INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL 

  

Centro de Desarrollo de Productos Bióticos 

 

Estudios Estructurales de Almidón de Fuentes No Convencionales: Mango 

(Mangifera indica L.) Y Plátano (Musa paradisiaca L.) 

   T E S I S 

Que para obtener el grado de Maestría en     Ciencias en Desarrollo de Productos Bióticos 

    

      PRESENTA     Vicente Espinosa Solis 

        Director de tesis 

              Dr. Luis Arturo Bello Pérez 

Yautepec, Morelos 2008 

Este trabajo fue realizado en el Laboratorio de Control 

de Calidad del Departamento de Desarrollo Tecnológico del Centro 

de  Desarrollo  de  Productos  Bióticos  del  Instituto  Politécnico 

Nacional y en el Laboratorio de Carbohidratos del Departamento de 

Ciencia  de  los  Alimentos  y  Nutrición  Humana  en  la  Universidad 

Estatal de Iowa (Ames, Iowa, EUA), bajo la dirección del Dr. Luis 

Arturo Bello Pérez.    

  Se agradece al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología 

(CONACYT)  y  al  Programa  Institucional  de  Formación  de 

Investigadores  (PIFI‐IPN)  por  las  becas  otorgadas  para  la 

realización de estos estudios. 

 

 

 

 

 

A G R A D E C I M I E N T O S 

 

 

 

 

Dr.  Luis  Arturo  Bello  Pérez,  por  haberme  permitido 

incorporarme a su grupo de trabajo y ser director de esta tesis, 

de  quien  aprendí  que  la  disciplina  es  importante  para  salir 

adelante en cualquier meta que me proponga. 

 

Dra.  Jay‐Lin  Jane,  por  los  consejos  recibidos  durante  mi 

estancia en la Universidad estatal de Iowa. 

 

Dra.  María  Guadalupe  del  Carmen  Méndez  Montealvo,  por  su 

apoyo  en  la  primera  etapa  de  este  trabajo,  por  los  consejos 

brindados y por su tutoría incondicional. 

 

A mis amigos por brindarme su apoyo y porque con ellos viví 

muchas cosas buenas y malas de las cuales aprendimos a no caer y 

superarnos siempre. 

 

I N D I C E 

   

 

Página 

 

  Lista de figuras  I 

  Lista de cuadros  III 

  Lista de Abreviaturas  IV 

  Resumen  VI 

  Abstract  VII 

I  INTRODUCCIÓN  1 

II  ANTECEDENTES  3 

  2.1   Generalidades del almidón  3 

  2.2   Características de la amilosa  4 

  2.3   Características de la amilopectina  6 

  2.4   Organización del gránulo del almidón  9 

  2.5   Propiedades funcionales del almidón  12 

        2.5.1   Gelatinización  12 

        2.5.2   Retrogradación  15 

        2.5.3   Propiedades de formación de pasta  16 

  2.6   Fuentes y usos del almidón  18 

        2.6.1   Fuentes no convencionales  20 

                2.6.1.1   Plátano  21 

                2.6.1.2   Mango  22 

  2.7   Estudios estructurales  23 

        2.7.1   Peso molecular y radio de giro  24 

       2.7.2   Distribución de la longitud de las 

cadenas de la amilopectina 

26 

  2.8   Relación estructura – función  27 

III  JUSTIFICACIÓN  30 

IV  OBJETIVOS  31 

  4.1   Objetivo general  31 

  4.2   Objetivos específicos  31 

V  MATERIALES Y MÉTODOS  32 

  5.1   Materia prima.  32 

  5.2   Métodos     32 

       5.2.1   Almidón total  34 

         5.2.2   Contenido de amilosa aparente  35 

         5.2.3   Microscopia electrónica de barrido  35 

      5.2.4   Difracción de rayos X  36 

        5.2.5   Tratamiento del almidón con dimetil 

sulfóxido (DMSO) al 90% 

36 

         5.2.6   Cromatografía de permeación en gel (CPG)  37 

        5.2.7    Electroforesis  capilar  asistida  con  un 

fluoróforo (ECAF) 

38 

 

       5.2.8    Cromatografía  de  alta  resolución  por 

exclusión  de  tamaño  (CLARET)  acoplada  a 

detectores  de  dispersión  de  luz  multi‐

ángulos  (DDLMA)  e  índice  de  refracción 

(IR) 

40 

        5.2.9   Calorimetría de barrido diferencial 

(CBD) 

41 

         5.2.10  Análisis rápido de la viscosidad  41 

         5.2.11  Análisis estadístico   42 

VI  RESULTADOS Y DISCUSIONES  43 

  6.1   Contenido de almidón total y amilosa aparente  43 

  6.2   Microscopia electrónica de barrido  47 

  6.3   Difracción de rayos X  47 

  6.4   Cromatografía de permeación en gel  50 

  6.5   Electroforesis capilar asistida con fluoróforos  52 

 

6.6   Cromatografía de alta resolución por exclusión de 

tamaño (CLARET) acoplada a detectores de 

dispersión de luz multi‐ángulos (DDLMA) e índice 

de refracción (IR) 

56 

  6.7   Calorimetría de barrido diferencial  59 

  6.8   Análisis rápido de la viscosidad  63 

  6.9   Relación estructura función  67 

VI  CONCLUSIONES  69 

VII  BIBLIOGRAFÍA  70 

I 

L I S T A   D E   F I G U R A S 

 

Figura    Pagina 

1  Conformación  de  las  unidades  de  glucosa  en  la 

estructura de la amilosa 

5 

2  Modelos  propuestos  para  la  estructura  de  la 

amilopectina 

7 

3  Organización  estructural  del  granulo  de  almidón 

en relación a sus dos estructuras cristalinas y 

amorfas 

10 

4  Patrones de difracción de almidones tipo A, B y 

C. 

13 

5  Empaquetamiento  de  las  dobles  hélices  de 

amilopectina en base al tipo de polimorfismo 

14 

6  Representación esquemática de las propiedades de 

formación de pasta del almidón 

17 

7  Perfil de viscosidad, obtenido con un analizador 

rápido de la viscosidad 

19 

8  Aminación  reductiva  con  APTS  (A)  y  marcaje  con 

APTS de amilopectina desramificada (B). 

28 

9  Diagrama  con  los  procedimientos  experimentales 

realizados  a  las  muestras  de  almidón  de  mango, 

plátano y maíz normal 

33 

II 

10  Micrografía  electrónica  de  barrido  de  almidones 

de maíz normal (A), mango (B) y plátano (C). (la 

barra  en  la  parte  inferior  de  las  fotografias 

corresponde a una escala de 20 μm). 

46 

11  Patrón  de  difracción  de  rayos  X.  de  almidones: 

maíz normal, mango y plátano. 

49 

12  Perfiles  de  elusión  obtenidos  mediante 

cromatografía  de  permeación  en  gel,  para 

almidones  de  maíz  normal  (A),  mango  (B)  y 

plátano  (C).  (valor  azul    )  y  (carbohidratos 

totales   ) 

51 

13  Distribución  de  la  longitud  de  cadena  para 

amilopectinas  desramificadas  [maíz  normal  (A), 

mango (B) y plátano (C)]. 

54 

14  Perfiles  de  viscosidad  de  los  almidones  maíz 

normal  (o),  mango  (∆)  y  plátano  (◊),  obtenidos 

con un analizador rápido de la viscosidad. (8 % 

bs). 

65 

 

 

 

 

 

 

 

III 

 

L I S T A  D E  C U A D R O S 

Cuadro    Pagina 

1  Almidón  total,  afinidades  al  yodo  y  contenido 

de amilosa aparente de almidones. 

44 

2  Distribución  de  la  longitud  de  las  cadenas  de 

la amilopectinas. 

55 

3  Peso  molecular  (MM),  radio  de  giro  (RG)  y  (ρ) 

densidad  molecular  de  amilopectinas  de 

diferentes fuentes botánicas 

58 

4  Propiedades  térmicas  de  gelatinización  de 

almidón 

61 

5  Propiedades  térmicas  de  retrogradación  de 

almidón 

62 

6  Propiedades  de  formación  de  pasta  de  almidón, 

determinado mediante un analizador rápido de la 

viscosidad 

66 

 

IV 

L I S T A  D E  A B R E V I A T U R A S 

%R     Porcentaje de retrogradación 

AT  Almidón total 

CHO  Carbohidratos 

Da  Dalton 

ΔH  Cambio de entalpía  

dn/dc  Cambio de índice de refracción 

g  Gramos 

g/mol  Gramo / mol 

GP  Grado de polimerización 

h  Hora 

kV  Kilovolt 

M  Molaridad 

mg  Miligramo 

min  Minuto 

mL  Mililitro 

mL  Microlitro 

mm  Micrometro 

MM  Masa molecular 

mM  Milimolar 

mV  Milivolt 

N  Normalidad 

nm  Nanometro 

°C  Grado Celsius 

θ  Angulo teta 

ρ  Densidad molecular 

RG  Radio de giro 

V 

rpm  Revoluciones por minuto 

Tc  Temperatura de conclusión 

To  Temperatura de inicio 

Tp  Temperatura pico 

UB  Unidades Brabender 

UVR  Unidades de viscosidad rápida 

V.A.  Valor azul 

VI 

R E S U M E N 

 El  almidón  es  un  carbohidrato  importante  en  todo  el  mundo, 

debido  a  su  uso  en  diferentes  industrias  como:  la  alimenticia, 

farmacéutica,  textil,  etc.  Las  propiedades funcionales  del  almidón, 

son  consecuencia  de  la  organización  física  de  la  amilosa  y 

amilopectina  dentro  del  gránulo.  El  objetivo  de  este  trabajo  fue 

determinar  la  estructura  y  propiedades  fisicoquímicas  de  los 

almidones  aislados  de  mango  (Mangifera  indica  L.)  y  plátano  (Musa 

paradisiaca L.) en estado inmaduro. La distribución de la longitud de 

las cadenas de la amilopectina de mango mostró mayores cantidades de 

cadenas  de  longitud  larga  y  corta,  y  la  amilopectina  de  plátano 

presentó altas cantidades de cadenas largas, ambos comparados con la 

amilopectina de almidón de maíz normal. Esto está relacionado con los 

patrones de difracción de rayos X desplegados para los almidones de 

mango y plátano:  tipo‐A y tipo‐C, respectivamente. Los almidones de 

plátano  y  mango  contienen  36.2  y  31.1  %  de  amilosa  aparente.  Los 

almidones de plátano y mango tuvieron masas moleculares promedio 3.37 

x  108  y  5.01  x  108  g  /mol,  y  radios  de  giro  de  267  y  297  nm, 

respectivamente.  El  almidón  de  plátano  presentó  la  temperatura 

(76.5°C)  y  entalpía  (16.5  J/g)  de  gelatinización  más  altas.  Las 

pastas de almidón medidas mediante análisis rápido de la viscosidad, 

tuvieron viscosidades pico de 215.8 y 194.1 RVU, con una temperatura 

de empastado de 79.3 y 71.3 °C, viscosidad final 323.8 y 239.1 RVU, 

para  los  almidones  de  plátano  y  mango,  respectivamente.  Por  lo 

anterior,  se  encontró,  que  la  estructura  fina  de  la  amilopectina, 

está relacionada con las propiedades fisicoquímicas de los almidones 

de mango y plátano.  

