknung wurde der endgültige Trockensubstanzgehalt bestimmt,
mit dessen Hilfe die tatsächlich vorhandenen Konzentrationen der EDCs berechnet werden
konnten. Die dotierten, trockenen und gemahlenen Schlämme wurden in Braunglasgefäße
gefüllt und bei 4 °C bis zur Analyse gelagert. Diese Schlämme wurden im weiteren Verlauf
der Methodenentwicklung eingesetzt, um die Wiederfindungen der EDCs unter den
verschiedenen beschriebenen Parametern zu optimieren. Als optimierte Parameter werden
die Bedingungen ausgewählt, bei denen die Wiederfindungen möglichst nah um 100 %
lagen.
7.3.5 Extraktion
Um die ausgewählten endokrinen Substanzen aus Klärschlamm zu extrahieren wurde ein
„accelerated solvent extraction“-System (ASE) der Firma Dionex verwendet. Der Aufbau des
ASE-Gerätes ist in Abbildung 7.3 dargestellt. Dabei wird die Probe in eine verschließbare
Edelstahlextraktionszelle gegeben, diese wird im geschlossenen Zustand über ein
Pumpensystem mit dem gewünschten Lösungsmittel gefüllt. Im Ofen wird die
Extraktionszelle erhitzt und unter Druck gesetzt. Durch das Anlegen eines hohen Druckes
siedet das Lösungsmittel bei einer höheren Temperatur und somit ist eine bessere
Extraktionsausbeute zu erwarten. Nach der gewünschten Extraktionszeit wird der Extrakt
wiederum durch ein Pumpensystem in ein Sammelgefäß gedrückt, die Extraktionszelle wird
7 Material und Methoden zur Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen 55
mit frischem Lösungsmittel gespült und Lösungsmittelreste werden im Stickstoffstrom
entfernt. Der Extrakt ist dann für die weitere Analyse bereit.
Im Laufe der Methodenentwicklung und –optimierung wurden die möglichen
Extraktionsparameter, wie z.B. die Art des Lösungsmittels, die Temperatur, der Druck usw.
variiert und angepasst. Die im Einzelnen untersuchten Extraktionsvarianten sind in
Tabelle 7.5 aufgeführt.
Im Anschluss an die Extraktion wurde der Extrakt mittels eines Rotationsverdampfers (Büchi,
Schweiz) bei einem Vakuum von 100 mbar und einer Temperatur von 50 °C auf ca. 1 mL
eingeengt. Der eingeengte Extrakt wurde quantitativ in einen 10 mL Messkolben überführt
und mit dem verwendeten Extraktionsmittel auf das gewünschte Endvolumen aufgefüllt.
Abbildung 7.3: Schematische Darstellung eines ASE-Gerätes (Dionex)
7.3.6 Anreicherung
Im Laufe der Methodenentwicklung zeigte sich, dass die Derivatisierung des
Schlammextraktes direkt nach der Reinigung an Kieselgel schwer möglich war. Der
Rückstand war in Aceton schwer löslich und stark mit Matrix belastet, was die folgende
GC/MS-Detektion durch schnelle Verschmutzung des Systems störte. Da dies bei den
wässrigen Proben nicht aufgetreten war, wurde aus den Schlammextrakten zunächst eine
wässrige Mischung hergestellt. Dazu wurde, wenn ein wasserlösliches
Extraktionslösungsmittel verwendet wurde, 1 mL des Extraktes in 100 mL Wasser gelöst. Bei
der Extraktion mit wasserunlöslichem Lösungsmittel wurde 1 mL des Extraktes im
Stickstoffstrom getrocknet, in Aceton wieder aufgenommen und anschließend in 100 mL
56 7 Material und Methoden zur Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen
Wasser gelöst. Der nachfolgende Anreicherungsschritt entspricht weitestgehend dem
Verfahren, das bei der Anreicherung wässriger Proben, wie unter Abschnitt 7.2.3 erläutert ist,
verwendet wurde. Zur Sicherstellung der quantitativen Überführung des geringen
Probenvolumens von 100 mL wurde auf die automatische Anreicherung verzichtet und diese
manuell in der in Abbildung 7.4 gezeigten Apparatur (Schleicher & Schüll Dassel, Werkstatt
ISA) durchgeführt.
Tabelle 7.5: ASE-Extraktionsvarianten
Probe Nr.
Schlamm EDCs Lösungs- mittel
Temp-eratur [°C]
Druck[psi]
Extrak-tions-zeit
[min]
Extrak-tions-cyclen
Ein-waage
[g] 1 belebt alle Aceton 170 2000 45 1 2
2 belebt alle Aceto-nitril 170 2000 45 1 2
3 belebt alle Dichlor-methan
170 2000 45 1 2
4 belebt alle Ethyl-acetat 170 2000 45 1 2
5 belebt alle Methanol 170 2000 45 1 2
6 belebt alle Toluol 170 2000 45 1 2
7 faul alle Methanol 170 2000 45 1 2
8 belebt alle Methanol 100 2000 45 1 2
9 belebt alle Methanol 150 2000 45 1 2
10 belebt alle Methanol 200 2000 45 1 2
11 belebt alle Methanol 170 1000 45 1 2
12 belebt alle Methanol 170 1500 45 1 2
13 belebt alle Methanol 170 2000 15 1 2
14 belebt alle Methanol 170 2000 60 1 2
15 belebt alle Methanol 170 2000 45 2 2
16 belebt alle Methanol 170 2000 45 3 2
17 belebt alle Methanol 170 2000 45 1 1
18 belebt alle Methanol 170 2000 45 1 4
19 belebt E1 + 0,1 % NaN3
Methanol 170 2000 45 1 2
20 belebt E2+ 0,1 % NaN3
Methanol 170 2000 45 1 2
21 belebt E1, E2 Methanol 170 2000 45 1 2 22 belebt E2 + 1 %
NaN3
Methanol 170 2000 45 1 2
23 belebt sterilisiert
alle Methanol 170 2000 45 1 2
24 faul sterilisiert
alle Methanol 170 2000 45 1 2
Die Probe wurde in einen Edelstahlzylinder geben, der mit der C18-Säule (1000 mg, J.T.
Baker, Niederlande) verbunden war. An der Verbindungsstelle war ein Glasfaserfilter
7 Material und Methoden zur Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen 57
(∅ 50 mm, Schleicher & Schüll, Dassel, geglüht bei 450 °C) angebracht. Die als
Vorratsgefäß dienende Edelstahlhülse wurde mit Reistwasser vorgespült, um eine
quantitative Erfassung der Analyten zu gewährleisten. Mit Hilfe von Druckluft wurde die
Probe durch die C18-Säule gedrückt. Dabei wurde eine Tropfgeschwindigkeit von ca.
1 Tropfen/s eingestellt. Die feuchte Säule wurde 30 min lang im Stickstoffstrom getrocknet.
Im Anschluss daran wurden die Analyten mit 3 x 2 mL Aceton wieder eluiert. Das Eluat
wurde bei 60 °C im Stickstoffstrom auf ca. 0,5 mL eingeengt. Die Säulen wurden im
Anschluss verworfen.
Druckluftzufuhr
Glasfaserfilter (geglüht, T: 450°C)
Edelstahlhülse mitC -Anreicherungskartusche18
Sammelgefäß für das abgereicherte Probematerial
Adapter
Edelstahlvorratsgefäß mit Probematerial
Abbildung 7.4: Extraktionsapparatur (Schleicher & Schüll Dassel, Werkstatt ISA)
7.3.7 Probenaufreinigung
In den Vorversuchen hat sich gezeigt, dass eine Reinigung an 1000 mg Kieselgel und
Elution mit Aceton/Pentan die besten Ergebnisse geliefert hat, deshalb wurde diese zur
Reinigung der Probenextrakte eingesetzt. Dazu wurden sowohl die nicht vorbehandelten
ASE-Extrakte direkt, als auch die nach Zwischenreinigung durch Einbringung in
Reinstwasser und Anreicherung auf C18-Material erhaltenen Eluate verwendet. Der Extrakt
bzw. das Eluat wurde auf eine mit 3 x 1 mL Aceton/Pentan (2:1) konditionierte Kieselgelsäule
(1000 mg, J.T. Baker, Niederlande) gegeben. Nach vollständiger Aufgabe des Extraktes
58 7 Material und Methoden zur Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen
wurden die Analyten mit 3 x 2 mL derselben Aceton/Pentan-Mischung eluiert. Das Eluat
wurde zur Trockene eingeengt und, wie in Abschnitt 7.3.8 beschrieben, derivatisiert.
7.3.8 Derivatisierung
Wie aus den Vorversuchen hervor ging, war die Derivatisierung mit 30 µL die effizienteste.
Deshalb wurde diese Menge an Reagenz beibehalten. Die weiteren Bedingungen sind mit
denen unter Abschnitt 7.2.4 identisch.
7.3.9 GC/MS-Messung und anschließende Auswertung der Ergebnisse
Die Parameter für die an die Derivatisierung anschließende GC/MS-Detektion und die
Ergebnissauswertung sind in Abschnitten 7.1.2 und 7.1.3 beschrieben.
7.3.10 Validierung der zur Bestimmung von EDCs aus Klärschlämmen eingesetzten Methode
Um die entwickelte Methode zur Bestimmung der ausgewählten endokrin wirksamen
Substanzen aus verschiedenen Klärschlämmen zu validieren, wurden die Wiederfindungen
der Analyten, die Reproduzierbarkeit der Bestimmungsmethode und die Nachweis- sowie die
Bestimmungsgrenzen ermittelt.
7.3.10.1 Bestimmung der Wiederfindungen
Zur Bestimmung der Wiederfindungen wurde die während der Methodenentwicklung
optimierte Variante verwendet, d. h. 2 g des mit ca. 35 µg/g TS der sieben EDCs dotierten
und sterilisierten Belebtschlamms sowie der mit ca. 40 µg/g TS der ausgewählten EDCs
dotierten und sterilisierten Faulschlamms wurde je dreimal mit Methanol in der ASE
extrahiert. Parallel dazu wurde jeweils ein undotierter Schlamm extrahiert, der zur
Bestimmung der Blindwerte herangezogen wurde. Die Extraktionen wurden bei einem Druck
von 2000 psi bei 170 °C über 45 min durchgeführt. 1 mL des auf 10 mL gestellten Extrakts
wurde in 100 mL entmineralisiertem Wasser gelöst, auf 1 g C18-Material angereichert, mit
6 mL Aceton eluiert, eingeengt und an 1 g Kieselgel gereinigt. Die Analyten wurden mit 6 mL
Aceton/Pentan (2:1) eluiert und das Lösungsmittel wurde im Stickstoffstrom entfernt. Der
Rückstand wurde in 200 µL Acetonitril wieder aufgenommen und mit 30 µL
Heptafluorbuttersäureanhydrid für 30 min im verschlossenem Reaktionsgefäß bei 60 °C
7 Material und Methoden zur Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen 59
derivatisiert. Nach der Derivatisierung wurde das überschüssige Derivatisierungsreagenz
durch Trocknung im Stickstoffstrom entfernt. Der Rückstand wurde in 1000 µL Aceton gelöst,
ein Aliquot von 2 µL wurde zur gaschromatographischen Trennung und
massenspektrometrischen Detektion verwendet. Die Wiederfindungen wurden, wie in
Gleichung 4 beschrieben, berechnet. Aus den drei bestimmten Wiederfindungen wurde der
Mittelwert gebildet.
7.3.10.2 Reproduzierbarkeit der Bestimmungsmethode
Zur Gewährleistung der Reproduzierbarkeit der Messergebnisse wurden je 2 g
gefriergetrockneter Belebt- und Faulschlamm (EDC-Gehalt ca. 40 µg/g TS) wie beschrieben
aufgearbeitet. Das Endvolumen der Probenlösung betrug 1000 µL. Jede Probe wurde
fünfmal gaschromatographisch getrennt und massenspektrometrisch im EI-Modus detektiert.
Die Peakflächen wurden verglichen. Die Berechnung erfolgte nach Gleichung 7 und 8.
7.3.10.3 Ermittlung der Nachweis- und Bestimmungsgrenzen
Zur Ermittlung der Nachweis- und Bestimmungsgrenzen wurde der sterilisierte
Belebtschlamm, der mit ca. 35 µg/g TS dotiert war, mit undotiertem Belebtschlamm
gemischt, so dass unter der Veraussetzung, dass der undotierte Klärschlamm keine der
EDCs enthielt, Konzentrationen von ca. 2; 4; 7,5; 15 und 30 µg/g TS entstanden. Diese
Proben wurden wie beschrieben extrahiert und aufgearbeitet. Die mathematische
Berechnung der Nachweis- und Bestimmungsgrenzen erfolgte analog zu Abschnitt 7.2.6.3.
Gleichzeitig wurde in diesem Schritt die Linearität der Bestimmungsmethode überprüft. Der
Extrakt wurde auf ein Volumen von 10 mL aufgefüllt. Von diesem Extrakt wurde 1 mL für die
oben beschriebene Aufarbeitung verwendet. Das Endvolumen betrug 100 µL. Die
Bestimmung der Nachweis- und Bestimmungsgrenzen wurde an diesem Belebtschlamm
exemplarisch durchgeführt. Sollten weitere Schlämme aus anderen Kläranlagen oder
Klärstufen vorliegen, können sich die Nachweis- und Bestimmungsgrenzen aufgrund von
Unterschieden in der Matrix geringfügig ändern.
60 7 Material und Methoden zur Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen
7.4 Analytische Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen aus Sedimenten
7.4.1 Beschreibung des beprobten Sees Volvi
Der See Volvi (Abbildung 7.5) ist ein meso- bis euthrophischer See, der im Norden von
Griechenland, ca. 11,5 km nordöstlich der Stadt Thessaloniki gelegen ist. Das gesamte
Gebiet ist durch die Ramsar Convention on Wetlands als ein international bedeutendes
Feuchtgebiet ausgewiesen. Aus diesem Grund ist es besonders wichtig, Kenntnisse über
das Vorkommen von Schadstoffen, wie z. B. endokrin wirksamen Substanzen zu gewinnen.
Das Feuchtgebiet enthält komplexe natürliche Lebensräume wie Süßwassergrenzgebiete,
Flussuferbewaldung und Buschwerk sowie landwirtschaftlich genutzte Flächen. Der See wird
hauptsächlich durch Regenwasser, Oberflächen- und Grundwasser sowie durch
Thermalquellen gespeist. Als Hauptkontaminationsquellen, die die Wasserqualität und den
trophischen Status beeinträchtigen können, treten landwirtschaftlicher Abfluss, Abwasser
aus der Tierhaltung, unbehandeltes oder teilweise behandeltes kommunales Abwasser und
Industrieabwasser hauptsächlich aus Färbereien und der Nahrungsmittelindustrie auf.
Weitere wichtige Quellen sind re-suspendierte Flusssedimente und erodiertes
Flussufermaterial (Kaiserli et al., 2002). An der Probenahmestelle 8 fließt der Fluss Megalo
Rema in den See. An diesem Fluss liegt eine kleine Kläranlage, deren Abwasser über den
Fluss in den See gelangt. An der Probenahmestelle 7 liegt die Stadt Nea Madytos mit ca.
5000 Einwohnern.
7.4.2 Probenahme
Die Probenahmen an den in Abbildung 7.5 bezeichneten Stellen des Sees erfolgten durch
Mitarbeiter des Arbeitskreises von Prof. K. Fytianos, Aristotle Universität Thessaloniki. Die
Oberflächensedimente wurden in einer Tiefe von 0–10 cm mit Hilfe eines Eckman Sammlers
genommen. Sie wurden alle drei Monate im Zeitraum von April 2003 bis März 2005
(Tabelle 7.6) gezogen, um einen saisonalen Überblick über das Vorkommen der endokrin
wirksamen Substanzen zu erhalten. Die Proben wurden in gekühlte Glasgefäße gefüllt und
bei 4 °C ins Labor transportiert. Dort wurden die Proben gefriergetrocknet und mit Hilfe einer
Kugelmühle homogenisiert. Das Homogenisat wurde durch ein 75 µm Edelstahlsieb
gegeben. Diese getrockneten und gesiebten Sedimente wurden nach Deutschland
verschickt und hier weiter bearbeitet. Die Lagerung erfolgte bei 4 °C.
