ESTUDIO DE LA EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DE LOS RECEPTORES TIPO TOLL (TLRs) EN CÉLULAS MADRE DE LA RETINA DE MAMÍFERO ADULTO

Ana Paz Flores Raga

Departament de Fisiologia, Genètica i Microbiologia

Departamento de Fisiología, Genética y Microbiología

ESTUDIO DE LA EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DE LOS RECEPTORES TIPO TOLL (TLRs) EN CÉLULAS

MADRE DE LA RETINA DE MAMÍFERO ADULTO

Tesis doctoral presentada por:

Ana Paz Flores Raga

Alicante, 2015

La Dra. Victoria EugeniaManeu Flores

Profesora titular delDepartamento de

Óptica, Farmacología y Anatomíade la

Universidad de Alicante.

La Dra. Mª VioletaGoméz Vicente

Profesora Ayudante Doctor delDepartamento de

Óptica, Farmacología y Anatomíade la

Universidad de Alicante.

CERTIFICAN:

Que el trabajo de investigación que se recoge en la presente memoria,

presentada por la licenciada Dña. Ana Paz Flores Raga para optar al título de

Doctora por la Universidad de Alicante titulada "Estudio de la expresión

y función de los receptores tipo Toll (TLRs) en células madre de la retina

de mamífero adulto" ha sido realizado bajo su dirección en el departamento

de Óptica, Farmacología y Anatomía de la Universidad de Alicante.

Conforme

Firmado: Victoria Eugenia Maneu Flores

Conforme

Firmado: Mª Violeta Gómez Vicente

Índice general

1. INTRODUCCIÓN 11.1. EL GLOBO OCULAR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11.2. LA RETINA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

1.2.1. Estructura de la retina . . . . . . . . . . . . . . . . . 41.2.2. Organización histológica de la retina . . . . . . . . . . 5

1.2.2.1. Células de la retina . . . . . . . . . . . . . . 51.2.2.2. Capas de la retina . . . . . . . . . . . . . . . 61.2.2.3. Fotorreceptores . . . . . . . . . . . . . . . . 81.2.2.4. Células horizontales . . . . . . . . . . . . . 111.2.2.5. Células bipolares . . . . . . . . . . . . . . . 121.2.2.6. Células amacrinas . . . . . . . . . . . . . . 141.2.2.7. Células ganglionares . . . . . . . . . . . . . 151.2.2.8. Células del epitelio pigmentario . . . . . . . 161.2.2.9. Células gliales . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

1.2.3. La transducción visual . . . . . . . . . . . . . . . . . . 241.3. CÉLULAS MADRE Y PROGENITORAS . . . . . . . . . . . 25

1.3.1. Células madre y progenitoras embrionarias de la retina 281.3.2. Células madre y progenitoras neurales en la retina adulta 301.3.3. Identificación de células madre y progenitoras en la re-

tina de ratón adulto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 321.3.3.1. Células madre y progenitoras en peces y anfibios 351.3.3.2. Células madre y progenitoras en aves . . . . 361.3.3.3. Células madre y progenitoras en mamíferos . 371.3.3.4. Células VSELs . . . . . . . . . . . . . . . . 42

1.4. RECEPTORES TIPO TOLL . . . . . . . . . . . . . . . . . . 441.4.1. Receptores tipo Toll en la respuesta inmunitaria . . . . 451.4.2. Receptores tipo Toll en las células madre hematopoyé-

ticas (HSCs) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

1.4.3. Receptores tipo Toll en las células madre mesenquimales(MSCs) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

1.4.4. Receptores tipo Toll en el sistema nervioso central (SNC) 47

2. OBJETIVOS 51

3. MATERIALES Y MÉTODOS 533.1. Animales utilizados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 533.2. Extracción de retinas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 533.3. Obtención de células linaje negativo a partir de retinas adultas 543.4. Análisis mediante citometría de flujo . . . . . . . . . . . . . . 55

3.4.1. Preparación de las células y marcaje con anticuerpos . 553.4.2. Análisis de células con fenotipo "Side Population" (SP) 553.4.3. Separación celular mediante citometría de flujo . . . . 553.4.4. Anticuerpos utilizados en citometría de flujo . . . . . . 563.4.5. Equipos y programas utilizados para el análisis de células

mediante citometría de flujo . . . . . . . . . . . . . . 563.5. Ligandos de los TLRs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 573.6. Medida de la proliferación celular . . . . . . . . . . . . . . . . 583.7. Obtención de una línea celular a partir de retinas de ratón adulto 583.8. Obtención de neuroesferas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 593.9. Aislamiento de ARNm y PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . 603.10. Oligonucleótidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 613.11. Análisis de expresión de proteínas mediante Western blot. . . . 633.12. Ensayos de inmunocitoquímica . . . . . . . . . . . . . . . . . 653.13. Medida del calcio intracelular . . . . . . . . . . . . . . . . . . 663.14. Estudio del efecto de toxinas de los canales de sodio dependien-

tes de voltaje sobre la viabilidad celular . . . . . . . . . . . . . 673.15. Determinación de la producción de TNF-a in vitro . . . . . . 673.16. Ensayo de la actividad de agentes antioxidantes y antiapoptó-

ticos sobre la viabilidad de células MU-PH1 sometidas a estrésoxidativo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68

3.17. Análisis estadístico de los resultados . . . . . . . . . . . . . . 693.18. Medios de cultivo y soluciones . . . . . . . . . . . . . . . . . 69

4. RESULTADOS 734.1. IDENTIFICACIÓN DE POBLACIONES DE CÉLULAS MADRE

EN RETINA DE RATONES ADULTOS . . . . . . . . . . . . 744.1.1. Identificación de células madre con el fenotipo "Side

Population" . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74

4.1.2. Identificación de células madre mediante la deteccióndel antígeno Sca-1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75

4.2. ESTUDIO DE LA EXPRESIÓN Y FUNCIONALIDAD DE RE-CEPTORES TIPO TOLL EN LAS POBLACIONES DE CÉLU-LAS Sca-1+ CD45 � IDENTIFICADAS . . . . . . . . . . . . . 774.2.1. Estudio de la expresión de TLR2 en las células Lin�

Sca-1+ CD45� en retina de ratón adulto . . . . . . . . 784.2.2. Estudio de la funcionalidad de TLR2 en células Lin�

Sca-1+ CD45� en retina de ratón adulto . . . . . . . . 814.2.2.1. Estudio en células en cultivo durante una se-

mana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 814.2.2.2. Estudio en células en cultivo durante dos se-

manas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 834.3. AISLAMIENTO Y CULTIVO DE CÉLULAS Lin� Sca-1+ CD45�.. 864.4. ESTUDIO DE LA FUNCIONALIDAD DE LOS RECEPTORES

TIPO TOLL EN LAS CÉLULAS AISLADAS Lin� Sca-1+ CD45� 884.4.1. Estudio del efecto de la activación de TLRs sobre la

proliferación celular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 884.4.2. Estudio del efecto de la activación de TLRs en la expre-

sión de Sca-1, TLR2 y CD11b . . . . . . . . . . . . . 894.5. OBTENCIÓN DE UNA LÍNEA CELULAR A PARTIR DE CÉ-

LULAS PROGENITORAS DE RETINA ADULTA . . . . . . . 934.6. CARACTERIZACIÓN DE LA LÍNEA CELULAR MU-PH1 . . . 94

4.6.1. Estudio de la pérdida de diferenciación: formación deneuroesferas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95

4.6.2. Estudio de la expresión de marcadores celulares y pro-teínas relacionadas con la visión . . . . . . . . . . . . 964.6.2.1. Estudio de la expresión de marcadores celula-

res mediante RT-PCR . . . . . . . . . . . . 964.6.2.2. Estudio de la expresión de marcadores celula-

res mediante Western blot . . . . . . . . . . 974.6.2.3. Estudio de la expresión de marcadores celula-

res mediante inmunofluorescencia . . . . . . 984.6.3. Estudio de la expresión de otras proteínas no relaciona-

dos con la visión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1004.6.3.1. Expresión de receptores de melatonina . . . . 1004.6.3.2. Expresión de canales de sodio dependientes de

voltaje . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1024.6.4. Estudio de la sensibilidad a la luz . . . . . . . . . . . . 104

4.7. EXPRESIÓN Y FUNCIONALIDAD DE RECEPTORES TIPOTOLL EN LA LÍNEA CELULAR MU-PH1 . . . . . . . . . . . 1054.7.1. Estudio de la expresión de receptores tipo Toll en la

línea celular MU-PH1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1054.7.2. Estudio de la funcionalidad de receptores tipo Toll en la

línea celular MU-PH1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1064.7.2.1. Estudio del aumento de la expresión de TLRs

en respuesta a la activación por MAMPs . . 1064.7.2.2. Estudio del efecto de la estimulación de los

TLRs de las células MU-PH1 sobre la prolife-ración celular . . . . . . . . . . . . . . . . . 107

4.7.2.3. Estudio del efecto de la estimulación de losTLRs en las células MU-PH1 sobre la diferen-ciación celular . . . . . . . . . . . . . . . . . 110

4.7.2.4. Producción de citocinas: implicación de losTLRs de las células MU-PH1 en la respues-ta inmunitaria . . . . . . . . . . . . . . . . . 110

4.8. UTILIZACIÓN DE LA LÍNEA CELULAR MU-PH1 COMO MO-DELO DE CRIBADO DE COMPUESTOS NEUROPROTEC-TORES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1124.8.1. Estudio de la sensibilidad de la línea MU-PH1 a distintos

estímulos nocivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1124.8.2. Estudio del efecto neuroprotector de sustancias antioxi-

dantes en la línea MU-PH1 . . . . . . . . . . . . . . . 113

5. DISCUSIÓN 117

6. CONCLUSIONES 129

7. ABREVIATURAS 131

Capítulo 1

INTRODUCCIÓN

La función del ojo es percibir y captar la luz del exterior, de manera queuna vez percibida, pueda ser procesada y enviada al cerebro donde se forma laimagen. Para realizar esta función, el globo ocular dispone de un sistema ópticoque va enfocando la imagen, la cual se proyecta sobre una capa sensible que esla que finalmente procesa y emite dicha señal. Esta capa sensible es la retina yes la capa más importante para la visión. La degeneración de la retina, debidoa enfermedades o a lesiones, es la causa más común de ceguera irreversible enel mundo desarrollado (Cuenca et al., 2014; Singh and MacLaren, 2011).

1.1. EL GLOBO OCULAREl ojo es un órgano esférico alojado en el cráneo, dentro de una cavidad

ósea denominada órbita, que protege al globo ocular de los impactos. Entre elojo y la órbita se encuentran: El saco lacrimal, que secreta el líquido lacrimal,los músculos extraoculares, seis músculos extrínsecos encargados de la mo-tilidad ocular, tejido adiposo que actúa como almohadilla, la arteria centralde la retina que es una rama colateral de la arteria oftálmica e irriga el globoocular y el nervio óptico o II par craneal que es un nervio sensitivo encargadode transmitir la información visual al cerebro (Fig. 1.1) (Derrickson, 2011).

El globo ocular está compuesto por una cubierta llamada conjuntiva y trescapas esféricas, cada una de las cuales cumple una función distinta. Estas capasforman la pared del globo ocular y en su interior hay líquido a presión y unaestructura lenticular transparente llamada cristalino que separa dos cavidades.(Fig 1.1). El humor acuoso es el líquido que ocupa el segmento anterior delglobo ocular y el humor vítreo, el líquido que ocupa el segmento posterior del

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INTRODUCCIÓN

globo ocular.

1. LA CAPA EXTERNA o capa fibrosa, está formada por la córnea y laesclerótica. Tienen la función de proteger el contenido ocular y mante-ner la forma del globo ocular. Ofrecen, además, una superficie para lainserción de los músculos extraoculares.

2. LA CAPA MEDIA es una capa vascular de la cual depende el meta-bolismo de las capas externa e interna. Por su color, a esta capa se ledenomina úvea, y por las diferenciaciones que presenta, podemos recono-cer en ella tres regiones: el iris, el cuerpo ciliar y la coroides. El iris es unamembrana delicada, fina y pigmentada. Tiene un orificio central llamadopupila cuya función es regular la cantidad de luz que pasa. El cuerpociliar se extiende desde la base del iris hasta el final de la coroides, la oraserrata. Está constituido por dos partes: la pars plicata que continene losprocesos ciliares y la pars plana en la que se encuentra el músculo ciliar.La coroides está formada por vasos sanguineos y su función principal esnutrir y recoger los productos de desecho (Fig. 1.1).

3. LA CAPA INTERNA del globo ocular es la retina. Aunque todas laspartes del ojo son necesarias para percibir una buena imagen, esta esla capa más importante para la visión. La retina es esencialmente unaextensión del sistema nervioso central (SNC) que recibe la estimulacióndirecta de la luz y genera impulsos nerviosos que son transmitidos alcerebro para su interpretación (Alm, 2004; Derrickson, 2011; Karl andReh, 2010).

Al final de la tercera semana del desarrollo embrionario comienzan a desarro-llarse los ojos a ambos lados del prosencéfalo cómo vesículas ópticas:

1. La retina, el nervio óptico, los músculos, el epitelio del iris, y el cuerpociliar derivan todos ellos del neuroectodermo del cerebro anterior.

2. El cristalino, el epitelio de las glándulas lacrimales, los párpados, la con-juntiva y la córnea surgen del ectodermo superficial.

3. Los músculos extraoculares, el tejido conectivo y vascular de la córnea,el iris, el cuerpo ciliar, la coroides y la esclerótica tienen su origen en elmesodermo (Gilbert, 2005).

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INTRODUCCIÓN

Figura 1.1: Corte transversal del globo ocular humano. El eje visual corresponde altrayecto seguido por los rayos luminosos provenientes de un objeto enfocado con lamirada, pasando por el punto nodal del cristalino hasta la fóvea. Modificada a partirde: Derrickson (2011).

1.2. LA RETINALa retina es una lámina translúcida de tejido nervioso que tapiza la parte

posterior del globo ocular llegando hasta la ora serrata (Fig. 1.2). Es la capaencargada de procesar la información visual (Cuenca et al., 2014; Lledó Riquel-me et al., 2010).

Cuando realizamos una sección vertical de la retina y la observamos al mi-croscopio, resulta evidente que la retina es una estructura muy compleja quecontiene muchos elementos aunque tiene una arquitectura común en todas lasespecies (Fig. 1.2) tanto en mamíferos como en no mamíferos (Karl and Reh,2010).

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INTRODUCCIÓN

Figura 1.2: Corte transversal del globo ocular humano. Ampliación de la estructurade la retina.

1.2.1. Estructura de la retinaLa retina humana tiene un diámetro total aproximadamente de 42 mm. En

el centro de la retina se encuentra un área de forma circular u oval que mideaproximadamente 2 x 1.5 mm. Esta zona se denomina papila y corresponde ala salida del nervio óptico y al paso de los vasos sanguíneos que llegan a laretina (arteria central de la retina). A unos 17 grados (4.5-5 mm) a la derechade la papila se encuentra una zona también ovoidea, con una coloración rojiza,que carece de vasos sanguíneos y se denomina fóvea. Es a este nivel dondese enfocan los rayos luminosos y se consigue la máxima agudeza visual. Sedenomina región central de la retina a la porción de la retina que se encuentraalrededor de la fóvea (unos 6 mm alrededor de la fóvea). El resto es retinaperiférica y llega hasta 0.5 mm de la ora serrata (que está a unos 21 mm desdeel centro de la papila). La retina se divide en dos partes (Derrickson, 2011; Karland Reh, 2010; Kolb and Dekorver, 1991; Lledó Riquelme et al., 2010; Polyak,1941; Van Buren, 1963):

1. El epitelio pigmentario � Es la porción más externa y está formadopor una sola capa de células. Capta, almacena, distribuye y metabolizatodos los pigmentos visuales fagocitando los discos membranosos másexternos de los fotorreceptores durante el ciclo diurno. Constituye la ba-rrera hemato-ocular, que controla el paso de nutrientes de la coroides

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INTRODUCCIÓN

hacia la retina neurosensorial, manteniendo concentraciones apropiadaspara la fisiología neural.

2. La retina neurosensorial � Es un complejo circuito neural situado enla porción más interna. Está compuesta por 3 capas que contienen loscuerpos neuronales y 2 capas de conexiones sinápticas denominadas ple-xiformes. Es responsable de la fototransducción de la luz: conversión dela energía de la luz en un patrón de impulsos eléctricos que informan alcerebro, por medio del nervio óptico, de las imágenes visuales.

1.2.2. Organización histológica de la retina1.2.2.1. Células de la retina

El epitelio pigmentario está formado por una sola capa de células que tienenmelanina y absorben la luz que les llega.

La retina neurosensorial está formada por distintas clases de células y a suvez, cada una de ellas con distintos subtipos (Derrickson, 2011; Karl and Reh,2010; Lledó Riquelme et al., 2010; Marc, 2008):

1. Seis tipos de NEURONAS:

a) Sensibles a la luz que captan en primer lugar la señal luminosa:Conos (visión de colores durante el día)Bastones (sensores de luz baja)

b) Interneuronas que procesan la señal de los fotorreceptores:Células horizontalesCélulas bipolaresCélulas amacrinasCélulas ganglionares (las células ganglionares que expresan me-lanopsina son también sensibles a la luz)

2. Tres tipos de CÉLULAS GLIALES:

a) Microglíab) Macroglía:

Células de MüllerAstroglía

5

INTRODUCCIÓN

1.2.2.2. Capas de la retina

En todos los vertebrados, la retina se describe de forma tradicional consti-tuida por 10 capas, donde se distribuyen las distintas células, nueve constituyenla retina sensorial y la décima es el epitelio pigmentario (Karl and Reh, 2010;Marc, 2008). Las diez capas de la retina, numeradas desde el lado más externo,el epitelio pigmentario (Fig. 1.3), son:

1. Epitelio pigmentario (RPE, del inglés Retinal Pigment Epithelium).

2. Capa de segmentos internos y externos de bastones y conos (OSL, delinglés Outer Segments Layer).

3. Membrana limitante externa (OLM, del inglés Outer Limiting Mem-brane).

4. Capa nuclear externa (ONL, del inglés Outer Nuclear Layer), quecontiene los cuerpos celulares y terminaciones sinápticas de los conos ybastones.

5. Capa plexiforme externa (OPL, del inglés Outer Plexiform Layer),donde contactan los conos y bastones con las dendritas de las célulasbipolares y las células horizontales.

6. Capa nuclear interna (INL, del inglés Inner Nuclear layer), que contie-ne los cuerpos celulares de las células horizontales, bipolares y amacrinas.

7. Capa plexiforme interna (IPL, del inglés Inner Plexiform Layer), don-de se produce la segunda sinapsis de la vía vertical de la retina. Aquícontactan los axones de las células bipolares con las dendritas de lascélulas ganglionares. Además a este nivel, terminan gran cantidad deprolongaciones de las células amacrinas.

8. Capa de células ganglionales (GCL, del inglés Ganglion Cell Layer),que contiene los cuerpos celulares de estas células ganglionares, ademásde los de algunas células amacrinas desplazadas.

9. Capa de fibras nerviosas (OFL, del inglés Outer Fiber Layer).

10. Membrana limitante interna (ILM, del inglés Inner Limiting Mem-brane).

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INTRODUCCIÓN

Figura 1.3: Distribución de las células retinianas responsables de la codificación visualen las distintas capas de la retina. Modificada a partir de: Marc (2008).

La luz entra al ojo a través de la córnea, atraviesa la cámara anterior, elcristalino, el humor vítreo y llega a la retina. Una vez aquí debe atravesar todaslas capas de la retina hasta llegar a la capa donde se encuentran los elementosfotosensibles: conos y bastones óptimamente orientados para detectar la inci-dencia de los fotones (Fig. 1.4).

Los fotorreceptores, que son el primer nivel neuronal, son neuronas foto-sensibles que detectan cambios en la intensidad de la luz y se hiperpolarizanal recibir la energía de un estímulo luminoso. Esta hiperpolarización es unarespuesta eléctrica que se constituye en un impulso nervioso. Esta señal eléc-trica se envía a través de las terminaciones sinápticas de conos y bastones queconectan con interneuronas que codifican aun más las señales eléctricas. Esteproceso permite el reconocimiento de formas, tamaños, colores y movimientos.El segundo nivel neuronal está constituido por las células horizontales y célulasbipolares. Asimismo, existe un tercer nivel neuronal que recoge todos estosimpulsos modificados por las células bipolares, son las células amacrinas queprocesan las señales de nuevo. Por último, las células ganglionares transmitenlas señales eléctricas mediante sus axones, el conjunto de los cuales conformael nervio óptico que sale de cada ojo (Fig 1.4).

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INTRODUCCIÓN

Figura 1.4: Capas de una retina humana sana. Los fotorreceptores están orientadosde manera óptima para detectar la incidencia de fotones. Su extremo exterior sensible ala luz está adosado al epitelio pigmentario retiniano y su extremo interior especializadopara realizar la transmisión sináptica, conectado a neuronas de segundo orden en laretina interna. Con la entrada de luz en las capas de la retina, los fotorreceptores seestimulan generando impulsos que son procesados por las células de la retina interna yluego transmitidos al cerebro a través del nervio óptico (Singh and MacLaren, 2011).

La información visual recibida por los fotorreceptores y codificada por lasinterneuronas retinianas es transmitida a áreas específicas del cerebro por losaxones de las células ganglionares a través del nervio óptico. El nervio ópticodeja la cavidad orbitaria a través del canal óptico para unirse con el nerviocontralateral y conformar el quiasma óptico hasta el siguiente núcleo de lavía visual, el núcleo geniculado lateral. Los axones de las neuronas del cuerpogeniculado lateral, terminan sinaptando con las neuronas de la corteza visualprimaria, en el tálamo (Lopez and York, 2006). La sensación visual se producecuando los impulsos llegan a la corteza visual en el lóbulo occipital (Singh andMacLaren, 2011).

1.2.2.3. Fotorreceptores

Los fotorreceptores son elementos fotosensibles de la retina. En todos losgrupos de vertebrados existen dos tipos de fotorreceptores que se clasificansegún la morfología del segmento externo, si es corto y de forma cónica se de-

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INTRODUCCIÓN

nominan conos, y si es más largo y cilíndrico bastones (Marc, 2008) (Fig. 1.5).

Figura 1.5: Fotorreceptores devertebrados (Cuenca et al., 2014).

La estructura del fotorreceptor compren-de varias partes principales: el segmento ex-terno y el segmento interno, un cuerpo celu-lar, un axón y un terminal axónico. El seg-mento externo tiene forma cilíndrica y es-tá conectado con el segmento interno porun delgado cilio. Contiene discos densamenteempaquetados, formados por invaginacionesde la membrana plasmática en los conos, ydiscos superpuestos a modo de pila de mone-das y recubiertos por la membrana plasmáticaen los bastones. El segmento interno contienelos orgánulos subcelulares típicos, incluidos elretículo endoplasmático y el aparato de Golgien una zona denominada mioide, y un grancúmulo de mitocondrias debajo del segmen-to externo en una zona denominada elipsoi-de, así como un cuerpo sináptico, localizadoen el extremo más interno de dicho segmen-to que establece contacto sináptico con lascélulas bipolares y horizontales de la retina.El terminal axónico, denominado esférula enlos bastones y pedículo en los conos, contie-ne una gran cantidad de vesículas sinápticas,de forma que los neurotransmisores almace-nados en ellas son liberados a la hendidurasináptica (Lledó Riquelme et al., 2010). Aun-que los somas celulares de conos y bastonesse localizan en la ONL y sus segmentos inter-nos y externos se proyectan dentro del espa-cio subretiniano hacia el epitelio pigmentario,se distribuyen de manera distinta en el espe-sor de la capa. Mientras que los núcleos delos conos se sitúan formando una monocapa, alineados justo por debajo dela OLM, los cuerpos celulares de los bastones constituyen el resto de la ONLformando varias capas (Kolb et al., 2001).

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INTRODUCCIÓN

Los conos y bastones constituyen sistemas diferentes en la recepción dela señal luminosa. Los bastones contienen rodopsina y son responsables de lavisión escotópica, sensibles únicamente en condiciones de baja luminosidad. Apartir de cierto nivel de iluminación, los bastones se saturan e intervienen losconos, capaces de registrar cambios rápidos de la intensidad de luz, permitien-do la visión en color (Kolb et al., 2001). Mientras que los bastones forman unsólo tipo morfológico y funcional, los conos contiene opsinas y existen distintostipos de conos según la opsina que poseen.

El número y naturaleza de los pigmentos visuales expresados en los fotorre-ceptores varía considerablemente entre diferentes especies. La mayoría de losmamíferos tienen dos tipos de conos (cono rojo y cono azul) pero en el caso delos primates existen tres tipos de conos que dan lugar a la visión tricromática:rojos, verdes y azules (Kolb et al., 2001). Los pájaros diurnos y los reptilesexpresan cinco tipos de opsinas en los diferentes fotorreceptores, una en basto-nes y las otras cuatro en los conos, dando visión tetracromática. En el caso delos teleósteos existe mucha más variabilidad, ya que se han adaptado práctica-mente a todos los hábitats acuáticos y la importancia de la visión cromáticadependerá del ambiente y de su ciclo vital. Podemos encontrar visión monocro-mática en peces abisales, dicromática en peces de aguas turbias, tricromáticaen peces de arrecifes coralinos e incluso tetracromática para los peces de aguasdulces cristalinas (Goldsmith, 1980; Hughes et al., 1998; Robinson et al., 1993).

Estudios fotométricos y fisiológicos han demostrado que en la retina huma-na existen tres tipos de conos que dan lugar a la visión tricromática. El sistemade nomenclatura más utilizado es el RGB (rojo, verde, azul), pero existe tam-bién el sistema LMS (onda larga, media y corta). El sistema RGB hace alusión alos espectros de percepción (rojo, verde, azul) y el LMS a los picos espectralesde absorción de los pigmentos visuales (amarillo-verde, verde, violeta) (Marc,2008).

Siguiendo la terminología tradicional de la fisiología, el SNC de primatesmuestra una visión tricromática RGB, con tres picos de percepción, represen-tados por las tres clases de conos (Marc, 2008):

1. Conos rojos � Presentan una sensibilidad máxima para las longitudesde onda más largas: 610 nm (rojo anaranjado).

2. Conos verdes � Presentan mayor sensibilidad a las longitudes de ondamedias: 535 nm (verde).

3. Conos Azules � Presentan mayor sensibilidad a las longitudes de onda

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INTRODUCCIÓN

más cortas: 430 nm (azul).Por el contrario, los bastones forman un sólo tipo morfológico y funcional defotorreceptor, presentando un pico de mayor sensibilidad hacia la longitud deonda de los 500 nm (luz verde azulada) y son responsables de la visión enblanco y negro. Así la retina humana sólo es capaz de detectar una pequeñaparte del espectro electromagnético, longitudes de onda comprendidas entrelos 400-700 nm.

En muchas especies los conos se concentran en regiones especializadas pa-ra conseguir una mayor agudeza visual y apreciación del color, esta región sedenomina fóvea (Kolb et al., 2001). En el centro de la fóvea se encuentra lafoveola de aproximadamente 0,35 mm de diámetro. La estructura de la foveolaes diferente de la del resto de la retina y consiste en una capa única que con-tiene sólo conos. Alrededor de la fóvea, en el área parafoveal entre la capa defotorreceptores y la OPL, los axones de los conos de la fóvea están dispuestosoblicuamente y constituyen una región anatómica llamada capa de fibras Hen-le, que no está presente en la retina periférica (Cuenca et al., 2014).

En la fóvea de primates, los conos predominantes son los sensibles a la luzverde y a la luz roja. No hay conos sensibles al azul en la región central de lafóvea, si bien alcanzan su máxima abundancia en sus pendientes. Los conossensibles al verde y al rojo, en el resto de la retina, se mantienen espaciados deforma homogénea y están rodeados por anillos de bastones. Los conos sensiblesal azul están separados de manera más irregular (Curcio et al., 1987; Marc andCenter, 2011; Osterberg, 1935).

En términos cuantitativos en la retina podemos encontrar en total 6,5 mi-llones de conos y 120 millones de bastones. La mayor densidad de conos seconcentra a nivel de la fóvea (160.000 conos/mm2), decreciendo su númeroconforme nos alejamos de la misma hasta una densidad más o menos unifor-me en la retina periférica (5.000 conos/mm2). Fuera de la fóvea predominanlos bastones cuya densidad máxima se alcanza en un anillo a unos 4,5 mm(140.000 bastones/mm2), que corresponde a unos 20 grados desde la fóvea.En la papila óptica no hay fotorreceptores, es el llamado punto ciego de laretina (Marc, 2008).

1.2.2.4. Células horizontales

Las células horizontales son neuronas de interconexión lateral que se en-cuentran en la OPL. Contribuyen a integrar y regular los impulsos de entrada

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INTRODUCCIÓN

enviados por las células fotorreceptoras. Permiten el cruce entre células foto-rreceptoras vecinas, haciendo que estas células puedan comparar la luz queperciben, un proceso necesario para poder ver las imágenes, ya que permite anuestro cerebro poder ver líneas y contornos. Esto se lleva a cabo gracias a losmecanismos de inhibición lateral de las células horizontales.

Si la retina simplemente transmitiera las imágenesdirectamente desde los fotorreceptores al cerebro, lavisión resultante probablemente sería de grano gruesoy borrosa. El procesamiento en la retina define y pre-cisa los bordes de las imágenes y nos permite apreciarlos detalles finos.

El perfeccionamiento de la imagen comienza en el primer nivel sinápticode la retina, donde las células horizontales reciben las señales de los fotorre-ceptores. Cada célula horizontal recibe la entrada de muchos fotorreceptorres,por lo que su área de recolección o campo receptivo es grande. Este campo sevuelve aún más amplio debido a que las membranas plasmáticas de las célulashorizontales se fusionan con las de las vecinas. Los potenciales de membra-na de toda una lámina de células se convierte en el mismo; en consecuencia,las células horizontales responden a la luz en un área muy grande (Kolb, 2003).

Las células horizontales modulan la señal de los fotorreceptores bajo dife-rentes condiciones de iluminación, dando mayor o menor sensibilidad a zonascon luz brillante con luz tenue y a su vez, impiden que la señal excitadora sedisemine en una amplia zona de la retina. En la zona limítrofe entre la ilumi-nación y la oscuridad, las diferencias de polarización de las membranas de losfotorreceptores son máximas. Las células horizontales aumentan el contrasteentre las dos zonas, facilitando la distinción de los contornos (Marc, 2008; Marcand Center, 2011; Vicario, 1999).