 

VII 

A B S T R A C T  

Starch is an important carbohydrate in the entire world, due 

to  their  use  in  different  industries  like:  food,  pharmaceutical, 

textil, etc. the functional properties of starch are consequence of 

amylopectin and amylose’s physical organization in the granule. The 

aim of this work was to determinate the structure and physicochemical 

properties of starch isolated from unripened mango (Mangifera indica 

L.)  and  banana  (Musa  paradisiaca  L.)  starches.  The  chain  length 

distribution of mango amylopectin showed higher amounts of both short 

and long chains, and banana amylopectin presented higher amounts of 

long  chains  and  lower  amounts  of  short  chains,  both  compared  to 

normal maize amylopectin,  this is related to the X‐ray diffraction 

patterns  displayed  by  mango  and  banana  starch:  A‐type  and  C‐type, 

respectively. Banana and mango starches contained 36.2 and 31.1 %, of 

apparent  amylose  content.  Banana  and  mango  starch  amylopectins  had 

molecular weights of 3.37 x 108 and 5.01 x 108 g/mol, and  gyration 

radii of 267 and 297 nm, respectively. Banana starch had the highest 

temperature  (76.5  ºC)  and  enthalpy  (16.5  J/g)  of  gelatinization. 

Starch  pastes,  measured  by  using  a  Rapid  Visco‐Analizer,  had  peak 

viscosity  of  215.8  and  194.1  RVU,  final  viscosity  323.8  and  239.1 

RVU, setback 141.7 and 95.2 RVU, with a pasting temperature of 79.3 

and  71.3ºC,  for  banana  and  mango  starches,  respectively.  Moreover, 

the amylopectin branch chain length distribution is related with the 

physicochemical properties of mango and banana starches. 

1

I. INTRODUCCIóN

El almidón es sintetizado en forma de gránulos

semicristalinos, almacenado en diferentes órganos de plantas

incluyendo: hojas, semillas, tubérculos, raíces y frutas. El almidón

está conformado por dos tipos de polisacáridos: la amilosa, una

molécula fundamentalmente lineal compuesta de glucanos unidos

mediante enlaces -(14), y por la amilopectina, una molécula de

mayor peso molecular altamente ramificada con enlaces -(16). La

funcionalidad del almidón y organización física dentro de la

estructura granular se debe a estas macromoléculas (French, 1984). Es

de gran importancia entender las características estructurales del

almidón para sugerir posibles aplicaciones de este polímero en

diversos sistemas. La mayoría de las caracterizaciones estructurales

y fisicoquímicas del almidón, han sido llevadas a cabo en almidones

de trigo, maíz, papa y arroz debido a su importancia comercial. Por

otra parte, poco se conoce acerca de almidón de fuentes no

convencionales como lo son mango y plátano.

Mango (Mangifera indica L.) y plátano (Musa paradisiaca L.)

son frutas climatéricas que en México y muchos otros países son

consumidos en estado maduro. Por esta razón, considerables cantidades

de frutas son perdidas durante su comercialización, como consecuencia

de un deficiente manejo pos cosecha. Las altas cantidades de almidón

reportadas para estas frutas en estado inmaduro, las hacen fuentes

aceptables para el aislamiento de almidón (Bello-Pérez et al., 1999).

Existen estudios, que han demostrado las propiedades

fisicoquímicas de los almidones de mango y plátano, utilizando

diferentes variedades de estas frutas. Kuar et al. (2004) estudiaron

cinco variedades de almidones de mango aislado de huesos de esta

2

fruta y reportaron sus propiedades fisicoquímicas y morfológicas;

Sandhu y Lim (2008) reportaron las características estructurales y

digestibilidad in vitro de mango chusa y kuppi; Torres-Gutiérrez et

al. (2007) estudiaron las características estructurales de almidón de

plátano cuadrado (Musa balbisiana); Millán-Testa et al. (2005)

reportaron las características estructurales y morfológicas de

almidones de plátano, mango y okenia. Sin embargo, no existen

estudios sobre la estructura fina de la amilopectina de estos

almidones.

El presente trabajo analiza las características estructurales

de almidones extraídos a partir de 2 fuentes no convencionales:

plátano variedad “macho” y mango variedad “Tommy Atkins”, usando

microscopia electrónica de barrido (MEB), titulación con yodo,

difracción con rayos X, cromatografía líquida de alta resolución por

exclusión de tamaño (CLARET) acoplados a detectores de dispersión de

luz multiángulos (DDLMA) e índice de refracción (IR), y

electroforesis capilar asistida con fluoróforo (ECAF), así como sus

propiedades fisicoquímicas mediante un analizador rápido de la

viscosidad (ARV) y calorimetría de barrido diferencial (CBD).

3

II. ANTECEDENTES

2.1 Generalidades del almidón

El almidón es el principal carbohidrato de reserva sintetizado

por las plantas y es una fuente de energía para muchos organismos.

Representa una fracción importante en un gran número de productos

agrícolas como son : los cereales (maíz, trigo, arroz), en los cuales

se ha reportado un contenido de almidón del 30 al 80%; las

leguminosas (frijol, chícharo, haba) con un contenido entre 25 a 50%;

los tubérculos (papa y yuca) con un 60 a 90%; y algunas frutas

(plátano y mango) que en su estado inmaduro alcanzan contenidos de

almidón de hasta el 70% en base seca (Bello-Pérez y Paredes-López,

1999).

Este polisacárido está organizado en partículas discretas

conocidas como gránulos, cuya morfología, composición química y

estructura son características de cada especie botánica. El tamaño de

los gránulos de almidón varía de 0.5 a 100 µm. Se pueden encontrar

gránulos de gran tamaño en el almidón de papa (15 a 100 µm) y

gránulos tan pequeños como los del almidón de amaranto (0.8 a 2.5 µm)

(Bello-Pérez y Paredes-López, 1999).

Químicamente, el almidón está integrado por dos polímeros de

diferente estructura: la amilosa y la amilopectina. Las cantidades

relativas de estos dos polímeros y su organización física dentro de

la estructura granular, le confieren propiedades fisicoquímicas y

funcionales características a los diferentes almidones (Bello-Pérez,

1995).

4

2.2 Características de la amilosa

La amilosa es un polisacárido esencialmente lineal, conformado

por unidades de D-glucosa unidas por enlace -(14) (figura 1); sin

embargo, se ha demostrado la presencia de algunas ramificaciones las

cuales están unidas mediante enlace -(16) (Thomas y Atwell, 1999).

La amilosa en soluciones neutras forma una hélice, la cual

presenta 6-8 unidades de glucosa por cada vuelta. La amilosa y el

yodo forman un complejo, el cual es de color azul obscuro y es

convencionalmente usado para cuantificar el contenido de amilosa en

los almidones. La amilosa tiene una capacidad de enlazamiento de yodo

del orden de 20 mg de yodo por 100 mg de amilosa a una longitud de

onda de máxima absorción entre 620 y 640 nm. La intensidad del color

azul del complejo amilosa-yodo proporciona información acerca de la

longitud de cadena de la amilosa. La titulación potenciométrica de la

amilosa con yodo, ha sido usada para determinar el contenido de

amilosa de los almidones (Schoch, 1964).

Los alcoholes de longitud de cadena larga y los lípidos,

también pueden formar complejos con la amilosa, los cuales son

capaces de prevenir la retrogradación. Estos complejos pueden

utilizarse para separar la amilosa de la amilopectina y para

modificar las propiedades de la amilosa, en un sistema que contenga

agentes formadores de complejos (Schoch, 1942).

La amilosa tiene una masa molar aproximadamente de 1 x 105 – 1

x 106 Dalton (Da) con un promedio de 500 a 6000 unidades de D-

glucosa, repartidas en un número de cadenas que va de 1 a 20

(MacAllister, 1979).

5

Figura 1. Conformación de las unidades de glucosa en la estructura de

la amilosa (Gallant y Bouchet, 1986).

6

2.3 Características de la amilopectina

La amilopectina es el componente ramificado del almidón, está

formada por cadenas de residuos α-D-glucopiranósidos unidos por

enlaces α-(14), presenta enlaces α-(16) en los puntos de

ramificación, los cuales representan un 5-6 % de los enlaces totales

(Buleón et al., 1998).

La amilopectina es el componente mayoritario del almidón, se

encuentra en una proporción de 70-80% (almidones normales), en

ciertos casos alcanza niveles de hasta un 98-99%, este tipo de

almidones son definidos como ceroso (Zobel, 1988). Su estructura,

composición y proporción en el gránulo contribuyen notablemente en

las propiedades funcionales del almidón, por esta razón, ha sido

estudiada ampliamente en términos de su tamaño molecular,

ramificación y longitud de las cadenas internas y externas (Bello-

Pérez et al., 2002).