7 Material und Methoden zur Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen 61
12 3
4
5
6
7
8
9
Stadt
Fluss
BergeBerge
Abbildung 7.5: Die Lage des Sees Volvi auf dem griechischen Staatsgebiet sowie markante Landschaftspunkte im Umfeld des Sees sowie die Probenahmestellen
7.4.3 Analysengang
Die Sedimente wurden auf die EDCs analog zu den Klärschlämmen analysiert (optimiertes
Verfahren siehe Abschnitt 7.3.10.1).
Tabelle 7.6: Probenahmezeitpunkte
Probeserie Probenahmezeitpunkt A-Sedimente 21.04.03
B-Sedimente 03.07.03
C-Sedimente 23.11.03
D-Sedimente 25.02.04
E-Sedimente 26.04.04
F-Sedimente 01.07.04
G-Sedimente 08.10.04
H-Sedimente 16.03.05
62 7 Material und Methoden zur Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen
7.4.4 Validierung der zur Bestimmung von EDCs aus Sedimenten eingesetzten Methode
7.4.4.1 Bestimmung der Wiederfindungen
Da hier kein Material unmittelbar nach Entnahme mit den entsprechenden EDCs dotiert
worden war, wurde aus den Sedimenten der ersten beiden Probenahmen ein Mischsediment
hergestellt. Dadurch sollte eine Beeinflussung der Wiederfindungen durch regionale
Unterschiede der Probenmatrix weitgehend ausgeschlossen werden. Nach
Homogenisierung wurden dreimal je 2 g Mischsediment mit 1 mL einer Standardlösung der
Analyten in Aceton mit einer Konzentration von ca. 40 µg/mL versetzt, durchmischt und über
Nacht stehen gelassen. Das zu extrahierende Sediment hatte somit eine Konzentration von
20 µg/g je Analyt. Gleichzeitig wurden 2 g des Mischsedimentes mit 1 mL Aceton versetzt
und genauso weiterbehandelt. Daraus wurden die Blindwerte der Analyten bestimmt, die von
den Ergebnissen für die dotierten Sedimente abgezogen wurden. Die Berechnung der
Wiederfindungen, die als Dreifachbestimmung durchgeführt wurde, erfolgt nach Gleichung 6.
Aus den drei bestimmten Werten wurde der Mittelwert gebildet.
7.4.4.2 Reproduzierbarkeit der Bestimmungsmethode
Um die Reproduzierbarkeit der Messergebnisse zu gewährleisten wurden 2 g des dotierten
Mischsediments wie beschrieben extrahiert. Der Extrakt wurde auf ein Volumen von 10 mL
aufgefüllt. Davon wurde 1 mL wie beschrieben angereichert, gereinigt und derivatisiert. Der
Rückstand wurde in 250 µL Aceton wiederaufgenommen und in einer Fünffachbestimmung
mittels GC/MS-Messung untersucht. Die Peakflächen der Analyten wurden verglichen. Die
mathematische Bestimmung erfolgt nach Gleichung 7 und 8.
7.4.4.3 Ermittlung der Nachweis- und Bestimmungsgrenzen
Die Nachweis- und die Bestimmungsgrenzen wurden durch eine Konzentrationsreihe
bestimmt. Zu diesem Zweck wurden je 2 g des undotierten Mischsediments mit 50, 125, 250,
500 und 1.000 µL einer Standardlösung, die die Analyten in einer Konzentration von
20 µg/mL gelöst in Aceton enthielt, dotiert. Ein Aliquot wurde nur mit 500 µL Aceton dotiert.
Die in dieser Probe enthaltenen EDCs werden als Blindwerte von den Ergebnissen der
dotierten Proben subtrahiert.
7 Material und Methoden zur Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen 63
Die Sedimente wurden homogenisiert und über Nacht stehen gelassen. In den Proben waren
so schließlich Konzentrationen von je 0,5; 1,25; 2,5; 5 und 10 µg EDCs je Gramm TS
vorhanden. Nach Extraktion mittels ASE (Abschnitt 7.3.10.1) wurden die Extrakte dann auf
10 mL aufgefüllt. Je 1 mL der Extrakte wurden zur Anreicherung verwendet und
entsprechend der in Kap. 2.3.7 aufbereitet. Nach erfolgter Aufarbeitung waren die Analyten
in 100 µL Aceton gelöst. Die mathematische Auswertung entspricht der unter Absatz 2.2.7.3
vorgestellten Weise. Gleichzeitig wurde anhand dieser Messwerte die Linearität der GC/MS-
Bestimmungsmethode überprüft.
7.4.5 Analyse der realen Proben
Zur Analyse der realen Proben wurde je 2,5 g gefriergetrocknetes Sediment eingewogen und
extrahiert. Der Extakt wurde auf 5 mL aufgefüllt. Davon wurde 1 mL aufgearbeitet und zum
Schluss in 100 µL Aceton aufgenommen.
64 8 Ergebnisse
8 Ergebnisse
8.1 Vorversuche
Um bei der Methodenentwicklung zur Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen die
Derivatisierung, die GC-Trennung und die MS-Detektion beurteilen zu können, wurden
zunächst Reinstsubstanzen derivatisiert, gaschromatographisch getrennt und
massenspektrometrisch detektiert. Die Ergebnisse der chromatographischen Trennung der
verschiedenen Derivate sind in den Abbildungen 8.1 und 8.2 zu sehen. Dabei eluierten die
EDCs mit Hilfe der eingesetzten Säule in folgender Reihenfolge: NP, OP, BPA, EE2, E3, E2
und E1. Dies wurde bereits im TIC sichtbar, in den ausgewählten Massenspuren des RICs
ließen sich Matrixeinflüsse ausblenden und die Trennung der einzelnen Substanzen,
insbesondere aber die Trennung der unterschiedlichen NP-Isomeren, wurde deutlich
erkennbar.
Die Länge des Carboxylatrestes, und damit auch die Anzahl der Fluoratome des
Derivatisierungsreagenz hatte nur einen geringen Einfluss auf die Retentionszeit der
Derivate. Die mit unterschiedlichen Derivatisierungsreagenzien synthetisierten Verbindungen
desselben EDCs wurden mit vergleichbaren Retentionszeiten gefunden. Die Detektion
erfolgte hier im EI-Modus. In diesem Modus wurden die Trifluor- und die Pentafluorderivate
im TIC mit einer Intensität von E4 bis E5, d.h., mit ähnlichen relativen Intensitäten detektiert.
Die Heptafluorderivate der Xenoestrogene und der Steroide ließen sich jedoch um den
Faktor 10 empfindlicher detektieren.
In Abbildung 8.3 wurden dieselben Derivate der Reinsubstanzen in denselben
Konzentrationen wie in den Abbildungen 8.1 und 8.2 getrennt, die Detektion erfolgte dann
jedoch im NCI-Modus. Hier zeigten sich deutliche Unterschiede bei den
Nachweisempfindlichkeiten und den damit verknüpften S/N-Verhältnissen zwischen den
Derivaten unterschiedlichen Fluorgehaltes. So waren die Trifluorderivate von NP und OP im
NCI-Modus überhaupt nicht erkennbar. Die übrigen Trifluorderivate erschienen mit gutem
S/N-Verhältnis, die Empfindlichkeit war aber relativ zu den Pentafluor- und
Heptafluorderivaten wesentlich geringer. NP ließ sich auch als Pentafluorderivat im NCI-
Modus nicht detektieren, während OP erst im RIC durch Massenspuranalyse sichtbar wurde.
Als Heptafluorderivate ließen sich alle Substanzen mit einer ausreichenden Empfindlichkeit
detektieren.
8 Ergebnisse 65
Rel
ativ
e In
tens
ität [
%]
Zeit [min]
A
B
C
D
E
F
Abbildung 8.1: Ionenstrom-Chromatogramme der Trifluor- und Pentafluorderivate, bestimmt im EI- Modus. (A): TIC einer Lösung der sieben EDCs (c = 20 µg/L) in Aceton, derivatisiert mit TFAAA; (B): RIC von (A) der Xenoestrogene NP (m/z: 203, 231, 245), BPA (m/z: 405, 420) und OP (m/z: 302); (C): RIC von (A) der Steroide E1 (m/z: 322, 366), E2 (m/z: 351,464), E3 (m/z: 235, 349) und EE2 (m/z: 359, 374); (D): TIC einer Lösung der sieben EDCs (c = 20 µg/L) in Aceton, derivatisiert mit PFPAA; (E): RIC von (D) der Xenoestrogene NP (m/z: 253, 267, 281), BPA (m/z: 505, 520) und OP (m/z: 352); (F): RIC (D) der Steroide E1 (m/z: 372, 416), E2 (m/z: 429, 564), E3 (m/z: 399, 726) und EE2 (m/z: 396, 424)
66 8 Ergebnisse
100
80
60
40
20
0100
80
60
40
20
0100
80
60
40
20
010 12 14 16 18 20 22 24 26 3028
NP
OP
BPA
EE2
E3E2E1
NP
OP
BPA
EE2
E3
E2E1
Zeit [min]
Rel
ativ
e In
tens
ität [
%]
MassenspurenSteroideHeptafluorderivate
2,00 E5
MassenspurenXenoestrogeneHeptafluorderivate
5,44 E6
TICHeptafluorderivate
1,30 E6
C
B
A
Abbildung 8.2: Ionenstrom-Chromatogramme der Heptafluorderivate, bestimmt im EI-Modus. (A): TIC einer Lösung der sieben EDCs (c = 20 µg/L) in Aceton, derivatisiert mit HFBAA; (B): RIC von (A) der Xenoestrogene NP (m/z: 303, 331, 345), BPA (m/z: 605, 620) und OP (m/z: 402); (C): RIC von (A) der Steroide E1 (m/z: 422, 466), E2 (m/z: 237, 451), E3 (m/z: 235, 449) und EE2 (m/z: 446, 474)
8.1.1 Massenspektren
Die C-F-Bindungen sind aufgrund der hohen Elektronegativität des Fluors wesentlich stabiler
als die C-C-Bindungen. Deshalb wurden die C-C-Bindungen im Gegensatz zu den C-F-
Bindungen bevorzugt bei der Ionisierung fragmentiert. Aus diesem Grund unterschied sich
das Fragmentationsverhalten der Derivate unterschiedlichen Fluorgehalts ein und derselben
Substanz im EI-Modus vom Prinzip her nicht, nur die Massenzahlen der Fragmentionen
änderten sich in Abhängigkeit des Fluorgehalts.
Bei den isomeren NP-Derivaten (Abbildung 8.4) wurden aus der Alkylkette Fragmentionen
mit jeweils immer einer CH2- Gruppe zusätzlich abgespalten. Nicht jedes Fragment war in
den einzelnen NP-Isomeren enthalten. Ebenfalls waren die Intensitäten der Fragmente
zueinander bei den Isomeren unterschiedlich. Betrachtete man die sich im RIC unter dem
gesamten NP-Signal verbergenden Fragmente, so erscheinen, wie in Abbildung 8.4 zu
erkennen, alle neun möglichen Fragmente. Die Molekülionen der Derivate waren aber bei
allen drei NP-Derivaten nicht, oder nur sehr schwach ausgeprägt, zu erkennen.
8 Ergebnisse 67
0
Zeit [min]
Rel
ativ
e In
tens
ität [
%]
A
B
C
D
E
F
Abbildung 8.3: Ionenstrom-Chromatogramme aller Derivate, bestimmt im NCI-Modus. (A): TIC einer Lösung der sieben EDCs (c = 20 µg/L) in Aceton derivatisiert mit TFAAA; (B): RIC von (A) der EDCs NP (m/z: n.d.), BPA (m/z: 211, 323), OP (m/z: n.d.), E1 (m/z: 269), E2 (m/z: 133), E3 (m/z: 367) und EE2 (m/z: 277); (C): TIC einer Lösung der sieben EDCs (c = 20 µg/L) in Aceton derivatisiert mit PFPAA; (D): RIC von (C) der EDCs NP (m/z: n.d.), BPA (m/z: 148), OP (m/z: 148), E1 (m/z: 148), E2 (m/z: 148), E3 (m/z: 164) und EE2 (m/z: 148); (E): TIC einer Lösung der sieben EDCs (c = 20 µg/L) in Aceton derivatisiert mit HFBAA; (F): RIC von (E) der EDCs NP (m/z: 199), BPA (m/z: 199), OP (m/z: 199), E1 (m/z: 199), E2 (m/z: 199), E3 (m/z: 215) und EE2 (m/z: 199)
68 8 Ergebnisse
Bei der Ionisierung der BPA-Dervate (Abbildung 8.5) entstand neben dem Molekülionenpeak
bei allen drei Derivaten mit unterschiedlichem Fluorgehalt jeweils nur ein einziges Fragment,
welches von der Abspaltung einer CH3-Gruppe herrührte.
Die OP-Derivate (Abbildung 8.6) zeigten ein dem NP ähnliches Fragmentierungsverhalten.
Allerdings war das Molekülion ausgeprägter und nicht jede mögliche Abspaltung einer CH2-
Gruppe wurde sichtbar, vielmehr wurden C4H9- und C7H5-Fragmente abgespalten.
Die Massenspektren der E1-Derivate enthielten die Molekülionen aller drei Derivate als
base-peaks (Abbildung 8.7). Desweiteren waren die Abspaltung von H2O, von C2H4O und
von einer Carboxylatgruppe erkennbar.
Die Spektren der E2-Derivate (Abbildung 8.8) wiesen das Molekülion und Fragmentionen mit
ungefähr gleicher Intensität auf. Diese waren durch die Abspaltung von einer bzw. zwei
fluorierten Carboxylatgruppen entstanden.
Eine Abspaltung dieser Carboxylatgruppen war neben dem Molekülion auch bei den
Spektren von E3 (Abbildung 8.9) zu sehen, wobei das Ion mit m/z 235 den base-peak
bildete.
Bei der Ionisierung der EE2-Derivate (Abbildung 8.10) trat nur die Fragmentierung von einem
Carboxylatrest auf. Die weiteren Fragmente entstanden durch die zusätzliche
Fragmentierung von einer CH3- bzw. CH-Gruppe. Es war jedoch kein Molekülion zu
erkennen.
Die Muster der EI-Fragmentspekten der Pentafluorderivate von E1 und E2 waren mit denen
von Croley et al., 2000 beschriebenen identisch.
Üblicherweise wird die Ionisierung im NCI-Modus als die gegenüber der EI-Ionisation
sanftere Ionisierungsmethode angesehen und dazu genutzt, Massenspektren zu erzeugen,
die neben dem Molekülion ([M+1]+) möglichst wenige Fragmente enthalten und die
Information der Molmasse liefern. Häufig stellt in NCI-Spektren das Molekülion sogar das
einzige Ion dar.
Die hier im NCI-Modus erzeugten Spektren der fluorierten EDC-Derivate (Abbildungen 8.11–
8.17) zeigten dagegen überhaupt keine Molekülionen sondern die Spektren enthielten
unspezifische, für die Identifizierung ungeeignete Fragmente. Die Trifluor- und
Pentafluorderivate der NP-Isomeren (Abbildung 8.11), sowie das Trifluorderivat des OP
(Abbildung 8.13) waren überhaupt nicht empfindlich genug detektierbar, um ein
Massenspektrum zu erhalten. Auch eine Optimierung der Einstellungen des
Massenspektrometers führte zu keinen sichtbaren NCI-Spektren. Es wird vermutet, dass der
relativ geringe Fluorgehalt der Detektion nicht förderlich war. Substanzen hingegen, die mehr
als eine derivatisierte Hydroxygruppe hatten oder deren Moleküle mehr als 5 Fluoratome
enthielten, zeigten einen NCI-MS-Response und deshalb auch ein Massenspektrum.
8 Ergebnisse 69
8.1.1.1 Massenspektren der Fluorderivate der endokrin wirksamen Substanzen,
bestimmt unter EI-Bedingungen
100 150 200 250 300 350 400 450 500m/z
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
366
301287
273259
245
231
217203
189
239
253 267
281
295
309323
337225
303317
331
345
359373
387416
- C H2 5
- C H3 7
- C H4 9
- C H5 11
- C H6 13
- C H7 15
- C H8 17
-C H9 19
M+
M+
- C H2 5
- C H3 7
- C H4 9
- C H3 7
- C H4 9
- C H2 5
- C H5 11
- C H5 11
- C H6 13
- C H6 13
- C H7 15- C H8 17
- C H7 15
- C H8 17
-C H9 19
-C H9 19
289
0
20
40
60
80
100
9,87 E3
7,84 E3
4,76 E3
A
B
C
Abbildung 8.4: Fragmentbildung der Nonylphenolderivate unter EI-Bedingungen. (A): TFAAA-, (B): PFPAA- und (C): HFBAA-Derivat.