1.2.2.5. Células bipolares

Se trata de neuronas que disponen de dos terminaciones, una dendrita yun axón. La dendrita las conecta con las células fotorreceptoras y producen ladicotomía funcional esencial de todas las retinas de vertebrados: canales "ON"y "OFF" , mientras que el axón sirve para realizar la conexión con la capa ce-lular más interna de la retina formada por las células ganglionares (Kolb, 2003;Marc and Center, 2011; Wässle, 2004).

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INTRODUCCIÓN

La información visual que se transfiere de los fotorreceptores a las célulasbipolares se separa en dos vías paralelas, llamadas respectivamente vía "centro-ON" y vía "centro-OFF". Se ha visto que la respuesta al potencial de membra-na que provoca la incidencia de la luz en una parte de su campo receptor esopuesta a la que povoca la luz en la otra parte del mismo. Las células bipo-lares poseen campos receptores centro-periféricos antagónicos. Así, podemostener una célula bipolar en la que la iluminación en el centro de su camporeceptor provoca una despolarización (respuesta "centro-ON"). En cambio, sila iluminación se produce en la periferia provoca una hiperpolarización (res-puesta "centro-OFF"). Estas vías paralelas de canales visuales de una imagenson fundamentales para la visión en los vertebrados ya que permiten percibir elcontraste entre las imágenes y sus orígenes. Por ejemplo, leemos letras negrasen un fondo blanco utilizando los canales "centro-OFF" en la retina (Kolb,2003).

Además, las células horizontales también modulantransversalmente el efecto que el glutamato liberado porlos fotorreceptores ejerce sobre las células bipolares. Comose ha comentado anteriormente, las células horizontalesresponden a la luz sobre un área muy grande, mientrasque una sola célula bipolar recibe la entrada de unos po-cos fotorreceptores y por lo tanto tiene un campo recep-tivo de tamaño medio. Considerando que una sola célulabipolar con su respuesta "ON" - "OFF" transmitiría unaimagen bastante borrosa a su célula ganglionar, las célulashorizontales añaden una señal que es espacialmente cons-trictiva, dando a la célula bipolar lo que se conoce como

una organización envolvente central. Las células horizontales añaden una señaltambién "ON" - "OFF" más general, acumulan información a partir de un am-plio campo de fotorreceptores trasmitiendo una señal inhibitoria directamentea la señal de la célula bipolar o retroalimentando de nuevo a los fotoreceptores,información que luego transmitirán ellos hacia las células bipolares que estánen contacto directo con dichos fotorreceptores (Kolb, 2003).

Los fotorreceptores situados en el centro del campo receptivo hacen sinapsiscon células bipolares que entran en contacto directo con células ganglionares.Los estímulos provenientes de los conos localizados en la periferia de los cam-pos receptivos son en cambio conducidos a lo largo de las vías colaterales quepasan a través de las células horizontales y las células amacrinas. Los cam-

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INTRODUCCIÓN

pos receptivos de cada neurona bipolar se organizan en unidades concéntricas,donde la parte central (centro) recibe aferencias directas de los fotorrecepto-res y la periferia de las células horizontales (marco) (Marc, 2008). Las célulashorizontales pueden incluso crear en la respuesta de las células bipolares uncódigo de colores, todo ello a través de los circuitos de retroalimentación conlos fotorreceptores (Kolb, 2003).

En retina de primates se han encontrado al menos 10 clases distintas decélulas bipolares ("ON" y "OFF") y pueden contactar con todos los tipos deconos, sólo con conos rojos y verdes, con conos rojos o conos verdes, con conosazules o sólo con bastones (Marc, 2008).

1.2.2.6. Células amacrinas

Las células amacrinas son el grupo más diverso deneuronas de la retina (Vaney, 2004), con más de 70clases en peces teleósteos (Wagner and Wagner, 1988)y más de 22 clases en mamíferos (Kolb, 2003; Macneilet al., 1999). La mayoría de células amacrinas, por defi-nición, carecen de axones clásicos y realizan su funciónpor medio de circuitos locales, a través de la sinapsis desus dendritas. Las células amacrinas presentan diversasmorfologías dependiendo de la extensión lateral de sus

dendritas que van desde estrechas (menor de 100 mm), tamaño medio (entre100 y 200 mm) y tamaño grande (mayores de 200 mm, con algunas célulasmayores de 1 mm) (Macneil et al., 1999).

Estas células presentan gran diversidad tanto en su morfología como ensu neuroquímica. La cifra exacta sigue siendo incierta, pero alrededor de dostercios de las células amacrinas utilizan como transmisor el GABA y el restola glicina. Con frecuencia, la mayoría de células amacrinas GABA liberado-ras, también liberan al medio otras sustancias neuroactivas (Kolb, 2003; Marc,2004). Estas células tienen un cuerpo celular situado en la INL y unas prolon-gaciones que se extienden por la IPL. No reciben conexiones directas de losfotorreceptores, sino sólo de las células bipolares y de otras células amacrinas,estableciendo a su vez conexiones con células ganglionares y retroalimentandotambién a las células bipolares (Marc, 2008).

Todas ellas modulan señales en la IPL y forman la vía de asociación laterala nivel de esta capa. Las células ganglionares tienen un campo receptivo organi-

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zado en círculos concéntricos. El circuito de células amacrinas en el interior dela IPL transmite información adicional a las células ganglionares, posiblementepara perfeccionar el límite entre el centro y el marco, incluso más allá de larealizada por las células horizontales (Kolb, 2003).

Mientras que los conos se conectan a una vía directa desde las células bipo-lares a las células ganglionares, las células bipolares de bastones no establecensinapsis directa con las células ganglionares, sino a través de una sinapsis pre-via con dos tipos de células amacrinas (Kolb, 2003; Vicario, 1999). Las célulasamacrinas AI (Amacrina recíproca, también conocida como A17), que esta-blecen retroalimentación con la propia célula bipolar y las células amacrinasAII. Las células bipolares conectadas a bastones son únicamente de un tipo,solamente transmiten la señal "ON" y utilizan como células amacrinas interme-diarias las células AII y A17 para llevar las señales a las células ganglionares. Lacélula AII recoge la señal de aproximadamente 30 células bipolares de bastonesy transmite una señal tanto "ON" a una célula ganglionar "ON" como unaseñal "OFF" a una célula ganglionar "OFF". La célula amacrina A17 recoge laseñal de miles de células bipolares conectadas a bastones. Esta célula amacrina,de alguna manera, amplifica y modula la información de las células bipolarespara transmitirla a las células AII. El proceso no es totalmente conocido peroen cualquier caso, esta vía está claramente diseñada para recoger y amplificarvestigios de luz para la visión nocturna (Kolb, 2003).

1.2.2.7. Células ganglionares

Las células ganglionares forman sinapsis a nivel dela IPL con las terminaciones de las células bipolares ylas células amacrinas. Las cifras exactas no se cono-cen, pero claramente aparecen en un número superiora 15 e incluso puede superar los 20 tipos (Dacey et al.,2003; Kolb, 2003; Yamada et al., 2005). No se hanestablecido muchas homologías exactas entre ellas en

mamíferos, pero hay algunos aspectos básicos comunes en su estructura. Casitodas las células ganglionares tienen un cuerpo celular voluminoso y ramifica-ciones dendríticas que muestran una gran variedad de patrones, que van desdeun patrón estrecho de campo grande muy ramificado y compacto a patroneslaminares, estrechos y estratificados o biestratificados y en última instancia conlaminaciones difusas (Marc, 2008).

Las células ganglionares no tienen ningún contacto presináptico, son neuro-

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INTRODUCCIÓN

nas puramente postsinápticas desde la perspectiva de la sustancia neuroquímicaque poseen, decodifican señales de células bipolares (receptores AMPA y sub-tipos de NMDA) y señales de células amacrinas (receptores GABA y glicina)(Marc, 2004; Marc and Jones, 2002). Cada célula ganglionar de la retina gene-ra un único axón que se sitúa a nivel de la capa de las fibras del nervio ópticoy sólo se mieliniza a nivel del nervio óptico, por fuera ya del globo ocular.Este axón llega hasta el cuerpo geniculado externo, donde ocurre la siguientesinapsis de la vía visual (Marc, 2008).

Las células ganglionares tienen un campo receptivo organizado en círculosconcéntricos. En retinas de humanos se observan dos tipos básicos de célulasganglionares "centro-ON" y "centro-OFF" y son la salida principal de la reti-na a los centros visuales del cerebro. Las células ganglionares "centro-ON" seactivan cuando un punto de luz cae en el centro de su campo receptivo y seinactivan cuando la luz cae sobre la la periferia del campo (respuesta "centro-ON" - "periferia-OFF"). Las células ganglionares "centro-OFF" reaccionan demanera opuesta, su actividad aumenta cuando la periferia de su campo recep-tor está encendido y disminuye cuando la luz incide en el centro del campo(respuesta "centro-OFF" - "periferia-ON") (Kolb, 2003).

En contraste con el resto de la retina, la fóvea humana contiene célulasganglionares conectadas en una relación de uno a uno con células bipolares.Esta vía lleva la información de un cono único, transmitiendo así la imagen deun único punto de la fóvea al cerebro. Cada cono puede transmitir una señal"ON" o una señal "OFF". La señal que va al cerebro lleva información espacialy espectral de alta resolución.

1.2.2.8. Células del epitelio pigmentario

El epitelio pigmentariode la retina (RPE) se en-cuentra entre la coroides yla retina neural. Es una mo-nocapa de células epiteliales

pigmentadas que individualmente presentan forma hexagonal y están dispuestasen la monocapa de forma columnar. Está flanqueada por la membrana de Bruchen su superficie basal, y por los segmentos externos de los fotorreceptores en suporción apical. Las células en esta capa están conectadas por uniones estrechasy constituyen los componentes exteriores de la barrera hemato-retiniana (Nagand Wadhwa, 2012; Spitznas, 1973).

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En el espacio subretiniano, se encuentra la matriz interfotorreceptores y las mi-crovellosidades de las células del RPE, opuestas a los segmentos externos de losfotorreceptores, formando los componentes físicos que pueden contribuir, entreotras cosas, al mantenimiento de la adhesión de la retina (Nag and Wadhwa,2012).

El RPE tiene varias funciones fisiológicas que son indispensables para lasupervivencia de las neuronas de la retina, (Strauss, 2005; Sun et al., 2003;Taylor, 2012; Urtubia Vicario, 2007), proporcionando apoyo metabólico y fun-cional a los fotorreceptores mediante:

1. Transporte de nutrientes como glucosa, retinol y ácidos grasos hacialos fotorreceptores, ya que no tienen suministro propio de sangre y losnutrientes deben viajar desde los capilares de la coroides a los fotorre-ceptores, a través de la membrana de Bruch y del RPE

2. Transporte activo de iones conservando la composición adecuada en elespacio subretiniano para mantener la excitabilidad de los fotorreceptores.

3. Transferencia de productos metabólicos finales del espacio subretinianoa la sangre. El camino seguido para la eliminación de restos celulares esel de retorno de los nutrientes.

4. Regeneración de los componentes del ciclo visual, suministrando la vi-tamina A para la síntesis de los pigmentos visuales. El ojo requiere unaporte continuo de vitamina A y es el único órgano en el que se ha de-terminado una función molecular para esta vitamina. El RPE almacenagrandes cantidades de vitamina A, la cual se intercambia continuamentea uno y otro lado de la membrana de los segmentos externos de conosy bastones, que se encuentran insertados entre las evaginaciones de lascélulas del epitelio pigmentario.

5. Contribuye a la renovación de los segmentos externos de los fotorrecep-tores, fagocitando y reciclando sustancias esenciales.

6. Absorbe la luz enfocada en la retina y protege contra la foto-oxidación.

7. Segrega factores de crecimiento, tales como factores de crecimiento defibroblastos (FGF-1, FGF-2 y FGF-5), factor de crecimiento tumoral b,factor de crecimiento-I similar a la insulina, factor neurotrófico ciliar,factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento deendotelio vascular y factor derivado del epitelio pigmentario.

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INTRODUCCIÓN

8. Regula la activación de las células T en el ojo.

HOTodas estas funciones son esenciales, y un fallo de cualquiera de ellas puedeconducir a la muerte de los fotorreceptores, degeneración de la retina, pérdidade la función visual y ceguera.

1.2.2.9. Células gliales

Las células gliales son células nodriza del SNC que desempeñan, de formaprincipal, la función de soporte y nutrición de las neuronas. Las células glialescontrolan funciones fisiológicas tales como el mantenimiento adecuado del mi-croambiente celular, los niveles de neurotransmisor y el suministro de citocinasy otros factores de crecimiento (Fig. 1.6). Además, contribuyen al manteni-miento de la barrera hemato-encefálica y del sistema inmunológico (Karl andReh, 2010).

En la retina de mamíferos se han identificado tres clases de células gliales(Karl and Reh, 2010):

1. Microglía

2. Macroglía: Células de Müller y astroglía.

1- Como parte del SNC, la retina humana tiene una población de fagocitosresidentes llamados microglía que tiene una capacidad inmunológica compa-rable a la de los monocitos y macrófagos en otros tejidos; representan a losmacrófagos del SNC (Graeber and Stre’rt, 1990). Las células de la microglíase encuentran principalmente en INL y OPL en retinas sanas. En las tincionesde Golgi, aparecen como células multipolares, con pequeños cuerpos celularesy unos prolongaciones irregulares y cortas.

La función principal de las células microgliales en la retina es la vigilanciainmunológica. Son los principales elementos inmunocompetentes y fagocíticosresidentes en el SNC: participan en la conservación de la homeostasis (detec-tan microrroturas de la barrera hemato-retiniana hasta el nivel de pequeñosvasos sanguíneos) y forman parte en los mecanismos de defensa mediados porel sistema inmunológico, actuando como fagocitos, limpiando de restos las cé-lulas dañadas desde el interior de las capas de la retina y formando una redde células con potencial efecto inmunológico (Hanisch and Kettenmann, 2007;Kreutzberg, 1996; Raivich et al., 1999).

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Sin embargo, el papel de la microglía va mucho más allá de su función rele-vante frente a patógenos en infecciones y lesiones de la retina. Aunque muchosaspectos aún no se entienden, hoy en día se cree que la microglía es importantepara mantener la supervivencia de los fotorreceptores. Las células microglialesjuegan un papel clave en la supervivencia de las neuronas ya que secretan fac-tores de protección, como citocinas antinflamatorias, antioxidantes y factoresde crecimiento, tales como el factor neurotrófico derivado del cerebro, factorneurotrófico ciliar, factor neurotrófico glial, factores de crecimiento de nervios,neurotrofina-3 y factores de crecimiento para fibroblastos básico (Langmann,2007).

En las retinas sanas, las células de la microglía es-tán en un estado de aparente reposo, pero sin embargo,están continuamente vigilando su entorno, moviéndoseextensamente y monitorizando el área o superficie a sualrededor para eliminar los productos metabólicos y res-tos en los tejidos. Este estado no activado se caracterizapor una morfología muy arborescente, plasticidad y unadistribución pluriestratificada en la INL y OPL. En este

estado, las células microgliales expresan bajos niveles de moléculas coestimu-ladoras y muestran niveles relativamente bajos de actividad fagocítica (Dicket al., 2003; Hume et al., 1983; Langmann, 2007; Streit et al., 1999). El apa-rente estado de reposo de la microglía en una retina sana se mantiene graciasa los contactos intercelulares y factores solubles secretados por neuronas, as-trocitos y el RPE (Langmann, 2007).

Las células microgliales se activan rápidamente por una variedad de se-ñales, ya sea por factores genéticos o ambientales, como resultado de dañosexternos, de infecciones oculares o debido al mal funcionamiento celular de laretina o del RPE neural. Además, la microglía de la retina puede ser tambiénactivada por infecciones sistémicas, ya sea de origen viral (Zinkernagel et al.,2013) o de origen fúngico (Maneu et al., 2014). Tras la activación, las célulasmicrogliales cambian de una morfología ramificada a una forma ameboide, conuna intensidad de la respuesta de acuerdo con el grado de activación (Hanischand Kettenmann, 2007; Raivich et al., 1999). En el estado activado, las célulasmicrogliales proliferan, migran al sitio del estímulo y se observa un incrementode su capacidad fagocítica. En la fase efectora, la microglía se acumula en lascapas nucleares y el espacio subretiniano, donde actúan como fagocitos, lim-piando las células que mueren (Langmann, 2007). La activacion de la microglía

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supone una defensa para las células mientras que una activación excesiva o muyprolongada puede producir inflamación cronica y neurotoxicidad (Cuenca et al.,2014).

2- Las células de Müller son el principal tipo de células gliales, de mayortamaño y más específico de la retina, abarcando todo el espesor de la misma,desde la OLM a la GCL. Sus núcleos se sitúan en la INL y sus prolongacionesrodean a las neuronas. Están en contacto con el cuerpo celular y las prolonga-ciones de todas las células de la retina, lo que constituye un vínculo anatómicoentre las neuronas y los compartimentos con los que éstas necesitan intercam-biar moléculas.

Las células de Müller son las principales responsa-bles del mantenimiento de la homeostasis del microam-biente extracelular de la retina, mediante la regulacióndel metabolismo de la glucosa, del flujo sanguíneo, delos procesos de señalización neuronal y de la homeos-tasis de iones, agua y pH, entre otros aspectos, ga-rantizando así su correcto funcionamiento. Los factorestróficos derivados de estas células son importantes pa-ra la supervivencia de las neuronas de la retina y parala formación de circuitos neuronales (una célula de gliada soporte a más de 15 neuronas) (Bringmann et al.,2009; Franze et al., 2007; Newman and Reichenbach,1996).

Las células de Müller también están involucradas en la regulación de laactividad sináptica de la retina interna mediante la liberación de glutamato,adenosina o ATP. Más específicamente, son responsables de la captación yel aclaramiento de los neurotransmisores, principalmente glutamato, aunquetambién GABA y glicina. Otra función de las células de Müller es proporcionarprecursores de neurotransmisores a las neuronas, tales como la glutamina parala síntesis de glutamato (Bringmann et al., 2006; Reichenbach and Bringmann,2013). Por otra parte, la retina tiene una elevada necesidad de protección an-tioxidante, debido a su exposición a la luz, el alto consumo de oxígeno y lapresencia de grandes cantidades de ácidos grasos poliinsaturados que hay enlos fotorreceptores. En este sentido, las células de Müller producen moléculasantioxidantes, tales como glutatión, que se genera tras el estrés oxidativo queresulta de la hipoxia en la oscuridad o en la hiperoxia durante la exposición

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a la luz (Pow and Crook, 1995; Schütte and Werner, 1998). Las células deMüller también protegen a los fotorreceptores y neuronas de la retina de lamuerte (Bringmann et al., 2006) a través de la secreción de factores neuro-tróficos, factores de crecimiento y citocinas (Bringmann et al., 2009) (Fig. 1.6).

Durante la última década, se han descrito nuevas funciones para las célulasde Müller (Fig. 1.6). Se ha demostrado están actuando como fibras ópticas queguían la luz a través de las capas de la retina interna hacia los fotorreceptores,lo que minimizaría su dispersión (Franze et al., 2007). Además, las células deMüller pueden actuar como sustrato deformable y flexible para la incorporacióny crecimiento de neuronas y de sus ramificaciones (Lu et al., 2006), propor-cionando a su vez protección a las neuronas ante la tensión mecánica causadapor traumatismos o lesiones en la retina (Lu et al., 2006).

En caso de daño en la retina, las células de Müller desempeñan un papelcrucial proporcionando una rápida respuesta a cualquier alteración del micro-ambiente de la retina. Son unas de las primeras células gliales que detectandaño en la retina debido por una parte, a su distribución radial y por otra, a queson células altamente resistentes a estímulos patógenos, tales como isquemia,anoxia, hipoglucemia y presión hidrostática elevada. Esta resistencia es debidaen parte, a la reserva de energía que posee en forma de glucógeno, a su altacapacidad antioxidante y su capacidad de proliferación y regeneración, entreotras propiedades (Bringmann et al., 2009).

En la retina de mamíferos, la típica respuesta a un daño es la gliosis reac-tiva de las células de Müller. Se trata de una respuesta no estereotipada delas células de glía asociada a un estado patológico que produce cambios enla expresión genética, en su morfología, migración, y con menos frecuencia enla proliferación celular dependiendo del tipo de daño o ataque (Karl and Reh,2010).

Los cambios reactivos en las células de Müller en respuesta al daño tienenun efecto neuroprotector directo en la retina, especialmente en las primerasetapas después de este. En este caso, los cambios funcionales y bioquímicosen las células de Müller se describen como "conservadores" o no proliferati-vos. Pero esta reacción generalmente beneficiosa puede conducir a un mayornivel de respuesta de las células de Müller que se describe como "masiva" oproliferativa, en cuyo caso la gliosis es perjudicial para el tejido de la retina yexacerba la muerte neuronal. Un posible detonador para realizar la transición de

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gliosis "conservadora" a "masiva" es la ruptura de la barrera hemato-retiniana,aumentando con ello el contenido de la retina de factores de crecimiento yfactores inflamatorios de la retina, así como una infiltración de células inmuni-tarias derivadas de sangre (Bringmann et al., 2009).

Una cualidad importante de las células de Müller también son capaces dedesdiferenciarse a células con características similares a las células multipoten-tes de la retina. Son las únicas células gliales que derivan del neuroepitelio,aunque han seguido un desarrollo filogénico y ontogénico diferente al de lasneuronas. Debido a que son menos diferenciadas que las neuronas, conservanla capacidad mitótica y son las que se encargan de la reparación y regeneraciónde las lesiones del sistema nervioso, siendo las encargadas de la neurogénesisadulta en algunas especies animales (Karl and Reh, 2010; Raymond et al.,2006). Después de una lesión, subpoblaciones de células de Müller parecen de-jar de expresar marcadores característicos de estas células, se desdiferencian ycomienzan a actuar como células progenitoras, expresando marcadores específi-cos de células madre neuronales (Bringmann et al., 2009; Fischer and Bongini,2010; Fischer and Reh, 2001; Kohno et al., 2006; Wohl et al., 2009).

3 - Los astrocitos se caracterizan por su cuerpocelular aplanado y una serie de prolongaciones radiales,llenas de filamentos intermedios. Los astrocitos son lasprincipales células gliales en el cerebro, donde se encar-gan de muchas de las funciones que realizan las célulasde Müller de la retina (Fig. 1.6) (Coorey et al., 2012).Estas células derivan del mesodermo circundante a las

vesículas ópticas, por lo que estrictamente no son células neurogliales. Pene-tran en la retina coincidiendo con los precursores de los vasos sanguíneos. Estosastrocitos se encuentran casi exclusivamente a nivel de la capa de fibras delnervio óptico de la retina. No existen astrocitos a nivel de la fóvea avascularni de la ora serrata. Su morfología cambia según su localización, de maneraque pasan de ser muy elongados a nivel de la retina central a una morfologíaestrellada a nivel de la retina periférica (Schnitzer, 1988).

A pesar de que muchas de las funciones de los astrocitos en la retina no seconocen, se considera que juegan un papel esencial en el desarrollo y la funciónde los vasos de la retina, el flujo sanguíneo y la barrera hemato-retiniana (Kuret al., 2012). Los capilares de la retina forman la barrera hemato-retiniana queconsta de una sola capa de células endoteliales fuertemente adheridas, una lá-

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mina basal, rodeada de pericitos, astrocitos y microglía, formando un complejofuncional denominado unidad neurovascular (Klaassen et al., 2013).

Figura 1.6: Función de las células de glia en la retina: microglía, células de Müllery astrocitos. Representación esquemática de las principales características morfológicasy funcionales de las células gliales en la retina, jugando un papel clave en el manteni-miento de la homeostasis y la preservación de la supervivencia de las neuronas (Cuencaet al., 2014).

En la unidad neurovascular, las células endoteliales, pericitos, astrocitos,microglía y neuronas están conectadas activamente a través de una red fun-cional. Así, por ejemplo, la actividad neuronal puede regular el flujo de sangrepor medio de la comunicación glial, a través de factores vasoactivos producidospor los astrocitos que pueden controlar el flujo de la sangre en regiones localesde la retina. Al igual que las células de Müller, los astrocitos forman una reden la que las células se comunican por medio de ondas de calcio o utilizan-do mensajeros extracelulares, tales como ATP (Metea and Newman, 2006,0).Además, los astrocitos ayudan a las células de Müller en el mantenimientode la homeostasis iónica y en la eliminación de los neurotransmisores, dandosoporte a la formación, función y eliminación de la sinapsis a través de la acti-vación de las células de microglía (Kimelberg, 2010; Stasi et al., 2006; Stevens

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et al., 2007). Por otra parte, ayudan a las neuronas a modular la transmisiónsináptica, los neurotransmisores pueden producir movimientos de calcio en losastrocitos, que a su vez son capaces de modular la actividad eléctrica de lasneuronas de la retina (Newman, 2004). En la figura 1.6 podemos observar lasprincipales funciones de las células gliales y la interconexión que existe entreellas.

1.2.3. La transducción visualLa transducción visual o fototransducción es el proceso mediante el cual un

fotón genera una respuesta nerviosa en los fotorreceptores. La estimulación dela rodopsina de los bastones y las opsinas de los conos activan una complejacascada de reacciones enzimáticas y bioquímicas como respuesta a la luz, in-duciendo el cierre de los canales catiónicos de la membrana del fotorreceptor.El potencial de membrana de los fotorreceptores se hiperpolariza, causandouna reducción de la cantidad de neurotransmisor liberado por el terminal delfotorreceptor hacia las neuronas postsinápticas. La transducción visual tienelugar en el segmento externo (Lledó Riquelme et al., 2010).

La rodopsina es una proteína transmembrana que consta de una parteprotéica llamada opsina unida covalentemente a una parte no protéica, un cro-móforo llamado retinal (11-cis retinal) derivado de la vitamina A. El retinales la parte sensible a la luz y presenta dos conformaciones: una forma cis yuna forma trans. El GMPc (monofosfato cíclico de guanosina) es una moléculacentral en la transducción visual que actúa como segundo mensanjero. Todoslos aspectos de señalización de esta cascada catalítica están dominados por elbalance entre la síntesis y degradación de esta sustancia en el citoplasma delsegmento externo del fotorreceptor(Burns and Arshavsky, 2005; Lledó Riquel-me et al., 2010).

En condiciones de oscuridad, el retinal se encuentra en forma cis, el GMPcse une a la superficie interna de los canales de sodio Na+ y los abre. Se ori-gina de esta forma la denominada corriente oscura que da como resultado ladespolarización del fotorreceptor. Es decir, hace más positivo el potencial demembrana del fotorreceptor (-40 mV) y se abren los canales de Ca2+ con laconsiguiente entrada de estos iones en el interior de la célula (Baylor, 1987;Lledó Riquelme et al., 2010). Como consecuencia de esta despolarización enoscuridad, los fotoreceptores están secretando constantemente el neurotransmi-sor glutamato, estimulando continuamente las neuronas bipolares de la retina.Cuando un fotón de luz llega al segmento externo, estimula la molécula de

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INTRODUCCIÓN

rodopsina y causa la isomerización del retinal, produciéndose un cambio con-formacional de la rodopsina a su estado activo (Arshavsky et al., 2002; Chabreand Deterre, 1989; Goldstein, 2013; Hargrave, 2001; Kono et al., 2008; Lle-dó Riquelme et al., 2010; Serrano et al., 2006). La rodopsina, excitada por laluz, cataliza el intercambio de los nucleótidos GDP (guanosildifosfato) por GTP(guanosiltrifosfato) de una proteína G denominada transducina. La transducinaactiva a otra enzima denominada fosfodiesterasa (PDE). Como consecuenciade la activación de la fosfodiesterasa se estimula la degradación de la moléculaGMPc (Stryer and Bourne, 1986). Por tanto, en presencia de luz, los nivelesde GMPc disminuyen, ocasionando el cierre de 250 canales de Na+ por uncuanto de luz absorbida. Todo ello dura alrededor de un segundo. De esta for-ma, se acumulan iones de sodio en el exterior de la membrana plasmática y elpotencial adopta una forma de hiperpolarización. Este cambio en el potencialde membrana conduce al cierre de los canales de calcio dependientes de voltaje(Hodgkin et al., 1987; Lledó Riquelme et al., 2010; Nakatani and Yau, 1988).El resultado final es una disminución de la secreción del neurotransmisor glu-tamato por parte de los fotorreceptores. La sinapsis con las células bipolares esinhibitoria, cuando se deja de inhibir a la célula bipolar, se forma un impulsonervioso que es transmitido a las células ganglionares y de éstas al resto decélulas (Lledó Riquelme et al., 2010).

1.3. CÉLULAS MADRE Y PROGENITORAS

Por definición, una célula madre es toda aquella célula que no está total-mente diferenciada, tiene capacidad de división ilimitada y cuando se divide,puede permanecer como célula madre o puede iniciar una vía que conduce deforma irreversible a su diferenciación terminal (Alberts et al., 1994). Así pues,las células madre son células indiferenciadas que tienen la capacidad de dividirseasimétricamente, dando lugar a una célula hija con capacidad de autorreno-vación y a otra célula hija con capacidad de diferenciación, si las condicionesambientales son adecuadas. Las células madre pueden clasificarse en cuanto asu potencia y en cuanto a su origen.

En cuanto a su potencia, las células madre pueden ser:

1- Totipotentes2- Pluripotentes3- Multipotentes4- Unipotentes

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INTRODUCCIÓN

Durante el desarrollo embrionario, las células madre se vuelven cada vezmás comprometidas de manera que pasan de ser totipotentes, con capacidadde generar el organismo entero, a ser pluripotentes las cuales sólo son capa-ces de generar las tres capas embrionarias. Las células pluripotentes, a su vez,se diferencian en células madre multipotentes, comprometidas a ciertos linajessiendo capaces de generar sólo células de dichos linajes. Las células madre uni-potentes, también llamadas precursores o células progenitoras o "Progenitorscells" (PCs), son células que tienen la capacidad de diferenciarse en un sólotipo celular dentro del tejido al que pertenecen. La diferencia más importanteentre las células madre y células progenitoras es que las células madre puedenreplicarse indefinidamente, mientras que las células progenitoras pueden divi-dirse sólo un número limitado de veces (Seaberg and van der Kooy, 2003).

Atendiendo a su origen, las células madre pueden dividirse en:

1- Células madre embrionarias o fetales: Son aquellas que forman par-te de la masa celular interna de un embrión de 4-5 días de edad, es decir enla fase de su desarrollo llamada blastocisto. Estas son células pluripotentes locual significa que pueden dar origen a las tres capas germinales: ectodermo,mesodermo y endodermo (Riveros et al., 2007).