La masa molar de la amilopectina varía entre 1 x 106 y 1 x 10

8

Da, estas variaciones dependen del origen botánico del almidón, de

las condiciones de fraccionamiento de las moléculas de amilosa y

amilopectina y del método usado para determinar la masa molar (Bello-

Pérez et al., 2002).

El estudio de la molécula de amilopectina ha ido aumentando a

lo largo del tiempo conforme se han desarrollado nuevas técnicas para

su estudio (figura 2). Uno de los primeros modelos establecidos fue

el modelo “trichitic” propuesto por Meyer (1895), este modelo no

encajó con el comportamiento de la amilopectina, debido a que asumía

una estructura con ramificaciones frecuentes, lo cual delimitaba el

espacio, conforme se elongaba la amilopectina hacia el exterior

del granulo. Posteriormente, con el estudio de la amilopectina

7

Figura 2. Modelos propuestos para la estructura de la amilopectina.

Modelo “Trichitic”1895

Modelo “Trichitic”Modificado

Meyer 1940 Modelo ClusterNikuni 1969

Modelo ClusterFrench 1972

Modelo ClusterHizukuri 1986 Robin 1974

8

mediante hidrólisis enzimática, llevada a cabo con -amilasa, se

reveló que las cadenas varían en longitud y debido a ello se

desarrolló una modificación del modelo “trichitic”. Este modelo

permitía una expansión indefinida a partir del extremo reductor de

la molécula, con una cantidad de ramificaciones que dependían

del espacio disponible dentro de la molécula.

Meyer et al. (1940), hidrolizaron amilopectina con -amilasa y

subsecuentemente con amiloglucosidasa. Con sus resultados propusieron

una estructura en forma de arbusto, deducida del porcentaje de

reducción de productos de la hidrólisis.

A finales de los 60’s, nace el primer modelo de racimo o

“cluster”, el cual fue propuesto por Nikuni (1969), en este modelo,

los cluster en la amilopectina estaban espaciados uno de otro. Al

igual que Nikuni, French (1972) propuso un modelo de cluster más

compacto, este modelo podría ser concebido sólo si parte de la

molécula de amilopectina cristalizara durante la biosíntesis del

gránulo, así, esa parte de la molécula de amilopectina no podía ser

elongada. Este patrón molecular presentaba regiones cristalinas y

amorfas alternadas.

Robin et al. (1974) realizaron estudios enzimáticos (-amilasa

y pululanasa) y cromatográficos (filtración en gel) con almidón de

papa lintnerizado, los cuales confirmaron y modificaron el modelo de

cluster propuesto por French (1972). En este modelo las cadenas -A- y

-B- son lineales y tienen un grado de polimerización (GP = numero de

unidades de glucosa que conforman un polisacárido) promedio de 15 y

45, respectivamente. La cadena -B- forma la columna de la molécula de

amilopectina y se extiende sobre dos o más cluster. Cada cluster

contiene de dos a cuatro cadenas -A- estrechamente asociadas. Un

cluster completo tiene aproximadamente 9 nm de largo.

9

Con el desarrollo de nuevas técnicas, el modelo de cluster fue

nuevamente analizado, esta vez por Hizukuri (1986), quien utilizó

cromatografía de permeación en gel y desramificación, para

desarrollar una estructura de cluster, en la cual podemos encontrar

cadenas tipo -A-, que no presentan ramificaciones; cadenas tipo -B-

las cuales pueden presentar ramificaciones por cadenas -A- o -B-. Las

cadenas –B- fueron divididas en cadenas -B1-, que al igual a las

cadena –A- se pueden encontrar en un sólo cluster, mientras que las

cadenas -B2-, -B3- y -B4-, se extienden sobre 2, 3 o 4 clusters,

respectivamente.

2.4 Organización del gránulo de almidón

En la naturaleza, la amilosa y amilopectina se encuentran en

forma semi-cristalina, en entidades llamadas gránulos, los cuales

pueden ser estudiados mediante microscopia electrónica de barrido

(MEB), la cual ha probado ser una herramienta efectiva para su

caracterización morfológica. Cuando los gránulos de almidón nativo

son sometidos a microscopia de luz polarizada, muestran un patrón de

birrifrigencia conocido como Cruz de Malta. Esta Cruz de Malta indica

un alto orden dentro del gránulo. En el centro de la cruz de Malta se

encuentra el hilum, el cual se cree, es el punto de inicio de la

biosíntesis (French, 1984).

Los gránulos de almidón presentan anillos de crecimiento

compuestos por regiones amorfas y cristalinas (figura 3), las cuales

rodean al hilum. La amilopectina llega a conformar clusters, los

cuales se alinean perpendicularmente a los anillos de crecimiento y

crecen a partir del hilum hacia la superficie del gránulo en un

arreglo radial (French, 1984).

10

Figura 3. Organización estructural del granulo de almidón en relación a sus dos estructuras cristalinas

y amorfas (Donald et al., 1997).

A) Microscopia electrónica de barrido de un granulo de almidón.

B) Estructuras semicristalinas separadas por láminas amorfas.

C) Visión de la apilación de las estructuras cristalinas y amorfas.

D) Lámina cristalina formada por las dobles hélices de la amilopectina mientras que las

laminas amorfas las constituyen los puntos de ramificación amilopectina.

A B C D

11

Las cadenas de la amilopectina son las responsables de las

regiones cristalinas dentro del gránulo, mientras que la región

amorfa esta formada por puntos ramificados de la amilopectina y

por la amilosa (Zobel, 1988).

Debido a que los gránulos son sintetizados en capas, se ha

sugerido que la amilosa es sintetizada a la par con la

amilopectina. Las ramificaciones de la amilopectina tienen una

mayor tendencia a interactuar entre ellas y formar estructuras

cristalinas constituidas por dobles hélices. Las ramificaciones

-(16) de la amilosa al igual que las ramificaciones de

la amilopectina, interactúan con otras cadenas para formar dobles

hélices. Así, la amilosa permanece amorfa en el granulo de almidón

e intermezclada con la amilopectina (Jane, 2006).

Estudios de gelatinización a diferentes proporciones de la

superficie del gránulo, en almidones de papa y maíz, usando

soluciones saturadas de LiCl y CaCl2, han demostrado que las

moléculas de amilosa están más concentradas hacia la periferia del

granulo, que en la parte central. El aumento en la concentración

de amilosa en la periferia del gránulo de almidón, hace posible

que incrementen las interacciones y asociaciones entre la amilosa

y amilopectina. La red de amilosa-amilopectina fuertemente

asociada en la perifereria del gránulo, proporciona una menor

susceptibilidad a la hidrólisis enzimática y resulta en una

digestibilidad menor (Jane, 2006).

La difracción de rayos X puede utilizarse para examinar la

naturaleza cristalina de los gránulos de almidón y para definir

las cantidades relativas de las áreas amorfas y cristalinas dentro

del gránulo. Las dobles hélices, formadas por las cadenas de la

amilopectina, se pueden ordenar en tres arreglos, lo cual da lugar

a tres patrones de difracción de rayos X: almidón tipo A, B y C

(Zobel, 1988) (figura 4). Estas dobles hélices son estabilizadas

12

por puentes de hidrogeno y fuerzas de Van der Waals (Imberty et

al., 1991)

El polimorfismo tipo A es encontrado regularmente en la

mayoría de los cereales y algunas raíces (yuca y camote), las

dobles hélices de la amilopectina están empaquetadas en forma

monoclínica y contienen de 4-8 moléculas de agua; el polimorfismo

tipo B, por lo regular es encontrado en tubérculos y raíces (papa

y canna) y presentan dobles hélices de amilopectina empaquetadas

en forma hexagonal y con 36 moléculas de agua (figura 5). Por otra

parte, el polimorfismo C, es una mezcla de los polimorfismos A y

B, es característico de almidones de leguminosas (Buleon et al.,

1998; Imberty et al., 1991).

2.5 Propiedades funcionales del almidón

2.5.1 Gelatinización

Los gránulos de almidón no son solubles en agua a

temperatura ambiente, debido a su estructura semicristalina.

Cuando el almidón se encuentra con suficiente agua, los gránulos

absorben una pequeña cantidad de ésta y se hincha hasta cierto

limite (30-50 % peso seco de almidón) (French 1984). Este proceso

es reversible antes de que se alcance la temperatura de

gelatinización. Mediante el calentamiento de los gránulos de

almidón en exceso de agua y sobrepasando la temperatura de

gelatinización, los gránulos de almidón pierden su orden molecular

manifestándose en cambios irreversibles en las propiedades tales

como: pérdida de la estructura cristalina nativa (solubilización)

y pérdida de la birrefringencia (Atwell, 1988).

13

Figura 4. Patrones de difracción de almidones tipo A, B y C

(Spence y Jane, 1999).

14

Figura

Figura 5. Empaquetamiento de las dobles hélices de amilopectina

en base al tipo de polimorfismo (Gallant et al., 1997).

15

Este proceso es conocido como gelatinización. La

gelatinización del almidón es un proceso endotérmico que

corresponde a la disociación de las moléculas de almidón, las

cuales se encuentran en una conformación con dobles hélices y

pasan a una conformación amorfa. La temperatura de gelatinización

y el incremento en la entalpía de gelatinización, pueden ser

determinados utilizando calorimetría barrido diferencial (CBD). El

pico en una endoterma de CBD refleja la pérdida de dobles hélices

de la amilopectina (Srichuwong y Jane, 2007).

2.5.2 Retrogradación

La retrogradación se presenta durante el almacenamiento

prolongado de las dispersiones de almidón gelatinizado. Las

moléculas de almidón, que tras la gelatinización, se presentan en

forma amorfa, gradualmente se reasocian formando cristales, que

están compuestos por las dobles hélices del almidón. La formación

de dobles hélices se debe a interacciones hidrofobicas y puentes

de hidrogeno, las cuales se forman entre las cadenas del almidón.