70 8 Ergebnisse
100 200 300 400 500 600 700m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
420
405
505
520
605
620
M+
M+
M+
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Rel
ativ
e In
tens
ität [
%]
2,27 E5
3,05 E5
1,04 E5
C
B
A
Abbildung 8.5: Fragmentbildung der Bisphenol A-Derivate unter EI-Bedingungen.(A): TFAAA-, (B): PFPAA- und (C): HFBAA-Derivat.
8 Ergebnisse 71
100 200 300 400 500m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
203
302
245
253
295
352
303
345
402
- C H4 9
- C H7 15
M+
- C H4 9
- C H7 15
M+
- C H4 9
- C H7 15
M+
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Rel
ativ
e In
tens
ität [
%]
9,76 E4
1,42 E5
9,21 E4
A
B
C
Abbildung 8.6: Fragmentbildung der Octylphenolderivate unter EI-Bedingungen. (A): TFAAA-, (B): PFPAA- und (C): HFBAA-Derivat.
72 8 Ergebnisse
100 200 300 400 500 600m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
235253
322
348
366
309
416
398
372
359235
253
235253368
409
422
448
466
M+
M+
M+
- C F COO2 5
- C H O2 4
- H O2
- CF COO3
- C H O2 4
- H O2
- C F COO3 7
- C H O2 4
- H O2
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
1000
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100 3,23 E3
1,64 E4
1,75 E4
Rel
ativ
e In
tens
ität [
%]
A
B
C
Abbildung 8.7: Fragmentbildung der Estronderivate unter EI-Bedingungen. (A): TFAAA-, (B): PFPAA- und (C): HFBAA-Derivat.
8 Ergebnisse 73
100 200 300 400 500 600 700 800m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
143
237 351
464
143
237
401
564
143
237
451
664
M+
M+
M+
- C F COO2 5
- CF COO3
- C F COO3 7
- 2 x C F COO3 7
- 2 x C F COO2 5
- 2 x CF COO3
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Rel
ativ
e In
tens
ität [
%]
9,06 E3
4,69 E4
4,38 E4
A
B
C
Abbildung 8.8: Fragmentbildung der Estradiolderivate unter EI-Bedingungen. (A): TFAAA-, (B): PFPAA- und (C): HFBAA-Derivat.
74 8 Ergebnisse
200 400 600 800 1000m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
143
235
349
576
463
143
235
399 562
726
143
235
449
663876
M+
M+
M+
- C F COO2 5
- CF COO3
- C F COO3 7
- CF COO- CF COOH
3
3
- CF COO- 2 x CF COOH
3
3
- C F COO- C F COOH
2 5
2 5
- C F COO- 2 x C F COOH
2 5
2 5
- C F COO- C F COOH
3 7
3 7
- C F COO- 2 x C F COOH
3 7
3 7
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
1000
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100R
elat
ive
Inte
nsitä
t [%
]1,21 E4
5,43 E4
1,22 E5
C
B
A
Abbildung 8.9: Fragmentbildung der Estriolderivate unter EI-Bedingungen. (A): TFAAA-, (B): PFPAA- und (C): HFBAA-Derivat.
8 Ergebnisse 75
200100 300 400 500 600m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
1000
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
245 304
331
346
374
429
359
245354
361
396
424
409
245
404
431
446
459
474
- C F COOH2 5
- CF COOH3
- C F COOH3 7
- CH3
- CH
- CH3
- CH
- CH
- CH3
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Rel
ativ
e In
tens
ität [
%]
6,63 E3
3,20 E4
2,98 E4
A
B
C
Abbildung 8.10: Fragmentbildung der Ethinylestradiolderivate unter EI-Bedingungen. (A): TFAAA-, (B): PFPAA- und (C): HFBAA-Derivat.
76 8 Ergebnisse
8.1.1.2 Massenspektren der Fluorderivate der endokrin wirksamen Substanzen,
bestimmt unter NCI-Bedingungen
200 300 400100m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
1000
10
20
30
40
50
60
70
80
90
1000
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
199
nicht nachweisbar
nicht nachweisbar
Rel
ativ
e In
tens
ität [
%]
7,73 E4C
B
A
Abbildung 8.11: Fragmentbildung der Nonylphenolderivate unter NCI-Bedingungen. (A): TFAAA-, (B): PFPAA- und (C): HFBAA-Derivat.
8 Ergebnisse 77
69
113
133
211
226
323
148
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0
10
199
100 200 300 400 500m/z
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0
10
Rel
ativ
e In
tens
ität [
%]
2,86 E2
1,01 E5
7,12 E5
A
B
C
Abbildung 8.12: Fragmentbildung der Bisphenol A-Derivate unter NCI-Bedingungen. (A): TFAAA-, (B): PFPAA- und (C): HFBAA-Derivat.
78 8 Ergebnisse
148
199
100 200 300 400 500
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
010
20
30
40
50
60
70
80
90
100
010
20
30
40
50
60
70
80
90
100
m/z
nicht nachweisbar
Rel
ativ
e In
tens
ität [
%]
C1,41 E5
B1,01 E5
A
Abbildung 8.13: Fragmentbildung der Octylphenolderivate unter NCI-Bedingungen. (A): TFAAA-, (B): PFPAA- und (C): HFBAA-Derivat.
8 Ergebnisse 79
113
145
212
269
363
148
199
100 200 300 400 500m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
010
20
30
40
50
60
70
80
90
100
010
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Rel
ativ
e In
tens
ität [
%]
C8,89 E5
B7,97 E4
A1,89 E1
Abbildung 8.14: Fragmentbildung der Estronderivate unter NCI-Bedingungen. (A): TFAAA-, (B): PFPAA- und (C): HFBAA-Derivat.
80 8 Ergebnisse
69
113
148
199
430
100 200 300 400 500m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
010
20
30
40
50
60
70
80
90
100
010
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Rel
ativ
e In
tens
ität [
%]
A
5,63 E2
B7,97 E4
C6,75 E5
Abbildung 8.15: Fragmentbildung der Estradiolderivate unter NCI-Bedingungen. (A): TFAAA-, (B): PFPAA- und (C): HFBAA-Derivat.
8 Ergebnisse 81
5995
113
367
148
164
120
199
215
100 200 300 400 500m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
010
20
30
40
50
60
70
80
90
100
010
20
30
40
50
60
70
80
90
100
C3,77 E5
B8,27 E4
Rel
ativ
e In
tens
ität [
%]
A1,13 E2
Abbildung 8.16: Fragmentbildung der Estriolderivate unter NCI-Bedingungen. (A): TFAAA-, (B): PFPAA- und (C): HFBAA-Derivat.
82 8 Ergebnisse
113 167
277
480
148
199
518
100 200 300 400 500m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
010
20
30
40
50
60
70
80
90
100
010
20
30
40
50
60
70
80
90
100
C4,07 E4
B5,18 E4
A5,20 E1
Rel
ativ
e In
tens
ität [
%]
Abbildung 8.17: Fragmentbildung der Ethinylestradiolderivate unter NCI-Bedingungen. (A): TFAAA-, (B): PFPAA- und (C): HFBAA-Derivat.
8 Ergebnisse 83
Die nachweisbaren Spektren wiesen in Abhängigkeit vom Derivatisierungsreagenz typische
Fragmente (Trifluor (3F): m/z = 113; Pentafluor (5F): m/z = 148; Heptafluor (7F): m/z = 199)
auf. Da dies häufig die einzigen Fragmente waren, die im NCI-Modus erhalten wurden,
erschien die Verwendung der NCI-Ionisierung zum substanzspezifischen Nachweis der
EDCs wenig geeignet. Denn die im NCI-Modus aus jedem Derivat erhaltenen Fragmente
waren derivatisierungsreagenz-spezifisch, d.h., sie waren aus der jeweiligen
Carboxylatgruppe und nicht aus der endokrin wirksamen Substanz entstanden. Welcher Teil
der Carboxylatgruppe letztendlich für das Fragment verantwortlich war oder ob das
Fragment durch Reaktion der Carboxylatgruppe mit dem Reaktantgas Methan und
anschließender Fragmentation entstand, konnte mit Hilfe der hier gezeigten Ergebnisse nicht
nachvollzogen werden.
Die quantitative Bestimmung der Substanzen erfolgte deshalb im EI-Modus, wobei jeweils
die Massenspuren der zwei intensivsten Fragmente genutzt wurden. Die hier ausgewählten
Fragmente sind in Tabelle 8.1 aufgelistet. Zur Quantifizierung der NP-Isomeren wurde
zusätzlich noch eine dritte Massenspur hinzugenommen, da die Alkylkette der NP-Isomeren
stark variierende Fragmentintensitäten aufwies. Zur repräsentativen und vollständigen
Erfassung wurden deshalb drei charakteristische NP-Derivatfragmente eingesetzt. Für OP
konnte nur die Massenspur des Molekülionenpeaks ([M]+) genutzt werden, da alle weiteren
vorkommenden Fragmentionen auch in den Spektren der NP-Derivate enthalten waren. Die
Quantifizierung von NP wurde dadurch nicht gestört, da die Spektren der NP-Derivate
genügend Fragmente zeigten, die nicht in den OP-Spektren enthalten waren.
Der Versuch der Quantifizierung im NCI-Modus gestaltete sich sehr viel schwieriger. Hier
war mit Ausnahme der Trifluorderivate meist nur ein Fragmention vorhanden. Dieses
Fragmention war kein substanzspezifisches Fragmention, da es aus dem Teil des Moleküls,
der durch die Derivatisierung angekoppelt worden war, entstand und somit für alle
Substanzen identisch war, d.h., es waren keine substanzspezifischen Fragmentionen
vorhanden. Hinzu kam, dass die NP-Isomeren und das OP als Trifluorderivat nicht detektiert
werden konnten. Dadurch ließ sich die übrige Fragmentvielfalt der Trifluorderivate nicht für
alle Substanzen ausnutzen.
Nach Beurteilung der erhaltenen Ergebnisse und Abwägung aller der Vor- und Nachteile
wurden zur Quantifizierung der ausgewählten EDCs im weiteren Verlauf dieser Arbeit die
Flächen der Peaks der im EI-Modus registrierten Massenspuren der EDCs genutzt. Als
Derivate wurden die aus HFBAA (Heptafluorbuttersäureanhydrid) erzeugten Verbindungen
genutzt.
84 8 Ergebnisse
Tabelle 8.1: Zur Quantifizierung verwendete Ionen (m/z) der unterschiedlichen EDC-Derivate
Fragmentionen (m/z) TFAAA-Derivate
Fragmentionen (m/z) PFPAA-Derivate
Fragmentionen (m/z) HFBAA-Derivate
Analyt
EI NCI EI NCI EI NCI NP 203, 231,
245 n.d. 253, 267,
281 n.d. 303, 331,
345 199
BPA 405, 420 211, 323 505, 520 148 605, 620 199
OP 302 n.d. 352 148 402 199
E1 322, 366 269 372, 416 148 422, 466 199
E2 351, 464 133 429, 564 148 237, 451 199
E3 235, 349 367 399, 726 164 235, 449 215
EE2 359, 374 277 396, 424 148 446,474 199 n.d.: nicht detektierbar
8.1.2 Empfindlichkeit des massenspektrometrischen Detektors in Abhängigkeit des Derivatisierungreagenzes
Da die NCI-Massenspektren aufgrund fehlender Selektivität wenig aussagekräftig waren und
zudem nicht für jede Substanz detektierbar waren, wurde auf die Bestimmung der
Nachweisgrenze mit Hilfe der NCI-Detektion verzichtet. Die NG (Tabelle 8.2) im EI-Modus
lagen für die EDCs aus einer Standardlösung und ohne eine vorherige Anreicherung für alle
Derivate bei ca. 1 µg/mL. Für keines der untersuchten Derivatisierungsreagenzien ließen
sich signifikant bessere Nachweisgrenzen erreichen. Da die NG von EE2 als Trifluorderivat
und die NG von E2 als Pentafluorderivat aufgrund von Schwankungen in der
Kalibrationsgerade nicht bestimmbar war, konnte die Derivatisierung mittels
Heptafluorbuttersäureanhydrids als die Methode der Wahl bezeichnet werden.
Tabelle 8.2: Massenspektrometrische Nachweisgrenzen, bestimmt im EI-Modus, in Abhängigkeit von den verschiedenen Derivatisierungsreagenzien
Analyt TFAAA-Derivate [µg/mL] PFPAA-Derivate [µg/mL] HFBAA-Derivate [µg/mL] NP 0,96 1,19 0,11
BPA 0,33 1,80 0,35
OP 0,72 1,67 0,87
E1 0,98 1,59 0,97
E2 0,80 n.a. 1,61
E3 0,56 1,71 1,38
EE2 n.a. 1,21 0,67 n.a. nicht auswertbar
8 Ergebnisse 85
8.1.3 Responsefaktoren
Damit eine Quantifizierung mittels internem Standard erfolgen konnte, sollten die
Responsefaktoren (Definition und Berechnung siehe Abschnitt 7.1.3) möglichst konstant sein
und im Idealfall nahe bei 1 liegen. Diese Konstanz war aber wie in Tabelle 8.3 zusehen in
keinem Fall gegeben. Der Fehler bei der zwölffachen Bestimmung der Responsefaktoren,
ausgedrückt als Variationskoeffizient liegt zwischen 9,5 % für BPA und 94,3 % für NP. Da
keine Konstanz der Faktoren gegeben war, wurde auf eine Quantifizierung mittels internem
Standard verzichtet und auf eine Quantifizierung mittels externem Standard zurückgegriffen.
Tabelle 8.3: Ermittelte Responsefaktoren der estrogen wirksamen EDCs bei der MS-Detektion im EI- Modus
Analyt Mittelwert Responsefaktoren
Standardabweichung[± s]
Variationskoeffizient[%]
NP 0,92 0,87 94,3
BPA 0,83 0,08 9,51
OP 1,47 0,74 50,1
E1 1,04 0,39 37,8
E2 0,71 0,38 53,8
E3 0,53 0,29 54,7
EE2 1,81 1,40 77,1
8.2 Analytische Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen aus wässrigen Matrices
Die Ergebnisse der chromatographischen Trennung von realen (nicht dotieren) und dotierten
Abwasserproben nach MS-Detektion im EI-Modus werden in den Abbildungen 8.18 und 8.19
gezeigt. Sowohl im TIC des Zulaufs als auch des Ablaufs waren in der Blindprobe keine
EDCs erkennbar. Erst die Massenspuranalyse machte deutlich, dass sowohl im Zulauf als
auch im Ablauf NP und BPA enthalten waren. In den dotierten Proben waren die EDCs
bereits im TIC erkennbar, wurden aber teilweise noch durch Matrixkomponenten überlagert.
In den RICs konnte durch gezielte Auswahl der Massenspuren die Matrix weitestgehend
ausgeblendet werden, so dass eine Quantifizierung erfolgen konnte.