2- Células madre somáticas: En la mayoría de los tejidos de individuosadultos existen pequeñas poblaciones de células indiferenciadas. Son célulasmadre adultas multipotentes que poseen la capacidad de diferenciarse paradar lugar a progenitoras indiferenciadas que, por una parte generarán célulasmaduras del tejido en el que se encuentran y a su vez mantienen el balancenecesario de células progenitoras indiferenciadas en dicho tejido. Son célulasmadre que permanecen a lo largo de la vida del individuo y que pueden estaren áreas activas o en áreas en reposo en estado mitótico latente (Fuchs andSegre, 2000).

Por factores exógenos las células en reposo pueden activarse, volver a entraren el ciclo celular, realizar una división celular característica (autorrenovación)y reexpresar factores de transcripción específicos de células inmaduras. Estánencargadas de regenerar los tejidos en continuo desgaste o que han sufrido undaño, por ejemplo, después de una lesión. Estas células desempeñan un papelesencial en el organismo, no sólo por su contribución en la formación de órga-nos y tejidos, sino sobretodo, por encargarse del mantenimiento y renovación

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INTRODUCCIÓN

de los mismos durante todo el proceso del desarrollo ontogénico (Edlund andJessell, 1999; Firulli and Olson, 1997; Orkin, 1998).

Las células madre somáticas se encuentran reguladas en función del micro-ambiente fisiológico en él que se encuentran, es el denominado nicho (Schofield,1977). Las características moleculares existentes en estos nichos afectan a laspropiedades intrínsecas de las células madre somáticas residentes regulandola proliferación y el destino celular (Eckfeldt et al., 2005). Las células del ni-cho (Fig. 1.8), células diferenciadas y moléculas de adhesión están en estrecharelación con las células madre somáticas anclándolas durante los periodos deinactividad (Wilson and Trumpp, 2006). Mantienen a las células madre somáti-cas en un estado quiescente (en la fase de reposo del ciclo celular G0) y dirigenla división asimétrica seguida de la proliferación y diferenciación de éstas enel momento y lugar que se precise. El papel más importante del nicho celulares detectar la necesidad del reemplazamiento celular y transmitir las señaleshacia las células residentes para que éstas puedan alcanzar el destino celularfinal mediante la proliferación celular (Li and Xie, 2005).

Figura 1.8: Representación del nicho de células madre somáticas. Las células del ni-cho dirigen vía señalización celular el futuro de las células madre somáticas a través delinicio y/o bloqueo de la diferenciación celular y de la regulación de los ciclos celulares(obtenido de.vroniplag.wikia.com).

Las células madre de vertebrados superiores, durante el desarrollo, pierdenprogresivamente la capacidad de diferenciación, de modo que, en la edad adul-ta, sólo una pequeña fracción de células madre/progenitoras se encuentran endeterminados tejidos. Esta pequeña población de células madre adultas sonsimilares a las células madre embrionarias, ya que mantienen la capacidad de

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INTRODUCCIÓN

diferenciarse en más de un tipo celular pero a diferencia de estas, las célulasmadre adultas se limitan a ciertos linajes tales como linaje hematopoietico,mesenquimal, neural, etc. (Weissman et al., 2001). A pesar de ello, las célulasmadre adultas comprometidas a ciertos linajes tienen la capacidad de conver-tirse en otro linaje, es lo que se denomina la transdiferenciación que es distintapara cada linaje (Jopling et al., 2011).

1.3.1. Células madre y progenitoras embrionarias de la retinaLa células madre neurales o "Neural Stem Cells" (NSCs) del SNC, son cé-

lulas madre multipotentes, ya comprometidas, que dan lugar a las células dellinaje neuronal, es decir, dan lugar a células progenitoras neuronales o "NeuralProgenitors Cells" (NPCs) tales como neuroblastos y glioblastos que posterior-mente se diferencian en neuronas y células gliales. En mamíferos, casi todas lasneuronas del SNC se forman temprano durante el desarrollo embrionario, a par-tir de NSCs (Alvarez-Buylla and Temple, 1998; Denham et al., 2005; Okano,2002; Potten and Loe�er, 1990; Temple, 2001; Temple and Alvarez-Buylla,1999).

La retina neural como parte del cerebro y con ello del SNC, se originatambién a partir de NSCs multipotentes que dan lugar a células madre multi-potentes de la retina o "Retina Stem Cells" (RSCs) y que a su vez, dan lugar acélulas progenitoras de la retina o "Retina Progenitors Cells" (RPCs), tempra-nas y tardías (Fig. 1.9). Los astrocitos de la retina derivan de NSCs del cerebroy emigran a la retina a través del nervio óptico. Los macrófagos perivascularesderivan de los progenitoras formados a partir de las células madre hematopo-yéticas o "Hematopoietic Stem Cells" (HSCs) y migran al cerebro y a la retinadurante la vascularización (Wohl et al., 2012). La microglía deriva directamen-te a partir de progenitores mieloides más inmaduros y migran a los tejidos delSNC en fases tempranas del desarrollo, antes de que comience la vasculariza-ción (Fig. 1.9) (Chen et al., 2002; Watanabe and Ra�, 1988; Wohl et al., 2012).

La retinogenesis embrionaria es un proceso altamente conservado en ma-míferos y no mamíferos, que se produce en una secuencia definida (Fig. 1.10)(Galli-Resta, 2002; Marquardt and Gruss, 2002; Reichenbach and Bringmann,2010; Reichenbach et al., 1993; Turner and Cepko, 1986). Esta secuencia en lageneración de células de la retina se debe a un cambio progresivo de las RPCsper se, es decir por señales intrínsecas, así como a un entorno cambiante, porseñales extrínsecas, durante el desarrollo (Livesey and Cepko, 2001; Reh andKljavin, 1989; Wohl et al., 2012).

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INTRODUCCIÓN

Figura 1.9: Rutas de diferenciación de las células madre neurales, de la retina y he-matopoyéticas. Las neuronas de la retina se forman, primero a partir de progenitorastempranos y posteriormente aparecen las neuronas formadas a partir de los progenitorastardíos. Los astrocitos de la retina derivan de células madre neurales. Los macrófagosderivan de progenitores formados a partir de células madre hematopoyéticas. La micro-glía deriva directamente de progenitores mieloides más inmaduros (Wohl et al., 2012).

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INTRODUCCIÓN

Figura 1.10: Retinogénesis. Etapas de la generación de todos los tipos celulares dela retina (Wohl et al., 2012).

1.3.2. Células madre y progenitoras neurales en la retina adulta

Las células madre y progenitoras neurales en adultos pueden estar en áreasneurogénicas activas o en áreas no neurogénicas donde están en reposo, enestado mitóticamente latente pudiendo activarse por factores exógenos, comopor ejemplo después de una lesión (Kernie et al., 2001; Ming and Song, 2005).

En la actualidad se reconoce que en mamíferos adultos persisten nichos es-pecializados de células madre neuronales, donde se generan determinados tiposde neuronas. Se han descrito, NSCs/NPCs en dos áreas neurogénicas del cere-bro, la zona subventricular (Alvarez-Buylla and García-Verdugo, 2002; Doetschet al., 1999; Lois and Alvarez-Buylla, 1993) y el giro dentado del hipocampo(Balu and Lucki, 2009; Eriksson et al., 1998; Kempermann et al., 2004) asícomo en las regiones no neurogénicas tales como la corteza cerebral (Gouldand Tanapat, 1999), la médula espinal (Matsumura et al., 2010) y en variasestructuras del ojo (Ahmad et al., 2000; Haruta et al., 2001; Tropepe et al.,2000).

Algunas de las características comunes de las células madre neurales quese encuentran en sus nichos son las siguientes (Conti and Cattaneo, 2010;Gerhart, 1999):

1. Prominentes uniones adhesivas mediadas por cadherina, una rica matrizextracelular en contacto con una lámina basal especializada a través deuniones mediadas por integrina.

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INTRODUCCIÓN

2. Estrecha asociación con los vasos sanguíneos.

3. Marcadores de superficie celular esenciales en el desarrollo embrionariotemprano, por ejemplo: antígeno-1 embrionario, SSEA-1, también llama-do Lewis X, LeX o CD15).

4. Expresión de proteínas como BLBP (proteína de unión de lípidos delcerebro, expresada durante el desarrollo) y expresión de proteínas defilamentos intermedios como la nestina o vimentina.

5. Capacidad de respuesta a señales extrínsecas por medio de factores talescomo IGF (factor de crecimiento similar a la insulina), TGF-b (factor-btransformante de crecimiento) de la familia Wnt, familia de proteinas deseñalización altamente conservadas que regulan las interacciones célula-a-célula durante la embriogénesis. Vías de señalización: Shh (sonic hed-gehog) esencial para la formación del tubo neural en humanos y otrosvertebrados, Notch (receptor de menbrana) y LIF (factor inhibidor de laleucemia). La señalización de Notch promueve la proliferación durantela neurogénesis, y su actividad es inhibida por Numb para promover ladiferenciación neural. LIF es una interleucina de clase 6 que afecta alcrecimiento celular mediante la inhibición de la diferenciación. La caídade niveles de dicha citocina hace que las células se diferencien.

6. SOX2 es un factor de transcripción que se expresa en niveles altos en elneuroepitelio del SNC en desarrollo y se cree que es de gran importanciapara la proliferación de células madre neurales y su diferenciación, esen-cial para el mantenimiento de la auto-renovación o pluripotencia de lascélulas madre embrionarias no diferenciadas. También son importanteslos factores Oct4 y Nanog.

holaLa retina neural, como parte del SNC, presenta también zonas neurogénicas

y no neurogénicas en diferentes regiones, con células madre y células proge-nitoras quiescentes. Durante la última década se han identificado diferentestipos de RSCs y RPCs que se clasifican como tales en base a la aparición devarias características principales (Ahmad et al., 2004; Alonso, 2001; Belecky-Adams et al., 1997; Ellis et al., 2005; Hitchcock et al., 1996; Karl and Reh,2010; Marquardt et al., 2001; Matsushima et al., 2011; Sakakibara et al., 1996):

1 - Capacidad de reentrada en el ciclo celular y en la mitosis, es decir, enla división celular.

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INTRODUCCIÓN

2 - Expresión de proteínas y factores de transcripción característicos deNSCs y específicos del desarrollo de la retina que indican un estado inmadu-ro de la célula, tanto en células inmaduras como en células que han sufridodesdiferenciación (si las células ya estaban diferenciadas), tales como proteí-nas que controlan una serie de pasos críticos en la formación del ojo: Pax6,SOX2, nestina, vimentina, Musashi, CHX10, también llamado VSX2 (Visualsystem Homeobox2) o RT-1, Ascl1, DII1, etc., que se conservan a través delas especies de vertebrados.

3 - Capacidad de expresión posterior de marcadores neuronales o glialesque indican la diferenciación en neuronas, glía o células del RPE de estascélulas inmaduras ya diferenciadas tales como: b-III-tubulina, GFAP, MAP-II,CRALBP, etc.

1.3.3. Identificación de células madre y progenitoras en la retinade ratón adulto

Las células madre somáticas son células indiferenciadas que se encuentranpresentes en órganos y tejidos adultos. Su singularidad, escasez y la falta tantode características morfológicas distintivas como de marcadores específicos y se-lectivos hacen que su identificación y localización sean muy complejas en casitodos los tejidos. La mayoría de los marcadores disponibles para la identifica-ción de células madre en la retina se expresan en células inmaduras, en RPCs,pero también en neuronas maduras y algunos tipos de células gliales. Por ejem-plo, el factor de transcripción Pax6 se expresa también en células amacrinasmaduras (Hitchcock et al., 1996; Karl et al., 2008; Ooto et al., 2004) mientrasque el gen homeobox CHX10 se ha encontrado en células horizontales maduras(Belecky-Adams et al., 1997; Liu et al., 1994). SOX2, otro factor de transcrip-ción, se expresa también en las células de Müller y astrocitos maduros de laretina (Fischer et al., 2010). Los filamentos intermedios de vimentina y nestinase expresan en las células gliales y, además, aumentan significativamente suinmunoreactividad después de una lesión (Wohl et al., 2009; Xue and Yuan,2010). Los filamentos de nestina también se encuentra en otros tipos de célulasincluyendo las células endoteliales (Mokry et al., 2008; Nickerson et al., 2007;Suzuki et al., 2010), pericitos (Alliot et al., 1999; Dore-Du�y et al., 2006) y lascélulas tumorales (Ishiwata et al., 2011; Krupkova Jr et al., 2011; Lobo et al.,2004).

A pesar de ello las células madre son pues, células indiferenciadas pre-sentes en tejidos u órganos diferenciados. Muchos de los diferentes tipos decélulas madre conservan y comparten vías bioquímicas, por lo que a pesar de

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INTRODUCCIÓN

todo, podemos utilizar estas características para identificarlas y aislarlas. Enconsecuencia podremos identificar las células de forma segura, a través de lacolocalización de más de uno de estos marcadores, mediante la unión de unconjunto de anticuerpos específicos, o por otras propiedades características decélulas inmaduras. Otro medio de identificación consiste en utilizar un modelode ratón transgénico en el que las células madre estén endógenamente marca-das por una proteína fluorescente tal como la nestina-GFP (Yamaguchi et al.,2000).

Una de las características universales de células madre o progenitoras, es laexpresión de ABCG2, un transportador perteneciente a la superfamilia de pro-teínas transmembrana ATP-binding cassette (ABC) (Doyle and Ross, 2003).Estos transportadores median el flujo de salida de un amplio espectro de sustra-tos que incluyen fármacos citotóxicos, péptidos, esteroides, iones y fosfolípidos(Krishnamurthy and Schuetz, 2006). La capacidad de este transportador paraextraer rápidamente diversos compuestos endógenos y xenobióticos al exteriorde la célula, así como colorantes fluorescentes in vitro, sirve como base para de-tectar células con el fenotipo SP. Una vez teñidas con el colorante intercalantedel ADN Hoechst 33342, las células diferenciadas retienen el colorante en suinterior dando una señal alta de fluorescencia mientras que las células madre/progenitoras extraen activamente el colorante por medio de dicha bomba.

Si analizamos la fluorescencia en un citometro de flujo, enfrentando la emi-sion dual del colorante Hoechst (azul y roja) en un histograma biparamétrico,aparece una pequeña subpoblación lateral en forma de cola que sale de la po-blación mayoritaria compuesta por células que estan perdiendo colorante y enconsecuencia fluorescencia. Esta cola es la denominada población "Side Popu-lation" (SP) y se identificó por primera vez en células de médula ósea de ratón(Fig.1.11) (Goodell et al., 1996), aunque actualmente constituye una técnicamuy valiosa para el aislamiento de células madre/progenitoras de diversos te-jidos, sobre todo en ausencia de marcadores específicos de superficie (Abbott,2003; Bunting, 2002; Doyle and Ross, 2003; Goodell et al., 1996).

La expresión de ABCG2 y el fenotipo celular SP son también característi-cas de las células madre neurales, derivadas de diferentes regiones del cerebro,incluida la retina (Ahmad et al., 2004; Bhattacharya et al., 2003; Hulspas andQuesenberry, 2000; Mouthon et al., 2006). Además, se ha descrito tambiénque la expresión de ABCG2 está regulada por el gen Notch, que participa enel mantenimiento de las células madre (Bhattacharya et al., 2007). Por lo tan-

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INTRODUCCIÓN

to, existe una expresión de ABCG2 regulada durante la histogénesis de retina,de manera que los niveles de ABCG2 disminuyen conforme las células adquie-ren mayor compromiso respecto al linaje. Esta disminución en la expresiónde ABCG2 se correlaciona con el agotamiento progresivo en la población decélulas SP según avanza la histogénesis de la retina (Bhattacharya et al., 2007).

Figura 1.11: Representación de la emision dual del colorante Hoechst (azul y roja)en un histograma biparamétrico de células de médula ósea de ratón analizadas por cito-metría de flujo. Se puede observar, dentro de la región, la subpoblación lateral en formade cola que sale de la población mayoritaria compuesta por células que estan perdiendocolorante y en consecuencia fluorescencia. Esta cola es la denominada población “SidePopulation” (SP).

El marcador Stem-cell-antigen-1 (Sca-1 o Ly6A) es una phosphatidylinositolglicosil (GPI) proteína de 18 kDa anclada en la superficie celular, miembro dela familia 6 de antígenos de linfocitos (Ly-6). Parece que Sca-1 podría estarinvolucrado en la regulación tanto de células B como en la activación de célulasT. Su expresión en las HSCs se ha utilizado como un marcador de las HSCs enratones, de manera que es ampliamente utilizado para enriquecer células madrehematopoyéticas murinas. Sin embargo, Sca-1 también se ha descubierto envarios tejidos no hematopoyéticos y se puede utilizar para enriquecer otraspoblaciones, tanto de células madre como de progenitoras de otros tejidos(Batts et al., 2011). En la retina de ratón recién nacido, se ha visto que existencélulas multipotentes Sca-1+ (Liu et al., 2009).

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INTRODUCCIÓN

1.3.3.1. Células madre y progenitoras en peces y anfibios

Los primeros estudios sobre la neurogénesis y la reparación celular se rea-lizaron en peces y anfibios. La retinogénesis en estos vertebrados se producedurante toda la vida. Las nuevas neuronas que se generan se integran fun-cionalmente en los circuitos ya existentes, de manera que crecen como unaampliación de la retina ya formada. (Amato et al., 2004; Hitchcock and Ray-mond, 2004; Moshiri et al., 2004; Perron and Harris, 2000).

RSCs multipotentes altamente proliferativas se encuentran en una zona es-pecializada, una zona neurogénica activa, en la periferia de la retina neural. Esun neuroepitelio en perpetua autorenovación situado en el límite entre la retinaneural y el epitelio ciliar, es una cuña semicircular llamada zona marginal ciliar(CMZ) (Fig. 1.12) (Amato et al., 2004; Fischer et al., 2010; Perron and Harris,2000; Perron et al., 1998; Raymond et al., 2006).

Figura 1.12: Nicho de células madre en la retina del pez zebra (Raymond et al., 2006).

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Posteriormente se demostró que, en peces, además, existían células proge-nitoras endógenas en la zona central de la retina. A partir de células de Müller,se lleva a cabo una producción continua de nuevos bastones que se insertanen el circuito de la retina madura. Las células de Müller diferenciadas, se des-diferencian y se vuelven a diferenciar para dar origen a células progenitoras defotorreceptores. Por lo tanto, en peces, las células de Müller juegan un doblepapel: como células gliales y como células progenitoras con una gran capaci-dad regenerativa (Bernardos et al., 2007; Karl and Reh, 2010; Raymond et al.,2006) (Fig. 1.12). También es posible que en la retina central se encuentre unapoblación de células madre quiescente (Bernardos et al., 2007).

En anfibios, las células madre situadas en el CMZ también contribuyen ala regeneración celular después de una lesión en la retina (Araki, 2007; Mi-tashov, 2001). Sin embargo, la capacidad de regeneración de estas células enanfibios disminuye con la edad (Moshiri et al., 2004). Además, los precursoresde bastones no están presentes. Las células de Müller carecen de la capacidadde regeneración que se observa en peces. Aunque la respuesta en anfibios delas células de Müller a una lesión en la retina no está tan bien estudiada, noparece que estas células de manera espontánea vuelvan a entrar en el ciclocelular. Las progenitoras de la retina, en este caso, derivan de las células delepitelio pigmentario (Karl and Reh, 2010; Reh, 1987; Sakami et al., 2008).

1.3.3.2. Células madre y progenitoras en aves

En las aves, la retinogénesis está completa, con todas las neuronas integra-das y funcionales, en el momento de la eclosión. La expansión normal postnataldel ojo aviar se debe principalmente al estiramiento del tejido y no como resul-tado del crecimiento celular o de la adición de nuevas neuronas (Amato et al.,2004), ya que al menos el 90 % de las células de la retina se han generado yauna semana antes de la eclosión (Prada et al., 1991).

Sin embargo, se ha identificado una zona marginal de proliferación como lazona CMZ en el ojo de pollo (Fischer and Reh, 2000) y de codorniz (Kubotaet al., 2002). El potencial neurogénico de estas células marginales está bastanterestringido en comparación con las células de peces y anfibios. La proliferacióncelular notable se limita a un período de 2-3 semanas de duración después de laeclosión, donde sólo se generan unas pocas interneuronas, excepto las célulasganglionares, aunque esta restricción puede cambiar con factores extrínsecos(factores de crecimiento) (Fischer and Reh, 2000). Las células de la CMZ aviar,en contraste con los peces y anfibios, no contribuyen en los procesos de rege-

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INTRODUCCIÓN

neración celular después de una lesión de la retina (Amato et al., 2004; Fischerand Reh, 2000; Moshiri et al., 2004; Reh and Fischer, 2006).

Fischer and Reh (2001) demostraron que, aunque en la retina sana de aveslas células de Müller no proliferan, después de un daño en la retina estas célu-las llevan a cabo una extensa proliferación. Las células de Müller de pollo trasla eclosión, responden a un daño neurotóxico en la retina volviendo a entraren el ciclo celular mitótico y expresando una variedad de genes de progenito-res; homeobox, CHX10 y Pax6, cash1/ascl1a, FoxN4, Notch1, Dll1 y Hes5.La reexpresión de estos genes, muchos de los cuales se expresan también enpeces después de una lesión, parece indicar que las células de Müller tiene ca-pacidad progenitora. Sin embargo, una cantidad limitada de células de Mülleren aves demostró tener capacidad de regeneración neuronal. Es cierto que unalto porcentaje de las células de Müller vuelven a entrar en el ciclo celulardespués de un daño, pero sólo un subconjunto de éstas expresan los marcado-res de células progenitoras y un número de ellas se diferencian en células queexpresan marcadores neuronales (Fischer and Reh, 2001,0; Hayes et al., 2007).

Una lesión en la retina tanto en aves como en peces hace que las célulasde Müller proliferen y expresen genes de células progenitoras neurales. Aunquealgunos de los pasos iniciales parecen ser muy similares, hay por lo menos tresdiferencias importantes entre peces y aves con respecto a la respuesta de lascélulas de Müller: primero, en aves, las células de Müller pasan a través de sólouna única ronda de la división celular, mientras que en los peces estas célulaspasan a través de múltiples rondas de división y de producción de progenie queforman pequeños grupos neurogénicos. La segunda diferencia es que sólo unpequeño porcentaje de la progenie de las células de Müller en aves se diferenciana neuronas, mientras que en el pez la mayoria parece hacerlo. La tercera esque las células de Müller en aves, ante una lesión de retina, se desdiferenciany proliferan regenerando la retina parcialmente, es decir, sólo se regeneranalgunos tipos de neuronas. (Karl and Reh, 2010; Kassen et al., 2009; Raymondet al., 2006).

1.3.3.3. Células madre y progenitoras en mamíferos

Se ha visto que in vivo, el ojo normal de mamífero adulto, incluyendo laretina neural, tiene una capacidad deficiente de regeneración y carece de unazona proliferativa en la zona periférica de la retina (Kubota et al., 2002). En elaño 2000, dos grupos identificaron de forma independiente células progenito-ras quiescentes en la retina de mamífero adulto (Ahmad et al., 2000; Tropepe

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INTRODUCCIÓN

et al., 2000). Bajo condiciones adecuadas de cultivo, estas células madre demamífero adulto proliferaban, mostraban signos de autorenovación y generabannuevas neuronas retinianas tanto en presencia como en ausencia de factoresde crecimiento endógenos. Sin embargo, estas células madre no se encuentranen la retina neural, sino en el epitelio ciliar (cuerpo ciliar). Es una estructuraque se ha descrito como homóloga a la CMZ en peces, anfibios y aves (Ahmadet al., 2000; Tropepe et al., 2000). Son células epiteliales pigmentadas queestán completamente diferenciadas (Cicero et al., 2009) en contraste con lacélulas inmaduras, indiferenciadas (no pigmentadas) de la CMZ de vertebradosinferiores o en mamíferos adultos en regiones neurogénicas cerebrales. Los ma-míferos también tienen una verdadera CMZ con RSCs cuyas células proliferany se diferencian en tipos de células gliales o neuronales tardías. Sin embargoesta propiedad sólo se puede observar durante las primeras semanas despuésdel parto (Moshiri et al., 2004; Nishiguchi et al., 2008; Wohl et al., 2012; Zhaoet al., 2005). Un estudio in vitro demostró que células disociadas de esta regiónde la retina de rata de entre 1 y 3 semanas postnatales, proliferan, aumentanen número, y expresan marcadores neuronales y gliales con la excepción delos marcadores de oligodendrocitos (Engelhardt et al., 2004). La capacidad deproliferación de estas células disminuye entre las semanas 8 y 14 postnatales,de modo que las células del tejido de la retina obtenidas después de la semana14, ya no proliferan ni se diferencian (Ahmad et al., 2000; Engelhardt et al.,2004; Tropepe et al., 2000). En la semana 14 posnatal, la retinogénesis enratones ya está concluida (Young, 1985), sin embargo se ha demostrado queciertas patologías pueden promover la activación de RSCs en el margen de laretina. En ratas utilizadas como modelo de estudio de la retinosis pigmentaria,se encontraron en la CMZ, células con una capacidad mayor de proliferaciónque en ratas de tipo silvestre (Jian et al., 2009).

En quistes de retina de primates (Macaco nemestrina de hasta 15 años deedad) formados en la pars plana, se detectaron diferentes tipos de células de laretina, lo que sugiere que la neurogénesis puede ocurrir en el tejido ocular delprimate adulto (Fischer et al., 2001). Al analizar el margen de la retina y la parsplana de humano adulto post mortem, se observa formación de RPCs en pre-sencia de factor de crecimiento de fibroblastos (Mayer et al., 2005) o de factorde crecimiento epidérmico (EGF) (Coles et al., 2004). Estas células progeni-toras aisladas formaron esferas, mostrando así capacidad de desdiferenciación,que se manifestó en un 100 % de capacidad de autorrenovación y multipoten-cia, ya que se produjo la regeneración de todos los tipos de células retinianas(Coles et al., 2004). Después del trasplante de estas células en ojos de ratón de

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INTRODUCCIÓN

una semana de edad, sobrevivieron, migraron, se integraron y se diferenciaronen el retina neural, especialmente en fotorreceptores (Coles et al., 2004). Porotra parte, en los explantes de retina de humanos (entre 14 y 80 años de edad),se ha observado una zona semejante a la CMZ con células con capacidad altade proliferación después del tratamiento con EGF in vitro, lo que sugiere quela retina humana adulta sí posee potencial regenerativo (Bhatia et al., 2009).Existe cada vez más evidencia para sugerir que la retina periférica y la parsplana de monos adultos, así como de humanos, contienen células madre de laretina neural (Bhatia et al., 2009; Coles et al., 2004; Martínez-Navarrete et al.,2008; Mayer et al., 2005). Sin embargo, actualmente se carece de evidenciasdefinitivas que sugieran la neurogénesis en la retina de primates y humanos.

En ratón se han descrito, además de las células progenitoras del epitelio ci-liar y de la CMZ, otras células que son capaces de transdiferenciarse en célulasneuronales, pasando primero a un estado primario de desdiferenciación, a unacélula más inmadura y una posterior diferenciación al linaje neuronal (Asamiet al., 2007; Engelhardt et al., 2005; Wohl et al., 2012).

Los estudios en peces y aves, como hemos visto, han demostrado que le-siones en la retina hacen que las células de Müller se desdiferencien y expresengenes de células madre y progenitoras. Además, la capacidad de las células deMüller para adoptar un patrón de expresión génica de RPCs se correlaciona consu capacidad para regenerar neuronas después del daño. Por ello, varios gruposhan llevado a cabo estudios sobre la retina dañada en ratas y ratones paradeterminar si también se produce el mismo desarrollo de células progenitoras apartir de células de Müller después de una lesión.

Se ha visto que las células de Müller así como los astrocitos de la reti-na de ratón, tanto in vitro como in vivo, adquieren características de célulasprogenitoras. Karl et al. (2008) y Osakada et al. (2007) encontraron que síse expresan marcadores de células progenitoras en células de Müller despuésde una lesión, tales como Pax6 así como componentes de la vía Notch y nestina.

A pesar de la evidencia de que después de una lesión se produce una esti-mulación mitótica y muchos genes de células progenitoras se vuelven a activaren las células de Müller de mamíferos, muchos de estos genes críticos en célulasprogenitoras no parece que se reexpresen (Fig. 1.13). Esta parcial desdiferencia-ción de las células de Müller de mamífero contrasta con la reversión completaal fenotipo progenitor observado en vertebrados no mamíferos, y puede expli-

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INTRODUCCIÓN

car en parte la regeneración muy limitada observada en mamíferos de sólo unsubconjunto de neuronas de la retina. Los estudios en la retina humana indicanque al menos una parte del perfil de expresión génica de las RPCs, por ejemploSOX2 y Pax6, aparecen en células de Müller humanas (Karl and Reh, 2010).

Figura 1.13: Esquema del proceso de desdiferenciación de la célula de Müller y pos-terior diferenciación a neurona o célula de Müller para la regeneración como respuestaa un daño causado en la retina adulta. Las células de Müller estan mitóticamente enreposo y ya no expresan la mayoría de los genes de RPCs; sin embargo, después de unalesión, algunos de estos genes se reexpresan. Modificado de Karl and Reh (2010).

En la figura 1.14 A y B, podemos ver un resumen de todas las célulasmadre y progenitoras neuronales identificados actualmente en las diferentesregiones del ojo de ratón, descritas por Wohl et al. (2012), células epitelialespigmentadas de la retina, células del iris y cuerpo ciliar, ambas situadas enestructuras del tracto uveal, células del CMZ, así como células gliales de Müller,astrocitos, RSCs situadas en el nervio óptico y las células identificadas másrecientemente, la microglía de la retina.

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INTRODUCCIÓN

Figura 1.14 A: Células madre y progenitoras neurales en la retina de ratón adulto.Los colores indican los procesos analizados: desdiferenciación (cuadro verde), divisióncelular (cuadro rojo), diferenciación en neuronas (cuadro amarillo) o glía (cuadro azul),o ambos (cuadro amarillo/azul). Modificada de Wohl et al. (2012).

Figura 1.14 B: Células madre y progenitoras neurales en el tracto uveal y nervioóptico de ratón adulto. Los colores indican los procesos analizados: desdiferenciación(cuadro verde), división celular (cuadro rojo), diferenciación en neuronas (cuadro ama-rillo) o glía (cuadro azul), o ambos (cuadro amarillo/azul). Modificada de Wohl et al.(2012).