Las moléculas de amilosa retrogradan mucho más rápido que las

moléculas de amilopectina. La formación de dobles hélices en las

moléculas de amilosa se presentan inmediatamente después de la

gelatinización, por lo cual, la amilosa es la responsable de los

cambios reológicos iniciales de las pastas de almidón. Por su

parte, la retrogradación de la amilopectina es más lenta, y puede

presentarse a lo largo de días o semanas, debido a su estructura

altamente ramificada. La velocidad de retrogradación depende de

varios factores como: la longitud de las cadenas de la

amilopectina, de la concentración de lípidos y derivados monoester

y fosfatos (Srichuwong y Jane, 2007).

16

2.5.3 Propiedades de formación de pasta.

El término “pasta de almidón” engloba varios procesos:

hinchamiento del gránulo, lixiviación de componentes a partir del

gránulo (principalmente amilosa), y eventualmente la

desintegración del gránulo, como es mostrado en la figura 6

(Atwell, 1988).

La amilopectina es la principal responsable del hinchamiento y

viscosidad de la pasta de almidón (Tester y Morrison, 1990).

Durante el hinchamiento de los gránulos, los puentes de hidrógeno

entre las cadenas de almidón se disocian y son reemplazados con

puentes de hidrógeno con las moléculas de agua, lo cual incrementa

la viscosidad. La amilosa es el principal componente que lixivia

el gránulo y la concentración de la amilopectina solubilizada,

incrementa conforme la temperatura aumenta. En general, las

propiedades de formación de pasta de los almidones son afectadas

por la concentración de almidón, velocidad de calentamiento y

esfuerzo de corte aplicado, contenido de amilosa del almidón,

estructura molecular de la amilopectina, tamaño de gránulo y

contenido de componentes minoritarios (Srichuwong y Jane, 2007).

Los cambios de viscosidad en las dispersiones de almidón

durante el calentamiento, comúnmente son medidos con instrumentos

llamados viscoamilografos (Brabender) y analizadores rápidos de

la viscosidad (ARV). Estos aparatos llevan a cabo programas de

mezclado, calentamiento y enfriamiento, que generan perfiles de

gelatinización y retrogradación altamente reproducibles. Las

unidades de medida son unidades brabender (UB) y unidades de

viscosidad rápida (UVR), para un viscoamilografo y ARV,

respectivamente (Thomas y Atwell, 1999).

17

Figura 6. Representación esquemática de las propiedades de formación de pasta del almidón (Srichuwong y

Jane, 2007).

18

Un perfil típico de viscosidad registrado por un ARV es

presentado en la figura 7. Durante la fase inicial de

calentamiento, se registra un aumento de la viscosidad, como

indicativo de que los gránulos de almidón comienzan a

hincharse. En este punto, los polímeros con bajo peso

molecular, particularmente las moléculas de amilosa, comienzan a

lixiviar a partir del granulo. Durante la formación de pasta, se

obtiene un pico de viscosidad, lo cual representa que la mayoría

de los gránulos se han hinchado. Durante el rompimiento

(BreakDown), la temperatura se mantiene a 95 °C, registrándose una

disminución de la viscosidad, debido al rompimiento de los

gránulos hinchados, a la disociación de la amilosa y a que las

moléculas de almidón continúan solubilizandose. Por ultimo, en la

fase de enfriamiento, la amilosa y amilopectina solubilizadas

empiezan a reasociarse manifestándose otro incremento en la

viscosidad, el cual es conocido como la viscosidad de

recuperación (Set-Back) (Thomas y Atwell, 1999).

2.6 Fuentes y usos del almidón

Ningún otro ingrediente alimenticio se compara con el

almidón en términos de versatilidad de aplicación en la industria.

Este carbohidrato fue diseñado por la naturaleza para fungir como

almacén de energía. Sin embargo, el hombre ha extendido su uso más

allá de su diseño original (Taggart, 2004).

Casi todas las industrias han encontrado algún uso para el

almidón. En la industria de alimentos, el almidón ha sido

utilizado para impartir propiedades funcionales a los alimentos,

tales como: agente espesante, encapsulante, impartir sabor, como

relleno, etc.

19

Figura 7. Perfil de viscosidad, obtenido con un analizador rápido

de la viscosidad (Zhou et al., 1998)

20

El almidón es utilizado en sopas enlatadas, postres,

helados, carnes procesadas, salsas, productos horneados, entre

otros. El almidón también puede ser convertido en azúcar; es

utilizado para fabricar edulcorantes, jarabes y enzimas para la

producción de glutamato monosódico, un potenciador de sabor. Los

usos del almidón en las industrias no-alimenticias son tan

diversos como en la industria alimenticia, los principales usos

incluyen las industrias: textil, papel, adhesivos y farmacéutica

(Fuglie y Oates, 2001).

En el 2006, el Instituto Internacional del Almidón, reportó

que el maíz es la principal fuente de obtención del almidón a

nivel mundial, seguido de la papa, el camote y la yuca. La mayor

parte de los almidones comerciales se produce a partir de maíz y

papa; más del 80% del almidón que se produce a nivel mundial se

obtiene de maíz, principalmente en Estados Unidos. Europa es el

mayor productor de almidón de trigo y papa; en Asia se produce

almidón a partir de yuca y tapioca; en varios países se produce en

menor proporción almidón de arroz y camote (Jobling, 2004; Huang

et al., 2007).

2.6.1 Fuentes no convencionales

El almidón extraído de las diversas fuentes botánicas tiene

diferentes propiedades. Las industrias requieren de almidones

específicos para la fabricación de sus productos. Además, siendo

el maíz el más utilizado y debido a la problemática en su precio

de venta, hoy en día la búsqueda de fuentes alternativas ha tomado

más fuerza.

El almidón de algunas fuentes no convencionales ha sido

estudiado en estado nativo; se pueden mencionar los siguientes:

avena, frijol, chícharo, lenteja, tubérculo de chayote, jicama,

21

sorgo, yam chino, taro, sago (Kim et al., 1997; Perez et al.,

1997; Hoover et al., 2003; Srichuwong et al., 2005; Jiménez-

Hernandez et al., 2007; Stevenson et al., 2007; Sandhu y Lim,

2008;).

Numerosos tipos de frutas acumulan almidón durante su

desarrollo. Sin embargo, la caracterización de almidones de frutos

ha recibido poca atención, debido a que pocas frutas contienen

altos niveles de almidón cuando son consumidas. Se cuenta con

trabajos reportado de almidón de: calabaza (Cucurbita maxima D.),

manzana (Malus domestica Borkh), Kiwi (Actinidia deliciosa),

plátano (Musa paradisiaca L.), y mango (Mangifera indica L.)

(Bello-Pérez et al., 2000, 2005a; Stevenson et al., 2005, 2006a,

2006b;), entre ellos el plátano ha recibido mayor atención.

2.6.1.1 Plátano

El plátano (Musa Paradisíaca L) tuvo su origen en Asia

meridional, siendo conocido en el Mediterráneo desde hace 650 años

atrás. El plátano llegó a Canarias en el siglo XV y desde allí fue

llevado a América en el año 1516. El plátano pertenece a la

familia de las Musáceas teniendo dos variedades principales M.

cavendish (plátanos comestibles cuando están crudos) y M.

paradisíaca (plátanos machos o para cocer).

El plátano es el cuarto cultivo más importante del mundo,

después del arroz, el trigo y el maíz. Además de ser considerado

un producto básico y de exportación, el plátano constituye una

importante fuente de empleo e ingresos en numerosos países en

desarrollo (Zhang et al., 2005).

El plátano es considerado el principal cultivo de las

regiones húmedas y cálidas del sudoeste asiático. La producción

mundial de plátano en el año del 2003 fue estimada en 102 millones

22

de toneladas métricas (TM). Latinoamérica y las Islas del Caribe

cubren el 80% de las exportaciones de este fruto a nivel mundial

(FAO, 2003).

Se ha reportado que el fruto del plátano en estado inmaduro

contiene 70-74% de humedad, 1% de proteína, 0.3-0.5% de grasa, 20-

30% de carbohidratos totales, 0.5% de fibra bruta, 3.5% de fibra

dietaria y el 1% de cenizas (Tobin y Muller, 1988; Chávez et al.,

1992). Cabe destacar que el polisacárido predominante en el

fruto del plátano en estado inmaduro es el almidón; Flores-

Gorosquera et al. (2004), llevaron a cabo el aislamiento del

almidón en el fruto del plátano y ellos reportaron que obtuvieron

una pureza del 95%.

2.6.1.2 Mango

El mango es nativo del noroeste de la India, de las laderas

del Himalaya, de donde se ha distribuido desde épocas remotas por

todo el suroeste de Asia y Archipiélago Malayo.

El cultivo del mango es probablemente un híbrido natural

entre M. indica y M. sylvatica, que ocurrió en el noroeste de la

India, entre las laderas del Himalaya y Sri Lanka, 400 años

atrás. El mango fue introducido en el continente Americano,

llegando primeramente a Brasil en el año de 1700 y tiempo después

a Florida y México en el año de 1800 (Infoagro, 2006). El mango se

cultiva en todos los trópicos y subtrópicos del mundo.

El mango (Mangifera indica L) pertenece a la familia de las

Anacardiaceae. El género Mangifera comprende aproximadamente 50

especies nativas del suroeste de Asia. Mangifera indica L.,

variedad “Tommy Atkins”, es una variedad que se logró en la década

de 1920 en Fort Lauderdale, Estado de Florida (EUA). El árbol es

de copa redonda, densa, los frutos son de tamaño mediano a grande

23

(400-600 g), de cáscara gruesa y forma oval-oblonga, de semilla

pequeña (representa el 7-8 % con relación a la pulpa). En la

madurez adquiere el color rojo y tono púrpura. La pulpa es firme y

jugosa, posee cierta cantidad de fibra y es de buena calidad

(Aguirre, 1998).