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NP
OP
BPA
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E3E2
E1
Rel
ativ
e In
tens
ität [
%]
AZulauf blind
TIC
4,24 E5
5,28 E3
1,52 E3
BZulauf blind
Massenspuren Xenoestrogene
CZulauf blind
Massenspuren Steroide
DZulauf dotiert
TIC
EZulauf dotiert
Massenspuren Xenoestrogene
FZulauf dotiert
Massenspuren Steroide
3,15 E5
1,27 E5
3,57 E5
Zeit [min] Abbildung 8.18: Totalionenstrom- und Massenspurchromatogramme von Extrakten aus Kläranlagenzuläufen: (A): TIC einer undotierten Zulaufprobe, derivatisiert mit HFBAA; (B): RIC von (A) der Xenoestrogene NP (m/z:303, 331, 345), BPA (m/z: 605, 620) und OP (m/z: 402): (C): RIC von (A) der Steroide E1 (m/z: 422, 466); E2 (m/z: 237, 451); E3 (m/z: 235, 449) und EE2 (m/z: 446, 474); (D): TIC einer mit den sieben EDCs dotierten Zulaufprobe (c = 20 µg/L), derivatisiert mit HFBAA; (E): RIC von (D) der Xenoestrogene (m/z: siehe B); (F): RIC von (D) der Steroide (m/z: siehe C)
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NP
BPA
NP
OP
BPA E3
E2
E1EE2
NP
OP
BPA
EE2
E3
E2E1
Rel
ativ
e In
tens
ität [
%]
Zeit [min]
AAblauf blind
TIC
BAblauf blind
Massenspuren Xenoestrogene
CAblauf blind
Massenspuren Steroide
DAblauf dotiert
TIC
EAblauf dotiert
Massenspuren Xenoestrogene
FAblauf dotiert
Massenspuren Steroide
2,20 E5
4,80 E3
1,07 E3
8,86 E5
4,51 E5
2,91 E5
Abbildung 8.19: Totalionenstrom- und Massenspurchromatogramme von Extrakten aus Kläranlagenabläufen: (A): TIC einer undotierten Ablaufprobe, derivatisiert mit HFBAA; (B): RIC von (A) der Xenoestrogene NP (m/z:303, 331, 345), BPA (m/z: 605, 620) und OP (m/z: 402): (C): RIC von (A) der Steroide E1 (m/z: 422, 466); E2 (m/z: 237, 451); E3 (m/z: 235, 449) und EE2 (m/z: 446, 474); (D): TIC einer mit den sieben EDCs dotierten Ablaufprobe (c = 20 µg/L), derivatisiert mit HFBAA; (E): RIC von (D) der Xenoestrogene (m/z: siehe B); (F): RIC von (D) der Steroide (m/z: siehe C)
88 8 Ergebnisse
8.2.1 Validierung der zur Bestimmung von EDCs aus wässrigen Matrices eingesetzten Methode
8.2.1.1 Bestimmung der Wiederfindungen
Nach Anreicherung auf 500 mg C18-Material lagen die Wiederfindungen, wie in Tabelle 8.4
zu sehen, sowohl in den Extrakten aus dotierten demineralisierten Wasser als auch in den
Extrakten aus den dotierten Zulauf- und Ablaufproben unter 72,3 % (meistens sogar noch
weit darunter). Das lässt vermuten, dass die Kapazität der Kartuschen erschöpft war. Da
diese Wiederfindungen nicht akzeptabel waren, wurde auf eine Wiederholung der
Untersuchungen verzichtet.
Durch Verdopplung der Menge an Adsorbens erhöhten sich die Wiederfindungen
(Tabelle 8.4). Sie lagen für Extrakte aus dotiertem demineralisiertem Wasser zwischen
89,4 % für E3 und 119,0 % für NP. Die Wiederfindungen in Extrakten aus dotierten
Zulaufproben betrugen minimal 76,7 % für EE2 und maximal 112,9 % für NP. In den
Extrakten aus den dotieren Ablaufproben lagen die Wiederfindungen zwischen 84,1 % für E1
und 122,9 % für BPA. Die Wiederfindungen lagen damit im akzeptablen Bereich von 80-
120 % und deshalb wurden für die weitere Anreicherungen aus wässrigen Proben C18-
Kartuschen mit 1000 mg Füllung eingesetzt. Um diese Ergebnisse zu bestätigen, wurde die
Bestimmung der Wiederfindungen an 1000 mg Adsorbens als Dreifachbestimmung
durchgeführt. Der Variationskoeffizient lag im Bereich von 2,1 und 23,7 %. Unter
Berücksichtigung der komplexen Matrix waren dies realistische Werte.
Tabelle 8.4: Wiederfindungen der EDCs in wässrigen Medien
Wiederfindung [%] ± Variationskoeffizient [%] Analyt demineralisiertes Wasser Zulauf Ablauf
500 mg 1000 mg a) 500 mg 1000 mg a) 500 mg 1000 mg a)
NP 35,8 119,0 ± 17,3 61,4 112,9 ± 9,1 39,4 116,3 ± 3,0
BPA 72,3 114,8 ± 3,8 14,3 92,3 ± 8,9 49,6 122,9 ± 5,5
OP n.b. 106,4 ± 6,4 n.b. 105,6 ± 3,3 n.b. 99,0 ± 17,4
E1 61,1 100,2 ±2,9 10,2 93,0 ± 3,0 38,3 84,1 ± 2,6
E2 59,9 115,7 ± 2,4 36,3 102,7 ± 2,1 20,2 88,7 ± 12,5
E3 45,9 89,4 ± 20,7 9,7 86,1 ± 23,7 12,7 104,1 ± 4,9
EE2 25,1 100,5 ± 8,3 5,5 76,7 ± 18,7 20,7 99,4 ± 8,0 a) Mittelwert aus jeweils einer Dreifachbestimmung
n.b.: nicht bestimmt
8 Ergebnisse 89
8.2.1.2 Reproduzierbarkeit der Bestimmungsmethode
Der Fehler, der bei einer fünfmaligen Bestimmung der endokrin wirksamen Substanzen aus
Reinstwasser, entstand, lag, wie Tabelle 8.5 zeigt, zwischen 1,5 und 17,2 %. Wurden reale
Proben untersucht, sank der Fehler und die Ergebnisse waren noch besser reproduzierbar.
Für Zulaufproben lag der Fehler für die einzelnen Substanzen zwischen 1,7 und 7,5 %
(Tabelle 8.6). Bei der Ablaufprobe sah das Ergebnis ähnlich aus. Dort waren die Ergebnisse
mit einem Fehler von 3,0–6,8 % reproduzierbar (Tabelle 8.7).
Tabelle 8.5: Reproduzierbarkeit der Bestimmungsmethode (Matrix: Reinstwasser)
Analyt Mittelwert Peakflächen
Standardabweichung [± s]
Variationskoeffizient [%]
NP 533934 32068 6,0
BPA 920436 13698 1,5
OP 194872 13305 6,8
E1 202032 34694 17,2
E2 376107 25792 6,9
E3 365840 26196 7,2
EE2 204053 17072 8,4
Tabelle 8.6: Reproduzierbarkeit der Bestimmungsmethode (Matrix: Zulauf)
Analyt Mittelwert Peakflächen
Standardabweichung [± s]
Variationskoeffizient [%]
NP 205683 9104 4,4
BPA 293436 7395 2,5
OP 87222 2100 2,4
E1 71881 1187 1,7
E2 77517 5820 7,5
E3 115715 3463 3,0
EE2 42136 2036 4,8
90 8 Ergebnisse
Tabelle 8.7: Reproduzierbarkeit der Bestimmungsmethode (Matrix: Ablauf)
Analyt Mittelwert Peakflächen
Standardabweichung [± s]
Variationskoeffizient [%]
NP 307944 18669 6,1
BPA 876493 26322 3,0
OP 121306 8214 6,8
E1 265060 16940 6,4
E2 362540 17249 4,8
E3 653043 36622 5,6
EE2 265502 12815 4,8
8.2.1.3 Ermittlung der Nachweis- und Bestimmungsgrenzen
Die Nachweis- und Bestimmungsgrenzen für endokrin wirksame Substanzen aus Abwässern
wurden nach der Kalibrationsgeradenmethode der DIN 32645 (1994) bestimmt. Die genauen
Werte für die NG und BG, sowie der Korrelationskoeffizient als Maß für die Linearität der
Kalibrationsgeraden sind in Tabelle 8.8 aufgelistet. Die Nachweisgrenzen der endokrin
wirksamen Substanzen lagen in Zulaufproben zwischen 2,7 ng/L und 7,7 ng/L. Die
Nachweisgrenzen in den Ablaufproben lagen in einem ähnlichen Bereich zwischen 1,1 ng/L
und 9,8 ng/L. Da die Korrelationskoeffizienten nur wenig von 1 abwichen, war die Methode
über den untersuchten Bereich linear.
Tabelle 8.8: Nachweis- (NG) und Bestimmungsgrenzen (BG) der Analyten sowie deren Korrelationskoeffizienten, bestimmt aus Abwässern
Zulauf Ablauf Analyt NG
[ng/L] BG
[ng/L] Korrelations-koeffizient
[r2] NG
[ng/L] BG
[ng/L] Korrelations-koeffizient
[r2]
NP 5,5 8,3 0,9979 6,6 9,9 0,9999
BPA 7,7 11,6 0,9964 4,8 7,2 0,9999
OP 3,2 4,8 0,9993 9,8 14,7 0,9998
E1 7,5 11,2 0,9998 7,2 10,7 0,9999
E2 3,6 5,4 1,0000 5,4 8,2 0,9999
E3 5,2 7,7 0,9999 6,7 10,1 0,9999
EE2 2,7 4,1 1,0000 1,1 1,6 0,9998
8 Ergebnisse 91
8.3 Analytische Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen aus Klärschlämmen
In Abbildung 8.20 sind die Ergebnisse der gaschromatographischen Trennung von
Belebtschlammextrakten dargestellt. In der undotierten Probe war nur Bisphenol A
nachweisbar, wie im „RIC Xenoestrogene“ zu erkennen ist. Wurde der Belebtschlammextrakt
dotiert, waren die Signale mit guten S/N- Verhältnissen schon im TIC erkennbar, eine
Quantifizierung war allerdings noch nicht möglich, da keine klare Basislinie zu erkennen war.
Im RIC, das nur die Massenspuren ausgewählter Fragmente der Analyten wiedergibt, wurde
die Matrix ausgeblendet und die Signale wurden deutlicher erkennbar.
In der Blindprobe des Faulschlammextraktes (Abbildung 8.21) war NP vorhanden. Die
dotierte Probe zeigte die gleichen Ergebnisse wie der dotierte Belebtschlamm, so dass die
chromatographische Trennung für beide Schlammarten angewendet werden konnte.
8.3.1 Vorversuche zur Probenaufreinigung
Da Schlammextrakte im Vergleich zu Abwässern eine in Konzentration und Vielfalt sehr viel
komplexere Matrix enthalten, war zu überprüfen, in wie weit sich eine Erhöhung der Menge
und eine Änderung der Art des Adsorbens auf die Wiederfindungen einer EDC-
Standardlösung auswirkten. Die Ergebnisse wurden mit denen der Reinigung für
Abwässerextrakte verglichen.
In Abbildung 8.22 werden die Wiederfindungen an Kieselgel gezeigt, wobei unterschiedliche
Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemische zur Elution (Probenummern vgl. Abschnitt 7.3.1)
eingesetzt wurden. Erkennbar wurde, dass die Probe Nr. 13, die unter denselben
Bedingungen behandelt wurde, wie die Abwässer, Resultate erbrachte, die am nächsten an
100 % heranreichten.
Florisil und Aluminiumoxid eigneten sich nicht als Adsorbens (Abbildung 8.23) im
Reinigungsprozess. Dort lagen die Wiederfindungen immer unterhalb von 60 %. Die
Reinigung, die bereits bei den Abwasserextrakten erfolgreich eingesetzt wurde, wurde für die
Reinigung der Schlammextrakte übernommen.
92 8 Ergebnisse
10 15 20 25 30 35
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BPA
NPOP
BPA
EE2
E2 + E3
E1
NP
BPA
OP
EE2
E2 + E3
E1
Zeit [min]
FBelebtschlamm dotiert
Massenspuren Steroide
EBelebtschlamm dotiert
Massenspuren Xenoestrogene
DBelebtschlamm dotiert
TIC
CBelebtschlamm blind
Massenspuren Steroide
BBelebtschlamm blind
Massenspuren Xenoestrogene
ABelebtschlamm blind
TIC
8,71 E5
9,27 E3
3,86 E3
3,58 E5
9,44 E4
5,82 E4
Rel
ativ
e In
tens
ität [
%]
Abbildung 8.20: Totalionenstrom- und Massenspurchromatogramme von Belebtschlammextrakten: (A): TIC eines undotierten Belebtschlamms, derivatisiert mit HFBAA; (B): RIC von (A) der Xenoestrogene NP (m/z:303, 331, 345), BPA (m/z: 605, 620) und OP (m/z: 402): (C): RIC von (A) der Steroide E1 (m/z: 422, 466); E2 (m/z: 237, 451); E3 (m/z: 235, 449) und EE2 (m/z: 446, 474); (D): TIC eines mit den sieben EDCs dotierten Belebtschlamms (c = 30 µg/g TS), derivatisiert mit HFBAA; (E): RIC von (D) der Xenoestrogene (m/z: siehe B); (F): RIC von (D) der Steroide (m/z: siehe C)
8 Ergebnisse 93
NP
100
80
60
40
20
0
100
80
60
40
20
0
100
80
60
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20
0
100
80
60
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0
100
80
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20
0100
80
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100
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0
100
80
60
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0
100
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20
0
100
80
60
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20
0100
80
60
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20
0
100
80
60
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0
100
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40
20
0
100
80
60
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0
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40
20
0
100
80
60
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20
0
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40
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0
100
80
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20
0100
80
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0
100
80
60
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0
100
80
60
40
20
0
100
80
60
40
20
0
100
80
60
40
20
0100
80
60
40
20
0
100
80
60
40
20
0
100
80
60
40
20
0
100
80
60
40
20
0
100
80
60
40
20
010 15 20 25 30 35
NPOP
BPAE2 + E3
NP
OP
BPA
EE2
E2 + E3
E1
Zeit [min]
Rel
ativ
e In
tens
ität [
%]
FFaulschlamm dotiert
Massenspuren Steroide
2,38 E3
EFaulschlamm dotiert
Massenspuren Xenoestrogene
4,76 E3
DFaulschlamm dotiert
TIC
2,97 E4
CFaulschlamm blind
Massenspuren Steroide
9,30 E1
BFaulschlamm blind
Massenspuren Xenoestrogene
3,17 E2
AFaulschlamm blind
TIC
1,96 E4
Abbildung 8.21: Totalionenstrom- und Massenspurchromatogramme von Faulschlammextrakten: (A): TIC eines undotierten Faulschlamms, derivatisiert mit HFBAA; (B): RIC von (A) der Xenoestrogene NP (m/z:303, 331, 345), BPA (m/z: 605, 620) und OP (m/z: 402): (C): RIC von (A) der Steroide E1 (m/z: 422, 466); E2 (m/z: 237, 451); E3 (m/z: 235, 449) und EE2 (m/z: 446, 474); (D): TIC eines mit den sieben EDCs dotierten Faulschlamms (c = 30 µg/g TS), derivatisiert mit HFBAA; (E): RIC von (D) der Xenoestrogene (m/z: siehe B); (F): RIC von (D) der Steroide (m/z: siehe C)
94 8 Ergebnisse
0
50
100
150
200
1 2 7 8 9 10 11 12 13
Probennummer
Wie
derf
indu
ngen
[%]
NP BPA OP E1 E2 E3 EE2
Abbildung 8.22: Wiederfindungen der EDCs nach Reinigung an Kieselgel mit verschiedenen Elutionslösungsmitteln
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
3 4 5 6
Probennummer
Wie
derf
indu
ngen
[%]
NP BPA OP E1 E2 E3 EE2
Abbildung 8.23: Wiederfindungen der EDCs nach Reinigung an Florisil und Aluminiumoxid
8 Ergebnisse 95
8.3.2 Vorversuche zur Derivatisierung
Die Überprüfung der zur Derivatisierung eingesetzten Menge an HFBAA zeigte, dass auch
hier die Verwendung von 30 µL Reagenz pro Probe die optimale Menge zur Derivatisierung
der EDCs aus Schlammextrakten darstellte (Abbildung 8.24). Bei einer weiteren Erhöhung
der Reagenzmenge sanken die Wiederfindungen kontinuierlich. Im Folgenden wurden
deshalb weiterhin 30 µL HFBAA verwendet.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
20 30 40 50 60 70
Menge HFBAA [µL]
Wie
derf
indu
ng [%
]
NP BPA OP E1 E2 E3 EE2
Abbildung 8.24: Wiederfindungen in Abhängigkeit von der Menge des verwendeten HFBAA
8.3.3 Einfluss unterschiedlicher ASE – Extraktionsparameter auf die Wiederfindung der Analyten
Ausgehend von der von Meesters et al. (2002) veröffentlichten Methode zur Extraktion für
NP und BPA mittels ASE (Lösungsmittel: Ethylacetat/Ameisensäure, Temperatur 170 °C,
Druck 2000 psi, 1 Extraktionscyclus und 2 g Einwaage) wurde zunächst der Einfluss des
Lösungsmittels auf die Wiederfindungen der Analyten getestet.