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INTRODUCCIÓN

A éstas habría que añadir una población de células madre que se describenen el apartado siguiente.

1.3.3.4. Células VSELs

Además de las células madre multipotentes ya comprometidas al linaje deun tejido que hemos visto hasta ahora, en los órganos adultos pueden resi-dir poblaciones de células madre más primitivas pluripotentes/multipotentesque expresan marcadores embrionarios de las primeras etapas del desarrollo, yalgunas de estas células pueden incluso poseer el potencial de línea germinal(Anjos-Afonso and Bonnet, 2007; Atari et al., 2011; Dyce et al., 2011; McGuc-kin et al., 2005; Roy et al., 2013; Shirazi et al., 2012; Suszynska et al., 2013).

Se han aislado varios tipos de células primitivas no hematopoyéticas enmédula osea (MO) adulta y se han descrito de varias maneras en la litera-tura como MAPCs, células Miami, MASCs, OmniCytes y VSELs. Es posibleque todas estas células primitivas descritas y aisladas por diferentes técnicasexperimentales sean las mismas, pero que dependiendo de la estrategia de ais-lamiento, el protocolo de expansión ex vivo, y de los marcadores empleadospara su identificación, se les hayan dado diferentes nombres (Suszynska et al.,2013). La presencia de múltiples poblaciones de células madre en la MO po-dría ser el resultado de la migración de células madre durante la ontogénesis,propiciado por el ambiente permisivo de la MO que atrae a estas células (Zuba-Surma et al., 2008b).

El concepto propuesto hasta ahora de la plasticidad de las células madre,basado en el supuesto de que las células madre multipotentes comprometidasen los tejidos adultos (por ejemplo, las HSCs) podían trans-desdiferenciarse acélulas de otras capas germinales (por ejemplo, células neuronales), ha cambia-do. Actualmente este concepto es rechazado por la mayoría de la comunidadcientífica, y se proponen explicaciones alternativas a este fenómeno de la plas-ticidad celular tales como la fusión celular o la presencia de poblaciones decélulas madre heterogéneas, aisladas en médula ósea, sangre de cordón um-bilical y sangre periférica, células madre en muy pequeña cantidad, dotadasde más amplio potencial de diferenciación (Howell et al., 2003; Kassmer andKrause, 2013; Kucia et al., 2006; McGuckin et al., 2005,0; Ratajczak et al.,2011).

Mediante análisis por citometría de flujo, apoyado por otras técnicas, seha demostrado que los tejidos murinos adultos pueden albergar una población

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INTRODUCCIÓN

extremadamente pequeña que corresponde a células pluripotentes VSELs (delinglés very small embrionic/epibastic-like cells) (Suszynska et al., 2013). Inicial-mente fueron aisladas en MO murina (Kucia et al., 2008) pero posteriormentese ha comprobado la presencia de células que fenotípicamente correspondena VSELs en múltiples órganos murinos (Zuba-Surma et al., 2008b). Tanto enhumanos (HuVSELs) como en ratón (MuVSELs) las células VSELs se hanidentificado en la mayoría de los tejidos examinados, se han encontrado en lasangre del cordón umbilical (UCB), en sangre periférica movilizada (MPB) engónadas, y en otros órganos sólidos, (Havens et al., 2013). Se trata de célulasmuy pequeñas que no expresan CD45 ni tampoco marcadores de linaje hema-topoyetico (Lin), y expresan el antígeno Sca-1 (Havens et al., 2013; Suszynskaet al., 2013). Las células VSELs Lin� Sca-1+ CD45� representan una poblaciónmuy escasa en la MO (menos de 0,02 % de las células nucleadas) y expresangenes de células embrionarias o "Embryonic Stem Cells" (ESCs), incluyendoOct4, Nanog, y el antígeno embrionario SSEA-1. Las células MuVSELs pre-sentan un tamaño de 3 a 5 mm, mientras que las células humanas VSELs sonligeramente más grandes (4-10 mm). Muestran una morfología primitiva conuna alta relación núcleo/citoplasma y presencia de eucromatina en los núcleos.Además, las células VSELs de humanos aisladas de UCB y MPB presentan elmarcador CD133 +, y las aisladas de gónadas fueron clasificadas como SSEA-4+. Las MuVSELs aisladas de MO presentan marcadores característicos de ESCs(Havens et al., 2013; Kucia et al., 2006; Suszynska et al., 2013; Zuba-Surmaet al., 2008a).

Las células VSELs pueden dar lugar a los derivados de las tres capas ger-minales. Por lo tanto, las células VSELs pueden ser los principales candidatospara regenerar muchas estructuras diferentes. Estas células primitivas podríanser una fuente potencial de copias de seguridad para las células madre com-prometidas de los tejidos. Residen en los tejidos adultos y probablemente seactivan o reclutan cuando se produce estrés o lesiones en los tejidos como in-tento de regenerar los órganos dañados (Havens et al., 2013).

En retina de ratón recién nacido, se ha aislado por separación celular, unapoblación de células pequeñas semejantes a las VSELs, Lin� Sca-1+ CD45�,que corresponden a un 1,5 % de la población celular de la retina. Son célulasmadre que en cultivo, por medio de protocolos específicos, pueden diferenciar-se a diferentes tipos celulares. Cuando se cultivan en condiciones analogas alas utilizadas para la formación de neuroesferas en RPCs, las VSELs se repro-graman, silencian los genes de ESCs e inducen genes específicos de RPCs. Si

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INTRODUCCIÓN

comparamos las VSELs derivadas de la médula ósea y las de la retina de ratónrecién nacido, se observa que las células de la retina tienen inducidos los genesPax6 y Otx2, necesarios para el establecimiento temprano del campo del ojo,lo que implica que las células de la retina pueden estar más diferenciadas hacialinajes más comprometidos del ojo antes de la formación de esferas. Otro factorimportante que induce la reprogramación hacia el linaje de retina es la presen-cia de suero fetal bovino en el medio de cultivo que lleva, de forma espontánea,a la diferenciación de las VSELs en células RPCs. Estas células, parece ser quepermanecen en reposo durante la diferenciación de la retina, y por lo tantono contribuyen al desarrollo normal de la misma. Sin embargo, muestran encultivo un potencial de diferenciación alto ya que son pluripotentes, pudiendodar lugar a células representantes de las tres capas embrionarias (Liu et al.,2009).

El hallazgo de VSELs pluripotenciales en la médula ósea y su presenciajunto con las células madre adultas en distintos órganos, plantea la posibilidadque las VSELs embrionarias sean un reservorio para la generación de una mayorcantidad de progenitoras más comprometidas. Si en la retina de ratones reciénnacidos se han encontrado células multipotentes VSELs, células que puedendiferenciarse en cultivo a células que presentan la morfología neuronal y queexpresan marcadores de linajes de retina, podrían generar RPEs reparadoras delesiones en este órgano (Liu et al., 2009).

Hay que resaltar que últimamente se ha planteado cierta controversia sobrela capacidad pluripotencial de estas células (Szade et al., 2014), principalmenteen tejidos humanos, de forma que algunos autores han cuestionado su capaci-dad de regeneración (Danova-Alt et al., 2012; Miyanishi et al., 2013; Ratajczaket al., 2014; Suszynska et al., 2013; Szade et al., 2013). Por todo ello, se re-quieren más estudios para demostrar que las células identificadas como VSELsen múltiples tejidos son similares a las células de MO en su pluripotencia y silas células similares también están presentes en retina de adultos (Suszynskaet al., 2013).

1.4. RECEPTORES TIPO TOLL

Los receptores tipo Toll (TLRs, del inglés Toll-like receptors), conformanuna familia de receptores transmembrana de reconocimiento de patrones muyconservados evolutivamente. Reconocen estructuras denominadas patrones mo-leculares asociados a microorganismos (MAMPs) como bacterias, virus, hongos

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INTRODUCCIÓN

y parásitos (Mogensen, 2009).

Los MAMPs son moléculas muy conservadas en los microorganismos yausentes en la célula de mamífero, de esta manera un número reducido deTLRs pueden reconocer una amplia variedad de microorganismos.

1.4.1. Receptores tipo Toll en la respuesta inmunitariaLa proteína Toll, fue identificada originalmente en Drosophila melanogaster

como una molécula esencial en la determinación de la polaridad dorso-ventraldurante la embriogénesis de la mosca (Hashimoto et al., 1988). Posteriormente,se describió la función de Toll en la respuesta inmunitaria en D. melanogaster,organismo que, sin presentar respuesta inmunitaria adquirida, es muy resisten-te a las infecciones microbianas debido a la capacidad de síntesis de péptidosantimicrobianos muy potentes. La deleción de Toll provoca en D. melanogasterun fenotipo inmunodeficiente caracterizado por la falta de expresión de diversosgenes, incluyendo el gen que codifica para el péptido antifúngico drosomicina,y por una marcada susceptibilidad a infecciones por hongos y bacterias Grampositivas (Lemaitre and Ho�mann, 2007). El hallazgo de proteínas homólogasa la proteína Toll en mamífero planteó el estudio de su posible función enla respuesta inmunitaria innata (Medzhitov and Janeway, 1997). En 1990 sedescubrió la primera proteína humana relacionada con los receptores Toll deD. melanogaster a la que se denominó TLR1 (Taguchi et al., 1996). En 1997se caracterizó otra proteína de la familia TLRs en humanos (TLR4), a la quese implicó en la respuesta inmunitaria innata, ya que causaba la inducción degenes relacionados con citocinas y otras moléculas coestimuladoras (Medzhitovand Janeway Jr, 1997). Posteriormente se implicó al receptor TLR4 en la res-puesta frente al lipopolisacárido (LPS) de bacterias Gram negativas (Hoshinoet al., 1999; Poltorak et al., 1998; Qureshi et al., 1999).

El descubrimiento de los TLRs marcó el comienzo de una nueva etapa enel estudio de la regulación de la respuesta inmunitaria frente a microorganis-mos patógenos. Las funciones de los TLRs como mediadores de la deteccióny la respuesta de las células inmunológicas a los patógenos invasores son bienconocidas (Takeda and Akira, 2004). La activación de los TLRs en las célulasdel sistema inmunitario por patógenos o sus productos (MAMPs) inicia la res-puesta innata caracterizada por la expresión de mediadores proinflamatorios ymoléculas efectoras antimicrobianas (Kumar et al., 2009). Los TLRs tambiénreconocen ligandos endógenos denominados patrones moleculares asociados auna lesión (DAMPs), y median la respuesta inflamatoria del huésped a las le-

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INTRODUCCIÓN

siones y al estrés (Piccinini and Midwood, 2010). Las respuestas inflamatoriasmediadas por TLRs iniciales son necesarias para la defensa del huésped contralos patógenos invasores y la reparación del tejido dañado. En la actualidad sehan identificado 13 TLRs, aunque no todos son funcionales: del 1 al 9 soncomunes en ratón y en humanos, TLR10 se ha encontrado sólo en humanos,y los TLRs del 11 al 13 están sólo en ratón (Takeda and Akira, 2004).

Los TLRs se expresan en células inmunitarias inmaduras, como los fago-citos profesionales, neutrófilos y macrófagos, así como linfocitos NK y otrostipos celulares (células endoteliales, células epiteliales, queratinocitos, mastoci-tos, etc.). Más recientemente se ha descrito que los TLRs también se expresanen las células madre y progenitoras hemotopoyeticas, donde pueden tener unafunción moduladora de la hematopoyesis (Yáñez et al., 2009).

Aunque los TLRs participan principalmente en el reconocimiento de di-ferentes patógenos, como receptores inmunitarios, y en la inducción de unarespuesta inmunitaria innata frente a ellos (Takeda and Akira, 2004), tambiénestán implicados en el desarrollo de la respuesta específica y en otras funcionesno relacionadas con la respuesta frente a microorganismos patógenos, comoenfermedades inflamatorias y autoinmunes (Barton and Medzhitov, 2002; Ka-wai and Akira, 2010; Kumagai et al., 2008; Zhang et al., 2004). Debido aque los TLRs reconocen patrones en lugar de moléculas específicas y que po-seen capacidad para reconocer compuestos fisiológicos (Johnson et al., 2003;Ohashi et al., 2000; Okamura et al., 2001), están dotados de una capacidadinnata para mediar una respuesta rápida a una amplia gama de señales en elmicroambiente y no sólo a los patógenos.

1.4.2. Receptores tipo Toll en las células madre hematopoyéticas(HSCs)

Los TLRs se han relacionado con los procesos de proliferación y diferen-ciación en distintos tipos de células madre y progenitoras, en concreto conlas HSCs (Megías et al., 2012; Rolls et al., 2007; Yáñez et al., 2010). Desdeel año 2006 se sabe que las HSCs y las células progenitoras expresan TLRsy sus ligandos pueden conducir a su diferenciación hacia progenitores mie-loides, produciendo una repoblación rápida del sistema de inmunidad innataNagai et al. (2006). Durante una infección es necesario repoblar las células delsistema inmunitario innato que se estan consumiendo durante la respuesta adicha infección. Este mecanismo es conocido como "mielopoyesis de emergen-cia", la cual puede resultar ser una monopoyesis (producción de monocitos o

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INTRODUCCIÓN

macrófagos), granulopoyesis (producción principalmente de neutrófilos) o am-bos, dependiendo de las características del microorganismo y de la severidadde la infección. Por otra parte nuestro grupo ha demostrado que C albicans,tanto levadura como hifas inactivas, estimulan directamente la proliferacióny diferenciación de las HSCs hacia linajes mieloides in vitro, a través de lavia TLR2/MyD88 (Yáñez et al., 2010). La diferenciación de los fagocitos esfuncional, internalizando las levaduras y secretando citocinas proinflamatorias(Yáñez et al., 2009).

1.4.3. Receptores tipo Toll en las células madre mesenquimales(MSCs)

Las MSCs están muy extendidas en organismos adultos y pueden estarimplicadas en el mantenimiento y reparación de los tejidos, así como en laregulación de la hematopoyesis y la respuesta inmunológica. Los factores quecontrolan la renovación y la diferenciación de MSCs están relacionados con losTLRs (Waterman et al., 2010). Las MSCs adultas expresan receptores TLRsfuncionales (Bunnell et al., 2010), cuya presencia se confirma por su respuestaa ligandos como Pam3CSK4, un ligando específico de TLR2, que aumenta lasecreción de interleucina-6 por las MSCs, induce la traslocación del factor nu-clear NF-kB, reduce la motilidad basal y aumenta la proliferación de las MSCs.El sello distintivo de la función de las MSCs es la capacidad de diferenciarse envarios linajes mesodérmicos. Pam3CSK4 inhibe la diferenciación de las MSCsen células osteogénicas, adipogénicas y condrogénicas. Por tanto, un ligandode TLRs puede antagonizar la diferenciación de las MSCs provocada por me-diadores exógenos y mantener las células in vitro, en un estado no diferenciadoy de proliferación. Parece pues, que los TLRs y sus ligandos pueden servir co-mo reguladores de la proliferación y la diferenciación de las MSCs, pudiendoafectar al mantenimiento de la multipotencia de las mismas (Pevsner-Fischeret al., 2007).

1.4.4. Receptores tipo Toll en el sistema nervioso central (SNC)

Se han descrito funciones no inmunitarias de la familia de los TLRs talescomo el establecimiento de la polaridad del eje dorso-ventral y el desarrolloaxonal durante la embriogénesis de D. melanogaster (Anderson et al., 1985;Halfon et al., 1995; Hashimoto et al., 1988; Rose et al., 1997). Los TLRs seexpresan en diversos tipos de células del SNC, endoteliales vasculares (Kongand Le, 2011), microglía, astrocitos, neuronas y NSCs (Okun et al., 2010).

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INTRODUCCIÓN

Diversos estudios sugieren que las neuronas expresan un subconjunto deTLRs y que su activación promueve la degeneración neuronal en modelos ex-perimentales (Okun et al., 2009). Se ha descrito que los TLRs juegan un papelimportante en la infección del cerebro y las lesiones, y están involucrados enla neuropatía autoinmune y trastornos neurodegenerativos (Fischer and Ehlers,2008; Okun et al., 2009; Rivest, 2009; Stenzel et al., 2008). En el SNC demamíferos adultos, los TLRs, en concreto TLR4, regula la neurogénesis delhipocampo adulto, mientras que TLR2 aumenta la diferenciación de célulasprogenitoras neuronales in vitro (Rolls et al., 2007). En el desarrollo del ce-rebro de los mamíferos, miembros de la familia de los TLRs, TLR3 y TLR8,se identificaron como reguladores negativos del crecimiento axonal (Cameronet al., 2007; Ma et al., 2006). Por el contrario, se encontró que TLR4 estabaausente en las neuronas durante las etapas de desarrollo de la formación delSNC (Lehnardt et al., 2003), sin embargo, con la edad, sus niveles de expre-sión aumentaban (Wadachi and Hargreaves, 2006). También se ha descrito elpapel de TLR3 como un regulador negativo de las células progenitoras neuralescultivadas en el cerebro en desarrollo (Lathia et al., 2008).

Aunque su función en el sistema ocular se ha atribuido comúnmente a larespuesta inmunitaria (Chang et al., 2006; Kumar et al., 2004), puesto que laretina es una parte de SNC, es lógico suponer un papel similar de los TLRsal que desempeñan en el cerebro. En la retina, la expresión de TLRs se haconfirmado en células ganglionares, fotorreceptores, RPCs, y también en lascélulas gliales, como los astrocitos, microglía y, por último, en las células deMüller (Jiang et al., 2009; Kumar and Shamsuddin, 2012; Kumar et al., 2004;Langmann, 2007; Okun et al., 2011; Shamsuddin and Kumar, 2011; Shech-ter et al., 2008). TLR4 se expresa en células del cuerpo ciliar del ojo de losmamíferos (Brito et al., 2004). También se ha descrito que TLR4 es un regu-lador negativo de proliferación de RCPs y se ha demostrado que, en el periodopostnatal temprano, TLR4 inhibe la proliferación de células de la retina queexpresan marcadores de progenitoras. En el adulto TLR4 también inhibe la pro-liferación de células progenitoras neurales (Shechter et al., 2008). A pesar deque algunos estudios han descrito la expresión de TLRs en la retina (Ebiharaet al., 2007; Kumar et al., 2010; Luo et al., 2010; Shamsuddin and Kumar,2011), se sabe relativamente poco sobre su papel en este órgano. No se harealizado una caracterización completa de la expresión de los TLRs y de sucapacidad de respuesta a ligandos en células de la retina. En conjunto, lasfunciones que se han atribuido recientemente a los TLRs en el SNC de losmamíferos, los cambios en el patrón de expresión de TLRs con el desarrollo

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INTRODUCCIÓN

y las pruebas de expresión de TLR4 en el cuerpo ciliar de la retina, un lugarconocido por albergar RPCs, plantean la posibilidad de que los TLRs puedandesempeñar un papel en la retina de mamíferos en la determinación del destinode RPCs (Shechter et al., 2008). Por lo tanto, los TLRs están implicados en laproliferación de células madre y progenitoras, desempeñando una función en laregulación de los procesos de neurogénesis y crecimiento de neuronas, es deciren la plasticidad neuronal (Okun et al., 2011).

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Capítulo 2

OBJETIVOS

De acuerdo con los antecedentes expuestos en la introducción, los objetivosgenerales de esta tesis doctoral son los siguientes:

1. Estudio de la expresión y funcionalidad de receptores tipo Toll en célulasmadre y progenitoras de retina de ratón adulto:

a) Identificación y cultivo de células retina de mamíferos adultos concaracterísticas de células progenitoras.

b) Estudio de la expresión de TLRs en las células progenitoras anali-zadas.

c) Estudio de la funcionalidad de TLRs en estos tipos celulares.

2. Obtención de una línea celular con características de células progenitorasa partir de retinas de ratón adulto:

a) Obtención de una línea celular estable con características de célulasprogenitoras.

b) Caracterización de la línea celular obtenida.c) Estudio de la expresión y funcionalidad de distintos receptores de

tipo Toll en la línea celular.d) Análisis de la utilidad de la línea celular como modelo de estudio

de sustancias neuroprotectoras.

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Capítulo 3

MATERIALES Y MÉTODOS

3.1. Animales utilizadosLos experimentos se realizaron utilizando ratones C57BL/6J machos, de 2-

4 meses de edad, adquiridos a Harlan Ibérica (Barcelona, España). Se utilizarontambién retinas de ratones TLR2�/� con base genética de ratones C57BL/6J,cedidos por el doctor Akira (Universidad de Osaka, Osaka, Japón). Los ani-males fueron cuidados y mantenidos en condiciones libres de patógenos en losServicios Centrales de la Universidad de Valencia.

El cuidado y la utilización de los animales se llevó a cabo en estricta con-formidad con las recomendaciones contenidas en el "Real Decreto 1201/2005,BOE 252" para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Ministeriode la Presidencia, España. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar elsufrimiento de los animales. Se utilizaron retinas de dichos ratones siguiendoel procedimiento A1264596506468 aprobado por el comité de experimentacióny bienestar animal de la Universitat de València.

3.2. Extracción de retinasPara la extracción de las retinas, los animales fueron sacrificados mediante

dislocación cervical. Tras rociar el animal con etanol al 70 %, se extrajeron losojos y se colocaron en un eppendorf con solución salina tamponada con fosfato(PBS) estéril (Tabla 6, pag. 69). A continuación, se utilizó una placa de Petricon una superficie de color que nos aporta contraste donde se colocó cada ojo,dentro de una gota pequeña de PBS estéril.

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MATERIALES Y MÉTODOS

Utilizando instrumental quirúrgico estéril y una lupa para observar mejorla estructura del ojo, se realizó una incisión en el globo ocular y se seccionóla parte anterior, eliminando la córnea, el iris, el cristalino y el vítreo, dejandoexpuesta la retina. A continuación se extrajo la retina utilizando una pinzasevitando en la medida de lo posible su rotura y se colocaron en un nuevo ep-pendof con PBS estéril o medio de cultivo, según su uso posterior.

Figura 3.1: Esquema de la extracción de la retina de ratones adultos.

3.3. Obtención de células linaje negativo a partir deretinas adultas

La purificación de células Lin� se realizó partiendo de retinas procesadascomo se indica en el apartado 3.2. A continuación, las células de las retinas sedisgregaron con ayuda de una pipeta y se incubaron con un cóctel de anticuer-pos monoclonales anti-linaje (Miltenyi Biotec, Madrid, Spain) conjugados conbiotina y específicos de diferentes poblaciones de células hematopoyéticas ma-duras: CD5, CD45R(B220), CD11b, Gr-1 (Ly-6C/G), 7-4 y Ter-119. Se incubócon 1 mL de dicho cóctel durante 15 minutos a 4º C. Seguidamente se incu-baron con un anticuerpo anti-biotina conjugado con microesferas magnéticas,también a 4º C durante 15 minutos. Tras el marcaje, las células se lavaron y sepasaron a través de una columna acoplada a un sistema magnético. Las célulasse separaron mediante selección inmunomagnética negativa: las células mar-cadas Lin+ quedaron retenidas en la columna, mientras que las no marcadasLin� pasaron a través de ella y fueron recuperadas en tampón de purificación(Tabla 6, pag. 69).

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MATERIALES Y MÉTODOS

3.4. Análisis mediante citometría de flujo

3.4.1. Preparación de las células y marcaje con anticuerpos

Las retinas extraídas se disgregaron con suavidad con una pipeta y se filtra-ron a través de un filtro de 30 mm (BD Biosciences) para evitar los agregadosde células. A continuación, las células filtradas se centrifugaron a 2000 rpm du-rante 4 minutos, se retiró el sobrenadante y se resuspendieron en PBS (Tabla 6,pag. 69), en una cantidad de 90 mL por cada 6 retinas aisladas. Seguidamentese añadió agente bloqueante al 10 % (FcR blocking solution, Milteny Biotec) yse incubó durante 10 minutos a 4º C. Entonces las células se marcaron durante20 minutos a 4º C con los anticuerpos adecuados en cada caso, tal y como seindica en la Tabla 1, pag. 56. Tras el marcaje, las células se lavaron con 800 mLde PBS, se centrifugaron y se resuspendieron de nuevo en 400 mL de PBS parasu análisis mediante citrometría de flujo. A las células que tras la extracción ydisgregación de las retinas se cultivaron con estímulos, se les cambió el mediocada 10 días y trascurrido el tiempo estimado, se despegaron de sus respectivospocillos suavemente con la punta de una pipeta, se centrifugaron a 2000 rpmdurante 4 minutos y se procedió a su marcaje de igual manera.

3.4.2. Análisis de células con fenotipo "Side Population" (SP)

Las células totales disgregadas de la retina, se tiñeron con el colorante vitalHoechts 33342 (Molecular probes, Life technologies) a una concentración finalde 5 mg/mL y se incubaron en un baño con agitación a 37º C durante una hora.A continuación las células se analizaron por citometría de flujo y se localizó lapoblación SP en el histograma biparamétrico obtenido.

3.4.3. Separación celular mediante citometría de flujo

Las células obtenidas como se ha descrito en los apartados anteriores (3.2 y3.3) fueron doblemente marcadas con el anticuerpo anti-Sca-1 conjugado con elfluorocromo APC y el anticuerpo anti-CD45 conjugado con FITC (Tabla 1, pag.56). Las células positivas para el marcador Sca-1 y negativas para el marcadorCD45 (Lin� Sca-1+ CD45�) fueron seleccionadas en una región, separadasy recogidas utilizando un separador celular MoFlo Legacy y el programa deadquisición Summit (Beckman Coulter). Las células se recogieron en medioLin� (Tabla 6, pag. 69) y se incubaron a 37 ºC, con un 5 % de CO2.

55

MATERIALES Y MÉTODOS

3.4.4. Anticuerpos utilizados en citometría de flujoEn los análisis por citometría de flujo se utilizaron los anticuerpos que se

indican en la Tabla 1, pag. 56 y sus respectivos controles isotípicos. Los anti-cuerpos se adquirieron en eBioscience (San Diego, CA, EE.UU.) y en MiltenyBiotec (Madrid, Spain) según se indica. En algunas ocasiones para observarmejor la población de células se marcaron con el colorante vital intercalantedel ADN, Hoechst 33342 (Molecular Probes, Life technologies), para identificarla población celular del resto del debrís, el cuál, al no tener ADN, no aparecemarcado.

CITOMETRÍA DE FLUJO

ANTICUERPO ISOTIPO FLUOROCROMO CASACOMERCIAL

Anti-Sca-1(Stem cellantigen-1)clon D7

IgG2a derata

APCAloficocianina

MiltenyiBiotec

Anti-CD45Panleucocitario

IgG2a deratón

FITCIsocianato deFluoresceína

MiltenyiBiotec

Anti-TLR2(CD282)Clon T2.5

IgG1 deratón

PEFicoeritrina eBiosciencie

Anti-TLR4(CD284)

Clon MTS510

IgG2a Kde rata

PEFicoeritrina eBiosciencie

Anti-CD11bIntegrina aM

Mac-1aClon M1/70

IgG2b Kde rata

FITCIsocianato deFluoresceina

eBiosciencie

Tabla 1: Anticuerpos utilizados en los ensayos de citometría de flujo.

3.4.5. Equipos y programas utilizados para el análisis de célulasmediante citometría de flujo

La adquisición de las muestras se realizó utilizando los citómetros FACS-Canto equipado con los láseres: Azul (488nm) y rojo (647 nm) (BD Biosciences)y LSRFortessa equipado con los láseres: Azul (488 nm), yellow-green (561 nm),

56

MATERIALES Y MÉTODOS

rojo (633 nm) y UV (375 nm) (BD Biosciences). Los datos se adquirieron conel software FACSDiva 6 y FACSDiva 7, respectivamente de cada equipo deanálisis. Posteriormente se utilizó el programa de análisis FlowJo (FlowJo LLC,Data Analysis Software, Ashland, Oregon).

3.5. Ligandos de los TLRs

Como estímulo de los TLRs, se utilizaron los siguientes agonistas: el ligandopuro de TLR2, Pam3CSK4 (0,125 mg/mL; Invivogen, San Diego, CA, USA ) yel ligando puro de TLR4, Lipopolisacárido ultra puro de Echerichia coli (LPS)(1 mg/mL; Invivogen).

También se utilizó la especie fúngica Candida albicans inactivada, cepaATCC 26555 en forma de levadura o de hifas (proporción 5/1, levaduras/célulasmurinas). Las cepas inactivadas de C. albicans se obtuvieron con el métododescrito por nuestro grupo de investigación (Murciano et al., 2007). En pri-mer lugar se crecieron levaduras hasta fase exponencial tardía de crecimiento(DO600nm 0,6-0,8) en medio YPD líquido estéril y libre de endotoxina (Tabla7, pag. 70), a 28º C con agitación. El crecimiento celular se valoró midiendola densidad óptica (DO) a 600 nm en un espectrofotómetro Helios (ThermoFisher Scientific, Waltham, USA). Tras el cultivo, las células fueron recogidaspor centrifugación, lavadas con PBS estéril, resuspendidas en el mismo volu-men de agua estéril, libre de endotoxina, y mantenidas durante 3 horas a 28ºC con agitación (periodo de ayuno metabólico o estrés nutricional) y a conti-nuación durante 48 horas a 4º C en reposo. Posteriormente, estas células serecogieron por centrifugación y se inocularon en medio Lee (en un volumen5 veces superior al utilizado en la incubación con agua) libre de endotoxina,estéril y precalentado (Tabla 7, pag. 70). Los cultivos fueron incubados durante3 horas con agitación a 28º C, para obtener levaduras, o a 37º C, para obtenerhifas. Tras la incubación, las células se lavaron dos veces con PBS estéril y sedeterminó el número de células para realizar el tratamiento de inactivación porfijación. Para ello, las células se resuspendieron a una concentración de 20 x106células/mL en tampón de fijación ("IC Fixation Bu�er", eBioscience), quecontiene paraformaldehído al 4 % y se mantuvieron en agitación durante 30minutos. Por último, tras el tratamiento de inactivación las células se lavarondos veces con PBS estéril para eliminar el agente inactivante y se determinóla concentración celular. Las células se guardaron en alícuotas en forma desedimento seco a -80º C hasta su utilización. En los experimentos con célulasviables de la misma cepa, se utilizaron levaduras en ayuno metabólico, obteni-

57

MATERIALES Y MÉTODOS

das tal y como se ha descrito anteriormente, lavadas con PBS estéril, libre deendotoxina y resuspendidas a la concentración adecuada.