El fruto del mango es de alta aceptación para el consumo

humano. En su estado de madurez, estado en el cual es usualmente

consumido, la porción comestible representa entre 60 y 75% del

peso total del fruto. El mango contiene 84% de agua, 15% de

azúcares y 0.5% de proteínas. También, es una fuente excelente

de muchas vitaminas, reportándose contenidos de vitamina C hasta

de 300 mg por 100 g de pulpa (Singh y Chada, 1961). Los minerales

presentes en mayor proporción en el mango son el magnesio, el

calcio, el sodio y el fósforo. El carbohidrato predominante en el

mango verde es el almidón, que en la fruta madura es reemplazado

en gran parte por sacarosa, glucosa, y fructuosa.

Guilbot y Mercier (1985) reportaron un contenido de almidón

en el fruto del mango verde de un 70% en base seca.

2.7 Estudios estructurales

La masa molecular y el tamaño de la molécula de

amilopectina, es más grande que cualquier otro polímero natural o

sintético. Debido a ello, la estructura del almidón no es del todo

bien entendida. Técnicas cromatográficas, tales como cromatografía

de permeación en gel (Jane y Chen, 1992; Wang et al., 1993),

cromatografía líquida de alta resolución por exclusión de tamaño

(Yuan et al., 1993) y cromatografía líquida de alta resolución por

intercambio aniónico (Jane et al., 1999), han sido utilizadas para

el estudio de las ramificaciones de las moléculas de amilopectina.

24

2.7.1 Peso molecular y radio de giro

La falta de estándares de calibración, principalmente

debido al tamaño grande de la amilopectina, causa dificultad en la

determinación de su peso molecular utilizando cromatografía por

exclusión de tamaño (CLARET). La técnica de dispersión de luz

multi-ángulos combinada con CLARET, es una herramienta poderosa

para determinar el peso molecular absoluto de macromoléculas tales

como el almidón (Aberle et al., 1994). Una buena separación entre

la amilopectina y amilosa, es un requisito para conducir una

medida exacta del peso molecular de la amilopectina utilizando

esta técnica. (Yoo y Jane, 2002b)

Los métodos utilizados para obtener la completa disolución

de la dispersión de almidón, sin llegar a romper los enlaces

covalentes, son críticos para el análisis cromatográfico. Una

dispersión de almidón pobremente disuelta, da como resultado

moléculas de amilopectina/amilosa insolubilizadas lo cual afecta

el resultado de la masa molecular (MM) y radio de giro (RG), el

cual es la raíz cuadrada de la distancia media de los diferentes

elementos desviados a partir del centro de la masa. determinado

por la técnica de dispersión de luz estática (Yoo y Jane, 2002b).

Cuando la muestra es inyectada en el sistema CLARET, la

solución es llevada a través de una columna (fase estacionaria)

por una fase móvil, a diferentes velocidades y con volumen de

separación por la columna. Las moléculas grandes son eluidas más

rápidamente que las moléculas pequeñas, porque las primeras

tienen menos penetración dentro de los poros de la columna.

Posteriormente, las moléculas eluidas pasan a través del

detector de dispersión de luz, en cualquier instante las moléculas

suspendidas tendrán una serie particular de posiciones dentro del

volumen de desvío, las moléculas desvían la radiación del

detector, las fases relativas de las ondas desviadas cambian

25

debido a que las fases incidentes difieren en esas posiciones y

también en las distancias partícula-detector (Bello-Pérez, 1995).

El detector de dispersión de luz permite obtener la masa molar

(MM) y radio de giro (RG). Teniendo en cuenta que a una

concentración (g/ml) dada, la señal de luz dispersada es

proporcional al MM , por lo cual, con pesos moleculares bajos, se

requieren altas concentraciones para producirse una señal en el

detector de luz.

Las técnicas CLARET y dispersión de luz, requieren de la

determinación en serie de la concentración para cada fracción de

elusión. A altos pesos moleculares y bajas concentraciones se

tiene dificultad para determinar la concentración utilizando los

métodos convencionales (cuantificación del índice de refracción).

Por lo que, se requiere una determinación correcta del incremento

de índice de refracción (dn/dc). El detector de índice de

refracción es un instrumento capaz de medir las diferencias en el

índice de refracción entre el disolvente y la solución, ya que el

índice de refracción de la solución cambia a medida que lo hace la

concentración de la sustancia disuelta, y así se puede entonces

deducir el cambio de concentración de un soluto diluido (Wyatt,

1993).

Para cada tiempo de elusión le corresponde un volumen, la

concentración se calcula del diferencial de la respuesta del

índice de refracción. Siguiendo esta determinación, la medición de

la luz dispersada utilizando los 18 fotodiodos del detector Heleos

permite, la determinación de la MM y RG de los α-glucanos empleando

el programa ASTRA V 5.1.9.1. (Wyatt, 1993).

26

2.7.2 Distribución de la longitud de las cadenas de la

amilopectina

Uno de aspectos más comúnmente reportados de la estructura

del almidón, es la distribución de la longitud de sus cadenas.

Cuando el almidón es sometido a hidrólisis con enzimas

desramificantes (isoamilasa o pululanasa), los enlaces -(16)

son hidrolizados para producir una mezcla de cadenas lineales. Los

métodos comúnmente utilizados para caracterizar la longitud de las

cadenas del almidón desramificado son: la cromatografía líquida de

alta resolución por exclusión de tamaño (CLARET) y la

cromatografía líquida de alta resolución por intercambio aniónico

(CLARIA). La CLARET proveé una descripción de todas las cadenas

presentes en la dispersión de almidón desramificado, pero no puede

dar información acerca de un determinado GP. Por su parte CLARIA

provee información para un GP individual, pero sólo para cadenas

con GP de un máximo (bajo circunstancias ideales) de alrededor de

80 GP (Yao et al., 2005).

Recientemente, se introdujeron técnicas que emplean

marcadores fluorescentes para el estudio de la amilopectina

(Morell, 1998; Hanashiro et al., 2002; Nakamura et al., 2002). La

distribución de longitud de las cadenas puede ser determinada

mediante electroforesis capilar equipada con un detector de

fluorescencia inducida por laser. El marcaje con fluoroforo

permite la cuantificación directa de la distribución en base molar

de las cadenas de glucosa.

Para poder llevar a cabo esta técnica, primero se debe de

realizar la desramificación de la molécula de amilopectina. Una

vez desramificada, se procede a el marcaje con el compuesto

fluoróforo. La aminación reductiva, ha sido utilizada como un

medio para el marcaje de los extremos reductores de las cadenas,

introduciendo un fluoróforo a su molécula. La introducción de un

27

sólo marcador en el extremo reductor, permite la cuantificación en

base molar. La aminación reductiva de la glucosa con acido-8-

amino-1,3,6-pirenetrisulfonico (APTS) está representada en la

figura 8 (O´Shea et al., 1998).

2.8 Relación estructura – función

Debido a que la amilopectina es el componente principal en

la mayoría de los almidones, las variaciones en su estructura

puede resultar en gránulos de almidón con diferentes propiedades

fisicoquímicas, funcionales y de digestibilidad.

Estudios realizados por Yuan et al. (1993) con

amilopectinas provenientes de diferentes genotipos de maíz ceroso,

encontraron que las amilopectinas que presentaban una mayor

proporción de cadenas largas, tenían mayor tendencia a

retrogradar, que aquellas que mostraron una mayor proporción de

cadenas cortas.

Jane et al. (1999) observaron que los almidones tipo B,

mostraban una temperatura de gelatinización menor que los

almidones tipo A, cuando ellos presentaban el mismo tipo de

distribución de cadena. Lo cual se atribuyó a una estructura

cristalina altamente compacta.

Vandepputte et al. (2003) reportaron que el porcentaje de cadenas

B1 (GP 13-24) presentaban una correlación positiva con la

temperatura de gelatinización de inicio en almidones de arroz,

mientras que el porcentaje de cadena corta A (GP ≤ 12)

correlacionaban negativamente con la temperatura de gelatinización

de inicio.

28

Figura 8. Aminación reductiva con APTS (A) y marcaje con APTS de

amilopectina desramificada (B) (O’Shea et al., 1998).

A

B

29

Los almidones que contienen amilopectinas con mayor

proporción de ramificaciones de GP 6-12 muestran una temperatura

de formación de pasta, viscosidad de pico menor y una viscosidad

de rompimiento (breakdown) mayor y esto es debido a que las

cadenas cortas no proveen interacciones fuertes para mantener la

integridad de los gránulos hinchados. De esa manera, los gránulos

se desbaratan durante el calentamiento, lo cual resulta en bajas

valores de viscosidad pico (Stevenson, 2003).

30

III. JUSTIFICACIÓN

En el mercado existen fuentes convencionales para el

aislamiento del almidón como son maíz y papa, las cuales son

fundamentales para la alimentación humana. Se ha considerado

buscar fuentes alternativas de almidón, como el mango y el

plátano, los cuales pueden presentar diferentes propiedades

funcionales a los almidones de fuentes convencionales y por lo

tanto, sean usadas para nuevas aplicaciones o el desarrollo de

nuevos productos.

El grupo de trabajo del Departamento de Desarrollo

Tecnológico ha estudiado las características fisicoquímicas y

funcionales de los almidones de plátano y mango, encontrándose que

estos almidones podrían tener una diversidad de aplicaciones a

nivel industrial.

En los últimos años, ha cobrado gran interés el estudio de

la relación estructura-función, para poder explicar cómo la

estructura repercute en las propiedades funcionales de los

almidones y con esto, buscar las mejores aplicaciones.

.

31

IV. OBJETIVOS

4.1 Objetivo general

Determinar las características estructurales y fisicoquímicas

de almidones de fuentes no convencionales: mango (Mangifera indica

L.) y plátano (Musa paradisiaca L.).

4.2 Objetivos específicos

Determinar la distribución de la longitud de las cadena de la

amilopectina en los almidones mediante electroforesis capilar

asistida con un fluoróforo

Determinar la masa molecular (MM) y el radio de giro (RG) de

los almidones mediante cromatografía líquida de alta

resolución por exclusión de tamaño acoplada a detectores de

dispersión de luz multiángulos e índice de refracción

(CLARET-DDLMA-IR).