Die Abbildungen 8.25 und 8.26 zeigen die Ergebnisse für sieben Lösungsmittel. Dabei wurde
der Schlammextrakt im Anschluss in Wasser gelöst und an C18-Material angereichert. Nach
einer Elution mit Aceton folgte eine Reinigung an Kieselgel. Die Analyten wurden mit einem
96 8 Ergebnisse
Aceton/Pentan-Gemisch (2 + 1) eluiert. Die anschließende Derivatisierung wurde in
Abschnitt 8.3.2 beschrieben (Abbildung 8.25). Abbildung 8.26 zeigt die Ergebnisse derselben
Extrakte ohne Lösen in Wasser und Anreicherung, nur an Kieselgel gereinigt. Die Elution der
Analyten und die Derivatisierung wurde nicht verändert.
0,0
50,0
100,0
150,0
200,0
250,0
300,0
Ethylacetat Methanol Dichlormethan Toluol Acetonitril Aceton Methanol Faul
Extraktionslösungsmittel
Wie
derf
indu
ng [%
]
NP BPA OP E1 E2 E3 EE2
Abbildung 8.25: Wiederfindungen nach Resuspendierung des Extraktes in Wasser, Anreicherung auf C18-Material und einem Kieselgel-clean-up
Mit vorhergehender Anreicherung liegen die Ergebnisse generell näher bei 100 %.
Außerdem entstand bei alleiniger Verwendung des Kieselgel clean-ups ohne eine vorherige
Reinigung durch Lösen in Wasser und erneuter Anreicherung an C18-Material bei der
Aufkonzentrierung ein hochviskoser schwarzer Rückstand, der nur schwer in Aceton wieder
aufnehmbar war und das GC/MS-System schnell stark verschmutzte. Die Konzentrate nach
einem zusätzlichen wässrigen Zwischenreinigungsschritt waren deutlich besser in Aceton
löslich und waren auch nur noch schwach gefärbt. Deshalb war es notwendig der Reinigung
mittels Kieselgels die zusätzliche Anreicherung an C18-Material vorzuschalten. Von den
sieben Lösungsmitteln lieferte Methanol das beste Ergebnis. Bis auf E2, das zu 50 % und
E1, das mit einer Wiederfindung weit über 200 % zurückgefunden wurde, lagen die
Wiederfindungen bei 100 %. Methanol wurde als Lösungsmittel für die weiteren Extraktionen
verwendet.
8 Ergebnisse 97
0,0
50,0
100,0
150,0
200,0
250,0
300,0
Methanol Dichlormethan Toluol Acetonitril Aceton Methanol Faul
Extraktionslösungsmittel
Wie
derf
indu
ng [%
]
NP BPA OP E1 E2 E3 EE2
Abbildung 8.26: Wiederfindungen nach Kieselgel-clean-up
Wie aus den Balkendiagrammen in den Abbildungen 8.27-8.31 ersichtlich wird, bestimmen
mehrere Einflussgrößen die Wiederfindungen der EDCs.
Temperatureinfluss:
Die Varianz der Temperatur (Abbildung 8.27) zeigte schlechte Wiederfindungen für 150 °C
und 200 °C. Zwischen 100 °C und 170 °C waren die Unterschiede geringer. Bei 100 °C
lagen die Wiederfindungen für BPA und OP zwischen 110–120 %, EE2 wurde sogar mit
130 % wiedergefunden. E3 hatte dagegen eine Wiederfindung von nur 70 %. Bei 170 °C
lagen die Wiederfindungen mit Ausnahme von E1 und E2 alle um 100 %. 170 °C wurde
deshalb als Temperatureinstellung übernommen.
Druckeinfluss:
Im nächsten Schritt wurde der Einfluss des Drucks untersucht (Abbildung 8.28). Bei 1000
und 1500 psi lagen die Wiederfindungen alle weit unter 50 %, so dass ein Druck von
2000 psi nötig war, um Wiederfindungen von rund 100 % zu erhalten.
98 8 Ergebnisse
Zeiteinfluss:
Als Extraktionszeiten wurden 15, 45 und 60 min gewählt (Abbildung 8.29). Bei 15 und 60 min
war insbesondere die Wiederfindung von EE2 sehr niedrig und die Wiederfindung von E3
über 150 %. Deshalb wurde die Extraktionszeit bei 45 min belassen.
Einfluss der Anzahl der Extraktionscyclen:
Die Erhöhung der Anzahl der Extraktionscyclen (Abbildung 8.30) hatte keinen verbessernden
Einfluss auf die Wiederfindungen. Die weiteren Extraktionen wurden deshalb mit nur einem
Extraktionscyclus durchgeführt.
Einfluss der Probemenge:
Zum Schluss wurde der Einfluss der Probemenge untersucht. Sie wurde auf 1 g halbiert und
auf 4 g verdoppelt. (Abbildung 8.31) Bei 4 g Einwaage sanken die Wiederfindungen,
während sie bei 1 g Einwaage etwa identisch blieben. Da eine höhere Einwaage als 1 g für
die Nachweis- und Bestimmungsgrenzen vorteilhafter war, 4 g jedoch Minderbefunde
verursachte, wurde als Kompromiss für die weiteren Untersuchungen 2 g Probematerial
eingesetzt.
0,0
50,0
100,0
150,0
200,0
250,0
300,0
100 150 170 200
Temperatur [°C]
Wie
derf
indu
ng [%
]
NP BPA OP E1 E2 E3 EE2
Abbildung 8.27: Wiederfindungen in Abhängigkeit von der Temperatur
8 Ergebnisse 99
0,0
50,0
100,0
150,0
200,0
250,0
300,0
1000 1500 2000
Druck [psi]
Wie
derf
indu
ng [%
]
NP BPA OP E1 E2 E3 EE2
Abbildung 8.28: Wiederfindungen in Abhängigkeit vom Druck
0,0
50,0
100,0
150,0
200,0
250,0
300,0
15 45 60
Extraktionszeit [min]
Wie
derf
indu
ng [%
]
NP BPA OP E1 E2 E3 EE2
Abbildung 8.29: Wiederfindungen in Abhängigkeit von der Extraktionszeit
100 8 Ergebnisse
0,0
50,0
100,0
150,0
200,0
250,0
300,0
1 2 3
Extraktionscyclen
Wie
derf
indu
ng [%
]
NP BPA OP E1 E2 E3 EE2
Abbildung 8.30: Wiederfindung in Abhängigkeit von den Extraktionscyclen
0,0
50,0
100,0
150,0
200,0
250,0
300,0
1 2 4
Einwaage [g]
Wie
derf
indu
ng [%
]
NP BPA OP E1 E2 E3 EE2
Abbildung 8.31: Wiederfindungen in Abhängigkeit von der Probemenge
8 Ergebnisse 101
Allen durchgeführten Extraktionen war gemeinsam, dass die Wiederfindung von E1
unrealistisch hoch lag, während die Wiederfindung für E2 nie über 50 % hinausging. Da E1
ein Metabolit von E2 ist, lag die Vermutung nahe, dass die Menge des während der
Herstellung des dotierten Materials zur Abtötung der Mikroorganismen zugegebenen
Natriumazids nicht ausreichend war, um die E2 abbauenden Bakterien vollständig abzutöten.
Während der 24 stündigen Homogenisierung wurde dann wahrscheinlich ein großer Teil des
E2 zu E1 metabolisiert. Um dies zu überprüfen, wurde ein Teil eines Belebtschlamms mit
0,1 % Natriumazid und mit E1 (Probe 19), ein Teil mit 0,1 % Natriumazid und mit E2
(Probe 20), ein Teil mit E1 und E2 (Probe 21) sowie ein Teil mit E2 und der zehnfachen
Menge Natriumazid (1%) (Probe 22) versetzt und wie beschrieben behandelt. Die nur mit E1
(Tabelle 8.9) dotierte Probe zeigte mit 77,4 % eine akzeptable Wiederfindung von E1. Waren
E1 und E2 gemeinsam enthalten, entstand das bekannte Bild, hohe Wiederfindung für E1,
niedrige für E2. In den beiden Proben, die nur E2 enthielten, war E1 nachweisbar. Selbst die
höhere Menge an Natriumazid konnte den biologischen Abbau von E2 zu E1 nicht
verhindern.
Tabelle 8.9: Wiederfindungen von E1 und E2, bestimmt zur Überprüfung des mikrobiellen Abbaus von E2 zu E1
Wiederfindungen [%] Probe Nr. E1 E2
19 77,4 -
20 nachweisbar, obwohl nicht zudotiert
21,0
21 123,0 43,6
22 nachweisbar, obwohl nicht zudotiert
6,6
102 8 Ergebnisse
0,0
50,0
100,0
150,0
200,0
Belebtschlamm Faulschlamm
Schlammart
Wie
derf
indu
ng [%
]
NP BPA OP E1 E2 E3 EE2
Abbildung 8.32: Wiederfindungen in sterilisierten Schlämmen
Zur Überprüfung, ob der mikrobielle Abbau von E2 der einzige Grund für die niedrigen
Wiederfindungen von E2 war oder ob die Extraktionsmethode noch weiter optimiert werden
musste, wurde eine Belebt- und eine Faulschlammprobe vor dem Zudotieren der endokrin
wirksamen Substanzen sterilisiert (Abbildung 8.32). Die weitere Behandlung war identisch.
Durch diese Vorbehandlung erreichte die Wiederfindung für E1 ca. 90 % und die
Wiederfindung von E2 stieg auf etwa den gleichen Wert. Damit lagen die Wiederfindungen
der sieben endokrin wirksamen Substanzen alle in akzeptabelen Bereichen. Die optimierten
Extraktionsparameter (Lösungsmittel Methanol, Temperatur 170 °C, Druck 2000 psi,
Extrationszeit 45 min, Anzahl der Extraktionscyclen 1, Einwaage 2 g) konnten zur Analyse
der EDCs aus Schlämmen genutzt werden.
Um die mikrobielle Umsetzung von E2 zu E1 möglichst gering zu halten, wurden den realen
Schlammproben möglichst direkt nach der Probenahme das Wasser durch Gefriertrocknung
entzogen.
8 Ergebnisse 103
8.3.4 Validierung der zur Bestimmung von EDCs aus Klärschlämmen eingesetzten Methode
8.3.4.1 Bestimmung der Wiederfindungen
Zur Bestimmung der Wiederfindungen wurden der dotierte und sterilisierte Belebt- und
Faulschlamm dreimal mit Hilfe der optimierten ASE-Methode extrahiert (Abschnitt 8.3.3). Der
Gehalt einer Blindprobe wurde von dem erhaltenen Ergebnis subtrahiert. Die Ergebnisse
sind in Tabelle 8.10 zusehen. Die Werte für die Wiederfindungen lagen im Belebtschlamm
zwischen 81,9 % für EE2 und 115,8 % für OP. Im Faulschlamm lagen die Werte zwischen
84,2 % für E3 und 101,3 % für EE2. Die Variationskoeffizienten, als Maß für die
Fehlerangabe der Bestimmung, liegen zwischen 1,6 und 18,2 %. Unter Berücksichtigung der
komplexen Matrix und dem geringen Gehalt an Analyten ist dies ein akzeptabler Bereich.
Tabelle 8.10: Wiederfindungen der sieben EDCs aus Belebt- und Faulschlamm, mittels optimierter Methodenparameter bestimmt
Wiederfindungen [%] a) ± Variationskoeffizient [%]Analyt Belebtschlamm Faulschlamm
NP 108,1 ± 5,5 100,7 ± 6,6
BPA 97,8 ± 7,4 83,1 ± 2,2
OP 115,8 ± 1,6 94,7 ± 17,4
E1 90,7 ± 4,8 89,8 ± 8,2
E2 88,9 ± 14,9 86,5 ± 6,6
E3 106,2 ± 3,2 84,2 ± 4,3
EE2 81,9 ± 18,2 101,3 ± 15,9 a) Mittelwert aus einer Dreifachbestimmung
8.3.4.2 Reproduzierbarkeit der Bestimmungsmethode
Der Fehler, der bei fünfmaliger Injektion ein und derselben Probe entstand, lag bei der
Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen aus Belebtschlammextrakten zwischen 0,6 und
6,0 % (Tabelle 8.11). Bei der Untersuchung von Faulschlammextrakten ergab sich ein
ähnliches Bild mit einem Fehler von 0,6–5,9 % (Tabelle 8.12).
104 8 Ergebnisse
Tabelle 8.11: Reproduzierbarkeit der Bestimmungsmethode (Matrix: Belebtschlamm)
Analyt Mittelwert Peakflächen
Standardabweichung [± s]
Variationskoeffizient [%]
NP 75401 1470 1,9
BPA 124547 3508 2,8
OP 11757 702 6,0
E1 16871 490 2,9
E2 35658 853 2,4
E3 73868 420 0,6
EE2 3822 58 1,5
Tabelle 8.12: Reproduzierbarkeit der Bestimmungsmethode (Matrix: Faulschlamm)
Analyt Mittelwert Peakflächen
Standardabweichung [± s]
Variationskoeffizient [%]
NP 85128 1353 1,6
BPA 129927 5725 4,4
OP 11869 697 5,9
E1 17450 340 1,9
E2 35581 947 2,7
E3 72770 414 0,6
EE2 4169 203 4,9
8.3.4.3 Ermittlung der Nachweis- und Bestimmungsgrenzen
Die Nachweis- und Bestimmungsgrenzen für die ausgewählten endokrin wirksamen
Substanzen aus Belebtschlamm wurden nach der Kalibrationsgradenmethode der
DIN 32645 (1994) bestimmt. Die genauen Werte für die NG und BG, sowie der
Korrelationskoeffizient als Maß für die Linearität der Kalibrationsgerade sind in Tabelle 8.13
aufgelistet. Die NG liegen zwischen 1,5 µg/g TS für EE2 und 2,9 µg/g TS für BPA. Die
entsprechenden BG liegen zwischen 2,2 µg/g TS für EE2 und 4,7 µg/g TS für BPA. Die
Korrelationskoeffizienten liegen alle in der Nähe von 1, so dass die Methode über den
untersuchten Bereich linear ist.
8 Ergebnisse 105
Tabelle 8.13: Nachweis- und Bestimmungsgrenzen der Analyten sowie deren Korrelationskoeffizienten, bestimmt aus Belebtschlamm
Analyt NG [µg/g TS] ± Variationskoeffizient [%]
BG [µg/g TS] ± Variationskoeffizient [%]
Korrelationskoeffizient [r2]
NP 2,0 ± 14,2 3,0 ±14,4 0,9994
BPA 2,9 ± 19,5 4,7 ±19,9 0,9983
OP 2,5 ± 13,6 3,3 ±32,5 0,9992
E1 2,8 ± 5,5 3,7 ±22,0 0,9996
E2 1,8 ± 35,4 2,7 ±35,3 0,9997
E3 2,7 ± 21,0 4,0 ±20,8 0,9995
EE2 1,5 ± 51,2 2,2 ±51,1 0,9995
8.4 Analytische Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen aus Sedimenten
Abbildung 8.33 zeigt das Ergebnis gaschromatographischer Trennungen eines undotierten
und eines mit den sieben ausgewählten EDCs dotierten Sediments. Im TIC der Blindprobe
war noch keine endokrin wirksame Substanz erkennbar. Erst im RIC mit den Massenspuren
der Xenoestrogene ließ sich das Vorhandensein von Bisphenol A bestätigen. Steroidale
EDCs waren dagegen nicht nachweisbar. Die gaschromatographische Trennung des mit den
ausgewählten EDCs dotierten Sediments zeigte dagegen bereits im TIC-Chromatogramm,
mit Ausnahme von NP, das Vorhandensein der EDCs an. Jedoch aufgrund des hier
beobachtbaren ungünstigen S/N-Verhältnisses war eine Quantifizierung noch nicht möglich,
da durch Überlagerung mit Signalen der Matrix keine klare Basislinie zu erkennen war. Im
sodann ausgewählten RIC ließ sich durch Darstellung der EDC-relevanten Massenspuren
die Matrix so ausblenden, dass die Trennung der EDCs sofort erkennbar und damit eine
Quantifizierung möglich wurde. Die Signale von E2 und E3 sind nicht basisliniengetrennt.
Ursache bei diesem chromatographischen Lauf war der aktuelle Zustand der verwendeten
GC-Säule. Diese war zuvor bereits für eine große Anzahl von Trennungen verwendet
worden. Dennoch war eine Quantifizierung möglich, da die nicht-basisliniengetrennten
Substanzen unterschiedliche Massenfragmente ausbildeten. Über diese erfolgte mittels ihrer
Massenspuren dann die Quantifizierung.