3.6. Medida de la proliferación celularPara analizar la proliferación de las células tras la incubación en presencia

de distintos estímulos, se utilizaron dos técnicas:

1. Recuento microscópico. Se cuantificó el número de células mediante re-cuento en cámara Neubauer. A partir del número de células contadas,conociendo el volumen de líquido que admite el campo de la cuadrícula,se calculó la concentración de células de la muestra: partículas / mL =(partículas contadas) / [ (superficie contada (mm�)⇧profundidad de lacámara(mm) ] ⇧ dilución.

2. Medida indirecta mediante el ensayo de XTT. La técnica permite anali-zar de una forma directa la viabilidad celular y de una manera indirecta,medir la proliferación celular. Se trata de un ensayo colorimétrico, decuantificación espectrofotométrica que se basa en la degradación de lassales de tetrazolio XTT {2,3-bis (2-methoxy - 4 - nitro - 5 - sulfophenyl)- 5 - [(phenylamino)carbonyl] - 2H - tetrazoliumhydroxide} a sales de for-mazán, mediante la acción de las deshidrogenadas mitocondriales, quese producen de forma natural cuando las células son viables. El métodopermite pues cuantificar la proliferación celular durante 24 horas por me-dio de una medida espectrofotométrica directa en un lector de placas. Elnúmero de células presente en cada pocillo correlaciona con la capacidadde reducir la sal de tetrazolio (XTT) a un producto coloreado y solublepor la actividad enzimática mitocondrial de las células vivas (Meshulamet al., 1995).

3.7. Obtención de una línea celular a partir de retinasde ratón adulto

Para obtener un cultivo de células progenitoras de retina a partir de ratonesC57BL/6J adultos, se siguió el método descrito por Hicks y Courtois (1990) ymodificado por Florian et al (2008) para la purificación y cultivo de células deMüller, ya que está descrito que estas células en cultivo pueden inmortalizarde forma espontánea y dar lugar a líneas celulares estables con características

58

MATERIALES Y MÉTODOS

de células progenitoras.

Se utilizaron animales macho de 2 meses de edad. Se extrajeron los ojosy se mantuvieron durante toda la noche a 4º C en oscuridad, en DMEM(GlutaMAXTM 4,5 g/L de glucosa) suplementado con 10 % de suero fetalbovino inactivado por calor y con penicilina/estreptomicina al 1 % (Gibco, Lifetechnologies). Las retinas se extrajeron según se ha descrito en el apartado 3.2.y se diseccionaron con cuidado, cortándolas en pequeños fragmentos no ma-yores de 1 mm2. A continuación se cultivaron en DMEM suplementado, en unincubador al 5 % de CO2 y a 37° C (Fig 3.2). Las células se cultivaron en estascondiciones, cambiando el medio cada tres días. Se realizaron pases cuando lascélulas alcanzaron la semiconfluencia.

Figura 3.2: Pasos para la obtención de un cultivo celular de células progenitoras apartir de retinas de ratón.

3.8. Obtención de neuroesferasPara evaluar la capacidad de formación de neuroesferas por las células se

siguió el método descrito en la bibliografía, expuesto inicialmente por Florianet al. (2008) con ligeras modificaciones.

Se cultivaron células de Müller murinas aisladas previamente, en medio sinsuero fetal bovino (DMEM/F-12 que contenía penicilina/estreptomicina; Gib-co, Life Technologies), suplementado con factor de crecimiento epidérmico 30

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MATERIALES Y MÉTODOS

ng/mL (EGF; Sigma-Aldrich). La densidad inicial fue de 50.000 células/cm2.Las células se cultivaron en placas de cultivo celular recubiertas de laminina ypoli-L-ornitina (Sigma-Aldrich). El medio de cultivo se cambió cada tres días.Las neuroesferas aparecieron a partir del quinto día de cultivo y el número seincrementó durante tres semanas. El recuento de neuroesferas se realizó enpocillos de placas de 12 pocillos, contando un mínimo de dos pocillos en cadaexperimento y en un total de tres experimentos independientes.

Figura 3.3: Esquema del proceso seguido para la obtención de neuroesferas a partirde la línea celular procedente del cultivo celular.

3.9. Aislamiento de ARNm y PCREl ARNm de las celulas se aisló utilizando el Kit MicroPoly (A) PuristTM

(Ambion) según las instrucciones del fabricante. Los posibles restos de ADNse eliminaron utilizando ADNasa I (Invitrogen).

La transcripción inversa se realizó con 1 mg de ARN total en presencia deoligo dT (Fermentas, Glen Burnie, MD), 1 mM de dNTPs (Fermentas), 20 Ude inhibidor de ribonucleasa (Fermentas), 50 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM

60

MATERIALES Y MÉTODOS

KCl, 4 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol y 200 U de transcriptasa inversa (RT;RevertAidTM M-MuLV transcriptasa inversa, Fermentas), a 42º C durante 60minutos. Se añadieron controles negativos sin retrotranscriptasa. Se utilizaronoligonucleótidos específicos para cada gen estudiado en la reacción de PCR(Tabla 2, pag 62 y Tabla 3, pag 63). El ADNc se amplificó mediante PCRbajo condiciones estandarizadas: un primer paso de desnaturalización a 94° Cdurante 2 minutos, seguido por 35 ciclos de tres pasos: un paso de desnatura-lización a 94º C durante 30 segundos cada uno; 1 minuto a la temperatura dehibridación adecuada según los oligonucleótidos empleados y 1 minuto a 72°C, seguidos de un paso de elongación final a 72° C durante 15 minutos. En to-das las amplificaciones se añadió un control negativo sin ADNc. Los productosde PCR se separaron por electroforesis en geles de agarosa al 2 %. Todos loscebadores se probaron utilizando ADNc de retina total como control positivo.

Para realizar las PCRs semicuantitativas, se optimizaron las condiciones deamplificación y el número de ciclos para cada par de oligonucleótidos empleados(25 ciclos para b-actina, 35 ciclos para TLR2 y TLR6). Para cada gen, serealizaron tres amplificaciones de PCR independientes y los datos de cadaamplificación se relativizaron a la señal de b-actina, la cual se amplificó tambiénpor triplicado. Cada experimento independiente se realizó al menos dos veces.El análisis y cuantificación de la intensidad de las bandas se realizó medianteel programa informático Adobe Photoshop®.

3.10. OligonucleótidosSe utilizaron oligonucleótidos que amplifican de forma específica marca-

dores de células neurales y progenitoras: Nestina, Abcg-2, a-tubulina, b-III-tubulina, AscI1 y Notch1, así como característicos de células gliales: Vimentina,glutamín sintetasa, S-100. Además, se analizó la expresión de otros marcado-res característicos de diferentes tipos celulares, para descartar la contamina-ción del cultivo con otros tipos de células como astrocitos (GFAP), microglía(CD11b), células bipolares (CHX10), células amacrinas (Pax6), células endote-liales (CD31) o epitelio pigmentario de la retina (CRALBP) (Tabla 2, pag. 62).Como control se utilizaron oligonucleótidos específicos de la b-actina. Con elfin de analizar la expresión de los receptores de sodio dependientes de voltaje,así como de los TLRs, se utilizaron oligonucleótidos específicos que se indicanen la Tabla 3, pag. 63.

61

MATERIALES Y MÉTODOS

OLIGONUCLEÓTIDOS IGEN SECUENCIA REFERENCIA

Abcg2 F:CCATAGCCACAGGCCAAAGTR:RGGGCCACATGATTCTTCCAC Florian et al. (2008)

Ascl1 F:GAGAGCTCTGGCAAGATGR:AAGCCGCTGAAGTTGAGC Este trabajo

a-tubulina F:GCGTGAGTGCATCTCCATCR:CTGGAGACCTGTGCACTG

Gomez-Vicente et al.(2013)

a-actina F:CCTAAGGCCAACCGTGAAAAGR:TCTTCATGGTGCTAGGAGCCA Nagai et al. (2006)

b-III-tubulina

F:TGAGGCCTCCTCTCACAAGTR:CGCACGACATCTAGGACTGA Florian et al. (2008)

CD31 F:ACTAGCTGAGTGCTTCAGTCTAR:CCCATTCATCACCTCCCATGAT Este trabajo

Chx10 F:CGGCCAGTGAGTTGTTGATTTR:ACAGAAAACAGGACAGAAATTATGC Este trabajo

CRALBP F:TACCCTGGTGTCCTTTCCAGR:GGTTTCCTCATTTTCCAGCA Florian et al. (2008)

GFAP F:CACGAACGAGTCCCTAGAGCR:ATGGTGATGCGGTTTTCTTC Florian et al. (2008)

Nestina F:AACTGGCACACCTCAAGATGTR:TCAAGGGTATTAGGCAAGGGG Zahir et al. (2006)

Notch1 F:TGTGCACACCATCCTGCR:CAATCAGAGATGTTGGAATGC Florian et al. (2008)

Pax6 F:AGTTCTTCGCAACCTGGCTAR:TGAAGCTGCTGCTGATAGGA Florian et al. (2008)

Recoverina F:ATGGGGAACAGCAAGAGCGGR:GAGTCCGGGAAAAACTTGGAATA Florian et al. (2008)

Rhodopsina F:TCA CCACCACCCTCTACACAR:TGATCCAGGTGAAGACCACA Florian et al. (2008)

Vimentina F:ATGCTTCTCTGGCACGTCTTR:AGCCACGCTTTCATACTGCT Florian et al. (2008)

b-actina F:CCTAAGGCCAACCGTGAAAAGR:TCTTCATGGTGCTAGGAGCCA Nagai et al. (2006)

Tabla 2 : Oligonucleótidos utilizados para la caracterización de la línea celular.

62

MATERIALES Y MÉTODOS

OLIGONUCLEÓTIDOS IITLRs SECUENCIA REFERENCIA

TLR1 F:CAATGTGGAAACAACGTGGAR:TGTAACTTTGGGGGAAGCTG Renshaw et al. (2002)

TLR2 F:AAGAGGAAGCCCAAGAAAGCR:CGATGGAATCGATGATGTTG Renshaw et al. (2002)

TLR4 F:ACCTGGCTGGTTTACACGTCR:CTGCCAGAGACATTGCAGAA Renshaw et al. (2002)

TLR6 F:TTCCCAATACCACCGTTCTCR:CTATGTGCTGGAGGGTCACA Renshaw et al. (2002)

Nav 1.1 F:AAGTTGAGTTCGAAGAGTGCR:TACTGTTGCGTCGCT-CTC Este trabajo

Nav 1.2 F:GGCTTCCGGTTTTCCCTAGR:ATTCATGGG-TAGAGTGGGTATC Este trabajo

Nav 1.6 F:AGGAGCTCATCTGAGCTGR:CCTCACTTTC-CTCCACTG Este trabajo

Nav 1.9 F:GGAACAGCGATAGCGCCR:ACCCGGAACATGGC-GAG Este trabajo

Tabla 3: Oligonucleótidos utilizados en este trabajo, específicos de TLRs y canales deNa+ dependientes de voltaje.

En las Tablas 2 y 3 se indican las referencias en las que se basó el diseñode los oligonucleótidos.

3.11. Análisis de expresión de proteínas mediante Wes-tern blot.

El análisis de la expresión de proteínas de interés mediante Western blotse realizó siguiendo las técnicas estándar que se describen a continuación: Lascélulas se despegaron de los frascos de cultivos mediante un raspador y fueronresuspendidas en tampón de lisis (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mMEDTA, 1 % NonidetP-40 (NP40), 0.25 % sodium deoxycholate) con inhibido-res de protesa (complete EDTA-free; Roche, Mannheim, Germany) y fosfatasa(PhoStop; Roche) según las instrucciones del fabricante. Tras incubar en hielo15 minutos, las células se centrifugaron durante 10 minutos a 10.000 g y 4º C.La concentración de las proteínas se calculó mediante el kit Bio-Rad proteinassay (Bio-Rad, USA), utilizando albúmina bovina como patrón. Las proteínasse diluyeron con el tampón de Laemmli (4 % SDS, 100 mM dithiothreitol, 20 %

63

MATERIALES Y MÉTODOS

glycerol, 0.004 % bromophenol blue, 125 mM Tris-HCl, pH 6.8) y se separa-ron en geles SDS-PAGE al 8-10 %. Las proteínas se transfirieron a membranasde PVDF (Roche) a 200 mA durante 4 horas. Las muestras transferidas sebloquearon con leche desnatada en polvo al 5 % en Tris-bu�ered saline, 0.1 %Tween-20 (TBS/T, pH 7.6), durante 1 hora a temperatura ambiente.

WESTERN BLOT

ANTICUERPO ISOTIPO CASACOMERCIAL CANTIDAD

Anti-nestina IgG de ratónPrimario

MAB 353, Chemicon,Millipore, Temecula,

CA, EE.UU1:100

Anti-b-III-tubulina

IgG de ratónPrimario

MMS-435P Covance,Emeryville, CA,

EE.UU1:100

Anti-ABCG2 IgG de rataPrimario

Ab24115, Abcam,Cambridje, Reino

Unido1:25

Anti-vimentina IgG de ratónPrimario

M0725,Dako,Glostrup,

Dinamarca1:100

Anti-CRALBP IgG de ratónPrimario

Ab15O51, 330Abcam, Cambridje,

Reino Unido1:100

Anti-ratón IgGSecundario

Santa CruzBiotechinc 1:1000

Anti-rata IgGSecundario

Santa CruzBiotechinc 1:1000

Tabla 4: Anticuerpos primarios y secundarios utilizados en los ensayos de Western blot.

Las membranas se incubaron a 4º C durante toda la noche con la concentra-ción adecuada de anticuerpo primario. Tras tres lavados de 5 minutos cada unacon TBS/T las membranas se incubaron con los correspondientes anticuerpossecundarios acoplados a peroxidasa (dilución 1:1000, Santa Cruz Biotechinc)durante 1 hora a temperatura ambiente. Seguidamente se lavaron de nuevotres veces con TBS/T y se sumergieron brevemente en PBS. A continuaciónse revelaron las membranas con el kit Lumi-light western blotting substrate (Ro-che). Como control de carga se utilizó la proteína de gliceraldehido-3-fosfato

64

MATERIALES Y MÉTODOS

deshidrogenasas (GAPDH 1:20000, Sigma). En todos los ensayos se incluye-ron controles negativos sin anticuerpo primario. Los anticuerpos utilizados seindican en la Tabla 4, pag 64.

3.12. Ensayos de inmunocitoquímica

INMUNOFLUORESCENCIA

ANTICUERPO ISOTIPOFLUOROCROMO

CASACOMERCIAL CANTIDAD

Anti-nestina IgG de ratónPrimario

MAB 353, Chemicon,Millipore, Temecula, CA,

EE.UU1:100

Anti-b-III-tubulina

IgG de ratónPrimario

MMS-435P Covance,Emeryville, CA, EE.UU 1:100

Anti-Abcg2 IgG de rataPrimario

Ab24115, Abcam,Cambridje, Reino Unido 1:25

Anti-vimentina

IgG de ratónPrimario

M0725, Dako,Glostrup,Dinamarca 1:100

Anti-GFAP IgG de conejoPrimario N1506, Dako 1:100

Anti-opsinaazul

IgG de conejoPrimario AB5407 Chemicon 1:100

Anti-opsinarojo/verde

IgG de conejoPrimario AB5405 Chemicon 1:100

Anti-melanop-sina

IgG de conejoPrimario

PAI-780 AfinidadBioReagents, Golde, Co,

EE.UU1:100

Anti-ratón IgG SecundarioAlexa Fluor 488

Jackson InmunoresearchLaboratories, West Grove,

PA, EE.UU1:100

Anti-rata IgG SecundarioAlexa Fluor 488

Jackson InmunoresearchLaboratories 1:100

Anti-conejo IgG SecundarioAlexa Fluor 488

Jackson InmunoresearchLaboratories 1:100

Tabla 5: Anticuerpos utilizados en los ensayos de inmunofluorescencia.

Para realizar los experimentos de inmunocitoquímica, primero se cultivaronlas células en cubreobjetos hasta llegar a semiconfluencia. A continuación se

65

MATERIALES Y MÉTODOS

lavaron con PBS y se fijaron durante 20 minutos con 4 % (w/v) de parafor-maldehído en PBS a 4º C. Las células se permeabilizaron con 0,1 % (v/v) deTriton X-100 en PBS durante 20 minutos. La unión no específica se bloqueópor medio de la incubación con 1 % (w/v) de albúmina de suero fetal bovinoen PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras el bloqueo las células seincubaron con anticuerpos primarios, en la misma solución de bloqueo, durantela noche a 4° C en una cámara húmeda. Tras realizar tres lavados de 5 minutosen PBS, se incubó con el anticuerpo secundario, durante 2 horas a temperaturaambiente.

Las células se observaron en un microscopio confocal (Leica TCS SP2, LeicaMicrosystems, Wetzlar, Alemania). En todos los casos se incluyeron controlesnegativos que carecían de anticuerpos primarios, secundarios o de ambos. Losanticuerpos utilizados se indican en la Tabla 5, pag. 65.

3.13. Medida del calcio intracelular

La sensibilidad a la luz de las células MU-PH1 se analizó midiendo el incre-mento de Ca2+ libre intracelular como respuesta a un estímulo luminoso, encélulas previamente marcadas con la sonda fluorescente Fluo-4. Esta sonda seune al Ca2+ de forma selectiva y reversible, cambiando el espectro de emisión yla señal de fluorescencia, permitiendo así su cuantificación mediante el sistemade detección adecuado.

Las células se incubaron en medio de cultivo en presencia del marcadorFluo-4 acetoxi metil ester (Fluo-4 AM; Molecular Probes, Eugene, OR, USA)a una concentración de 10 mM durante 45 minutos en oscuridad. Después deun lavado exhaustivo con medio de cultivo, las células se estimularon con luzde 480 nm durante un periodo de 10 minutos. La emisión de fluorescencia semonitorizó a 510 nm. El nivel de concentración libre de Ca2+ intracelular semidió como la relación entre el cambio de fluorescencia con el tiempo y lafluorescencia medida al comienzo de la estimulación con la luz (DF/F0). Co-mo blancos de estímulo se utilizaron células sin cargar con la sonda fluorescente.

Las determinaciones de fluorescencia se realizaron utilizando un sistemade microscopía de fluorescencia convencional (Leica Microsystems, Wetzlar,Alemania) acoplado a un ordenador, utilizando el programa Leica MM AF(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany).

66

MATERIALES Y MÉTODOS

3.14. Estudio del efecto de toxinas de los canales desodio dependientes de voltaje sobre la viabilidadcelular

La funcionalidad de los canales de Na+ dependientes de voltaje se analizómediante el estudio del efecto de la incubación con veratridina (Sigma Aldrich).La veratridina es un alcaloide que se obtiene a partir de extractos de las plan-tas Schoenocaulon o�cinale y de Veratrum album. La veratridina bloquea loscanales de Na+ en su estado abierto, impidiendo su inactivación, y causandouna despolarización sostenida. Como consecuencia de ello aumentan los nivelesintracelulares de Na+ y Ca2+. Esta sobrecarga catiónica termina produciendola muerte celular (Maroto et al., 1994) .

Los experimentos se realizaron con células de la línea MU-PH1 en los pa-ses 14 a 29, en placas de 96 pocillos, con 8 pocillos para cada condiciónexperimental, en cada uno de los ensayos. La veratridina se aplicó a distintasconcentraciones (entre 5 y 100 mM), y se mantuvo durante 24 horas en medioDMEM-GlutamaxTM , 4,5 g de glucosa, sin suero fetal bovino, basándonos endatos de la bibliografía (Nicolau et al., 2009,1). La viabilidad celular se midiómediante el ensayo de XTT (Cell proliferation kit Roche, ref 11465015001).Dado que la veratridina es soluble en DMSO, se comprobó que las concen-traciones de DMSO utilizadas no produjeran daño a las células añadiendo uncontrol conteniendo únicamente el disolvente.

Se estudió también el efecto de la administración conjunta de veratridinamás ouabaína (Sigma Aldrich). La ouabaína es un glucósido cardíaco, derivadode las semillas de la planta Strophanthus gratus. La ouabaína bloquea la bom-ba Na+/K+, impidiendo la salida activa de Na+. Administrada junto con laveratridina esperamos aumentara la sobrecaga de Na+ intracelular provocadapor esta última. La ouabaína se probó a las concentraciones de 100 y 200 mM,basándonos en datos bibliográficos previos (Milla et al., 2011).

3.15. Determinación de la producción de TNF-a invitro

La producción de la citocina proinflamatoria TNF-a por las células MU-PH1se determinó mediante el ensayo de enzimoinmunoanálisis (ELISA), utilizando

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MATERIALES Y MÉTODOS

un kit comercial adquirido a eBioscience, siguiendo las instrucciones del fabri-cante. El nivel de TNF-a se cuantificó en el sobrenadante libre de células delos cultivos de células MU-PH1 en presencia de diferentes ligandos de TLRs:LPS ultrapuro de E. coli, (250 ng/mL; InvivoGen, San Diego, CA, EE.UU.),Pam3CSK4 (1mg/mL; Invivogen) y dos formas inactivadas de C. albicans ATCC26555, levadura e hifa, obtenidos como se ha descrito previamente por nuestrogrupo de investigación (Murciano et al., 2007; Villamón et al., 2004), a unratio de 5/1 y 10/1 levaduras o hifas/celulas murinas. Los estímulos se man-tuvieron distintos tiempos: 12 horas, 1, 2 y 7 días. Las muestras se analizaronpor duplicado en cada ensayo.

3.16. Ensayo de la actividad de agentes antioxidantesy antiapoptóticos sobre la viabilidad de célulasMU-PH1 sometidas a estrés oxidativo

Para analizar la validez de la línea celular MU-PH1 como modelo de cribadode fármacos se utilizaron los reactivos que se indican a continuación adquiridosa Sigma Aldrich. Como agentes oxidantes se utilizaron oligomicina (bloqueantede la ATP sintasa), rotenona (bloqueante del complejo I de la cadena respi-ratoria) y el donador de óxido nítrico, inductor de apoptosis y muerte celularnitroprusiato sódico.

Según los numerosos trabajos bibliográficos que utilizan estos compuestos,las concentraciones utilizadas fueron: oligomicina (0,3-10 mM), rotenona (1-30mM), nitroprusiato sódico (0,3 mM). Como agentes con posible efecto neu-roprotector se analizaron las sustancias antioxidantes: vitamina E (200 mM),N-acetilcisteína (2 mM) y melatonina (1 mM) y los agentes antiapoptóticosácido Tauroursodeoxicólico (TUDCA) (500 mM) y ácido valproico (1 mM).

Los ensayos se realizaron en placas de 96 pocillos sembradas el día anterioral ensayo con una densidad celular de 5000 células/pocillo. Los estímulos semantuvieron durante 24 horas, en medio sin suero fetal bovino, previamente ala medida de la viabilidad celular. La viabilidad celular se cuantificó medianteel ensayo de XTT (Cell proliferation Kit, Roche). Cada condición se analizó en8 pocillos, cada experimento se repitió por triplicado.

68

MATERIALES Y MÉTODOS

3.17. Análisis estadístico de los resultados

Los datos se analizaron utilizando el test t-Student de dos colas. Los datosmostrados en las gráficas están expresados como la media ± la desviaciónestándar de la muestra. Los niveles de significación utilizados fueron: P 0,05(*) y P 0,01 (**).

3.18. Medios de cultivo y soluciones

Los medios de cultivo y las soluciones utilizados fueron:

MEDIOS DE CULTIVO Y SOLUCIONESMEDIO DMEM COMPLETO Concentración finalDMEM con GlutamaxTM (Gibco) -Suero fetal bovino inactivado (Gibco) 10 %Penicilina/estreptomicina (Gibco) 1 %pH 7,4PBS Concentración finalFosfato potásico monobásico (KH2PO4) 144,0 mg/L – 10,588 mMCloruro sódico (NaCl) 90000,0 mg/L – 1551,724 mMFosfato sódico dibásico (Na2HPO4-H2O) 7950,0 mg/L – 29,664 mMpH 7,4MEDIO LIN� Concentración finalRPMI con GlutamaxTM (Gibco) -Suero fetal bovino inactivado (Gibco) 5 %Penicilina/estreptomicina (Gibco) 1 %Stem cell factor (Peprotech) 20 ng/mLTAMPÓN DE PURIFICACIÓN Concentración finalPBS (Gibco) -EDTA (Gibco) 2 mMAlbumina sérica bobina (BSA,sigma-Aldrich) 0,5 %

pH 7.2 Esterilizado por filtración

Tabla 6: Medios de cultivo de levaduras utilizados en este trabajo.

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MATERIALES Y MÉTODOS

MEDIOS DE CULTIVO DE LEVADURASMEDIO LÍQUIDO YPD CantidadExtracto de levadura 10 gTriptona (Digerido pancreático de caseína) 20 gGlucosa 20 gAgua destilada c.s.p. (Gibco) 1 litropH 6-7MEDIO LÍQUIDO SINTÉTICO DE LEESIMPLIFICADO (Lee et al., 1975)

Cantidad

(NH4)2SO4 5 gMgSO4. 7H2O 0,2 gHK2PO4 anhidro 2,5 gNaCl 5 gGlucosa 12,5 gProlina 0,5 gBiotina 0,5 gAgua destilada c.s.p. (Gibco) 1 litropH 5,4 - 5,8

Tabla 7: Medios de cultivo y soluciones utilizados en este trabajo.SALTO DE PAGINAHOL

HOL

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HOLA

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Capítulo 4

RESULTADOS

Aunque la neurogénesis en la retina de mamíferos adultos termina en elperiodo postnatal temprano (Reh and Fischer, 2006), un pequeño número decélulas madre y progenitoras persisten en reposo en la retina madura cuya di-ferenciación neuronal ya no es evidente, pero siguen conservando el potencialneurogénico (Ahmad et al., 2000; Liu et al., 2009; Tropepe et al., 2000; Wohlet al., 2012). Comprender los mecanismos celulares y moleculares implicados enla proliferación, diferenciación y función de estas células progenitoras es esen-cial con el fin de determinar su capacidad neurorregenerativa y por tanto, suposible potencial terapéutico en enfermedades neurodegenerativas de la retina.

Los TLRs, receptores clave en la activación de la respuesta inmunológica,parecen estar implicados en la proliferación de las células progenitoras, y cadavez más estudios los implican en procesos de regulación de la neurogénesisy el crecimiento (Okun et al., 2011). En la retina, la expresión de TLRs seha confirmado en células ganglionares, fotorreceptores, epitelio pigmentario ytambién en células gliales, astrocitos, microglía y células de Müller (Jiang et al.,2009; Kumar et al., 2004; Langmann, 2007; Okun et al., 2011; Shamsuddin andKumar, 2011; Shechter et al., 2008). Dados estos antecedentes, consideramosde gran interés estudiar la expresión de TLRs en células de la retina adulta quepresenten características de progenitoras y estudiar la posible relación de losTLRs en los mecanismos celulares y moleculares implicados en la diferenciacióny función de estas células. Los TLRs podrían ser mediadores de la diferenciacióny de la capacidad de transformación de las células de la retina, con lo queresultarían relevantes en los procesos de neurorregeneración retiniana.

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RESULTADOS

4.1. IDENTIFICACIÓN DE POBLACIONES DE CÉ-LULAS MADRE EN RETINA DE RATONES ADUL-TOS

En primer lugar se intentó identificar células progenitoras en la retina deratones adultos. Para ello se utilizaron retinas de ratones C57BL/6J de edadcomprendida entre 4 y 8 semanas, y se intentó localizar en ellas células queexpresaran marcadores de células madre y progenitoras, tales como el trans-portador Abcg2 y el antígeno Sca-1, mediante citometría de flujo.

4.1.1. Identificación de células madre con el fenotipo "Side Po-pulation"

La expresión de la proteína Abcg2 se considera un marcador útil para laidentificación de células madre. Diversos tipos de células madre con gran poten-cial neurorregenerador de diferentes tejidos expresan el transportador Abcg2,el cual les confiere una capacidad elevada de expulsar sustratos, xenobióti-cos, toxicos, etc. (Ahmad et al., 2004; Bhattacharya et al., 2003; Hulspas andQuesenberry, 2000; Mouthon et al., 2006). El fenotipo "Side Population" escaracterístico de células que expresan este transportador las cuales pueden seridentificadas debido a la mayor capacidad para excluir la sonda fluorescenteintercalante del DNA, Hoechst 33342, en comparación con el resto de célulaspresentes en un tejido.

La emisión dual de fluorescencia de esta sonda nos permite obtener, trasel análisis por citometría de flujo, un diagrama de puntos de toda la poblaciónde células marcadas con Hoechst 33342. Las células que expresan la proteínaAbcg2 deben aparecer como una pequeña población desplazada hacia un lateral(población SP), ya que el colorante es rápidamente expulsado al exterior por laacción del transportador, presentando una baja acumulación de colorante quesitúa a estas células en canales de fluorescencia menores, en comparación con elresto de células de la población. En estudios previos se ha detectado el fenotipo"Side Population" en células de retina de ratones neonatos (Bhattacharya et al.,2003), pero no se ha encontrado esta población en retinas de animales adultos.

Para identificar esta población SP en la retina de nuestro modelo de estu-dio, se incubaron las células obtenidas de la retina de cuatro ratones adultos de8 semanas de edad con la sonda fluorescente intercalante del DNA, Hoechst33342 y se analizaron en un citómetro de flujo. Siguiendo este método no se

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RESULTADOS

observó la población esperada situada en canales más bajos de fluorescenciapara ambas emisiones (ver figura 1.11), ya que en esta región se obtuvo unapoblación por debajo del 0,001 % (Fig. 4.1.). Estos resultados indican que lasmuestras analizadas carecen de esta población inmadura.

Figura 4.1: Análisis de la expresión del fenotipo "Side Population" en la retina de ra-tón adulto por citometría de flujo. Las células de las retinas de cuatro ratones C57BL/6Jfueron teñidas con el fluorocromo Hoechst 33342. En el gráfico se enfrentan la emisióndual de fluorescencia del fluorocromo Hoechst 33342, a 405 nm (BLUE) y a 620 nm(RED). Se muestra la región donde deberían aparecer las células SP, que expulsan elcolorante más rápidamente que el resto de células de la retina, como una pequeñapoblación lateral situada en canales más bajos de fluorescencia para ambas emisiones.Se muestran los resultados de un experimento representativo de dos.