Evaluar las propiedades fisicoquímicas de gelatinización y

retrogradación mediante calorimetría diferencial de barrido,

así como la formación de pasta mediante análisis rápido de

viscosidad.

Relacionar las características estructurales con las

propiedades fisicoquímicas, para sugerir posibles

aplicaciones de los almidones.

32

V. MATERIALES Y METODOS

5.1 Materia Prima

Se obtuvieron almidones de mango (Mangifera indica L.)

variedad “Tommy Atkins” y plátano (Musa paradisiaca L.) variedad

“macho”, en el Departamento de Desarrollo Tecnológico del Centro

de Desarrollo de Productos Bióticos perteneciente al IPN. El

almidón de maíz normal fue adquirido de la empresa Sigma-Aldrich.

Este último fue utilizado como estándar en todas las mediciones

realizadas. Todos los compuestos fueron grado reactivo.

5.2 Métodos

A continuación se muestra un diagrama de los procedimientos

realizados a los almidones de mango y plátano (figura 9)

33

Figura 9. Diagrama con los procedimientos experimentales realizados a las muestras de almidón de mango, plátano y maíz normal.

Almidón

Estudios Estructurales

Propiedades Funcionales

Amilosa Aparente

Tratamiento Con DMSO 90%

Análisis Rápido de Viscosidad

Calorimetría de barrido diferencial

Almidón Total

Difracción de Rayos X

Microscopia electrónica De barrido

Masa molecular (MM) y Radio de giro (RG)

Fraccionamiento del Almidón

Distribución de la longitud de las cadenas

de amilopectina

Relación Estructura - función

34

5.2.1 Almidón total

Para verificar la pureza del almidón aislado se cuantificó el

contenido de almidón total (AT) por el método enzimático de Goñi et

al. (1997). Para ello se pesaron 50 mg de muestra en tubos de

centrifuga de 50 mL de capacidad. Se añadieron 3 mL de agua destilada

y 3 mL de KOH 4 M, se mezcló y agitó vigorosamente a temperatura

ambiente durante 30 minutos. Se añadieron aproximadamente 5.5 mL de

HCl 2 M y 3 mL de regulador de acetato sódico 0.4 M, se ajustó a pH

4.75. Se añadieron 60 μL de suspensión de amiloglucosidasa. Se mezcló

e incubó a 60 °C durante 45 min en un baño de agua con agitación. Se

centrifugó (15 min, 3000 rpm) y se recogieron los sobrenadantes en

matraces aforados de 50 mL. Se adicionaron al menos una vez, 10 mL de

agua destilada con la finalidad de realizar los lavados de la muestra

remanente en los tubos, se realizó la centrifugación correspondiente

y se recuperó el sobrenadante. Se aforó el matraz y se evaluó el

contenido de glucosa con el reactivo de glucosa oxidasa/peroxidasa

(GOD/POD), para ello: a) en tubos de ensayo, se transfirieron con una

pipeta 50 μL de la muestra, b) se añadió 1 mL del reactivo de

glucosa. Los tubos se incubaron en un baño con agitación durante 15

min a 37 °C, c) Se leyó la absorbancia a 510 nm. El porcentaje de

almidón total se calculó empleando las siguientes ecuaciones:

ml

g

muestrag

xxvolumenxml

aglug

AT_

1009.0cos__

%

Donde: Volumen = 50 mL 0.9 = Factor de conversión de glucosa a almidón

Absorbancia de la muestra

Absorbancia del estándar de glucosa

g de glucosa

35

5.2.2 Contenido de amilosa aparente

La concentración de amilosa fue determinada mediante un método

potenciométrico, siguiendo la metodología de Jane et al. (1999). Para

lo cual 3 g de almidón fueron desgrasados utilizando metanol al 85%

en un equipo soxhlet durante 24 horas. El almidón fue resuspendido en

10 mL de etanol y centrifugado a 7000 rpm durante 20 min.

Posteriormente fue filtrado a través de un filtro de celulosa

Whattman tamaño 1 (11 m tamaño de poro) y secados en un horno a 50

C durante toda una noche. Se colocaron 100 mg de almidón desgrasado

en un vaso de precipitado. Se humectó el almidón con 1 mL de agua y

se puso en agitación durante 10 min. Se agregó 5 mL de KOH 1 N y se

continúo con la agitación por 30 min (colocando el vaso de

precipitado sobre hielo, para evitar una posible degradación de las

moléculas del almidón). Se neutralizó la solución con HCl 0.5 N y

para ver el cambio de pH se agregaron unas gotas de naranja de

metilo. Se adicionaron 10 ml de una solución de KI 0.5N. Se agregó

agua hasta obtener un peso de muestra de 100.9 g.

Las afinidades al yodo del almidón desgrasado fueron

cuantificadas usando un titulador potenciométrico automático (702 SM

Tirino, Metrohm, Herisau, Suiza). El análisis fue realizado por

triplicado para cada muestra.

5.2.3 Microscopía electrónica de barrido

La morfología de los gránulos de almidón fue analizada

mediante microscopia electrónica de barrido. Los gránulos de almidón

fueron esparcidos sobre una cinta conductora de plata, la cual fue

montada sobre un disco de latón. Posteriormente los gránulos fueron

recubiertos con oro y paladio, en una proporción 60/40, usando el

36

equipo Polaron E5100 (Polaron equipment Ltd., Watford, UK). Las

imágenes de los gránulos de almidón fueran capturadas a una

magnificación de 1500X usando un microscopio electrónico de barrido

modelo JSM-5800LV (JEOL, Tokio, Japón).

5.2.4 Difracción de rayos X

El patrón de cristalinidad del almidón fue estudiado mediante

difracción de rayos X, las muestras fueron equilibradas en una cámara

de humedad relativa al 100 % y a temperatura ambiente durante 24

horas. Los patrones de difracción de rayos X de los almidones fueron

obtenidos mediante un difractómetro (D-500, Siemens, Madison, WI). El

difractometro fue operado a 27 mV y 50 kV. La región de búsqueda o

barrido con ángulo dos teta (2) fue de 4° a 40° con un tamaño de

paso de 0.05°, con un tiempo de conteo de 2 segundos. El porcentaje

de cristalinidad fue calculado utilizando la siguiente ecuación:

100)(

(%) xAA

AdadCristalini

aC

C

Donde Ac= área cristalina bajo el difractograma de rayos X Aa= área amorfa bajo el difractograma de rayos X.

5.2.5 Tratamiento del almidón con dimetil sulfóxido (DMSO) al

90 %

El uso del almidón en productos alimenticios y no alimenticios

comúnmente requiere la disolución en un medio acuoso, para disolver

el almidón usualmente se utiliza el calentamiento y/o agitación. Sin

embargo, las cadenas de los componentes del almidón en soluciones

37

acuosas neutras tienen una limitada estabilidad y constantemente

sufren cambios físico-químicos. Por este motivo, el análisis de la

estructura del almidón se dificulta en un medio acuoso. Un disolvente

comúnmente usado para el almidón es el dimetil sulfóxido (DMSO). Para

dispersar adecuadamente el almidón en DMSO es necesaria una pequeña

cantidad de agua, para prevenir el rápido hinchamiento del gránulo.

Una capa del gel formada en la superficie del gránulo debida a el

hinchamiento, impediría que el DMSO penetrara al gránulo (Han y Lim,

2004).

El tratamiento del almidón con dimetil sulfóxido fue llevado

siguiendo la metodología de Yoo y Jane (2002a). Para lo cual 100 mg

de almidón fueron humectados con 1.0 mL de agua y agitados durante 10

min, posteriormente se dispersaron en 9 mL de DMSO, para obtener una

solución de DMSO al 90 %. La suspensión fue agitada mecánicamente

durante 1 h mientras era calentada en un baño de agua hirviendo, en

el que se mantuvo en agitación durante 24 h a 25 C. Una alícuota

(2mL) de la dispersión se mezcló con 4 volúmenes de etanol (8 mL)

para precipitar el almidón. El almidón fue separado mediante

centrifugación a 7000 rpm durante 20 min. El almidón fue entonces

redisuelto en 5 mL de agua caliente (se obtuvo una concentración de 4

mg /mL) y fue agitado durante 30 min en un baño de agua hirviendo. La

muestra se filtró a través de una membrana de nylon de 5.0 m tamaño

de poro.

5.2.6 Cromatografía de permeación en gel (CPG)

El fraccionamiento de los componentes del almidón fue llevado

a cabo mediante cromatografía de permeación en gel (CPG) siguiendo el

método de Song y Jane (2000), 5 mL de dispersión de almidón (4mg/mL)

38

pretratado con DMSO (90 %) fue inyectada en una columna de [2.6 cm

(diámetro interno) x 90 cm (longitud)] empacada con gel sefarosa CL-

2B (Pharmacia Inc., Piscataway, NJ). La columna eluyó en forma

ascendente. Una solución de 1 M de NaCl, 40 mM de NaOH y 0.8% NaN3

fue utilizada como fase móvil a una velocidad de 30 mL/h.

Colectándose fracciones de 4.8 mL para posteriormente analizarse

mediante las técnicas de carbohidratos totales (fenol - acido

sulfúrico) (Dubois et al., 1956) y valor azul (tinción con Yodo)

(Juliano, 1971) en un espectrofotómetro automático, modelo ELx 808

(Bio-Tek Instruments, Inc. Winooski USA.) a 490 y 630 nm,

respectivamente.

Con los cromatogramas se determinaron las fracciones donde se

localizó la amilopectina. Estas fueron colectadas, se les ajustó el

pH a 7.0 y se concentró la dispersión en un rotavapor (modelo R,

Büchi Labortechnik AG Meierseggstrasse, Suiza), cuidando que la

amilopectina no quedara pegada en las paredes del matraz. Una vez

concentrada la dispersión, se precipitó con 4 volúmenes de etanol y

se dejó reposar en un refrigerador durante toda la noche. Al otro día

se centrifugó a 7000 rpm durante 20 min y se seco en un horno a 50

C.