106 8 Ergebnisse
BPA
100
80
60
40
20
0
100
80
60
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100
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80
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20
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100
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60
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20
0
100
80
60
40
20
010 15 20 25 30 35
BPAOP
E2 + E3 E1
NP
OP
BPA
EE2
E2 + E3
E1
Rel
ativ
e In
tens
ität [
%]
ASediment blind
TIC
2,19 E4
BSediment blind
Massenspuren Xenoestrogene
4,62 E2
CSediment blind
Massenspuren Steroide
1,99 E2
DSediment dotiert
TIC
2,50 E5
ESediment dotiert
Massenspuren Xenoestrogene
3,98 E4
FSediment dotiert
Massenspuren Steroide
9,85 E3
Zeit [min] Abbildung 8.33: Totalionenstrom- und Massenspurchromatogramme von Sedimentextrakten: (A): TIC einer undotierten Sedimentprobe, derivatisiert mit HFBAA; (B): RIC von (A) der Xenoestrogene NP (m/z:303, 331, 345), BPA (m/z: 605, 620) und OP (m/z: 402): (C): RIC von (A) der Steroide E1 (m/z: 422, 466); E2 (m/z: 237, 451); E3 (m/z: 235, 449) und EE2 (m/z: 446, 474); (D): TIC einer mit den sieben EDCs dotierten Sedimentprobe (c = 20 µg/g TS), derivatisiert mit HFBAA; (E): RIC von (D) der Xenoestrogene (m/z: siehe B); (F): RIC von (D) der Steroide (m/z: siehe C)
8 Ergebnisse 107
8.4.1 Validierung der zur Bestimmung von EDCs aus Sedimenten eingesetzten Methode
8.4.1.1 Bestimmung der Wiederfindungen
Zur Bestimmung der Wiederfindungen wurden drei Proben des dotierten Mischsediments mit
der optimierten ASE-Methode extrahiert und wie beschrieben aufgearbeitet. Von den
Ergebnissen wurde der Gehalt der EDCs, die zuvor in der Blindprobe bestimmt worden
waren, abgezogen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8.14 zu sehen. Sie liegen zwischen
73,5 % für Estradiol und 103,5 % für das NP-Isomerengemisch.
Tabelle 8.14: Wiederfindungen der sieben EDCs aus Sedimenten
Analyt Wiederfindung [%] a) ± Variationskoeffizient [%]NP 103,5 ± 22,5
BPA 83,2 ± 4,3
OP 82,1 ± 15,7
E1 97,3 ± 9,2
E2 73,5 ± 13,2
E3 93,1 ± 13,0
EE2 82,9 ± 10,1 a) Mittelwerte aus einer Dreifachbestimmung
8.4.1.2 Reproduzierbarkeit der Bestimmungsmethode
Tabelle 8.15 zeigt die Ergebnisse der Untersuchung einer Sedimentprobe, durchgeführt als
Fünffachbestimmung. Der dabei ermittelte Variationskoeffizient lag zwischen 5,0 und 16,1 %.
Tabelle 8.15: Reproduzierbarkeit der Bestimmungsmethode (Matrix: Sediment)
Analyt Mittelwert Peakflächen
Standardabweichung [± s]
Variationskoeffizient [%]
NP 22595 1321 5,8
BPA 70391 3941 5,6
OP 5963 961 16,1
E1 17567 885 5,0
E2 15328 1309 8,5
E3 26301 2321 8,8
EE2 1906 137 7,2
108 8 Ergebnisse
8.4.1.3 Ermittlung der Nachweis- und Bestimmungsgrenzen
Die Nachweis- und Bestimmungsgrenzen für endokrin wirksame Substanzen aus
Sedimenten wurde nach der Kalibrationsgradenmethode der DIN 32645 (1994) bestimmt.
Die ermittelten Werte für die NG und BG, sowie der Korrelationskoeffizient als Maß für die
Linearität der Kalibrationsgeraden, sind in Tabelle 8.16 aufgelistet. Die NG liegen zwischen
0,2 µg/g TS für OP und 0,9 µg/g TS für BPA. Die entsprechenden BG liegen zwischen
0,4 µg/g TS für OP und 1,2 µg/g TS für BPA. Die Korrelationskoeffizienten liegen alle in der
Nähe von 1, so dass die Methode über den untersuchten Bereich linear ist.
Tabelle 8.16: Nachweis- und Bestimmungsgrenzen sowie Korrelationskoeffizienten der Kalibriergeraden unterschiedlicher EDCs, bestimmt aus Sedimenten
Analyt NG [µg/g TS] ± Variationskoeffizient [%]
BG [µg/g TS] ± Variationskoeffizient [%]
Korrelationskoeffizient
NP 0,6 ± 8,4 1,0 ± 8,6 0,9996
BPA 0,9 ± 9,2 1,2 ± 9,0 0,9994
OP 0,2 ± 41,2 0,4 ± 41,8 0,9997
E1 0,9 ± 14,1 1,3 ± 13,9 0,9997
E2 0,4 ± 12,1 0,5 ± 13,6 0,9997
E3 0,5 ± 17,2 0,8 ± 17,7 0,9996
EE2 0,3 ± 23,9 0,5 ± 24,8 0,9998
8.4.2 Gehalt an EDCs in Sedimentproben des Sees Volvi
Die Ergebnisse der zweiundsiebzig untersuchten Sedimentproben des Sees Volvi sind in
den Abbildungen 8.34–8.41 dargestellt. Dabei sind die Ergebnisse in Abhängigkeit vom
Probenahmezeitpunkt aufgetragen. Daraus sollte ein möglicher jahreszeitlicher Einfluss
erkennbar werden.
Insgesamt war die Belastung der Sedimente mit endokrin wirksamen Substanzen sehr
gering. Bisphenol A war die einzige Substanz, die in jeder Probe zu finden war. Die
Steroidhormone, die eine wesentlich höhere endokrine Wirksamkeit besitzen, waren
dagegen nur selten nachweisbar. Die Ergebnisse veränderten sich erwartungsgemäß in
Abhängigkeit mit den Jahreszeiten. Der niedrigste Gesamtgehalt an EDCs wurde im Frühjahr
und Sommer gemessen. Zu diesem Zeitpunkt war der mikrobielle Abbau der Substanzen am
größten, weil die erhöhte Umgebungstemperatur den biochemischen Abbau begünstigte. Im
Herbst nahm dagegen die Umgebungstemperatur ab und damit auch der mikrobielle Abbau
durch die an wärmere Umgebungstemperaturen adaptierten Bakterien. So ließen sich
8 Ergebnisse 109
verschiedene EDCs mit estrogenem Potential nachweisen, die zuvor nur vereinzelt gefunden
wurden. Zu ihnen gehörten insbesondere Nonylphenol und Octylphenol. Im Winter hatten
sich dann die Bakterien an die veränderte Umgebungstemperatur angepasst, so dass der
Abbau wieder schneller von statten ging und die Gesamtbelastung wieder sank.
A 1 A 2 A 3 A 4 A 5 A 6 A 7 A 8 A 9
NPBPA
OPE1
E2E3
EE2
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
Kon
zent
ratio
n [µ
g/g
TS]
Probenahmestelle
Anal
yt
Abbildung 8.34: Ergebnisse der EDC-Bestimmung aus Sedimenten der Probenahmeserie A (Frühjahr)
B 1 B 2 B 3 B 4 B 5 B 6 B 7 B 8 B 9
NPBPA
OPE1
E2E3
EE2
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
Kon
zent
ratio
n [µ
g/g
TS]
Probenahmestelle
Anal
yt
Abbildung 8.35: Ergebnisse der EDC-Bestimmung aus Sedimenten der Probenahmeserie B (Sommer)
110 8 Ergebnisse
C 1 C 2 C 3 C 4 C 5 C 6 C 7 C 8 C 9
NPBPA
OPE1
E2E3
EE2
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
Kon
zent
ratio
n [µ
g/g
TS]
Probenahmestelle
Anal
yt
Abbildung 8.36: Ergebnisse der EDC-Bestimmung aus Sedimenten der Probenahmeserie C (Herbst)
D 1 D 2 D 3 D 4 D 5 D 6 D 7 D 8 D 9
NPBPA
OPE1
E2E3
EE2
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
Kon
zent
ratio
n [µ
g/g
TS]
Probenahmestelle
Anal
yt
Abbildung 8.37: Ergebnisse der EDC-Bestimmung aus Sedimenten der Probenahmeserie D (Winter)
8 Ergebnisse 111
E 1 E 2 E 3 E 4 E 5 E 6 E 7 E 8 E 9
NPBPA
OPE1
E2E3
EE2
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
Kon
zent
ratio
n [µ
g/g
TS]
Probenahmestelle
Anal
yt
Abbildung 8.38: Ergebnisse der EDC-Bestimmung aus Sedimenten der Probenahmeserie E (Frühjahr)
F 1 F 2 F 3 F 4 F 5 F 6 F 7 F 8 F 9
NPBPA
OPE1
E2E3
EE2
0,000
0,005
0,010
0,015
0,020
0,025
Kon
zent
ratio
n [µ
g/g
TS]
Probenahmestelle
Anal
yt
Abbildung 8.39: Ergebnisse der EDC-Bestimmung aus Sedimenten der Probenahmeserie F (Sommer)
112 8 Ergebnisse
G 1 G 2 G 3 G 4 G 5 G 6 G 7 G 8 G 9
NPBPA
OPE1
E2E3
EE2
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
Kon
zent
ratio
n [µ
g/g
TS]
Probenahmestelle
Anal
yt
Abbildung 8.40: Ergebnisse der EDC-Bestimmung aus Sedimenten der Probenahmeserie G (Herbst)
H 1 H 2 H 3 H 4 H 5 H 6 H 7 H 8 H 9
NPBPA
OPE1
E2E3
EE2
0,000
0,002
0,004
0,006
0,008
0,010
0,012
0,014
0,016
Kon
zent
ratio
n [µ
g/g
TS]
Probenahmestelle
Anal
yt
Abbildung 8.41: Ergebnisse der EDC-Bestimmung aus Sedimenten der Probenahmeserie H (Winter)
8 Ergebnisse 113
Insgesamt wurden in den Sedimenten nur vereinzelt Steroidhormone gefunden. Waren diese
dann vorhanden, so lagen die Konzentrationen auch nur im unteren ng/g TS Bereich
(Abbildungen 8.34-8.41). Eine Ausnahme wurde beobachtet: Probe A 6 (Abbildung 8.34)
enthielt mit 5,3 µg/g TS einen extrem hohen Gehalt an Estron. Um zu überprüfen, ob es sich
dabei um den tatsächlichen Gehalt der Probe handelte, oder ob irgendwelche Interferenzen
vorhanden waren, die die Bestimmung störten, wurde eine GC/MS/MS-Analyse
durchgeführt. Abbildung 8.42 zeigt im Teil a bzw. c die Massenspektren von E1 von
Standard und Probe und in b bzw. d die Produktionenspektren, die von dem jeweiligen Ion
mit der Masse 466 erzeugt worden waren. Im Vergleich zeigten die Spektren von reinem E1
und der Probe keine Abweichungen. In den GC/MS-Spektren traten 422 und 466 als
intensivste Fragmente auf und die Produktionenspektren, erzeugt aus der Masse 466,
zeigten beide die Fragmente 422, 407 und 394 als dominierende Fragmente. Es war kein
zusätzliches Signal erkennbar, das durch eine Überlagerung des E1-Signals mit einer
unbekannten Substanz aus z.B. der Matrix verursacht wurde. Warum diese Probe dann
allerdings einen solch hohen Gehalt an E1 enthielt, konnte unter den gegebenen Umständen
nicht aufgeklärt werden. Eine Alternative wäre, dass in der Sedimentprobe ein mikrobieller
Abbau von E2 hin zu E1 stattgefunden hatte, weil das Probenmaterial bis zur Aufbereitung
nicht entsprechend gelagert worden war. Da aber sämtliche Proben unter den gleichen
Bedingungen entnommen, gelagert und sowohl durch Gefriertrocknung als auch durch
Temperaturabsenkung auf 4°C stabilisiert worden waren, erscheint diese Möglichkeit aber
als sehr unwahrscheinlich.
Um zu überprüfen, ob die geographische Lage der Entnahmestelle einen Einfluss auf den
Gehalt an EDCs in den Sedimenten hatte, wurden in Abbildungen 8.43-8.45 die Ergebnisse
des Probenmaterials, welches in der Nähe der Berge entnommen worden war, den
Ergebnissen des in der Nähe der Stadt Nea Madytos bzw. in der Nähe der Mündung des
Flusses Megalo Rema entnommenen Probenmaterials einander gegenübergestellt.
Theoretisch müsste der Gehalt an EDCs in der Nähe der Stadt und im Flussmündungsgebiet
aufgrund der erhöhten antropogenen Einträge durch die höhere Populationsdichte größer
sein, als in der Nähe der dünner besiedelten Bergregion. Es war aber kein signifikanter
Unterschied erkennbar. Eine Erklärung könnte sein, dass die Strömung und die
Durchmischung im See unabhängig von der Jahreszeit so hoch ist, dass die EDCs zuerst im
gesamten See verteilt werden, bevor sie letztendlich an das Sediment adsorbiert werden.
114 8 Ergebnisse
422
409
235
253
422
407
394
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0100 200 300 400 500
m/z100 200 300 400 500
m/z
448
235
253
409
422
422
407
394
AStandardE1MS
CProbe A6E1MS
BStandardE1MS/MS466
DProbe A6E1MS/MS466
Rel
ativ
e In
tens
ität [
%]
Abbildung 8.42: EI-Massenspektren der Probe A6 im Vergleich mit einer Standardlösung. (A): GC/MS- Spektrum einer Lösung von Estron (m/z: 422, 466) in Aceton, derivatisiert mit HFBAA; (B): GC/MS/MS-Tochterionenspektum von (A), der Massenspur 466; (C): GC/MS- Spektrum des Sedimentextraktes A6 (m/z: 422, 466), derivatisiert mit HFBAA; (D): GC/MS/MS-Tochterionenspektrum von (C), der Massenspur 466
8 Ergebnisse 115
A 2 B 2 C 2 D 2 E 2 F2 G 2 H 2 A 3 B 3 C 3 D 3 E 3 F 3 G 3 H 3 A 4 B 4 C 4 D 4 E 4 F 4 G 4 H 4
NPOP
E2EE2
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
Kon
zent
ratio
n [µ
g/g
TS]
Probenahmestelle Anal
yt
Abbildung 8.43: Ergebnisse der EDC-Bestimmung aus Sedimenten der Probenahmestellen in der Nähe der Berge
A 8 B 8 C 8 D 8 E 8 F 8 G 8 H 8
NP
BPAOP
E1E2
E3EE2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
Kon
zent
ratio
n [µ
g/g
TS]
Probenahmestelle
Anal
yt
Abbildung 8.44: Ergebnisse der EDC-Bestimmung aus Sedimenten der Probenahmestelle in der Nähe des Flusses Megalo Rema
116 8 Ergebnisse
A 7 B 7 C 7 D 7 E 7 F 7 G 7 H 7
NP
BPAOP
E1E2
E3EE2
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
Kon
zent
ratio
n [µ
g/g
TS]
Probenahmestelle
Anal
yt
Abbildung 8.45: Ergebnisse der EDC-Bestimmungen aus Sedimenten der Probenahmestelle in der Nähe der Stadt Nea Madytos
9 Diskussion 117
9 Diskussion
Diese Arbeit beschreibt validierte, analytische Methoden zur Bestimmung der endokrin
wirksamen Substanzen Nonylphenol, Bisphenol A, Octylphenol, Estron, 17β-Estradiol, Estriol
und 17α-Ethinylestradiol aus Abwässern, Klärschlämmen und Sedimenten. Die Methoden
wurden bereits in der Routineanalytik eingesetzt und haben sich dort bewährt. Für ihre
Durchführung ist allerdings ein erheblicher Zeitaufwand von nöten, der durch die einzelnen
Schritte - Anreicherung bzw. Extraktion, Reinigung (clean-up), Derivatisierung,
chromatographische Trennung und Quantifizierung – bedingt ist.