4.1.2. Identificación de células madre mediante la detección delantígeno Sca-1

El antígeno Sca-1 está presente en células madre de diversos tejidos (Ka-wamoto et al., 1997; Morrison et al., 1995,9; Spangrude and Brooks, 1993;Spangrude et al., 1988; Van De Rijn et al., 1989; Yamamoto et al., 1996).Este marcador también se encuentra presente en células madre de la retina demamíferos en edad neonatal (Liu et al., 2009), pero no se ha descrito su expre-sión en retinas de animales adultos. Por este motivo en primer lugar decidimoscomprobar, mediante citometría de flujo, la existencia de células Sca-1+ en laretina de ratón adulto. Para ello en cada experimento se extrajeron las retinasde cuatro ratones de entre 4 y 8 semanas de edad y se marcaron las células conun anticuerpo frente al antígeno Sca-1, conjugado con un fluorocromo. Como

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RESULTADOS

control de fluorescencia se utilizaron células sin marcar.

Tras detectar la población de células de la retina por su tamaño FSC ycomplejidad SSC, tanto para la muestra sin marcar (Fig. 4.2 A1) como para lamuestra marcada con el anticuerpo anti-Sca-1 conjugado con el fluorocromoAPC (Fig. 4,2 B1), se analizó la fluorescencia de ambas poblaciones.

Figura 4.2: Análisis de la expresión del antígeno Sca-1 en células de retina de ratónadulto mediante citometría de flujo. En los histogramas biparamétricos A1 y B1 pode-mos observar las células de la retina teniendo en cuenta su tamaño (FSC) y complejidad(SSC), tanto de la población no marcada (blanco) A1, como de la población marcadacon el anticuerpo fluorescente frente al antigeno Sca-1, B1. En los histogramas bipa-ramétricos A2 y B2 podemos observar la fluorescencia de las células Sca-1+, tanto delblanco (población no marcada con anti-Sca-1) A2, como de la población marcada, B2.Se muestran los resultados de un experimento representativo de cuatro.

Los resultados muestran una pequeña población positiva de células Sca-1que superan los canales en los que habíamos acotado la autofluorescencia de lapoblación (Fig 4.2 B2), correspondiente al 0,076 %±0,027 de la población delas células de la retina total. Estos resultados confirman la existencia de célulasinmaduras en la retina de ratón adulto que expresan el antígeno Sca-1.

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RESULTADOS

Tras haber comprobado la presencia de células Sca-1+ en la retina de ratónadulto, el siguiente paso fue comprobar la presencia de células Sca-1+ de origenno hematopoyético, descartando otras células Sca-1+ que pudieran estar pre-sentes en la retina, las cuales expresarían marcadores de linaje hematopoyético(Lin+) y la proteína CD45.

Para ello se procedió en primer lugar a eliminar las células linaje positivas(Lin+) de la población total de células de la retina y recoger las células linajenegativas (Lin�), mediante selección inmunnomagnética negativa con un cóc-tel de anticuerpos que reconocen marcadores de linaje. Entre estos se encuentraun anticuerpo que reconoce al receptor de membrana CD11b perteneciente auna superfamilia de glicoproteínas, las integrinas, expresado también por lascélulas de microglía de la retina, con lo cual también eliminamos todas lascélulas de este tipo. Estas células son linaje positivas (Lin+), ya que son partedel sistema inmunitario y expresan estos receptores característicos del linajehematopoyético.

La población obtenida de células Lin� se marcó con un anticuerpo anti-Sca-1 y también con el anticuerpo anti-CD45. Con esta aproximación intentamosdetectar la presencia de una población Lin� Sca-1+ CD45� similar a la pe-queña población descrita por otros grupos en retinas neonatales murinas concaracterísticas de células madre y capacidad de diferenciación en distintos te-jidos. Se ha descrito que esta población resultante Lin� Sca-1+ CD45� tieneuna gran capacidad regenerativa, con lo que podría reparar tejidos dañados yresultar de interés en procesos neurodegenerativos.

4.2. ESTUDIO DE LA EXPRESIÓN Y FUNCIONA-LIDAD DE RECEPTORES TIPO TOLL EN LASPOBLACIONES DE CÉLULAS Sca-1+ CD45 �

IDENTIFICADAS

Como hemos comentado, diversos estudios relacionan el TLR2 con procesosde proliferación y diferenciación de células madre y progenitoras de distintoorigen (Megías et al., 2012; Rolls et al., 2007; Yáñez et al., 2010). Así pues,decidimos inestigar la expresión de TLR2 en la población identificada de célulasLin� Sca-1+ CD45�.

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RESULTADOS

4.2.1. Estudio de la expresión de TLR2 en las células Lin� Sca-1+ CD45� en retina de ratón adulto

Para comprobar la expresión del receptor TLR2 en las células Lin� Sca-1+CD45� de retina de ratón adulto, realizamos en las células Lin� purificadasun marcaje triple con anticuerpos monoclonales, anti-Sca-1, anti-CD45 y anti-TLR2 conjugados con tres fluorocromos APC, FITC y PE respectivamente.Incluimos también una muestra en la que sustituimos el anticuerpo anti-TLR2por su isotipo control, conjugado con el fluorocromo PE. Se analizó la expresióndel receptor TLR2 en células Lin� Sca-1+ CD45� (Fig. 4.3).

Figura 4.3: Análisis de la expresión del receptor TLR2 en las células Lin� Sca-1+

CD45� de retina de ratón adulto analizadas por citometría de flujo. (A) Histogramasbiparamétricos que muestran en el eje de ordenadas la fluorescencia del marcador CD45conjugado con el fluorocromo FITC y en el eje de abcisas la fluorescencia del marcadorSca-1 conjugado con el fluorocromo APC. Se muestran los resultados de la poblaciónsin marcar con ningún anticuerpo (blanco) y las marcas triples con anticuerpos anti-Sca-1 y anti-CD45 junto con el anticuerpo anti-TLR2 o con su isotipo control. (B)Histogramas monoparamétricos que muestran la expresión del receptor TLR2 para lasregiones Q4, Q3 y Q3 respectivamente para las tres condiciones. (C) Histograma mo-noparametrico en el que se muestra la superposición de los tres picos obtenidos en lastres regiones estudiadas. En los tres casos se parte de 1.250.000 eventos totales paracada condición. Se muestran los resultados de un experimento representativo de cuatro.

En la figura 4.3 A se muestran los tres histogramas biparamétricos en loscuales se analiza la señal fluorescente de los anticuerpos anti-CD45 y anti-Sca-1. A partir de estas poblaciones se analizó la fluorescencia del anticuerpo

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RESULTADOS

anti-TLR2 conjugado con PE, que es el tercer fluorocromo utilizado y nospermite medir la expresión del receptor TLR2, para cada población (Fig. 4.3B). La autofluorescencia de la población para las tres señales (FITC, APC yPE) se delimitó teniendo en cuenta la región Q4 (región coloreada en gris) querepresenta la población sin marcar con ningún anticuerpo. Las células marcadaslas obtuvimos en la región Q3 para las otras dos poblaciones, región azul (Sca-1+, CD45� e isotipo control TLR2) y región roja (Sca-1+, CD45� y anti-TLR2)(Fig. 4,3 A).

Figura 4.4: Análisis de la expresión del receptor TLR2 en la población de células Sca-1� CD45� en células Lin� de retina de ratón adulto, analizadas por citometría de flujo.(A) Histogramas biparamétricos que muestran en el eje de ordenadas la fluorescenciadel marcador CD45 conjugado con el fluorocromo FITC y en el eje de abcisas la fluores-cencia del marcador Sca-1 conjugado con el fluorocromo APC para las tres condiciones,población sin marcar con ningún anticuerpo (blanco) y las marcas triples con anticuer-pos anti-Sca-1 y anti-CD45 junto con el anticuerpo anti-TLR2 o con su isotipo control.(B) Histogramas monoparamétricos que muestran la expresión del receptor TLR2 paralas regiones Q4 respectivamente para cada una de las tres condiciones. (C) Histogramamonoparamétrico en el que se muestra la superposición de los tres picos obtenidos enlas tres regoines estudiadas. En los tres casos se parte de 1.250.000 eventos totales paracada condición. Se muestran los resultados de un experimento representativo de cuatro.

La marca TLR2 se muestra en los histogramas monoparamétricos como unpico de color gris, azul y rojo respectivamente para cada población (Fig 4.3 B).Los tres picos se superpusieron en un nuevo histograma monoparamétrico paravalorar el desplazamiento de la señal con respecto al control negativo (pico

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RESULTADOS

gris) (Fig 4.3 C). Los resultados muestran que las células de la región Q3 roja(pico rojo) que representan células Lin� Sca-1+ CD45� presentan un mayoravance con respecto al negativo y al marcaje inespecífico. Esto demuestra quelas células Lin� Sca-1+ CD45� de retinas de ratones adultos expresan recep-tores TLR2.

Se analizó también la expresión del receptor TLR2 en células Lin� Sca-1�CD45� (Fig. 4.4). Las células Lin� Sca-1� CD45� son las células que no ex-presan el antígeno Sca-1 y por tanto no tienen la característica de célula madreinmadura. Para analizar la expresión de TLR2 en estas células, se utilizaronlos mismos histogramas analizando la región Q4 en vez de la Q3 para los treshistograma biparamétricos (Fig 4.4 A). La marca del anticuerpo anti-TLR2 seanalizó para cada una de las tres poblaciones por separado y se mostró en lostres histogramas monoparamétricos (Fig. 4.4 B), así como la superposición delos tres picos (Fig. 4.4 C).

A continuación se muestran los valores obtenidos de células TLR2+, tan-to para la población Sca-1+ (regiones Q3) como para la población Sca-1�(regiones Q4), frente a su respectivo control isotípico (Fig. 4.5).

Figura 4.5: Histograma que muestra el porcentaje de células TLR2 +a partir de lapoblación de células Sca-1+ (región Q3 roja de la figura 4.3) frente a su isotipo control(región Q3 azul de la figura 4.3) y el porcentaje de las células TLR2 +de la población decélulas Sca-1� (región Q4 roja de la figura 4.4) frente a su isotipo control (región Q4azul de la figura 4.4). Se muestra la media de cuatro experimentos más la desviaciónestándar. Los datos están normalizados respecto al isotipo control.

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RESULTADOS

Los resultados muestran que las células de la región Q4 roja (pico rojo)que representan células Lin� Sca-1� CD45�presentan un pequeño avance conrespecto al negativo y al marcaje inespecífico. Esto demuestra que las célulasLin� Sca-1+ CD45�de retinas de ratones adultos expresan proporcionalmentemás receptores TLR2 que las células Lin� Sca-1� CD45�(Fig. 4,5).

4.2.2. Estudio de la funcionalidad de TLR2 en células Lin� Sca-1+ CD45� en retina de ratón adulto

Una vez demostrada la expresión de TLR2 en la población de células Lin�Sca-1+ CD45� decidimos estudiar su funcionalidad. Para ello, como una prime-ra aproximación, se realizaron cultivos de las células linaje negativo Lin�. Lascélulas Lin� obtenidas, se cultivaron en medio apropiado junto con ligandosde los TLRs para valorar la posible participación de estos receptores en la pro-liferación y/o diferenciación de las células inmaduras. Como ligando puro delheterodímero TLR2/TLR6 utilizamos Pam3CSK4. Incluímos también el ligan-do de TLR4 LPS. Puesto que, como hemos comentado previamente, estudiosanteriores demuestran que C. albicans induce la proliferación y diferenciaciónvía TLR2, decidimos comprobar si en estas células produce el mismo efectoutilizando como estímulo levaduras e hifas de este microorganismo. Las célulasse mantuvieron en cultivo durante una o dos semanas en presencia cada unode estos estímulos, administrados por separado.

Posteriormente se valoró, la expresión del antígeno Sca-1, la proliferacióncelular, la expresión de los receptores TLR2 y TLR4 y la posible diferenciacióna células de defensa estudiando la expresión de la proteína CD11b, dado quelas células Lin� son CD11b �. Se escogió este último marcador, característicode linaje hematopoyetico (integrina Mac-1), ya que se expresa en células ma-duras de defensa, tales como monocitos/macrófagos. Dado que está descritoque TLR2 induce diferenciación hacia linaje mieloide y que las células linajenegativo que obtuvimos carecían de este marcador, su expresión apuntaría auna diferenciación celular inducida por los ligandos.

4.2.2.1. Estudio en células en cultivo durante una semana

Tras mantener las células Lin� en cultivo durante una semana con losdistintos estímulos, se analizó la expresión de los marcadores Sca-1, TLR2,TLR4 y CD11b para cada una de las condiciones (Fig. 4.6).

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RESULTADOS

Figura 4.6: Estudio de la expresión de los marcadores: TLR2, TLR4, Sca-1 y CD11ben células Lin� de retina de ratón adulto por citometría de flujo. Las células se cul-tivaron durante una semana sin ningún estímulo (control) y con tres ligandos de losTLRs de forma independiente: Pam3CSK4(0,125 mg/mL), LPS (1 mg/mL) y levadurasinactivadas (en proporción 5:1, levaduras:células murinas) de la cepa de C. albicansATCC 26555. Se muestran, en un histograma biparamétrico FSC frente a SSC, lastres poblaciones marcadas e incubadas con estímulos, la población marcada e incuba-da sin estimulo (control) y el blanco (células sin marcar). Cada población es a su vezanalizada en cuatro histogramas monoparamétricos correspondientes a la intensidadde fluorescencia de los anticuerpos monoclonales anti-TLR2, anti-TLR4, anti-Sca-1 yanti-CD11b, teniendo como base la población sin marcar (blanco). Se muestran losresultados de un experimento representativo de dos.

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RESULTADOS

Los resultados mostraron un aumento de la expresión de receptores Sca-1en la población de células estimuladas con el ligando Pam3CSK4 (Fig. 4.6).La población de células que expresan este receptor en la muestra control (n=2experimentos) fue de un 6,40±2,92 % y la muestra de células estimuladas condicho ligando alcanzó un valor de 18,60±8,30 %. Se observó también un aumen-to en la expresión de los receptores TLR2 de dicha población, ya que pasaronde un 4,18±1,62 % en la población control a un 12,64±6,26 % estimuladascon el ligando Pam3CSK4 (Fig. 4.6). En estas condiciones la expresión del re-ceptor CD11b aumenta levemente pasando de un 2,71±1,00 % en la poblacióncontrol a un 6,91±2,18 % respectivamente (Fig 4.6). Por otra parte, el ligan-do LPS no aumentó apenas la expresión del receptor Sca-1 ya que pasó a un8,06±1,27 %, siendo el control 6,40±2,92 %, así como tampoco se apreció unaumento en la intensidad de fluorescencia para los receptores TLR4 (3,04 %)ni CD11b (1,60±0,17 %).

En la población estimulada con C. albicans, aparece un aumento de laexpresión de receptores Sca-1 de hasta un 18,75±1,95 %. En cuanto al receptorCD11b, aparece un pico mayoritario con menor fluorescencia que el blanco, estepico corresponde a la autofluorescencia de dicho hongo, pero el pico de célulasno sobrepasa los niveles de fluorescencia del control. En cuanto a la expresiónde TLR4, no se apreció aumento en su expresión en ninguna de las poblacionespor encima de los valores obtenidos en la muestra control (Fig. 4.6). Todoslos valores corresponden al valor medio de los resultados obtenidos de dosexperimentos.

4.2.2.2. Estudio en células en cultivo durante dos semanas

Tras mantener las células Lin� en cultivo durante dos semanas con los mis-mos estímulos, se analizó la expresión de los receptores Sca-1, TLR2, TLR4 yCD11b para cada una de las poblaciones incubadas con un solo estímulo. Losresultados confirmaron la tendencia al aumento de la expresión de receptoresSca-1 en la población de células estimuladas con el ligando Pam3CSK4 pasan-do de un 8,35±0,02 % en el control a un 13,50±1,49 % (Fig. 4.7), así comotambién un ligero aumento en la expresión de TLR2 pasando de un 3,26 % enel control a un 5,00 %, en la expresión de TLR4 pasando de un 1,85 % en elcontrol a un 5,57 % y un aumento casi inapreciable en la expresión de CD11bpasando de un 2,68±0,015 % a un 3,82±0,01 %. Las células incubadas conLPS continuaron sin mostrar un aumento en la señal de fluorescencia con nin-guno de los anticuerpos analizados. En la población de células incubadas conC. albicans, también hubo un aumento considerable de la expresión de recep-

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RESULTADOS

tores Sca-1, pasando de un 8,35 %±0,02 a un 46,35±7,35 % (Fig. 4.7). No seapreció ningún aumento en la expresión de los receptores TLR4 (Fig. 4.7) enninguna de las demás condiciones estudiadas. Todos los valores correspondenal valor medio de los resultados obtenidos de dos experimentos.

Figura 4.7: Estudio de la expresión de los marcadores: TLR2, TLR4, Sca-1 Y CD11ben células Lin� de retina de ratón adulto por citometría de flujo. Las células se cul-tivaron durante dos semanas sin ningún estímulo (control) y con tres ligandos de losTLRs de forma independiente: Pam3CSK4(0,125 mg/mL), LPS (1 mg/mL) y levadurasinactivadas (en proporción 5:1, levaduras:células murinas) de la cepa de C. albicansATCC 26555. Se muestra, en un histograma biparamétrico FSC frente a SSC, las trespoblaciones marcadas e incubadas con estímulos y el control (células sin estímulo).Cada población es a su vez analizada en cuatro histogramas monoparamétricos corres-pondientes a la intensidad de fluorescencia de los anticuerpos monoclonales anti-TLR2,anti-TLR4, anti-Sca-1 y anti-CD11b, teniendo como base la población sin estimular(control). Se muestran los resultados de un experimento representativo de dos. Losvalores de TLR2 y TLR4 corresponden a experimentos únicos.

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RESULTADOS

Estos datos indican que los TLR2 de las células de la retina Lin� son funcio-nales, pues responden al estímulo producido por sus ligandos. El hecho de queaumente la población Sca-1+ puede resultar de la proliferación de la poblaciónSca-1+con respecto a la población negativa o bien deberse a un aumento en laexpresión del marcador en células que no lo expresaban, debido a la presenciade los estímulos. Se ha descrito que en respuesta a la infección o inflamación,progenitores comunes mieloides o "Common Myeloid Progenitors" (CMPs) queya han perdido la expresión de Sca-1 pueden volver a expresarlo, es decir laexpresión de dicho marcador puede verse aumentada por la infección y/o in-flamación (Megías et al., 2013).

A continuación, analizamos las células Sca-1+ obtenidas tras la estimu-lación y medimos, sólo en ellas, la expresión de TLR2 para cada uno de losestímulos. Los resultados mostraron que en el caso de la población celular esti-mulada con Pam3CSK4, había un aumento de la expresión del receptor TLR2con respecto al control y con respecto al resto de poblaciones (Fig. 4.8).

Figura 4.8: Estudio de la expresión de TLR2 en células Sca-1+de retina de ratónadulto por citometría de flujo, a partir de las poblaciones de células obtenidas de loscultivos de una semana, sin ningún estímulo (control) y con dos ligandos de los TLRsde forma independiente: Pam3CSK4(0,125 mg/mL) y LPS (1 mg/mL). Se muestra, enun histograma biparamétrico el SSC frente a la intensidad de fluorescencia del anti-cuerpo monoclonal anti-TLR2, teniendo como base la población sin marcar (blanco).Se muestran los resultados de un experimento representativo de dos.

Como un control adicional, se realizó el mismo experimento pero en estecaso se utilizaron ratones Knockout (KO) para el receptor TLR2. Se obtubieroncélulas Lin� y se cultivaron durante una semana con el estímulo Pam3CSK4.

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RESULTADOS

Los resultados no mostraron cambios relevantes de la población estimulada conrespecto al control.

Figura 4.9: Estudio de la expresión de TLR2 y Sca-1 en células de retina de ratón KOTLR2 adulto por citometría de flujo. Las células se cultivaron durante una semana sinningún estímulo (control) y con el estímulo Pam3CSK4(0,125 mg/mL). Se muestranhistogramas monoparamétricos con la intensidad de fluorescencia de los anticuerposmonoclonales anti-TLR2 y anti-Sca-1, teniendo como base la población sin estimular(control). Se muestran los resultados de un experimento.

Este resultado confirmó que el aumento en la expresión del antígeno Sca-1se debe a la estimulacion de los TLR2 (Fig 4.9).

4.3. AISLAMIENTO Y CULTIVO DE CÉLULAS Lin�

Sca-1+ CD45�..

Para confirmar si los resultados mostrados en el apartado anterior se de-bían a la población de células Lin� Sca-1+ CD45� nos planteamos estudiar acontinuación el efecto de la estimulación de TLR2 en la población de célulasLin� Sca-1+ CD45�, aisladas del resto de las células de la retina.

Para ello, las células Lin� de la retina de ratón adulto marcadas con los an-ticuerpos anti Sca-1 y anti-CD45 se analizaron en un histograma biparamétrico

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RESULTADOS

enfrentando la fluorescencia de ambos anticuerpos (APC y FITC respectiva-mente) y utilizando un separador celular, se aislaron las células situadas en laregión positiva para el marcador Sca-1 y negativa para CD45. El porcentajede esta población fue de un 0,033±0,004 % (media de seis experimentos) yuno representativo se muestra en la figura 4.10. Estos datos coinciden con lospublicados en la bibliografía (Havens et al., 2013; Liu et al., 2009), ya que enretina de ratones neonatos aparecen estas células en un porcentaje del 1,5 %,disminuyendo considerablemente en la retina de ratón adulto (Liu et al., 2009).

Figura 4.10: Purificación de células Lin� Sca-1+CD45� de retina de ratón adulto.Histograma biparamétrico donde se representa la intensidad de fluorescencia del doblemarcaje de los anticuerpos anti-Sca-1 y anti-CD45. Las células positivas para la señal deSca-1 y negativas para la señal CD45 que están situadas dentro de la región mostradase aislaron y recogieron mediante separación celular. Se muestran los resultados de unexperimento representativo de seis.

Las células separadas Lin� Sca-1+ CD45� una vez obtenidas se cultivaroninmediatamente en medio Lin�, un medio que, manteniendo la viabilidad delas células, induce muy poco la diferenciación.

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RESULTADOS

4.4. ESTUDIO DE LA FUNCIONALIDAD DE LOSRECEPTORES TIPO TOLL EN LAS CÉLULASAISLADAS Lin� Sca-1+ CD45�

4.4.1. Estudio del efecto de la activación de TLRs sobre la pro-liferación celular

Para comprobar si los TLRs pueden estar implicados en la proliferación delas células de nuestro estudio al igual que se ha descrito para otros tipos celu-lares, estudiamos el efecto de la activación de TLR2 en la proliferación de lapoblación Lin� Sca-1+ CD45�separada. Las células se cultivaron inmediata-mente después de su purificación, en ausencia de estímulos (control negativo)y en presencia de Pam3CSK4. Estudiamos también el efecto de la incubacióncon LPS a modo comparativo. A los 12 días de la incubación a 37 ºC y conun 5 % de CO2, se observaron las células al microscopio de campo claro. Seobservó un aumento claro del número de células en el cultivo con Pam3CSK4

respecto al control negativo. El número de células en el cultivo con LPS tam-bién fue mayor (Fig 4.12). La cuantificación del número de células confirmóestos resultados, mostrando un aumento significativo del número de célulasincubadas con Pam3CSK4 con respecto al control negativo (3,87±0.32 veces,n=4 experimentos) (Fig. 4,11). El número de células en el cultivo con LPStambién fue mayor (4,10±0.84 veces, n=2 experimentos) (Fig 4.11).

Figura 4.11: Histograma que muestra la proliferación de células Lin� Sca-1+ CD45�

purificadas e incubadas durante 12 días, sin estímulos (control) y con los estímulosPam3CSK4(0,125 mg/mL) y LPS (1 mg/mL). Se muestran los valores medios y ladesviación estándar. Entre paréntesis se indica el número de experimentos realizados.Los datos están normalizados respecto a la población control.

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RESULTADOS

Figura 4.12: Imagen de células Lin� Sca-1+ CD45� purificadas mediante separadorcelular y mantenidas 12 días en cultivo en ausencia (control) o presencia del ligandopuro del receptor TLR2, Pam3CSK4(0,125 mg/mL) y del ligando de TLR4, LPS. Lasimágenes están tomadas con un microscopio de campo claro con 40 aumentos. Lasbarras de escala representa 50 mm.

4.4.2. Estudio del efecto de la activación de TLRs en la expresiónde Sca-1, TLR2 y CD11b

Para comprobar si la activación de los TLR2 inducía, además de un au-mento en la proliferación celular, un cambio en la expresión de los marcadores

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RESULTADOS

Sca-1 y TLR2, nos propusimos analizar su expresión. Quisimos también evaluarun posible aumento en la diferenciación de las células y para ello, como hemoscomentado anteriormente, analizamos la expresión de la proteína CD11b. Lascélulas obtenidas tras la purificación se sembraron a razón de 2.000 células porpocillo y se incubaron en medio Lin� a 37º C con un 5 % de CO2, en presenciay en ausencia (control) del ligando Pam3CSK4. Dada la implicación descritapor otros autores del TLR4 en procesos de diferenciación celular, incluimostambién el ligando del TLR4, LPS. A los 12 días de incubación, se analizó laexpresión de los marcadores, marcando la población con los anticuerpos anti-Sca-1, anti-TLR2 y anti-CD11b, añadiendo además el fluorocromo intercalantedel ADN Hoechst 33342, para poder identificar mejor la población de células,ya que su pequeño tamaño impedía separarlas claramente del debrís y del ruidode fondo del equipo. Los resultados obtenidos tras el análisis por citometría deflujo se muestran en la figura 4.13.

En el diagrama de puntos de las células control apreciamos una única po-blación celular, más homogénea, mientras que en las muestras incubadas conPam3CSK4 y LPS observamos la aparición de una segunda población con ma-yor complejidad (SSC alto). Esto nos permite sospechar que la población conun mayor valor de SSC podría corresponder a células con un distinto grado dediferenciación. Cuando analizamos la expresión de los marcadores en las dossubpoblaciones (SSC bajo y SSC alto) tomando como referencia la intensidadmedia de fluorescencia de la población control en las regiones de bajo y altoSSC, cuyos valores son para el marcador Sca-1 de 57,5±29,5 y 321.5±208,5respectivamente, comprobamos que la incubación con Pam3CSK4 produjo unligero aumento de la expresión del marcador Sca-1 en la población con altoSSC, pasando a 683±429 y a 147,5±79,5 para la de bajo SSC. Comprobamostambién que se produjo un aumento de la intensidad media de fluorescenciadel marcador TLR2, tanto en la población de bajo SSC (510±315) como en lade alto SSC, siendo este último mayor (2204±350), partiendo de un valor defluorescencia control de 126±52 y de 370±48 respectivamente. En cuanto a laexpresión de CD11b, se observó también un aumento de dicha señal de fluo-rescencia en la población de bajo SSC, 301,5±161,5 con respecto a su control(152,5±63,5) y más elevado en la población de alto SSC, 1213,5±787,5 frentea su control (431±53). Estos datos apoyan un incremento en la diferenciaciónde las células en presencia del ligando Pam3CSK4.

Al analizar los datos de fluorescencia obtenidos en las células incubadas conLPS, obtuvimos aumentos en la señal de fluorescencia también perceptibles,

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RESULTADOS

aunque menos intensos. En este caso, la intensidad de fluorescencia del marca-dor Sca-1 aumentó en la población de alto SSC hasta un 576±295, partiendode un control de 57,5±29,5. La intensidad de fluorescencia para el marcadorTLR2 de la población de bajo SSC fue de un 297±113 y de un 1314±69 parala población de alto SSC, cuyos controles fueron, 126±52 y 370±48 respecti-vamente. También en este caso observamos un incremento de la fluorescenciadel marcador CD11b en la población de alto SSC, con un valor de 1009±460frente a su control de 431±53. Todos los valores corresponden al valor mediode los resultados obtenidos de dos experimentos.

Figura 4.13: Análisis mediante citometría de flujo de la intensidad de fluorescenciade los marcadores CD11b, TLR2 y Sca-1 en células Lin� Sca-1+ CD45� de retina deratón adulto. Las células fueron purificadas mediante un separador celular e incubadasinmediatamente después de la separación durante 12 días bajo tres condiciones: sin es-tímulos en el medio de cultivo (control) y en presencia de los ligandos Pam3CSK4(0,125mg/mL) y LPS (1 mg/mL). Se muestra, en un histograma biparamétrico SSC frentea la fluorescencia de la sonda Hoechst, las 3 poblaciones, control y estimuladas conPam3CSK4(0,125 mg/mL) y LPS (1 mg/mL). Cada población es a su vez analizadaen tres histogramas monoparamétricos correspondientes a la intensidad de fluorescen-cia de los anticuerpos monoclonales anti-TLR2, anti-Sca-1 y anti-CD11b en las dospoblaciones obtenidas: SSC Bajo (P1 magenta) y con SSC alto (P2 azul). Los valoresmostrados representan el tanto por cien de cada población en los histogramas biparamé-tricos y el valor medio de fluorescencia para cada pico (población) en los histogramasmonoparamétricos. Se muestran los resultados de un experimento representativo dedos.

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RESULTADOS

Figura 4.14: Histograma que muestra la media de fluorescencia de los marcadoresCD11b, TLR2 y Sca-1 en células Lin� Sca-1+ CD45�purificadas e incubadas durante12 días, sin estímulos (control) y con los estímulos Pam3CSK4(0,125 mg/mL) y LPS(1 mg/mL) para P1, P2 y de la población total, análizadas por citometría de flujo endos experimentos independientes. Los datos están normalizados respecto a la poblacióncontrol.

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RESULTADOS

Si tenemos en cuenta las medias de fluorescencia obtenidadas para cadacondición y para las dos poblaciones por separado P1 (población magenta debajo SSC) y P2 (población azul de alto SSC) de la figura anterior, podemosconfirmar el aumento en la expresión del marcador TLR2 frente a los otrosmarcadores en la población estimulada con el ligando Pam3CSK4(Fig 4.14).

A la vista de los resultados expuestos podemos concluir que la incubación dela población Lin� Sca-1+ CD45� con los ligandos Pam3CSK4 y LPS induceuna proliferación de las células y un aumento en la expresión de TLR2. Apa-rece también una subpoblación de células que expresan la proteína CD11b, loque parece indicar un aumento en la diferenciación de las células. Estos datosimplicarían a los TLR2 y TLR4 en los procesos de proliferación y diferenciacióncelular en las células Lin� Sca-1+ CD45� de la retina de ratón adulto.