5.2.7 Electroforesis capilar asistida con un fluoróforo

(ECAF)

La longitud de cadena de la molécula de amilopectina fue

determina de acuerdo a los métodos descritos por O´Shea y Morrell

(1996) y O´Shea et al. (1998). Para lo cual 20 mg de amilopectina

fueron humectados con 0.5 mL de agua desionizada y agitados por 10

min. A continuación fueron agregados 4.5 mL de DMSO y la dispersión

39

fue colocada en un baño de agua hirviendo bajo agitación magnética,

se agitó durante 12 horas y fue precipitada agregando 4 volúmenes de

etanol, separada mediante centrifugación a 7000 rpm durante 20 min.

Se agregó 10 mL de agua desionizada y filtrada a través de una

membrana 0.02 m tamaño de poro, con lo cual se obtuvo una dispersión

de 2 mg/mL. La que ebulló por 30 min, al término de este, se filtró a

través de una membrana de 5 m (tamaño de poro). Se tomaron 80 L de

la dispersión antes mencionada y se agregaron 19 mL de una solución

amortiguadora de acetato de sodio (pH = 3.5) y 1 L (1U = unidad de

actividad de enzima) isoamilasa obtenida de Pseudomonas sp.

(Megazyme, wicklow, Ireland), la muestra fue puesta en incubación por

2 horas a 40 C, con lo cual se logró la desramificación de la

molécula de amilopectina debido a que esta enzima hidroliza enlaces

-(16). Esta desramificación generó cadenas lineales con diferentes

grados de polimerización (GP). Para inactivar la enzima la muestra se

ebulló durante 10 min. Posteriormente se colocaron 50 L de esta

solución en tubos eppendorf para ser secados al vacío. Una vez secada

la muestra se agregaron 2 L de solución de APTS (acido 8-amino

1,3,6-pirenotrisulfonico) y 2 L de NaBH3CN (cianoborohidruro de

sodio) agitados en un vortex e incubados durante 18 h a 40 C, con

este paso se lograron marcar a las cadenas lineales de la

amilopectina con un fluoróforo. Se agregaron 46 L de agua destilada,

desionizada y filtrada (membrana con tamaño de poro de 0.02 m). Se

mezcló en vortex y se centrifugó a 7000 rpm por 2 min. Se tomaron 10

L de la solución y se colocaron en tubos de PCR (reacción en cadena

de la polimerasa), se agregó 190 L de agua y se cuantificó la

longitud de las cadenas mediante electroforesis capilar con un

detector de luz uv. Para lo cual se utilizó el equipo P/ACE MDQ

Glycoprotein system (Beckman Coulter, Inc. Fullerton, CA. USA).

40

5.2.8 Cromatografía de alta resolución por exclusión de tamaño

(CLARET) acoplada a detectores de dispersión de luz

multi-ángulos (DDLMA) e índice de refracción (IR)

El peso molecular de la amilopectina es más grande que

cualquier otro polímero natural o sintético conocido. Por lo tanto,

no hay compuestos que sean utilizados como referencia para la

calibración de los cromatogramas de permeación en gel. La masa

molecular promedio de amilopectinas determinado mediante CLARET-

DDLMA-IR muestran valores en un intervalo de 108 a 109 Da, para una

amplia variedad de amilopectina provenientes de diferentes fuentes

botánicas, incluyendo cereales, raíces y tubérculos.

El peso molecular y radio de giro de las moléculas de

amilopectina fueron determinadas mediante el sistema de cromatografía

líquida de alta resolución por exclusión de tamaño acoplado a

detectores de dispersión de luz multiángulos e índice de refracción

(CLARET-DDLMA-IR), siguiendo la metodología utilizada por Yoo y Jane,

(2002b). Los almidones pretratados con DMSO al 90%, fueron inyectados

al sistema CLARET-DDLMA-IR a una concentración de 0.3 mg/mL, EL

sistema CLARET-DDLMA-IR consistió de una bomba isocrática HP 1050

(Hewlett Packard, Valley Forge, PA) equipada con una válvula de

inyección (100 L de capacidad, modelo 7125, Rheodyne), un detector

multiángulos de dispersión de luz (Dawn DSP-F, Wyatt Tech. Corp.,

Santa Barbara CA) con un láser de He-Ne (=632.8 nm) y una celda de

flujo K-5, un detector de índice de refracción HP 1047A RI (Hewlett

Packard, Valley Forge, PA). Para separar a la amilosa de la

amilopectina se utilizo una guarda columna Shodex OH pak KB-G y dos

columnas analíticas KB-806 y KB-804 (Showa Denko K.K., Tokio, Japan).

La temperatura del inyector y de las columnas fue mantenida a 55.0 C

usando un calentador de columna CH-460 y un controlador TC-50

41

(Eppendorf, Madison, WI). La temperatura del detector de índice de

refracción fue de 30 C. La fase móvil utilizada fue agua desionizada

y filtrada a través de una membrana de 0.02 m, cuya velocidad de

flujo fue 0.5 mL/min. Los resultados obtenidos de las señales de los

detectores DDLMA-IR fueron analizados mediante el software ASTRA

(version 4.7.07, Wyatt Technology, Santa Barbara. CA. USA).

5.2.9 Calorimetría de barrido diferencial (CBD)

Las propiedades térmicas de los almidones fueron determinadas

usando un calorímetro de barrido diferencial (DSC-7, Perkin-Elmer,

Norwalk, CT) (Jane et al., 1999). Aproximadamente 2 mg de almidón

fueron pesados en una charola de aluminio, mezclado con 6 mL de agua

desionizada y selladas herméticamente. Las muestras fueron

equilibradas durante 1 hora a temperatura ambiente, la prueba fue

llevada a cabo a una velocidad de calentamiento de 10 °C /min en un

intervalo de 10-100 °C. Una charola vacía fue utilizada como

referencia. La velocidad de retrogradación del almidón fue

determinada usando las muestras gelatinizadas, almacenadas a 4 °C por

7 días, y analizadas usando CBD. El porcentaje de retrogradación es

la relación entre la (HR)/(HG). El análisis de las propiedades

térmicas fue llevado a cabo por triplicado para cada muestra.

5.2.10 Análisis rápido de la viscosidad (ARV)

Las propiedades de formación de pasta fueron analizadas usando

un analizador rápido de la viscosidad (ARV) (RVA-4, Newport

Scientific, Sydney, Australia) (Jane et al., 1999). Se preparó una

suspensión de almidón (8% p/p), pesando 2.24 g de almidón en un bote

42

de ARV y se agregó agua destilada hasta un peso final de 28 g. La

suspensión de almidón fue equilibrada a 30 °C por 1 min y calentada a

una velocidad de 6.0 °C/min hasta 95 °C, posteriormente se mantuvo a

esa temperatura por 5.5 min, y se enfrió hasta 50 °C a una velocidad

de 6 °C/min. Se utilizó una velocidad de rotación de pala de 160 rpm

durante todo el análisis. La prueba fue realizada por triplicado.

5.2.11. Análisis estadístico.

Para determinar las diferencias estadísticas en las

propiedades funcionales y afinidad al yodo se aplicó un análisis de

varianza (ANOVA) de una vía. A un nivel de significancia de 5 % ( p =

0.05) y los parámetros estadísticos se calcularon empleando el

paquete estadístico Sigma Stat versión 2.03.

43

VI. RESULTADOS Y DISCUSION

6.1 Contenido de almidón total y amilosa aparente

El contenido de almidón total de los almidones de maíz normal,

mango y plátano fueron: 97.8, 96.6 y 96.8 %, respectivamente (Cuadro

1). La pureza de estos almidones fue alta, el resto de los contenidos

están dados por cenizas, proteínas o lípidos, presentes en los

almidones, pero en mínimas cantidades.

La afinidad al yodo y su correspondiente contenido de amilosa

aparente se muestran en la Cuadro 1. El contenido de amilosa fue

diferente en los tres almidones analizados. El almidón de plátano

presentó el mayor contenido de amilosa (36.2 %), seguido del mango

(31.1 %) y maíz normal (29.7%). La diferencia en el contenido de

amilosa se ve reflejada en las propiedades fisicoquímicas, debido a

que los almidones con altos contenidos de amilosa, producen geles más

firmes y claros, así como, mayores propiedades de retrogradación y

formación de películas.

El contenido de amilosa aparente encontrado en el almidón de

plátano, concuerda con los valores reportados por Aparicio-Saguilan

et al. (2005), que determinaron un contenido de amilosa aparente de

37 %, y por Hernández et al. (2008) quienes cuantificaron el

contenido de amilosa en almidón de plátano con un método

colorimétrico (40 %) y mediante cromatografía de permeación en gel

(46 %); El almidón de mango presentó valores similares al reportado

por Agustiano-Osornio et al. (2005), quienes obtuvieron un contenido

de amilosa aparente de 28.7 % para almidón de mango de la misma

especie utilizada en este estudio. Sin embargo, existen reportes de

contenidos de amilosa aparente menores, reportados para almidones

44

Cuadro 1. Almidón total, afinidades al yodo y contenido de amilosa

aparente de almidones.

Fuentes Almidón totala (%) Afinidad al yodoa (%)* Amilosa aparenteb (%)

Maíz normal 97.8 1.60 5.88 0.15a 29.7

Mango 96.6 1.66 6.21 0.17a 31.1

Plátano 96.8 0.92 7.23 0.26b 36.2

1. Promedio de tres replicas desviación estándar

2. Calculado como C=(100 x AI)/20, donde: C es el porcentaje de amilosa aparente y AI es la afinidad al yodo del almidón desgrasado.

* Letras iguales indican que no existe diferencias estadísticas significativas (p 0.05).

45

de mango de las variedades criollo (12.9%) y manila (13.3%) (Bello-

Pérez et al., 2005a); por su parte el almidón de maíz normal,

presentó un contenido de amilosa aparente semejante al encontrado por

Jane et al. (1999), para almidón de maíz normal (29.7%) y empleando

titulación potenciométrica.