9.1 Vorversuche
9.1.1 Derivatisierungsverfahren
In den Vorversuchen sollten verschiedene Derivatisierungsarten für die sieben ausgewählten
endokrin wirksamen Substanzen getestet und miteinander verglichen werden. Dazu wurden
die Ionenstromchromatogramme und die zugehörigen Massenspektren der einzelnen
Derivate erstellt, um anhand dieser Ergebnisse die Abhängigkeit der Empfindlichkeit des
massenspektrometrischen Detektors von den unterschiedlichen Derivatisierungsreagenzien
zu ermitteln. Dabei hat sich gezeigt, dass die Derivatisierung mittels
Heptafluorbuttersäureanhydrids sowohl für die Detektion nach positiver Elektronenionisation
(EI) als auch während der negativen chemischen Ionisation (NCI) die Methode der Wahl
darstellte. Die Massenspektren waren für alle sieben EDCs in beiden Ionisierungarten
abbildbar, während bei der Derivatisation mit Trifluoressigsäureanhydrid und
Pentafluorpropionsäureanhydrid im NCI-Modus keine Massenspektren von Nonylphenol und
mit Trifluoressigsäureanhydrid zusätzlich kein Massenspektrum von Octylphenol
nachweisbar war.
Bei der Bestimmung im EI-Modus der Nachweisgrenzen der Derivate aus einer acetonischen
Lösung heraus hatten sich, entgegen der Vermutung, jedoch keine signifikanten
Unterschiede in der Empflindlichkeit des Detektors zwischen den verschiedenen Derivaten
gezeigt. Da aber bei der Bestimmung der Nachweisgrenzen von EE2 als Trifluorderivat und
von E2 als Pentafluorderivat keine Linearität der Geraden gewährleistet war, stellte sich auch
aus diesem Grund die Derivatisierung mittels Heptafluorbuttersäureanhydrids als die
Methode der Wahl heraus. In der Literatur wird über Ergebnisse berichtet, die sowohl nach
Derivatisierung mit Trifluoressigsäureanhydrid (Rinken, 2002) als auch mit
Pentafluorpropionsäuranhydrid (Croley et al., 2000; Lee et al., 2005) erhalten wurden.
118 9 Diskussion
Allerdings wird hier nicht das große Spektrum der endokrin wirksamen Substanzen
untersucht, welches Gegenstand der vorliegenden Arbeit war. Rinken bestimmte nur BPA,
Croley nur die Steroidhormone E1, E2, E3 und EE2, wohingegen Lee NP, BPA, OP, E1 und
E2 ermittelte. Die in der Literatur am häufigsten verwendete Derivatisierungsmethode, die
Silylierung (Spengler et al., 1999; Bolz et al., 2000; Mol et al., 2000; Jeannot et al., 2002;
Ternes et al., 2002; Li et al., 2003; Hernando et al., 2004 und Quintana et al., 2004) stellte in
der vorliegenden Arbeit keine Alternative dar, da aufgrund der fehlenden Elektronegativität
der Silylderivate kein Vergleich der positiven Elektronenionisation mit der negativen
chemischen Ionisation möglich gewesen wäre.
9.1.2 Quantifizierungsverfahren
Das idealste Verfahren zur Quantifizierung wäre die Bestimmung unter Zuhilfenahme
stabilisotopen-markierter, interner Standards, die jeweils zu Beginn der Aufarbeitung
zugegeben werden. Durch dieses Verfahren ließen sich mögliche Fehler durch die
stabilisotopen-markierten Standards ausgleichen. Stabilisotopen-markierte Standards
existierten jedoch nur vereinzelt und waren sehr teuer, daher mussten andere interne
Standard gefunden werden, die sich bei allen Verfahrensschritten den Analyten möglichst
ähnlich verhielten. Zudem sollte das Verhältnis der Peakflächen des Analyten zum internen
Standard möglichst konstant und nahe bei eins liegen. Wie in Abschnitt 8.1.3 zu sehen ist, ist
diese Konstanz für keinen der Analyten gegeben. In der Literatur wird die Quantifizierung
zwar meist mit internem Standard durchgeführt, allerdings ist die Quantifizierung nicht so
detailiert beschrieben, dass ein Vergleich der Konstanz der Responsefaktoren möglich wäre.
Um den durch die Schwankungen der Responsefaktoren verursachten großen Fehler zu
vermeiden, wurde in dieser Arbeit auf die Quantifizierung mittels extrerner Standards
zurückgegriffen.
9.2 Analytische Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen aus wässrigen Matrices
Wie auch sonst in der Literatur häufig für Stoffe aus wässriger Matrix üblich (Spengler et al.,
1999; Baronti et al., 2000; Bolz et al., 2000; Croley et al., 2000; Hernando et al., 2004;
Quintana et al., 2004; Kojima et al., 2005 und Lee et al., 2005), wurde eine Methode
entwickelt, die sich aus Festphasenextraktion, evtl. einem Reinigungsschritt mit
anschließender Derivatisierung und Bestimmung mittels GC/MS zusammensetzte. Die
Auswahl der eingesetzten Festphasen variiert in der Literatur sehr. Für die vorliegenden
9 Diskussion 119
Abwässer hat sich die Kombination aus C18-Festphase mit anschließender Reinigung an
Kieselgel, Derivatisierung mittels Heptafluorbuttersäureanhydrids sowie Identifizierung und
Quantifizierung mittels GC/MS bewährt.
9.2.1 Bestimmung der Wiederfindungen aus Abwässern
Für eine zu entwickelnde Analysenmethode, die sich nicht stabilisotopen-markierter, interner
Standards bedienen konnte, war es wichtig, dass die Analyten möglichst vollständig aus der
Matrix extrahiert wurden und auch während der weiteren Aufbereitungsschritte der Proben
nicht verloren gingen. D.h. die Wiederfindung eines jeden Analyten sollte möglichst nahe bei
100 % liegen. Wie aus Tabelle 9.1 erkennbar, ist in der Literatur keine Methode zu finden,
bei der die Wiederfindungen aller in dieser Arbeit ausgewählter endokrin wirksamer
Substanzen zugleich bestimmt wurden. Vergleicht man die gefundenen Werte miteinander,
so sieht man, dass sie alle in einem ähnlichen Bereich zwischen 80 und 120 % liegen. Das
ist unter Berücksichtigung der Matrix ein durchaus angemessener Bereich. Dabei wurden
keine signifikaten Unterschiede zwischen den Wiederfindungen in Zu- bzw. Abläufen
festgestellt, so dass in der Übersicht auf eine Unterteilung in Zu- und Ablauf verzichtet
wurde.
Tabelle 9.1: Gegenüberstellung der in dieser Arbeit erzielten Wiederfindungen für EDCs aus Abwässern mit den in der Literatur berichteten Methoden (zusammengesetzt aus den Teilschritten Festphasenanreicherung, clean-up, Derivatisierung und GC/MS- Bestimmung)
Wiederfindungen [%] Analyt diese Arbeit Bolz
et al., 2000 Quintana
et al., 2004 Kojima
et al., 2005 Lee
et al., 2005 NP 112,9–116,3 96–117 n. b. 103–108 102–104
BPA 92,3–122,9 101–106 n. b. n. b. 98–99
OP 99–105,6 95–99 n. b. 92–103 94–95
E1 84,1–93,0 n. b. 83–102 n. b. 105–109
E2 88,7–102,7 n. b. 94–97 n. b. 89–95
E3 86,1–104,1 n. b. 79–92 n. b. n. b.
EE2 76,7–99,4 n. b. 95–98 n. b. n. b. n. b. = nicht bestimmt
120 9 Diskussion
9.2.2 Bestimmung der Nachweisgrenzen von endokrin wirksamen Substanzen aus Abwässern
Tabelle 9.2 gibt einen Überblick über die in der Literatur berichteten Nachweisgrenzen neben
den Nachweisgrenzen, die mit der in dieser Arbeit entwickelten Analysenmethode zur
Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen erzielt werden konnten. Die Nachweisgrenzen
von Spengler et al. sind um den Faktor 10 niedriger, allerdings haben Spengler et al. nur
Abläufe untersucht. Die von Quintana et al. erzielten Nachweisgrenzen in Zu- und Abläufen
von Kläranlagen liegen in demselben Bereich, wie die mit den hier entwickelten Methoden
erreichbaren. Da die üblicherweise in Abwässern vorkommenden Konzentrationen an
Steroidhormen im unteren ng/L Bereich liegen und diese Konzentrationen auch bereits eine
endokrine Wirkung entfalten können, kann die entwickelte Bestimmungsmethode zwar
genutzt werden, um EDCs aus Abwässern zu bestimmen. Es besteht aber schnell die
Gefahr, dass die Bestimmungsmethode an ihre Grenzen gerät. Deshalb erscheint es wichtig,
in Zukunft die Nachweisgrenzen noch weiter zu vebessern, um dann noch niedrigere
Konzentrationen erfassen zu können.
Tabelle 9.2: Vergleich der Nachweisgrenzen von EDCs in Abwässern mit entsprechenden Literaturmethoden. In die Nachweisgrenzen gehen ein: Festphasenanreicherung, clean- up, Derivatisierung und GC/MS-Bestimmung
Nachweisgrenzen [ng/L] Analyt diese Arbeit Spengler et
al., 1999 Hernando et al., 2004
Quintana et al., 2004
Kojima et al., 2005
NP 5,5–6,6 k. A. n. b. n. b. 76
BPA 4,8–7,7 k. A. 26,5 n. b. n. b.
OP 3,2–9,8 n. b. 13,0 n. b. 7,9
E1 7,2–7,5 0,7 8,5 1 n. b.
E2 3,6–5,4 0,4 17,0 2 n. b.
E3 5,2–6,7 n. b. n. b. 3 n. b.
EE2 1,1–2,7 0,4 4,0 3 n. b. n. b. = nicht bestimmt
k. A. = keine Angabe
9 Diskussion 121
9.3 Analytische Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen aus Klärschlämmen
Die ASE-Extraktion wird bisher noch relativ selten zur Extraktion von endokrin wirksamen
Substanzen aus Klärschlämmen eingesetzt. Sie bietet sehr viele Vorteile gegenüber
klassischen Extraktionsmethoden wie z.B. der Soxhlet- oder der Heissdampfextration. Einer
dieser Vorteile ist in der erheblichen Zeitersparnis zu sehen. So dauert eine ASE-Extraktion
ca. 45 min gegenüber einer Extraktionsdauer von mindestens 24 Stunden für eine
Soxhletextraktion. Ein weiterer Vorteil ist in dem geringeren Lösungsmittelverbrauch zu
sehen. Dieser liegt mit ca. 12 mL wesentlich geringer als die üblicherweise für eine
Soxhletextraktion benötigten 30–50 mL. Der wichtigste Vorteil war aber in einer nahezu
vollständigen Extraktionsausbeute von rund 100 % für alle sieben extrahierten endokrin
wirksamen Substanzen zu sehen. Allerdings wird durch die größere Effizienz der ASE-
Extraktion auch eine größere Menge Matrix mitextrahiert. Dieser Nachteil kann nur durch
einen zusätzlichen Reinigungsschritt beseitigt werden.
9.3.1 Bestimmung der Wiederfindungen aus Klärschlämmen
Die Wiederfindungen der ausgewählten sieben Substanzen aus Schlämmen wurde bisher
selten bestimmt. In Tabelle 9.3 sind die in der Literatur beschriebenen Methoden zur
Bestimmung von endokrin wirksamen Substanzen mittels GC/MS- bzw. GC/MS/MS-
Identifizierung und Quantifizierung gegenübergestellt.
Tabelle 9.3: In dieser Arbeit ermittelte Wiederfindungraten der EDCs aus Klärschlämmen im Vergleich mit Daten aus der Literatur (Identifizierung und Quantifizierung mittels GC/MS bzw. GC/MS/MS)
Wiederfindungen [%] Analyt diese Arbeit Sweetman, 1994 Meesters et al., 2002 Ternes et al., 2002
NP 100,7–108,1 82 101 n. b.
BPA 83,1–97,8 n. b. 100 n. b.
OP 94,7–115,8 n. b. n. b. n. b.
E1 89,8–90,7 n. b. n. b. 77–104
E2 86,5–88,9 n. b. n. b. 66–73
E3 84,2–106,2 n. b. n. b. n. b.
EE2 81,9–101,3 n. b. n. b. 57–99 n. b. = nicht bestimmt
122 9 Diskussion
Die einzige Methode mit vergleichbaren Ergebnissen wurde 2002 von Meesters et al.
veröffentlicht, jedoch wurden dort nur die beiden Xenoestrogene Nonylphenol und Bisphenol
A bestimmt. Ternes et al. (2002), die einzige Arbeitsgruppe, die bisher Steroidhormone in
Klärschlämmen untersucht hatte, konnten trotz aufwendigster Aufreinigung mittels
Ultraschalls und unter Verwendung verschiedenster Lösungsmittel sowie
Gelpermeationschromatographie mit ihrer Methode prozentual weniger EDCs wieder finden,
als dies mit der in der in dieser Arbeit entwickelten Methode möglich war.
9.3.2 Bestimmung der Nachweisgrenzen von endokrin wirksamen Substanzen aus Klärschlämmen
In dieser Arbeit wurden für die Bestimmung ausgewählter endokrin wirksamer Substanzen
mit estrogenem Potential aus Klärschlämmen Nachweisgrenzen im Bereich von 1,5–2,9 µg/g
TS bestimmt. In der Literatur sind keinerlei Vergleichswerte publiziert.
9.4 Analytische Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen aus Sedimenten
Wenn endokrin wirksame Substanzen während des Klärprozesses aus dem Abwasser nicht
vollständig entfernt werden, gelangen sie in die Oberflächengewässer, wo sie von der Flora
und Fauna aufgenommen werden, in das Grundwasser gelangen oder aber an Sedimenten
adsorbiert werden können. Dort besteht durch Re-Suspendierung die Gefahr einer
Beeinträchtigung der Umwelt. Deshalb ist es besonders wichtig, über eine Analysenmethode
zu verfügen, mit deren Hilfe man die realen Gegebenheiten vor Ort abbilden kann. Die in
dieser Arbeit entwickelte Methode ist ausreichend empfindlich und reproduzierbar, um den
Gehalt an endokrin wirksamen Substanzen in realen Sedimentproben bestimmen zu können.
9.4.1 Bestimmung der Wiederfindungen aus Sedimenten
Die bisher in der Literatur veröffentlichten Methoden zur Bestimmung von EDCs aus
Sedimenten (Tabelle 9.4) beziehen sich auf ein wesentlich schmaleres Spektrum an
endokrin wirksamen Substanzen mit estrogenem Potential. Es werden nur die
Xenoestrogene wie z.B. Nonylphenol, Octylphenol und Bisphenol A bestimmt (Ferguson et
al., 2000; Hale et al., 2000; Li et al., 2003 und Patrolecco et al., 2004). Dem entsprechend
liegen in der Literatur auch nur wenige Vergleichsdaten vor.
9 Diskussion 123
Tabelle 9.4: Vergleich der in dieser Arbeit ermittelten Wiederfindungsraten mit Literaturmethoden, die zur Identifizierung und Quantifizierung der untersuchten EDCs ebenfalls GC/MS- Methoden verwendeten
Wiederfindungen [%] Analyt diese Arbeit Ferguson
et al., 2000 Hale et al., 2000 Li et al., 2003 Patrolecco et
al., 2004 NP 103,5 82,8 96 91–97 79–89
BPA 83,2 k. A. n. b. 83,5–93 89–108
OP 82,1 n. b. n. b. 87–99 n. b.
E1 97,3 n. b. n. b. n. b. n. b.
E2 73,5 n. b. n. b. n. b. n. b.
E3 93,1 n. b. n. b. n. b. n. b.
EE2 82,9 n. b. n. b. n. b. n. b. n. b. = nicht bestimmt
k. A. = keine Angabe
Die Wiederfindungen (Tabelle 9.4) bewegen sich in allen veröffentlichen Methoden ebenso
wie bei der in dieser Arbeit entwickelten Methode im Bereich von ca. 80 bis gut 100 %. Das
ist ein durchaus üblicher Bereich, wenn man die Komplexität der Matrix berücksichtigt. Diese
Arbeit zeigt den ersten Versuch, Steroidhormone in Sedimenten zu bestimmen, weshalb
auch kein Vergleich mit anderen Daten zur Wiederfindung möglich ist. Mit Ergebnissen von
73,5 % für Estradiol bis 97,3 % für Estron liegen die Wiederfindungsraten aber in einem für
solch komplexe Matrices üblichen Bereich.