4.5. OBTENCIÓN DE UNA LÍNEA CELULAR A PAR-TIR DE CÉLULAS PROGENITORAS DE RETI-NA ADULTA

Las líneas celulares inmortales, proporcionan una herramienta muy útil parael estudio de procesos básicos celulares. Se obtienen habitualmente mediante lasobreexpresión de oncogenes exógenos introducidos en las células nativas o bienmediante inmortalización espontánea. La inmortalización de las células alteralas características innatas de las células e incrementa el riesgo de formación detumores cuando se utilizan para transplantes in vivo.

Hasta la fecha se han obtenido varias líneas celulares inmortalizadas a partirde células de la retina, procedentes de las células de Müller (Giannelli et al.,2011; Limb et al., 2002; Otteson and Phillips, 2010; Sarthy et al., 1998; Tomiet al., 2003), de células ganglionares (Krishnamoorthy et al., 2001), de fotorre-ceptores (Al-Ubaidi et al., 1992; Seigel, 1996), de células endoteliales (Hosoyaet al., 2001; Su et al., 2003), de pericitos (Kondo et al., 2003) y de astrocitos(Scheef et al., 2005).

Debido al interés que suponen las líneas celulares que hemos comentado,decidimos intentar obtener una línea celular estable a partir de células de retina,que nos sirviera como modelo de estudio de los mecanismos celulares básicosen la retina y que pudiera servir también como modelo en estudios de neuroto-

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RESULTADOS

xicidad y neuroprotección. En etapas posteriores se podrá evaluar también suutilidad en estudios de neurorregeneración. Para ello decidimos seguir el mé-todo descrito inicialmente por Hicks y Courtois (Hicks and Courtois, 1990) ymodificado por Florian (Florian et al., 2008) para la obtención de lineas celu-lares inmortalizadas espontaneamente a partir de cultivos de células de Müller.Decidimos realizar los cultivos a partir de retinas de animales adultos paracomprobar su potencial en procesos de neuroregeneración, puesto que hasta lafecha sólo se han realizado estudios con animales en edad perinatal. Siguiendoel método descrito, y partiendo de las retinas de cuatro ratones C57BL/6J de8 semanas de edad, se obtuvo una línea celular inmortalizada de forma espon-tánea. Nombramos esta línea celular como MU-PH1 ya que proceden de uncultivo de células de Müller (MU) y expresan marcadores de fotorreceptores(PH). Bajo condiciones de cultivo in vitro, estas células han demostrado te-ner una morfología elongada, similar a las células gliales (Fig. 4.15). Hasta lafecha, las células han sido objeto de más de 80 pases y se han congelado ydescongelado varias veces sin perder sus características morfológicas.

Figura 4.15: Imagen de la línea celular MU-PH1 en condiciones estándar de cultivoin vitro. Se muestra la imagen obtenida mediante microscopio óptico, con 10 aumentos.La barra de escala representa 50 mm.

4.6. CARACTERIZACIÓN DE LA LÍNEA CELULARMU-PH1

A continuación pasamos a caracterizar la línea celular obtenida, su genotipoy fenotipo.

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RESULTADOS

4.6.1. Estudio de la pérdida de diferenciación: formación de neu-roesferas

Se ha descrito que las células de Müller de mamíferos poseen propiedadesde células progenitoras de la retina y generan nuevas neuronas después de unalesión (Bringmann et al., 2009; Fischer and Bongini, 2010; Fischer and Reh,2001; Kohno et al., 2006; Wohl et al., 2009). Como está bien descrito, lascélulas de Müller murinas, bajo condiciones in vitro son capaces de volversea diferenciar a distintos tipos celulares bajo los estímulos adecuados (Florianet al., 2008; Hicks and Courtois, 1990). Para estudiar su capacidad de desdi-ferenciación, las células se transfirieron a medio sin suero fetal bovino (SRM)y con factor de crecimiento EGF. Tras varios días en cultivo en estas condicio-nes se formaron neuroesferas, con características similares a las descritas en labibliografía (Florian et al., 2008; Hicks and Courtois, 1990). Las neuroesferasaparecieron a partir del quinto día de cultivo y permanecieron durante variassemanas, incrementándose su tamaño y su número (Fig. 4.16).

Figura 4.16: Imagen de neuroesferas formadas por las células de la línea celularMU-PH1 tras 10 días de cultivo en SRM suplementado con 30ng/mL de EGF. Imagenobtenida mediante microscopio óptico con 10 aumentos. Ampliación de una neuroesferaobservada por microscopio óptico. La barra de escala representa 50 mm.

Al cultivar las células en las mismas condiciones anteriores y sobre sustratode laminina/ornitina algunas células se diferenciaron en células con morfologíasimilar a la de las neuronas, como también se había descrito previamente porotros autores (Florian et al., 2008) (Fig 4.17).

Estos resultados confirman que la línea celular MU-PH1 tiene característi-cas de células progenitoras, con capacidad de desdiferenciación y de posteriordiferenciación hacia células de morfología neuronal.

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RESULTADOS

Figura 4.17: Imagen de células de morfología neuronal formadas por las células dela línea celular MU-PH1 in vitro en condiciones de SRM. Las flechas señalan ramifica-ciones con aspecto de neuritas. Imagen obtenida mediante microscopio óptico con 10aumentos. La barra de escala representa 50 mm.

4.6.2. Estudio de la expresión de marcadores celulares y proteí-nas relacionadas con la visión

Para caracterizar la línea celular MU-PH1, estudiamos la expresión de di-versos marcadores celulares, tanto a nivel de expresión de ARNm (medianteRT-PCR), como de proteínas (utilizando las técnicas de Western blot e inmu-nofluorescencia).

4.6.2.1. Estudio de la expresión de marcadores celulares mediante RT-PCR

Los análisis por RT-PCR mostraron que las células MU-PH1 expresanARNm que codifica para los marcadores de células gliales: vimentina, S-100y glutamina sintetasa, si bien no expresan CRALBP, otro marcador de célulasde Müller. Esto puede deberse a la adaptación a las condiciones de cultivo,como se ha descrito por otros grupos para este y otros marcadores (Guidry,1996; Hauck et al., 2003) (Fig. 4.18). Comprobamos también que las célulasde la línea MU-PH1 expresan marcadores de células madre neurales, incluyendonestina, Abcg2, a-tubulina , b-III-tubulina y Ascl1 , mientras que no se observóexpresión de Notch1 (Fig. 4.18). Por otra parte, no se detectó la expresión demarcadores correspondientes a otros tipos celulares, como astrocitos (GFAP),células bipolares (CHX10), células amacrinas (Pax6) o endotelio (CD35), porlo que descartamos su presencia a modo de contaminante en el cultivo (Fig.4.18). Se descartó también la posibilidad de contaminación con EPR puestoque no se detectaron células pigmentadas desde el primer pase del cultivo.

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RESULTADOS

Figura 4.18: Amplificación por RT-PCR a partir de ADNc de la línea celular MU-PH1,utilizando oligonucleótidos específicos anti-vimentina, anti-nestina, anti-a-tubulina, anti-b-III-tubulina, anti-Abcg2, anti-Ascl1, anti-glutamina sintetasa (GS) y anti-S-100; seutilizó como control positivo ADNc de retina de ratón adulto C57BL/6J. Se incluyó uncontrol negativo sin ADNc en cada amplificación (R: retina, M: línea celular MU-PH1,C: control negativo).

4.6.2.2. Estudio de la expresión de marcadores celulares mediante Wes-tern blot

El análisis mediante Western blot confirmó la expresión de los marcado-res vimentina, nestina, b-III-tubulina y Abcg2. Se descartó la expresión deCRALBP. Como control positivo se utilizó la expresión de GAPDH (Fig. 4.19).

Figura 4.19: Estudio de la expresión proteica mediante Western blot en la línea MU-PH1 utilizando anticuerpos específicos para vimentina, nestina, b-III-tubulina, Abcg2,CRALBP y GAPDH.

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RESULTADOS

4.6.2.3. Estudio de la expresión de marcadores celulares mediante in-munofluorescencia

Figura 4.20: Expresión de marcadores de células madre y neuronales por la línea celu-lar MU-PH1. Se muestra la señal obtenida por inmunofluorescencia de células MU-PH1teñidas con anticuerpos específicos para vimentina (A), nestina (B), b-III tubulina (C),y Abcg2 (D). Los insertos en C y D muestran los controles negativos sin anticuerpoprimario. Se muestran imágenes a gran aumento obtenidas en el microscopio confocalde células MU-PH1 teñidas con anticuerpos frente a vimentina (E), nestina (F) y b-III-tubulina (G), donde los microtúbulos y los filamentos intermedios se pueden observaren detalle. Las barras de escala representan, 50 mm en A, B, C, D y 20 mm en E, F, G.

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RESULTADOS

Mediante inmunofluorescencia se confirmó la expresión de vimentina (Fig.4.20 A), nestina (Fig. 4.21 B), b-III-tubulina (Fig. 4.20 C) y Abcg2 (Fig. 4.20D). Los anticuerpos frente a la vimentina, proteína formadora de los filamentosintermedios de la célula, tiñe la red típica de filamentos que se extiende a travésde todo el citoplasma (Fig. 4.20 E).

Como en el caso de la vimentina, las imágenes de alta resolución de lascélulas inmunomarcadas con anticuerpos frente a nestina y b-III-tubulina reve-laron la red característica de filamentos y microtúbulos en todo el citoplasma,sobre todo en la zona perinuclear (Fig. 4.20 F, G).

El análisis mediante inmunofluorescencia de la línea celular MU-PH1 tam-bién mostró la expresión de los marcadores de fotorreceptores: opsinas ro-jo/verde (Fig. 4.21 A) y azul (Fig. 4.21 B), ambos fotopigmentos específicosde conos y transducina (Fig. 4.21 C) proteína fundamental para la transducciónpresente en conos y bastones. Como era de esperar, los controles que carecíande anticuerpo primario, secundario o ambos anticuerpos, no dieron un marcajedetectable (Fig. 4.21 D,E,F).

Figura 4.21: Estudio de la expresión de opsinas por la línea celular MU-PH1. Imágenesde las células MU-PH1 cultivadas bajo condiciones in vitro estándar, marcadas conanticuerpos frente a la opsina rojo/verde (A), a la opsina azul (B), a la transducina(C) y observadas mediante microscopio confocal. Controles negativos que carecen deanticuerpos primarios (D, E, F). Las barras de escala representan 50 mm.

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RESULTADOS

4.6.3. Estudio de la expresión de otras proteínas no relacionadoscon la visión

Resulta imprescindible para realizar una buena caracterización de la líneacelular MU-PH1, el estudio de otros marcadores celulares que permitan co-nocer lo máximo posible las características de las células, lo que permitiráevaluar mejor su potencial utilidad en estudios posteriores de neurotoxicidad,neurorregeneración o neurorreparación.

4.6.3.1. Expresión de receptores de melatonina

Se ha descrito que las células madre neurales expresan receptores fun-cionales de melatonina MT1 y que estos receptores MT1 se colocalizan conmarcadores neurales y gliales (Niles et al., 2004).

La detección de los receptores de la melatonina en células madre/progenitorasneurales sugiere la participación de esta hormona pleiotrópica en el desarrolloneurológico de los mamíferos. Por otra parte, diversos estudios demuestran lacapacidad de la melatonina para inducir la expresión de factores neurotróficos,lo que apoya un papel funcional sobre todo para el receptor MT1 (Niles et al.,2004).

Se analizó la expresión de los receptores MT1 y MT2 por técnicas de in-munofluorescencia en la nueva línea celular MU-PH1.

Los resultados demostraron que las células MU-PH1 también expresan es-tos receptores (Fig. 4.22). Como se puede observar en la figura 4.22, las célulasmarcadas con el anticuerpo anti-MT1, muestran una alta inmunoreactividaden áreas específicas de la superficie celular, con una fluorescencia muy inten-sa y localizada. En cambio, las células marcadas con el anticuerpo anti-MT2muestran una fluorescencia menos intensa y repartida uniformemente por todala célula.

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RESULTADOS

Figura 4.22: Expresión de los receptores de melatonina MT1 y MT2 por las célulasMU-PH1. Las imágenes fueron obtenidas por immunoflouorescencia en un microscopioconfocal. (A) Las células MU-PH1 marcadas con un anticuerpo policlonal anti-receptorde melatonina MT1, muestran alta inmunoreactividad en áreas específicas de la super-ficie celular (flechas). (B) En las células MUPH1 marcadas con anticuerpos policlonalesanti-receptor de melatonina MT2, la inmunofluorescencia aparece distribuida uniforme-mente a lo largo de la célula. (C) Fotografía de alta resolución de una célula marcadacon el anticuerpo anti-MT1 (D) Fotografía de alta resolución de una célula marcadacon el anticuerpo anti MT2. (E) Tinción de los receptores MT1 en verde. (F) Dobletinción de los receptores MT1 en verde y nestina en rojo. (G) Control negativo sinanticuerpos primarios. Las barras de escala representan 50 mm (A, B, E, F, G) y 20mm (C, D).

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RESULTADOS

4.6.3.2. Expresión de canales de sodio dependientes de voltaje

Se ha descrito que los canales de Na+ dependientes de voltaje tienen unagran relevancia en la retina. Estan implicados en muchos procesos de la visión yestán presentes en las neuronas de la retina. Diversos estudios han demostradocómo influyen estos canales en el desarrollo y funcionamiento de la visión. Así,se ha demostrado que las células bipolares tienen un papel fundamental paracodificar la luz (Saszik and DeVries, 2012), que mutaciones en el canal Nav1.6 provocan defectos graves en la visión escotópica (Smith and Côté, 2012), oque en las células amacrinas la modulación de la señal depende de los canalesde Na+ (Tian et al., 2010; Trenholm et al., 2012).

Se han identificado nueve isoformas de canales de Na+ en mamíferos (Ertelet al., 2000; Goldin et al., 2000). En nuestro trabajo decidimos seleccionar losreceptores de subtipo Nav1.1, Nav1.2 y Nav1.6, por tener a priori una mayorrelación con el proceso de visión (Duflocq et al., 2008; Waxman, 2006). Porello, realizamos un estudio de la expresión de dichos canales en cultivos decélulas MU-PH1 mediante RT-PCR.

Tal y como observamos en la figura 4.23 las células MU-PH1 expresanARNm de los receptores Nav1.1, Nav1.2 y Nav1.6.

Figura 4.23: Amplificación por RT-PCR utilizando oligonucleótidos específicos paraNav1.1 (1.1), Nav1.2 (1.2) y Nav1.6 (1.6). Como control positivo se utilizó la amplia-ción específica de b-actina (b). Expresión obtenida apartir de extractos de retina deratón adultos C57BL/6J (RETINA) y de la línea celular (MU-PH1).

A continuación pasamos a estudiar la posible funcionalidad de los canalesde Na+dependientes de voltaje en la línea MU-PH1, estudiando el efecto de laveratridina. Estudiamos la posible toxicidad de dosis crecientes de veratridina(inhibidor de los canales de Na+), incubada durante 22 horas, en presenciade medio sin SBF. Como control comparamos con el daño producido por unamezcla de oligomicina/rotenona que produce muerte celular por estrés oxida-tivo.

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RESULTADOS

En la figura 4.24 se muestra la curva dosis respuesta de veratridina, en laque se observa que sólo se produce muerte celular, medida por XTT, a dosismuy altas de veratridina. Previamente se comprobó que el DMSO utilizadocomo disolvente no produjo daño en las células.

Figura 4.24: Curva dosis-efecto de la veratridina en la línea celular MU-PH1. Sepresentan los datos de las medias más la desviación estándar de tres experimentos in-dependientes.

A continuación estudiamos el efecto conjunto de veratridina y ouabaina.Como podemos observar en la figura 4.25, la incubación de ambas toxinastampoco produjo un efecto marcado de muerte celular.

Figura 4.25: Efecto de la incubación de la línea celular MU-PH1 en presencia deveratridina y ouabaina. Se muestran determinaciones de viabilidad medida mendianteel ensayo de XTT. Se presentan los datos de las medias más la desviación estándar detres experimentos independientes.

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RESULTADOS

Así pues, los resultados obtenidos permiten demostrar la expresión de ca-nales de Na+ dependientes de voltaje en la línea celular MU-PH1 pero no lafuncionalidad de los mismos. A pesar de ello, no podemos descartar que in vivoestos canales sean funcionales en células con características similares a la deesta línea celular.

4.6.4. Estudio de la sensibilidad a la luzDado que las células MU-PH1 expresan marcadores de células fotosensi-

bles, decidimos estudiar su funcionalidad mediante la respuesta de las célulasa estímulos luminosos.

Para estudiar la presencia de opsinas funcionales en cultivos de células MU-PH1, determinamos los niveles de Ca2+ libre intracelular en respuesta a la luz,utilizando el colorante Fluo-4 AM sensible al Ca2+.

Figura 4.26: Se muestran las respuestas a la luz de células MU-PH1 en cultivo. Lastrayectorias de las líneas representan cambios de fluorescencia en relación con el tiempo(DF/FO) de células MU-PH1 marcadas con el colorante sensible al calcio Fluo-4. Loscambios de fluorescencia reflejan los incrementos de calcio libre intracelular medido enlas células al ser expuestas a la luz de 480 nm, durante el tiempo de 10 minutos. Cadatrazo corresponde a la respuesta de una sola célula.

Como se muestra en la figura 4.26, la estimulación de las células con luzde 480 nm en estímulos de 10 minutos de duración, produjo respuestas tran-sitorias, con aumentos rápidos y lentos de Ca2+, en la mayoría de las células

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RESULTADOS

analizadas. Durante la estimulación con luz, la mayoría de las células sensiblesmostraron un aumento progresivo del Ca2+ libre intracelular, que llegó al máxi-mo entre los 2-4 minutos después del inicio del estímulo, y se mantuvo elevadodurante los 10 minutos de estímulo. Además de estos movimientos transitorioslentos de Ca2+, varias células fotosensibles mostraron también movimientostransitorios rápidos de Ca2+ que, en algunos casos, se repitieron periódicamen-te cada 1-2 minutos.

Estos resultados coinciden con los observados en estudios realizados porotros autores, utilizando los mismos estímulos luminosos, en diferentes tiposde células (Hollborn et al., 2011; Nieto et al., 2011). Por lo tanto, estas célulasMU-PH1 demuestran tener opsinas funcionales

4.7. EXPRESIÓN Y FUNCIONALIDAD DE RECEP-TORES TIPO TOLL EN LA LÍNEA CELULARMU-PH1

Diversos estudios han descrito la expresión de los TLRs en células glialeso progenitoras, y se han relacionado con funciones relevantes aparte de lasbien conocidas en la respuesta inmunitaria. Así los TLR4 se han descrito comoreguladores negativos de la proliferación de células progenitoras de la retina(Shechter et al., 2008) o inhibidores de la proliferación de células progenitorasen el hipocampo (Rolls et al., 2007). Por otra parte, TLR2 se ha relacionadocon la diferenciación in vitro de células neurales progenitoras (Rolls et al., 2007)y con la proliferación de células madre hematopoyéticas (Megías et al., 2012;Yáñez et al., 2010). Dado que en la retina se ha confirmado la expresión deTLRs en células ganglionares, fotorreceptores, RPCs, glía: astroglía, microglíay Müller (Brito et al., 2004; Jiang et al., 2009; Kumar et al., 2004; Langmann,2007; Okun et al., 2011; Shamsuddin and Kumar, 2011; Shechter et al., 2008),decidimos comprobar su expresión en la línea celular MU-PH1.

4.7.1. Estudio de la expresión de receptores tipo Toll en la líneacelular MU-PH1

El estudio de la expresión de TLRs en la línea MU-PH1 se realizó medianteRT-PCR y citometría de flujo. La amplificación por RT-PCR mostró la expre-sión de TLR1, 2, 4 y 6 (Figura 4.27 A). Se decidió estudiar la expresión delreceptor TLR2 en la superficie celular mediante citometría de flujo dado que

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RESULTADOS

TLR2 es el receptor que mayor expresión muestra y tiene relación con los pro-cesos de proliferación y diferenciación celular (Figura 4.27 B). Como se pudocomprobar, las células MU-PH1 expresan el receptor TLR2 en su superficie.

Figura 4.27: Expresión de TLRs en la línea celular MU-PH1. (A) Amplificación porRT-PCR de los TLRs 1, 2, 4 y 6 a partir de cDNA de MU-PH1. (B) Confirmación de laexpresión de TLR2 por citometría de flujo utilizando anticuerpos anti-TLR2; Tambiénse muestra la señal del isotipo control para este anticuerpo.

4.7.2. Estudio de la funcionalidad de receptores tipo Toll en lalínea celular MU-PH1

4.7.2.1. Estudio del aumento de la expresión de TLRs en respuesta ala activación por MAMPs

Es bien sabido que los TLRs reconocen patrones moleculares conservados depatógenos microbianos e inducen la activación de la respuesta inmunitaria in-nata, así como la posterior respuesta inmunitaria adaptativa. El receptor TLR2,que forma el heterodímero TLR2/TLR6, está implicado en la señalización in-ducida por C. albicans y una activación del mismo induce su sobreexpresiónen diversos tipos celulares (Yáñez et al., 2009). En consecuencia, decidimoscomprobar si C. albicans es capaz de inducir la sobreexpresión de los TLRs delas células MU-PH1. Para ello coincubamos las células MU-PH1 con la cepaC. albicans ATCC 26555, tanto inactivada por calor (Fig. 4.28 A,B) como ensu forma viable (Fig. 4.28 C,D) y analizamos la expresión de los genes TLR2y TLR6 mediante RT-PCR semicuantitativa.

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RESULTADOS

Figura 4.28: (A) Imagen de células MU-PH1 (M) coincubadas con células de le-vadura C. albicans ATCC 26555 (Ca) inactivadas por calor. La escala representa 20mm. (B) Análisis mediante RT-PCR semicuantitativa de la expresión de TLR2 y TLR6a partir de ARNm de células MU-PH1, después de 24 horas de incubación conjuntacon células de levadura C. albicans ATCC 26555 inactivadas por calor. Se muestranlos valores normalizados respecto a la expresión de b-actina. (C) Imagen de célulasMU-PH1 (M) coincubadas durante 4 horas con células de levadura C. albicans ATCC26555 (Ca) viables; En estas condiciones experimentales C. albicans desarrolla tubosgerminales y abundantes hifas verdaderas. La escala representa 20 mm. (D) Análisismediante RT-PCR semicuantitativa de la expresión de ARNm de TLR2 y TLR6 encélulas MU-PH1 después de 4 horas de incubación conjunta con células de levadura C.albicans ATCC 26555 viables. Proporción 5:1, levaduras:células murinas. Se muestranlos valores normalizados respecto a la expresión de b-actina. Los datos correspondena los valores promedios de dos experimentos independientes, cada uno de ellos conmedidas cuadruplicadas para cada valor analizado.

En ambos casos se produjo un aumento de los niveles de expresión de TLR2y TLR6 como se observa en las figuras 4.29 B y D. Estos resultados sugierenque los TLR2 de las células MU-PH1 son funcionales.

4.7.2.2. Estudio del efecto de la estimulación de los TLRs de las célulasMU-PH1 sobre la proliferación celular

Para estudiar la posible implicación de TLR2 en procesos de proliferación enlas células MU-PH1.

Analizamos en primer lugar la influencia de la activación de TLR2 en el desa-rrollo de neuroesferas en un cultivo de células MU-PH1, incubando las célulasen SRM suplementado en EFG y en presencia de Pam3CSK4 o de células delevadura de C. albicans ATCC 26555 inactivadas por calor. Como pudimos com-

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RESULTADOS

probar, la presencia de ligandos de TLRs causó un aumento estadísticamentesignificativo en la formación de neuroesferas en ambos casos (Fig. 4.29).

Figura 4.29: Formación de neuroesferas a partir de células MU-PH1 en cultivo, incu-badas en SRM, con EGF (30 ng/mL) y en presencia de ligando de TLR2 Pam3CSK4(0,125mg/mL) o C. albicans. (A) Imagen de las neuroesferas tras dos semanas en cultivo enpresencia de C. albicans (flechas). (B) Histograma que muestra el número de neuroes-feras formadas en presencia de los estímulos Pam3CSK4(0,125 mg/mL) y C. albicans.El recuento de neuroesferas se realizó en tres experimentos independientes, en placasde 6 pocillos, contando un mínimo de dos pocillos para cada condición experimental.(C) Imágenes de las neuroesferas formadas sin estímulos (control) y en presencia dePam3CSK4(0,125 mg/mL) tras cuatro y veinticinco días en cultivo. Proporción 5:1,levaduras:células murinas. Se muestran campos representativos de cada condición. (*=P.68 p<0,05, considerado significativo en el análisis de t-student). La barra de escalarepresenta 100 mm.

A continuación estudiamos si la proliferación celular de las células MU-PH1aumentaba como consecuencia de la activación de los TLRs por medio de li-

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RESULTADOS

gandos y estímulos de estos receptores. La proliferación se estimó valorandoel número de células viables mediante el ensayo de XTT. Los resultados semuestran en la figura 4.30, en la que podemos observar el aumento de la pro-liferación con respecto al control cuando la línea celular se incubó en presenciade Pam3CSK4 y de C. albicans. En cambio, no se observó un aumento de lapoblación celular tras incubar en presencia de LPS.

Figura 4.30: Histograma que muestra la proliferación celular células MU-PH1 en au-sencia (control) y presencia de los estímulos LPS (1 mg/mL), Pam3CSK4(0,125 mg/mL)y C. albicans inactivadas por calor. Proporción 5:1, levaduras:células murinas. Los da-tos, obtenidos a partir de los valores de viabilidad celular medidos mediante el ensayode XTT, se muestran normalizados respecto al control. Se muestran las medias y lasdesviación estándar de tres experimentos independientes.

Este hallazgo indica que TLR2 puede estar implicado en el proceso de proli-feración en células progenitoras de la retina y coincide con resultados previos deotros autores y de nuestro grupo sobre la participación de TLR2 en el controlde los procesos de proliferación de células madre (Megías et al., 2012; Yáñezet al., 2013). Este efecto proliferativo se opone a la función restrictiva de TLR4descrita para la proliferación de la retina, lo que sugiere que los TLRs puedenmodular las respuestas en este proceso.

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RESULTADOS

4.7.2.3. Estudio del efecto de la estimulación de los TLRs en las célulasMU-PH1 sobre la diferenciación celular

Dada la relación de los TLR2 con la proliferación de las células progenitoras,podemos pensar que en situaciones patológicas oculares en las que aparecenprocesos proliferativos, como en el caso de la neovascularización, las célulasprogenitoras presentes en la retina podrían contribuir en el desarrollo de esteproceso, quizás mediante la activación de TLRs. La neovascularización garan-tiza la perfusión sanguínea en zonas dañadas, pero también es responsable depérdidas irreversibles de la visión, como las que se producen en la DegeneraciónMacular Asociada a la Edad de tipo exudativo.

A continuación nos preguntamos si los TLRs podrían participar en fenóme-nos de diferenciación celular. Así, cabe pensar que, en caso de que participen enel proceso de neovascularización, quizá podrían diferenciarse a células de tipoendotelial. Para explorar esta posibilidad, tras mantener las células en cultivodurante 28 días en las condiciones ensayadas de desdiferenciación y produc-ción de neuroesferas y en presencia de levaduras de C. albicans inactivadaspor calor como estímulo de TLRs, purificamos ARNm y analizamos medianteRT-PCR la expresión de CD31, marcador de células endoteliales. Mediante estemétodo no detectamos un aumento de la expresión de esta proteína (resulta-dos no mostrados), por lo que no podemos proponer una relación directa conla neovascularización. En cualquier caso, dadas las características de nuestroestudio in vitro, no tenemos datos suficientes para descartar esta posibilidad,puesto que pueden ser necesarios otros factores o circunstancias presentes enlas condiciones in vivo, que no hayamos reproducido en nuestros estudios.

4.7.2.4. Producción de citocinas: implicación de los TLRs de las célulasMU-PH1 en la respuesta inmunitaria

El papel principal reconocido de los TLRs es su implicación en la respuestainmunitaria, en el reconocimiento de patógenos y la producción de citocinascomo respuesta a la presencia de los mismos. TLR2 juega un papel clave enla respuesta inmunitaria innata a patógenos mediada a través de la producciónde citocinas proinflamatorias como el factor de necrosis tumoral (TNF-a). ElTNF-a es una citocina clave producida en abundancia por varias células del sis-tema inmunitario que reconocen ligandos microbianos por los receptores TLRs.

Para probar si la estimulación de los TLRs es capaz de inducir la secreciónde TNF-a en células MUPH1, se coincubaron cultivos de células MU-PH1 con

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RESULTADOS

células de C. albicans inactivadas por calor (levadura e hifa) y con Pam3CSK4,ligando puro de TLR2.

Figura 4.31: Medida de la secreción de TNF-a por la células MU-PH1 tras su incu-bación con Pam3CSK4(0,125 mg/mL), LPS (1 mg/mL), C. albicans y zymosan en lostiempos que se indican. Proporción 5:1, levaduras:células murinas. Se muestra la mediade dos experimentos independientes en los que cada condición se ensayó por duplicado.

Para evaluar la posible participación de otros TLRs se añadió también LPS,ligando puro de TLR4. Se ensayaron diferentes períodos de tiempo, de 1 a 7días. Se probó también el efecto de partículas del glucano zymosan, que tam-bién se une a los TLR2. Se midió la secreción de TNF-a al medio de cultivomediante ELISA ("Enzyme-Linked InmunoSorbent Assay").

No se observaron cambios morfológicos en las células cultivadas en ninguna delas condiciones ensayadas. La estimulación con C. albicans, Pam3CSK4, LPS ozymosan no provocó cambios morfológicos en células cultivadas ni la secreciónde TNF-a en las distintas condiciones utilizadas. Este resultado indica que, ennuestras condiciones in vitro, los TLRs no median la producción de TNF-a encélulas MU-PH1. Es posible que esto se deba a a la falta de expresión de la

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señal completa de la vía de transducción de TLR2 en condiciones in vitro, porlo que con estos resultados, no es posible descartar un papel de TLR2 en laproducción de citocinas in vivo (Fig. 4.31).

4.8. UTILIZACIÓN DE LA LÍNEA CELULAR MU-PH1 COMO MODELO DE CRIBADO DE COM-PUESTOS NEUROPROTECTORES

Una de las ventajas que ofrece trabajar con una línea celular de retina esla posibilidad de servir como modelo para el estudio de nuevas sustancias, per-mitiendo valorar los posibles efectos nocivos de dichas sustancias, así como supotencial neuroprotector y su posible aplicación en el tratamiento de patologíasde la retina.

4.8.1. Estudio de la sensibilidad de la línea MU-PH1 a distintosestímulos nocivos

Para valorar la utilidad de la línea celular como modelo de cribado, analiza-mos en primer lugar la sensibilidad de las células MU-PH1 a diversos estímulosnocivos reconocidos. Cuantificamos la viabilidad celular tras el periodo de es-tímulo mediante el método de XTT.

Figura 4.32: Curva dosis-respuesta de la administración conjunta de oligomicina (de0,3 mM a 10 mM) y rotenona (de 1 mM a 30 mM) a las dosis indicadas y durante 24horas en la línea celular MU-PH1, analizada mediante el ensayo de XTT. Se muestranlos valores normalizados respecto al control. Los datos corresponden al valor de lamedia y la desviación estándar de cinco experimentos independientes, en los que cadacondición se ensayó por cuadruplicado.

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RESULTADOS

Como estímulo nocivo seleccionamos en primer lugar una combinación deoligomicina y rotenona, que producen la muerte celular mediante estrés oxi-dativo. Como se observa en la figura 4.32, concentraciones crecientes de oli-gomicina y rotenona produjeron un daño progresivamente mayor. Las célulastambién se mostraron sensibles al agente apoptótico nitroprusiato sódico (Fig.4.33 A).

4.8.2. Estudio del efecto neuroprotector de sustancias antioxi-dantes en la línea MU-PH1

A continuación ensayamos el efecto de diversas sustancias de conocidoefecto antiapoptótico (TUDCA y ácido valproico) o antioxidante (vitamina E,melatonina y N-acetilcisteína) sobre las células MU-PH1 sometidas a un dañoproducido por nitroprusiato sódico (0,3 mM) (Fig. 4.33 A) o bien oligomicina(3 mM)/rotenona (10 mM) (Fig. 4.33 B), como se ha indicado anteriormente.

Los estímulos se mantuvieron durante 24 horas en la línea celular MU-PH1con las siguientes concentraciones: nitroprusiato sódico (0,3 mM) y oligomici-na (3 mM)/rotenona (10 mM). Las sustancias antioxidantes se utilizaron pararevertir el efecto fueron: vitamina E: 200 mM, N-acetilcisteína: 2 mM, mela-tonina: 1 mM, TUDCA: 500 mM y ácido valproico: 1 mM. A las 24 horas serealizó la medida de la viabilidad celular mediante el ensayo de XTT.

Como pudimos comprobar, al tratar las células con nitroprusiato sódico 0,3mM, la viabilidad celular disminuyó hasta un 64 % del valor control. Tanto laN-acetilcisteína como la vitamina E revirtieron parcialmente el daño produ-cido, consiguiendo una viabilidad del 87 % y del 70 % respectivamente a lasconcentraciones ensayadas. Con el resto de sustancias no se consiguió revertirel efecto lesivo.

En cambio el TUDCA sí consiguió revertir completamente el daño produ-cido por la combinación de oligomicina y rotenona en las condiciones ensayadas.

Los resultados muestran que la línea celular MU-PH1 puede ser utilizadacomo modelo de estudio para el cribado de sustancias con propiedades anti-oxidantes y neuroprotectoras y así ser de utilidad en el desarrollo de nuevosfármacos para el tratamiento de patologías de la retina.

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RESULTADOS

Figura 4.33: Estudio del efecto neuroprotector de sustancias antioxidantes frente a elefecto nocivo de (A) nitroprusiato sódico (0,3 mM) y (B) oligomicina (3 mM)/rotenona(10 mM), analizado en la línea celular MU-PH1. Las concentraciones utilizadas fueronvitamina E: 200 mM, N-acetilcisteína: 2 mM, melatonina: 1 mM, TUDCA: 500 mM yácido valproico: 1 mM. Los estímulos se mantuvieron durante 24 horas previamente ala medida de la viabilidad celular. Se muestran los valores promedios y la desviaciónestándar de medidas realizadas por cuadruplicado para cada condición.SALTO DE PAGINA

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Capítulo 5

DISCUSIÓN

La degeneración de la retina es una causa común de ceguera. Frecuente-mente esta se debe a la degeneración de los fotorreceptores, que ocasiona unapérdida de respuesta a la luz y, en consecuencia, una pérdida de visión. Lasenfermedades degenerativas de la retina en humanos son actualmente incura-bles, ya que una vez iniciado el proceso de degeneración es irreversible. Lostratamientos experimentales encaminados a reemplazar las células de la retinaperdidas o restaurar la visión no son todavía efectivos. Para ello, sería necesariorescatar a los fotorreceptores de la muerte o introducir componentes fotosensi-bles alternativos en el ojo. En este sentido se están haciendo grandes esfuerzospara desarrollar terapias celulares que intentan sustituir los fotorreceptores enlos pacientes.

En la actualidad, los posibles enfoques terapéuticos dirigidos a la búsquedade una cura para enfermedades degenerativas de la retina se centran en tresgrandes líneas de acción. En primer lugar se encuentra el uso de estrategiasde prevención que tratan de contrarrestar los mecanismos subyacentes de laenfermedad, ya sea mediante la manipulación celular a través de la utilizaciónde compuestos farmacológicos o mediante modificación genética por silencia-miento y/o sustitución de genes. El segundo enfoque no se refiere tanto a lacausa de la enfermedad sino a la prevención de la muerte celular, con la ad-ministración de compuestos antioxidantes, antiapoptóticos, antiinflamatoriosy factores neurotróficos. El tercer enfoque se centra en la regeneración de laretina, a través de la sustitución de los fotorreceptores dañados por célulasmadre o tipos celulares diferenciados (Cuenca et al., 2014). En este sentido,la reparación de la retina por reemplazo de células se intenta bien medianteel trasplante de células madre/progenitoras (Cuenca et al., 2014) bien me-

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DISCUSIÓN

diante el reclutamiento de poblaciones de progenitores endógenos que residenen tejidos de mamífero adulto. La identificación y caracterización de estas cé-lulas progenitoras endógenas de la retina es un área de investigación activa,no sólo en roedores, sino también en primates, incluidos los seres humanos(Singh and MacLaren, 2011; Wohl et al., 2012). El éxito de la sustitución delos fotorreceptores depende de la supervivencia de las células trasplantadas enla retina, por lo que resulta importante la prevención del rechazo de tejidos.Otra cuestión importante es la facilidad de su obtención y el coste del proceso.

La necesidad clínica de terapias para la regeneración de la retina ha ac-tivado la búsqueda de células renovables para reemplazar los fotorreceptoresperdidos en pacientes con procesos de degeneración retiniana (Singh and Ma-cLaren, 2011). Como se ha descrito, los peces y anfibios regeneran neuronasretinianas durante toda la vida. La neurogénesis de la retina en mamíferos,en cambio, termina en el periodo postnatal temprano. No obstante, aunquela proliferación de células progenitoras y la diferenciación neuronal ya no sonevidentes, persiste un pequeño número de células madre y progenitoras en laretina de mamíferos adultos. Los estudios actuales muestran evidencias cre-cientes de que el potencial neurogénico podría estar conservado, lo que abrela posibilidad a una terapia basada en células regeneradoras para restaurar lafunción visual.

Tal y como hemos visto, existen progenitores neuronales identificados enlas diferentes regiones del ojo de ratón adulto y estos pueden provenir de va-rias fuentes, como las células de Müller, el RPE o el cuerpo ciliar. Las célulasgliales de Müller se perfilan como una fuente de células madre endógenas parareemplazar los fotorreceptores perdidos. Su capacidad para desdiferenciarse yvolverse a diferenciar después a células con fenotipo neuronal representa unaestrategia terapéutica prometedora, ya que este tipo de células diferenciadaspueden obtenerse de muchas fuentes, tales como líneas celulares humanas in-mortalizadas, así como por medio de cirugía de membranas epirretinianas deojos de pacientes con patologías oculares (Reichenbach and Bringmann, 2013).Se ha descrito la proliferación y migración de estas células transdiferenciadasdespués de lesiones inducidas por láser o por toxicidad con glutamato, aunquela diferenciación a nuevas neuronas de la retina todavía no se ha conseguidocon éxito (Reyes-Aguirre et al., 2013).

Aunque existe bastante trabajo publicado al respecto, todavía es necesarioconocer mejor este proceso para dilucidar los mecanismos moleculares exactos

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DISCUSIÓN

requeridos para obtener progenitores neuronales a partir de células de Müller.Además de estas células, varios estudios realizados en anfibios y pollos señalanal RPE como una posible fuente de células regeneradoras. Diversos autores handemostrado que el RPE está formado por una población celular no homogé-nea, con subpoblaciones que retienen potencial proliferativo, con una capacidadinusual de transdiferenciarse en diversos tipos de células para producir una nue-va retina (Fuhrmann et al., 2014; MachaliÒska et al., 2013). Por otra parte,hay que tener en cuenta que las células madre mesenquimales también pue-den suponer una buena fuente de células progenitoras para la terapia celular.Hoy en día la médula ósea sigue siendo la fuente principal de células madremesenquimales para la mayoría de los estudios preclínicos y clínicos, si bien lagrasa está ganando cada vez más importancia como fuente de células progeni-toras, porque las células pueden ser fácilmente aisladas y se obtienen en grancantidad. Se ha demostrado que células madre mesenquimales de médula óseainyectadas en el espacio subretiniano de ratones y ratas knockout para el gende la rodopsina son capaces de prevenir el deterioro funcional sin problemas derechazo inmunológico (Arnhold et al., 2007,0; Lu et al., 2010).

Otra estrategia en cuanto a la realización de transplantes, consiste en lautilización de líneas celulares con características de células progenitoras. Eneste sentido se han utilizado diferentes líneas celulares para el transplante deretina, como la línea celular E1A, obtenida a partir de un cultivo de células deMüller de retina de ratones adultos pero utilizando ADN viral para su inmor-talización (Seigel et al., 1998), la línea ARPE-19 procedente de RPE (Pinillaet al., 2007; Wang et al., 2008), células no retinianas (Pinilla et al., 2009)o células progenitoras neuronales (Gamm et al., 2007; Giannelli et al., 2011).Giannelli et al. (2011) consiguieron diferenciar células de Müller a bastones,con una eficiencia del 54 %, y demostraron que estos fotorreceptores derivadosde células de Müller pudieron integrarse y sobrevivir en retinas de ratones in-munodeficientes (Giannelli et al., 2011).

A pesar de los esfuerzos investigadores en este campo, todavía no se co-nocen completamente los mecanismos y factores implicados en la proliferaciónde células madre presentes en la retina adulta. En este sentido, se ha sugeridoque los receptores de tipo Toll, bien conocidos por su función como mediadoresde la respuesta innata y la respuesta adquirida, podrían estar implicados en losmecanismos de inducción e inhibición de la proliferación y diferenciación celu-lar. Un hecho que apoya esto es que estos receptores, además de expresarseen las células implicadas en la respuesta inmunitaria, también se expresan en

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células madre y neuronales. Así, se ha demostrado que los TLRs se expresanen diversas células en el sistema nervioso central humano, incluyendo micro-glía, astrocitos, neuronas y células endoteliales vasculares (Hanamsagar et al.,2012). Los TLRs se expresan también en células madre y progenitoras hema-topoyéticas, en las cuales modulan procesos de proliferación y diferenciacióncelular (Boiko and Borghesi, 2012; Yáñez et al., 2009). En la retina de mamífe-ros se ha detectado la expresión de diferentes TLRs en astrocitos (Jiang et al.,2009), células de Müller (Kumar and Shamsuddin, 2012), RPE (Ebihara et al.,2007; Kumar et al., 2004), fotorreceptores (Tu et al., 2011; Yi et al., 2012) ymicroglía Maneu et al. (2014). Se ha demostrado además la expresión de TLRsen diversas células madre y progenitoras, gliales y retinianas, tanto de la retinacomo del cuerpo ciliar (Brito et al., 2004; Shechter et al., 2008; Tu et al.,2011). Shechter et al. (2008) demostraron que TLR4 es un regulador negativode la proliferación de células progenitoras de la retina en el periodo postnataltemprano, inhibiendo la proliferación de células que expresan marcadores deprogenitoras (Rolls et al., 2007; Shechter et al., 2008). Rolls et al. (2007) de-mostraron que TLR4 inhibe la proliferación de células progenitoras neurales enel hipocampo adulto, mientras que TLR2 aumenta la diferenciación de célulasprogenitoras neuronales in vitro (Rolls et al., 2007). También se ha descrito elpapel de TLR3 como un regulador negativo de las células progenitoras neuralescultivadas en el cerebro en desarrollo (Lathia et al., 2008).

En este trabajo nos planteamos estudiar la expresión y funcionalidad deTLR en células madre o progenitoras presentes en la retina de mamíferos adul-tos, con el fin de contribuir al esclarecimiento de los mecanismos implicados enla proliferación y diferenciación de estas células y estudiar su potencial neuro-rreparador ante un proceso patológico neurodegenerativo. Dada su implicaciónen procesos de proliferación celular seleccionamos el TLR2 como principal ob-jeto de estudio. En primer lugar intentamos localizar en retinas adultas célulascon características de células madre o progenitoras según la expresión del trans-portador Abcg2 y el antígeno Sca-1. En nuestro trabajo no pudimos encontraren retinas de ratón adulto una población celular que expresara el marcadorAbcg2 y mostrara así el fenotipo de "Side Population". Este resultado fue encierta medida esperado, puesto que otros autores habían comprobado una dis-minución drástica en el número de células con este fenotipo a partir del díapostnatal 6 (Bhattacharya et al., 2003). Sí pudimos comprobar en cambio queen retina de ratón adulto se mantiene una población de células que expresan elantígeno de células madre Sca-1. Estas células no expresan la proteína CD45ni otros marcadores de linaje hematopoyético. Se trata de una población de

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DISCUSIÓN

tamaño muy pequeño, a veces difícil de distinguir del debrís celular. Por suscaracterísticas parece coincidir con la población descrita por diversos grupos deinvestigación, que han puesto de manifiesto la existencia en tejidos de ratón deuna pequeña población de células madre con potencial regenerador, que pre-sentan las características de expresar el antígeno Sca-1, siendo CD45 negativasy negativas también para otros marcadores de linaje, además de mostrar untamaño muy pequeño (2-6 mm) (Havens et al., 2013; Kassmer and Krause,2013). A esta población, a la que se ha llamado VSELs del inglés "Very SmallEmbrionic-Like stem cells" se le ha atribuido capacidad pluripotencial (Anandet al., 2014; Bhartiya et al., 2014; Chen et al., 2014; Guerin et al., 2015; Kass-mer and Krause, 2013). Aunque inicialmente se encontraron en médula ósea(pese a que no son hematopoyéticas), posteriormente se ha demostrado queestas células se encuentran presentes también en otros tejidos de ratón comocerebro, bazo (Kassmer and Krause, 2013; Kucia et al., 2006) o retina (Liuet al., 2009). Estas células expresan diversos marcadores de células pluripo-tentes (Oct-4, Nanog, Rex-1, Dppa3, y la proteina Rif1 (Havens et al., 2013;Kassmer and Krause, 2013; Zuba-Surma et al., 2008a). Recientemente se hapuesto de manifiesto cierta controversia sobre la capacidad pluripotencial deestas células y especialmente en tejidos humanos (Danova-Alt et al., 2012;Miyanishi et al., 2013; Parker, 2014; Ratajczak et al., 2014; Suszynska et al.,2013; Szade et al., 2014,1), estando cuestionada su posible aplicabilidad enregeneración de tejidos dañados. En cualquier caso, su presencia en diversostejidos y su potencialidad en medicina regenerativa merecen un estudio másprofundo para evaluar esta capacidad.

En nuestro trabajo demostramos que esta población de células Sca-1 po-sitivas presentes en la retina de ratón adulto expresan TLR2. Como hemosdescrito, pudimos aislar y cultivar estas células y estudiar la funcionalidad delos receptores. Tras su purificación comprobamos que este receptor es funcio-nal, puesto que cuando incubamos con Pam3CSK4, observamos un aumentoen la proliferación celular, acompañado de la sobreexpresión de TLR2. La ac-tivación de este receptor indujo además la expresión del marcador CD11b, enlo que parece ser un aumento en la diferenciación celular. Estos resultadoscoinciden con datos previos de otros autores y de nuestro propio laboratorioen los que se ha visto que TLR2 está implicado en procesos de proliferacióny diferenciación celular, como ocurre en células neurales progenitoras y célulasmadre hematopoyéticas (Megías et al., 2012; Rolls et al., 2007; Yáñez et al.,2010).

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DISCUSIÓN

Al estimular estas células con un ligando específico de TLR4, también ob-servamos un aumento en la proliferación y la diferenciación celular, si bien enmenor grado. Este resultado no coincide con lo descrito en trabajos previos deotros autores, que han demostrado que, en otros tipos de células progenitoras,TLR4 se comporta como regulador negativo de la proliferación celular en elperiodo postnatal (Shechter et al., 2008). El hecho de que en esta poblacióncelular TLR4 no suponga un "freno" en la diferenciación de estas células, su-giere que los distintos tipos de células madre y progenitoras podrían presentardistintos mecanismos de regulación por lo que pueden tener un papel muy dis-tinto en fenómenos de regeneración. Así, ante un daño en la retina, distintasseñales o moléculas intermediarias podrían reclutar unos tipos de células madreu otros para iniciar el proceso reparador, incluso en un mismo tejido. El hechode encontrar este tipo de células progenitoras en retinas de mamíferos adultosnos invita a pensar que con los estímulos adecuados, también podríamos ini-ciar un proceso neurorregenerador en caso de daño o degeneración retiniana,de manera similar a lo que ocurre en anfibios y peces.

En cuanto a la capacidad regeneradora, si bien con nuestros datos no pode-mos concluir que estas células efectivamente tengan capacidad pluripotencialcomo defienden algunos autores, tampoco podemos apoyar la teoría de que seauna población artefactual, puesto que responden a estímulos que activan losTLRs, lo que sugiere que sí pueden tener una función in vivo, bajo determinadascircunstancias. Así pues, podemos concluir que en la retina de ratones adultos,existe al menos una población de células inmaduras que expresa TLR2 y TLR4funcionales los cuales pueden estar implicados en procesos de proliferación ydiferenciación celular. Los mecanismos que frenan esta capacidad proliferativaen una situación patológica traumática o degenerativa deberán ser aclaradosen estudios posteriores.

Un segundo objetivo de nuestro trabajo consistió en obtener una línea decélulas progenitoras de la retina adulta de mamíferos y estudiar en ella la ex-presión y funcionalidad de los TLR, para conocer mejor su posible implicaciónen los procesos de proliferación y diferenciación celular. Elegimos el protocolode obtención a partir de un cultivo de células de Müller, puesto que es bienconocida la capacidad de las células de estos cultivos de inmortalizar espontá-neamente (Florian et al., 2008; Hicks and Courtois, 1990). Además, como seha demostrado previamente, las células gliales pueden actuar como precursoresneurales en procesos regenerativos (Raymond et al., 2006). Hasta la fecha sehan descrito varias líneas celulares derivadas de cultivos de células de Müller,

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a partir de rata, ratón y también humanas, algunas de ellas de retinas adultas,buscando su utilidad potencial en procesos de regeneración de la retina (Flo-rian et al., 2008; Giannelli et al., 2011; Limb et al., 2002; Otteson and Phillips,2010; Sarthy et al., 1998; Tomi et al., 2003). Las líneas celulares son particular-mente valiosas además para estudiar procesos básicos celulares y moleculares,especialmente cuando sólo se puede aislar un bajo número de células o hay unamarcada dificultad en la obtención de poblaciones puras de células. Además dela inmortalización espontánea, en algunos casos se recurre a la obtención delíneas celulares inmortalizadas mediante la sobreexpresión constitutiva de on-cogenes exógenos en células primarias. Este método presenta el inconvenientede que la inmortalización permanente altera las características innatas de lascélulas primarias y aumenta el riesgo de generación de tumores cuando se uti-lizan en el trasplante in vivo. En este sentido, la inmortalización espontáneapodría representar una ventaja, por no sobreexpresar estos oncogenes de formaartificial.

Siguiendo el método descrito en la bibliografía, obtuvimos una nueva líneacelular, MU-PH1, derivada de células de Müller murinas con características decélulas progenitoras. Como pudimos comprobar, estas células, en condicionesadecuadas, poseen la capacidad de perder la diferenciación y formar neuroesfe-ras, como es característico de este tipo de células progenitoras (Florian et al.,2008; Hicks and Courtois, 1990; Limb et al., 2002; Shechter et al., 2008). Co-mo demostramos, se trata de una línea celular pura que expresa marcadoresde células progenitoras, a la vez que expresa marcadores de células gliales yfotorreceptores, mientras que no expresa marcadores característicos de otrascélulas (tales como células bipolares, amacrinas astrocitos, microglía o endo-telio). Entre los marcadores de células madre, demostramos la expresión dela proteína nestina, que es característica de células progenitoras neuronales.Según se ha descrito, sólo la subpoblación de células de Müller que expresaeste filamento intermedio es capaz de proliferar in vitro de forma indefinida,mientras que las poblaciones que no lo expresan no presentan esta capacidad(Bhatia et al., 2009; Lawrence et al., 2007). De hecho, en nuestro laboratorioobtuvimos mediante el mismo procedimiento otras líneas celulares que no ex-presaban nestina y que murieron tras varios pases en cultivo. También es dedestacar la expresión en las células MU-PH1 del transportador Abcg2, presenteen células madre neuronales, a las que confiere el fenotipo de "Side Population",con capacidad multipotencial (Bhattacharya et al., 2007; Mato et al., 2009).Por otra parte, la expresión de marcadores característicos de fotorreceptores,como diversas opsinas, concuerda con las características descritas para otras

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DISCUSIÓN

líneas celulares, como la línea MIO-M1, obtenida por Hollborn et al. (2011) apartir de células humanas .

La línea MU-PH1, además de expresar marcadores de fotorreceptores essensible a la luz, demostrando así la funcionalidad de estas proteínas. Estosresultados de sensibilidad a la luz concuerdan con los de otros investigadores,descritos en líneas celulares como MIO-M1 (Hollborn et al., 2011) y RGC-5(Nieto et al., 2011). Se trata de una población homogénea, con patrones deexpresión homogéneos en todos los casos analizados. Esta homogeneidad su-pone una ventaja frente a otras líneas celulares como la R28 (Seigel, 1996),que presenta gran heterogeneidad que no la hace apta para algunas determi-naciones. Frente a otras lineas celulares como la 661W, obtenida a partir deconos (Tan et al., 2004), la línea MU-PH1 ofrece la ventaja de haber inmorta-lizado de forma espontanea y presentar a priori un menor riesgo de formacionde tumores. Así pues, es una línea celular con características únicas, obtenidaa partir de retinas adultas que puede ser útil para investigar la función de losfotorreceptores tanto in vitro como in vivo y para realizar estudios de trans-plante de retina.

En los trabajos de caracterización celular comprobamos que las células MU-PH1 expresan además otros marcadores no relacionados con la visión y quepueden resultar de gran interés, como receptores de melatonina 1 y 2. Nileset al. (2004) demostraron que las células madre neuronales expresan receptoresfuncionales de melatonina, de tipo MT1, y que estos colocalizan con marcado-res neuronales y gliales. La función de estos receptores en células progenitorasy la posible implicación de la melatonina en el desarrollo neuronal no se haaclarado todavía, aunque sí se ha sugerido que esta tiene alguna función en eldesarrollo del sistema nervioso central y podría tener implicaciones relevantesa la hora de optimizar estrategias terapéuticas en enfermedades neurodegene-rativas (Niles et al., 2004).

Comprobamos también que MU-PH1 expresa canales de sodio dependien-tes de voltaje, que están implicados en la modulación del potencial de acciónde iniciación y propagación de los fotorreceptores, ya que son responsables dela despolarización inicial de la membrana. En nuestras condiciones experimen-tales no pudimos comprobar una funcionalidad para estos canales en nuestrascondiciones de estudio, pero no podemos descartar su funcionalidad bien in vi-vo o in vitro con otras condiciones de cultivo (por ejemplo mediante cocultivocon otros tipos celulares de soporte).

124

DISCUSIÓN

Como hemos demostrado, la línea MU-PH1 expresa TLR1, 2, 4 y 6 a nivelde ARNm y al menos TLR2 en la membrana celular, lo que la convierte enun buen modelo para estudiar su funcionalidad. Atendiendo a la función delos TLRs en la respuesta inmune, como pudimos comprobar, ante un agentepatógeno microbiano como C. albicans, las células incrementaron la expresiónde TLR2 y TLR6, de los que es bien sabido que están implicados en el reco-nocimiento de PAMPs. Dado que está descrito que TLR2 tiene una funciónrelevante en la respuesta inmune mediante la producción de citocinas proin-flamatorias como TNF-a (Murciano et al., 2007), analizamos la producciónde esta citocina por las células MU-PH1. Si bien tras incubar con diferentesestímulos (tanto C. albicans como ligandos puros) y a distintos tiempos nose indujo la secreción de TNF-a en estas células, no podemos descartar com-pletamente que in vivo TLR2 tenga una función relacionada con la respuestainmunitaria en ellas, pues al estar en cultivo se pierde parte de la ruta de trans-ducción de las señales inducidas por la activación de los receptores.

Por otra parte, la presencia de C. albicans, al igual que el ligando purode TLR2 Pam3CSK4 sí indujo un incremento en la proliferación celular, tantoen la formación de neuroesferas, como en las células en cultivo en condicio-nes estándar, lo que sugiere que, además del papel en el reconocimiento depatógenos, también aquí los TLR2 parecen tener un efecto sobre la capaci-dad proliferativa de las células. Este resultado no se observó al estimular conLPS. Estos resultados concuerdan con los obtenidos por Rolls et al. (2007),que demostraron que la deficiencia de TLR2 disminuye la neurogénesis en elhipocampo mientras que su activación estimula la diferenciación de célulasprogenitoras neurales in vitro y con los trabajos previos de nuestro grupo sobrela implicación de TLR2 en la proliferación de células madre hematopoyéticas(Megías et al., 2012; Yáñez et al., 2010). Al contrario del comportamiento quehemos descrito para la población de células Sca-1 positivas, estos resultadossí que concuerdan con las observaciones de otros autores que describieron queTLR4 restringe la capacidad proliferativa de las células progenitoras (Shechteret al., 2008), reforzando la idea que hemos expuesto de que distintos tipos decélulas progenitoras presentes en la retina pueden tener distintos mecanismosde regulación de la proliferación y diferenciación celulares. Así pues, nuestrosresultados apoyan la idea de que las células madre de la retina mantienen lacapacidad proliferativa aún en la edad adulta, y que esta proliferación, así comoprocesos de diferenciación, pueden producirse por mediación de los receptoresTLR2 y/o TLR4.

125

DISCUSIÓN

Para estudiar la posible utilidad de la línea celular para el rastreo de sustan-cias neuroprotectoras, sometimos a las células a diferentes estímulos nocivoscomo nitroprusiato sódico, oligomicina y rotenona y evaluamos el efecto protec-tor de reconocidos antioxidantes y neuroprotectores como TUDCA, VitaminaE, N-acetilcisteína, ácido valproico y melatonina. Dado que los compuestosN-acetilcisteína, vitamina E y TUDCA pudieron revertir parte del efecto lesivoproducido por los agentes tóxicos, consideramos que la línea celular MU-PH1puede ser utilizada como modelo de estudio para el cribado de sustancias conpropiedades antioxidantes y neuroprotectoras y ser de utilidad en el desarrollode nuevos fármacos para el tratamiento de patologías de la retina.

SALTO DE PAGINA

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Capítulo 6

CONCLUSIONES

1. En la retina de ratón adulto existe una población de células que expre-san marcadores de células inmaduras Lin� Sca-1+ CD45�. Estas célulaspueden ser aisladas y mantenidas en cultivo.

2. La población de células inmaduras Lin� Sca-1+ CD45�presente en laretina de ratón adulto expresa TLR2 y TLR4 funcionales.

3. La señalización a través de TLR2 y TLR4 en la población de células in-maduras Lin� Sca-1+ CD45�presente en la retina de ratón adulto inducela proliferación y diferenciación celular in vitro.

4. Se ha obtenido una nueva línea celular, inmortalizada de forma espontá-nea a partir de células de Müller murinas con características de progeni-toras, llamada MU-PH1.

5. La línea celular MU-PH1 expresa de forma estable marcadores de fo-torreceptores, así como marcadores de glia y de células madre, ademásresponde a estímulos luminosos. Es la primera línea celular con estas ca-racterísticas, lo que confiere a MU-PH1 un gran interés como modelo dedesarrollo de los fotorreceptores y de la regeneración de la retina.

6. La línea celular MU-PH1 puede ser utilizada como modelo de cribadode diferentes ligandos y compuestos neuroprotectores en la búsqueda dedianas terapéuticas para el tratamiento de enfermedades degenerativasde la retina.

7. La línea celular MU-PH1 expresa TLR2 funcionales. La señalización através de TLR2 en las células de esta línea confirma la participación delos TLRs en la inducción de mecanismos de proliferación celular.

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Capítulo 7

ABREVIATURAS

ABCG2 Transportador transmembrana ATP-Binding Cassette G2

ADP Adenosín Difosfato

APC Aloficocianina

ATP Adenosín Trifosfato

EGF «Epidermal Growth Factor»; Factor de crecimiento epidérmico

ELISA «Enzyme-Linked InmunoSorbent Assay»

ESCs «Embryonic Stem Cells»; Células madre embrionarias

FGF « Fibroblast Growth Factor»; Factor de crecimiento de fibroblastos

FITC Isotiocianato de fluoresceina

GABA Ácido g-aminobutírico

GCL «Ganglionar Cells Layer»; Capa de células ganglionales

HSCs «Hematopoyetic Stem Cells»; Células madre hematopoyéticas

KO «Knockout»

Lin «Lineage»; Linaje

LPS Lipopolisacárido

MO Médula ósea

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PBS «Phosphate Bu�ered Saline»; Solución salina tamponada con fos-fato

PCs «Progenitors Cells»; Células progenitoras

PDE Fosfodiesterasa

PE Ficoeritrina

RPCs «Retinal Progenitors Cells»; Células progenitoras de la retina

RSCs «Retinal Stem Cells»; Células madre de la retina

Sca-1 «Stem Cell Antigen-1»

SNC Sistema Nervioso Central

SP «Side Population»

TLRs «Toll-Like Receptors»; Receptores tipo Toll

TNF-a «Tumor Necrosis Factor-a»; Factor de necrosis tumoral-a

TUDCA Ácido Tauroursodeoxicólico

VSELs «Very Small Embrionic/epiblastic-Like cell»

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