9.4.2 Bestimmung der Nachweisgrenzen von endokrin wirksamen Substanzen aus Sedimenten
Die in der Literatur besschriebenen Nachweisgrenzen sind sehr unterschiedlich. Li et al.
(2003) beschreiben die niedrigsten Nachweisgrenzen (Tabelle 9.5) mit nur 0,6 bis 2,8 ng/g
TS für die Xenoestrogene Nonylphenol, Bisphenol A und Octylphenol. Auch Patrolecco et al.
(2004) bestimmte die Stoffe mit niedrigeren Nachweisgrenzen als sich mit der Methode, die
in dieser Arbeit entwickelt wurde, erzielen ließen. Allerdings ist keine direkte Vergleichbarkeit
zwischen den Methoden gegeben, da sowohl Li et al. als auch Patrolecco et al. eine völlig
andere Aufarbeitung des Probenmaterials einsetzten. Durch die universellere Einsetzbarkeit
zur Bestimmung von EDCs, d.h., da es nämlich mit Hilfe der hier entwickelten Methode
möglich ist, zusätzlich auch biogene und anthropogene Steroidhormone quantitativ in einem
Arbeitsgang mit zu bestimmen, erscheinen die etwas weniger empfindlichen
Nachweisgrenzen akzeptabel.
124 9 Diskussion
Tabelle 9.5: Vergleich der Nachweisgrenzen von EDCs, bestimmt aus Sedimenten, mit in der Literatur beschriebenen Bestimmungsmethoden, die sich aus den Arbeitsschritten - Extraktion, clean-up, Derivatisierung und GC/MS-Bestimmung - zusammensetzten
Nachweisgrenzen [µg/g TS] Analyt diese Arbeit Hale et al., 2000 Li et al., 2003 Patrolecco et al., 2004
NP 0,6 5 0,0028 0,06
BPA 0,9 n. b. 0,0006 0,03
OP 0,2 n. b. 0,0024 n. b.
E1 0,9 n. b. n. b. n. b.
E2 0,4 n. b. n. b. n. b.
E3 0,5 n. b. n. b. n. b.
EE2 0,3 n. b. n. b. n. b. n. b. = nicht bestimmt
k. A. = keine Angabe
In Zukunft wäre es sinnvoll, zu untersuchen, ob die Nachweisgrenzen durch einen
zusätzlichen Reinigungschritt oder durch eine stärkere Aufkonzentrierung weiter abgesenkt
werden können. Ebenfalls würde der routinemäßige Einsatz von
Tandemmassenspektrometrie (GC/MS/MS) für die Quantifizierung zu einer weiter
verbesserten Nachweisgrenze führen.
9.4.3 Belastung des Sees Volvi
Eine so umfangreiche Untersuchung eines natürlichen aquatischen Lebensraumes auf
EDCs, wie sie in dieser Arbeit erfolgte, ist nach dem derzeitigen Kenntnisstand bisher noch
nicht durchgeführt worden. Deshalb stellen die hier präsentierten Ergebnisse auch nur eine
sehr individuelle Wiedergabe der isolierten Situation dieses Sees dar und kann nur bedingt
mit vergleichbaren Lebensräumen nicht aber mit den Gegebenheiten anderer Lebensräume
verglichen werden.
Die Belastungen sind insgesamt erstaunlich niedrig. Wie in Abschnitt 8.4.2 beschrieben,
nimmt zudem die Belastung im Laufe des Untersuchungszeitraums von immerhin zwei
Jahren noch weiter ab.
Die beobachteten Belastungen des Sees Volvi mit endokrin wirksamen Substanzen stellen
zwar keine akute Bedrohung der Umwelt dar, dennoch erscheint es wichtig, die Belastung
auch weiterhin zu verfolgen und vor allen Dingen mit den Belastungen in anderen
Gewässern ähnlicher Art und davon abweichenden aquatischen Lebensräumen zu
vergleichen. Nur so wird es in Zukunft möglich sein, die Belastung von Gewässern mit
endokrin wirksamen Substanzen weiterhin kritisch zu verfolgen, um so dann letztendlich eine
9 Diskussion 125
integrale Bewertung der Belastung vornehmen zu können. Es ließen sich so mögliche
Gefahrenquellen besser erkennen und als Folge daraus, könnten Strategien sowie
Methoden primär zur Eintragsvermeidung und, sollte das nicht möglich sein, zur Elimination
der endokrin wirksamen Substanzen entwickelt werden.
126 10 Zusammenfassung
10 Zusammenfassung
Ziel dieser Arbeit war es, Analysenmethoden zum Nachweis, zur Identifizierung und zur
Quantifizierung endokrin wirksamer Substanzen (EDCs) aus Matrices, die während des
Abwasserreinigungsprozesses anfallen, zu entwickeln. Dazu sollte ein besonderes
Augenmerk auf Matrices gelegt werden, die in die Umwelt ausgebracht werden und dort
durch Resuspendierung Quellen endokrin wirksamer Subtanzen darstellen. Dazu gehören
insbesondere Klärschlämme und Sedimente.
Aus der Fülle der EDCs wurden die Xenoestrogene Nonylphenol, Bisphenol A und
Octylphenol sowie die estrogenen Steroidhormone Estron, 17β-Estradiol, Estriol und 17α-
Ethinylestradiol ausgewählt. Diese Substanzen besitzen eine hohe Umweltrelevanz. Sie
werden entweder in großen Mengen industriell hergestellt und eingesetzt, ggf.
weiterverarbeitet, sie entstehen teilweise aber auch durch biochemischen Abbau im
Klärprozess oder sie werden im menschlichen Körper gebildet und gelangen über die
menschlichen Ausscheidungen in die Kläranlagen.
Für Zulauf- und Ablaufproben wurde ein Verfahren, bestehend aus einer Anreicherung an
C18-Festphasenmaterial mit anschließendem clean-up an Kieselgel und einer Derivatisierung
mittels Heptafluorbuttersäureanhydrids, entwickelt. Der Nachweis der endokrin wirksamen
Substanzen und ihre anschließende Identifizierung und Quantifizierung erfolgte mittels
massenspektrometrischer Detektion nach vorheriger gaschromatographischer Trennung
(GC/MS) der EDC-haltigen Extrakte. Besonders wurde der Einfluss unterschiedlicher
Derivatisierungsreagenzien auf die Nachweisbarkeit hinterleuchtet. Dabei wurde u.a. der
Einfluss unterschiedlicher Fluorgehalte der Derivate auf die Empfindlichkeit bei der
Ionisierung entweder mittels Elektronenionisation oder mittels negativer chemischer
Ionisation untersucht. Als optimales Derivatisierungsreagenz erwies sich das
Heptafluorbuttersäuranhydrid. Für den routinemäßigen Nachweis der EDCs wurde im
Anschluss an diese bewertenden Untersuchungen die positive Elektronenionisation (EI)
verwendet.
Die Wiederfindungen dieser optimierten Bestimmungsmethode lagen zwischen 77 und
116 % und die Nachweisgrenzen lagen im unteren ng/L-Bereich, so dass die Methode zur
Analyse realer Abwasserproben auf EDCs geeignet ist.
Die Besonderheit an der Bestimmung aus den festen Matrices Klärschlamm bzw. Sediment,
war die Extraktion mittels „accelerated solvent extraction“ (ASE) bzw. „pressurized liquid
extraction“ (PLE). Dieses Verfahren wurde bisher kaum, bzw. nicht für die komplette
Bandbreite der ausgewählten EDCs genutzt. Die Extraktion wurde in Bezug auf Temperatur,
Druck, verwendetem Lösungsmittel bzw. Lösungsmittelgemisch - nach Art und Menge -
10 Zusammenfassung 127
sowie in Bezug auf die Extraktionszeit und Einwaage des Probenmaterials optimiert. Die
erarbeitete Methode ist besonders effizient in Bezug auf die Extraktionsausbeute, d. h., die
Wiederfindungen liegen im Bereich von 82 bis 116 % für Klärschlämme und 74 bis 104 % für
Sedimente. Im Vergleich zu der häufig angewendeten Soxhlet-Extraktion ist die entwickelte
ASE-Extraktion zum einen wesentlich schneller und verbraucht zum anderen geringere
Volumina an Extraktionsmitteln. Das nachfolgende clean-up des Probenextraktes erfolgte
entsprechend der Aufarbeitung wässriger Proben, nachdem der organische Extrakt zuvor in
Reinstwasser suspendiert worden war.
Die optimierte Bestimmungsmethode der EDCs in festen Matrices wurde auch eingesetzt,
um die Belastung des Sediments eines in Griechenland gelegenen Sees mit Namen Volvi
über einen Zeitraum von zwei Jahren abzubilden. Dieser See ist durch die Ramsar
Convention on Wetlands als ein international bedeutendes Feuchtgebiet ausgewiesen.
Aufgrund dieses Schutzes ist die Information über eine Belastung mit endokrin wirksamen
Substanzen von großem Interesse. Die Ergebnisse zeigten, dass die Belastung im
Untersuchungszeitraum stark zurückgegangen ist. Am Anfang der Untersuchungen waren
noch die besonders potenten Steroide nachweisbar, am letzten Probenahmetermin war
dagegen nur noch Bisphenol A zu beobachten, dieses jedoch in deutlich geringeren
Konzentrationen als zu Beginn der Untersuchungen.
Damit stehen nunmehr validierte analytische Methoden zur Bestimmung der endokrin
wirksamen Substanzen Nonylphenol, Bisphenol A, Octylphenol, Estron, 17β-Estradiol, Estriol
und 17α-Ethinylestradiol aus flüssigen und festen Matrices, d.h., aus Abwässern,
Klärschlämmen und Sedimenten, zur Verfügung. Diese haben bereits in der Routineanalytik
ihre Bewährungsprobe bestanden.
128 11 Anhang
11 Anhang Tabelle 11.1: Im Rahmen der Erstellung dieser Arbeit verwendete Chemikalien
Chemikalie Lieferant, Firmensitz Helium 99,999 % Linde Gas, Höllriegelskreuth
Methan 99,999 % Linde Gas, Höllriegelskreuth
Stickstoff, 99,999 % Westfalen Gas, Münster
Aceton, tech. Chemikalien Scheins, Aachen
Aceton, picograde Promochem, Wesel
Acetonitril, für HPLC Promochem, Wesel
Hochreines, entmineralisiertes Wasser Reinigung von entionisiertem Aachener Trinkwasser mittels Milli-Q System (Millipore, Milford, MA, USA)
Dichlormethan, picograde Promochem, Wesel
Diethylether, picograde Promochem, Wesel
Ethylacetat, picograde Promochem, Wesel
Hexan, picograde Promochem, Wesel
Methanol, picograde Promochem, Wesel
n-Pentan, picograde Promochem, Wesel
Toluol, picograde Promochem, Wesel
Bisphenol A Dow, Stade
Bisphenol A d16, 98 % Sigma - Aldrich, Taufkirchen
17-β-Estradiol, 97 % Sigma - Aldrich, Taufkirchen
17-β-Estradiol-acetat, 99,3 % Riedel de Heen, Seelze
Estriol, 98 % Sigma - Aldrich, Taufkirchen
Estron, 99 % Sigma - Aldrich, Taufkirchen
17-α-Ethinylestradiol, 98 % Sigma - Aldrich, Taufkirchen
4-Nonylphenol, tech. Fluka, Taufkirchen
4n-Nonylphenol, 99,6 % Riedel de Haën, Seelze
Octylphenol, 99 % Sigma - Aldrich, Taufkirchen
Heptafluorbuttersäureanhydrid, 98 % Acros, Geel, Belgien
Pentafluorpropionsäureanhydrid, 98 % Acros, Geel, Belgien
Trifluoressigsäureanhydrid, 99 % Fluka, Taufkirchen
Ameisensäure, 98 – 100 % Merck, Darmstadt
Natriumazid, 99,0 % Merck, Darmstadt
Natriumsulfat, wasserfrei Merck, Darmstadt
Salzsäure, 37 % Riedel de Haën, Seelze
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13 Danksagung 139
13 Danksagung
Diese Arbeit entstand im Rahmen des Aachener Graduiertenkollegs zur Eliminierung
endokrin wirksamer Substanzen aus Abwasser (AGEESA) im Umweltanalytischem Labor
des Instituts für Siedlungswasserwirtschaft der Rheinisch-Westfälischen Technischen
Hochschule Aachen.
Allen, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben, möchte ich an dieser Stelle
herzlich danken, insbesondere:
Herrn PD. Dr. rer. nat. habil. H. Fr. Schröder für die Möglichkeit der Durchführung dieser
Arbeit, für die fachliche und anderweitige Unterstützung zu jedem Zeitpunkt.
Herrn Univ.-Prof. Dr. rer. nat. A. Schäffer und Herrn Univ.-Prof. Dr.-Ing. P. Doetsch für die
Übernahme der Co-Referate.
Herrn Univ.-Prof. Dr.-Ing. M. Dohmann und Herrn Univ.-Prof. Dr.-Ing. J. Pinnekamp für die
Unterstützung des Graduiertenkollegs AGEESA und der Möglichkeit die Arbeit am Institut für
Siedlungswasserwirtschaft durchzuführen.
Herrn Univ.-Prof. Dr.-Ing. M. Dohmann und Herrn Univ.-Prof. Dr.-Ing. T. Melin für die Leitung
des Graduiertenkollegs AGEESA.
Dem Umweltforum der RWTH Aachen für die Einrichtung und Unterstützung des
Graduiertenkollegs AGEESA.
Der Deutschen Forschungsgemeinschaft für die Finanzierung.
Allen Mitarbeiten des Umweltanalytischen Labors, insbesondere Herrn R.J.W. Meesters und
Herrn Gschwendtner für die unermüdliche Hilfe mit dem GC/MS und der ASE. Ebenso allen
Mitarbeitern für die anregenden Diskussionen und die freundliche Arbeitsatmosphäre.
Den Mitarbeitern des Arbeitskreises um Herrn Prof. Dr. K. Fytianos für die Bereitstellung der
Sedimentproben.
Allen AGEESA Mit-Stipendiaten, vor allem denen der 1. Phase, die mir, obwohl verspätet
dazu gestoßen, mit ihrer Unterstützung einen tollen Einstieg in die Arbeit ermöglicht haben.
Steffi, Daniela und Uwe, danke dass Ihr einen Blick auf die Arbeit geworfen habt.
Den Haus D Mitbewohnern, die immer ein offenes Ohr für Fragen und Probleme hatten.
Meiner Mutter, die mich zu jeder Zeit unterstützt hat.
14 Lebenslauf 141
14 Lebenslauf
Persönliche Daten: Name Angelika Stehmann
Anschrift Grünenthaler Str. 42
52072 Aachen
Geburtsdatum/-ort 27.02.1976 in Steinfurt
Familienstand ledig
Beruf: seit 02.2006 Ass. Quality Assurance Manager
Greenpower B.V., Kerkrade, NL
Promotion: 08.2001 – 07.2004 DFG-Promotionsstipendium im
Graduiertenkolleg AGEESA
(Aachener Graduiertenkolleg zur Eliminierung
Endokrin wirksamer Substanzen aus
Abwasser)
am Institut für Siedlungswasserwirtschaft,
RWTH-Aachen
08.2004 – 12.2005 wiss. Mitarbeiterin
am Institut für Siedlungswasserwirtschaft
Praktisches Jahr: 07.2000 – 09.2000 Praktikum bei der Sourcing Unit Reken der
Langnese-Iglo GmbH
10.2000 – 11.2000 Praktikum im Fachbereich Tiere und
Lebensmittel des Kreises Borken
12.2000 – 08.2001 Praktikum im Chemischen Landes- und
Staatlichen Veterinäruntersuchungsamt
Münster
Abschluss: 2. Staatsexamen für
Lebensmittelchemiker
142 14 Lebenslauf
Studium:
10.1995 – 05.2000 Studium der Lebensmittelchemie an der
Westf. Wilhelmsuniversität Münster
Abschluss: 1. Staatsexamen für
Lebensmittelchemiker
04.1997 – 03.2001 Diplomstudiengang Chemie an der
Westf. Wilhelmsuniversität Münster
Schulabschluss:
06.1995 Abitur am Städtischen Gymnasium
Borghorst