6.2 Microscopia electrónica de barrido

La figura 10 muestra las imágenes de los gránulos de almidón

de maíz normal (A), mango (B) y plátano (C), obtenidas por el

microscopio electrónico de barrido. La forma de los gránulos de

almidón depende de la fuente botánica, y se encuentran en la

naturaleza en diferentes formas y tamaños. El tamaño de granulo del

almidón de maíz normal estuvo en el intervalo de 10-15 m, mostrando

formas redondas, ovaladas y poligonales.

Los gránulos de almidón de mango presentaron forma esférica,

forma de campana, divididos y algunas hendiduras, con tamaño de

gránulo promedio de 5–10 m. Bello-Pérez et al. (2005a) reportaron el

tamaño de gránulo para dos variedades de mango (criollo y manila),

las cuales concuerdan con los valores reportados en este estudio. Por

otra parte, este tipo de morfología ha sido encontrada en otras

frutas como la calabaza (Stevenson et al., 2005) y la manzana

(Stevenson et al., 2006a). Las hendiduras en los gránulos de almidón

de mango, podrían deberse a que no existe un crecimiento uniforme en

el gránulo durante su desarrollo, o a que estos colapsan durante el

proceso de secado. Los gránulos de almidón de plátano fueron los de

mayor tamaño, con una longitud promedio de 40 m y un radio promedio

de 20 m, dichos valores coinciden con otros reportes

46

Figura 10. Micrografía electrónica de barrido de almidones de maíz normal (A), mango (B) y plátano (C). (La barra en la parte inferior

de las fotografías corresponde a una escala de 20 m).

A

B

C

47

de tamaño de gránulo para almidones de plátano (Bello-Pérez et al.,

2000; 2005b; Jane et al., 1994).

El tamaño de granulo es un parámetro importante que afecta las

propiedades funcionales y fisicoquímicas. Se ha reportado que los

gránulos muy pequeños pueden absorber una mayor cantidad de agua, en

comparación con gránulos grandes, debido a una mayor área de

contacto (Paredes-López et al., 1989).

6.3 Difracción de rayos X

El almidón de mango, al igual que el almidón de maíz normal,

presentó un patrón de difracción tipo A (figura 11). El patrón de

difracción tipo A se caracteriza por la presencia de picos de mayor

intensidad de difracción para los ángulos 2 = 15, 17, 18 y 23;

una diferencia entre ambos almidones se mostró en el pico a 2 = 20,

que es debido al complejo amilosa-lípidos (Tang et al., 2001), el

cual es más evidente en el almidón de maíz. Se tienen estudios de

almidón aislado de diferentes variedades de mango, los cuales también

han presentado un patrón de difracción tipo A (Bello-Pérez et al.,

2005a; Millán-Testa et al., 2005; Sandhu y Lim, 2008b), el cual es

típico de almidones de cereales (Zobel, 1988)

El almidón de plátano presentó un patrón de difracción que es

una mezcla entre los polimorfismos tipo A y B, el cual es referido

como el patrón de difracción tipo C. Ha sido reportado que el patrón

de difracción tipo C lo presentan algunas leguminosas y tubérculos

tropicales (Spence y Jane, 1999).

48

Como se puede observar en la figura 10, los tres almidones

estudiados mostraron picos similares, pero existen diferencias en el

almidón de plátano, debido a la presencia de cristales tipo B (el

cual presenta picos característicos de mayor intensidad en los

ángulos 2 = 5.6°, 17°, 22 y 24°). El patrón de difracción

determinado en el almidón de plátano, fue similar al reportado en

otros estudios de este tipo de almidón (Yoo y Jane, 2002b; Bello-

Pérez et al., 2005b; Millán-Testa et al., 2005).

El porcentaje de cristalinidad fue mayor para el almidón de

plátano (29%), seguido por el mango (27%) y el de menor cristalinidad

fue el maíz normal (22%). El valor de cristalinidad determinado para

plátano y mango fue menor que los calculados para las misma fuente

(36% y 35% almidón de plátano y mango, respectivamente) (Millán-Testa

et al., 2005). Jenkins y Donald (1995) investigaron la variación del

contenido de amilosa, sobre la estructura interna de almidones de

maíz, cebada y chícharo; indicaron que la amilosa se puede encontrar

dentro de las regiones cristalinas de la amilopectina, incrementando

el orden estructural, por lo que un aumento en el contenido de

amilosa incrementaría el porcentaje de cristalinidad de los

almidones. Este comportamiento fue encontrado en los almidones

estudiados, ya que el de plátano presentó el mayor contenido de

amilosa y el de cristalinidad.

Los almidones de plátano y mango presentaron diferentes

patrones de difracción, siendo ambos almidones de frutos. La forma en

que están empaquetadas las dobles hélices y el contenido de agua, son

parámetros determinantes del tipo de polimorfismo. Las dobles hélices

que presentan los cristales tipo A, están empaquetadas en forma

monoclínica y presentan de 4-8 moléculas de agua, mientras que los

cristales tipo B, presenta dobles hélices arregladas en forma

49

Figura 11. Patrón de difracción de rayos X de almidones: maíz normal, mango y plátano.

50

hexagonal y con un contenido de agua de 36 moléculas (Imberty et al.,

1991). Esto indica, que el almidón de mango presentó una estructura

mas compacta en comparación con el almidón de plátano, debido al

empaquetamiento de las dobles hélices de la amilopectina.

6.4 Cromatografía de permeación en gel

Los perfiles de elusión de los almidones nativos presentados

en la figura 12, muestran el contenido de carbohidratos totales y la

respuesta del valor azul derivado de la prueba de tinción con yodo.

En los perfiles de elusión, el primer pico (fracción I) corresponde a

la amilopectina, la cual, debido a su gran tamaño molecular, fue

eluida del gel en primer lugar. El segundo pico (fracción II)

corresponde a la amilosa.

Diversas investigaciones han detectado la presencia de

material intermedio eluido entre las fracciones I y II, representado

como una elevación del valor de la línea base, que no permite la

clara separación de ambas fracciones. El material intermedio presenta

propiedades diferentes a las de la amilosa y la amilopectina. (Wang

et al., 1993)

Entre los perfiles de elusión, existe una diferencia entre el

valor azul reportado para los tres almidones. Los almidones de

plátano y mango presentaron una mayor elevación de la línea base,

entre los valores de las fracciones I y II, lo que podría estar

asociado a la presencia de material intermedio.

El fraccionamiento del almidón fue llevado a cabo con la

finalidad de poder colectar las fracciones del primer pico (fracción

I), correspondiente a la amilopectina y con ello poder realizar la

51

Figura 12. Perfiles de elusión obtenidos mediante cromatografía de permeación en gel, para almidones de maíz normal (A), mango (B) y plátano (C). (valor azul ) y (carbohidratos totales )

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

20 30 40 50 60 70 80

Fracción

Re

sp

ue

sta

de

CH

O (

630

nm

)

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

Re

sp

ue

sta

de

V.A

. (4

90 n

m)

A

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

20 30 40 50 60 70 80 90

Fracción

Res

pu

es

ta C

HO

(6

30 n

m)

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

Re

sp

ue

sta

V.A

. (49

0 n

m)

B

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

20 30 40 50 60 70 80 90

Fracción

Re

sp

ue

sta

de

CH

O (

63

0 n

m)

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

Re

sp

ue

sta

V.A

. (49

0 n

m)

C

52

determinación de la distribución de sus cadenas. Para evitar la

caracterización del material intermedio, se colectaron las fracciones

correspondientes a 3/4 partes de la fracción I.

6.5 Electroforesis capilar asistida con fluoróforos

La figura 13 y Cuadro 2 muestra la distribución de la longitud

de las cadenas de la amilopectina para los almidones de maíz normal,

mango y plátano.

Cada uno de los almidones mostró un perfil de distribución de

cadenas distintivo, localizado en las cadenas cortas con un GP en el

intervalo 6–8. El maíz normal presentó una baja proporción de cadenas

con un GP 6, las cuales incrementaron gradualmente hacia los GP 7 y

8, lo cual ha sido reportado en almidones de cereales. (Jane et al.,

1999); El almidón de plátano también presentó un incremento en la

proporción de cadenas con un GP 6-8. Sin embargo, este incremento fue

más notorio que para el caso del almidón de maíz normal; el almidón

de mango presentó una proporción de cadenas cortas con un GP 7 mayor

a los GP 6 y 8, este tipo de distribución de cadena ha sido reportado

en almidones de tubérculos (McPherson y Jane, 1999). Algunas

tendencias han sido reportadas para la distribución de la longitud de

las cadenas de amilopectina, por ejemplo, una distribución bimodal

con una alta proporción de cadenas con un grado de polimerización

entre 13-24, seguido por una proporción de cadenas cortas con GP

entre 6-12, y adicionalmente cadenas con GP 37 (Hanashiro et al.,

1996).

Hanashiro et al. (1996) y Jane et al. (1999), reportaron que

los almidones con patrón de difracción tipo A tienen mayor proporción

de cadenas cortas, con un GP 6-12 y una menor proporción de cadenas

53

largas, con un GP 37, en comparación con los almidones tipo B. Lo

anterior concuerda con lo encontrado en este estudio, en donde los

almidones de mango y maíz normal, al ser almidones tipo A,

presentaron una mayor proporción de cadenas cortas con un GP 6-12

(mango 25.7% y maíz normal 24%) y una menor proporción de cadenas

largas con un GP 37 (mango 16.6% y maíz normal 13.4%) en

comparación con el almidón de plátano, que presentó una cristalinidad

tipo C, el cual mostró una menor proporción de cadenas cortas (20.5%)

y una mayor proporción de cadenas largas (18.6%).

En el Cuadro 2, se reportan los valores de longitud de cadena

promedio para las amilopectinas. La amilopectina aislada de almidón

de plátano, presentó una longitud cadena promedio que fue comparable

con el reportado para la amilopectina de almidón de Ginkgo biloba

(24.2), el cual, al igual que el almidón de plátano, presenta una

patrón de difracción tipo C (Spence y Jane, 1999). Por su parte, los

almidones de maíz normal y mango, presentaron una longitud de cadena

promedio comparable a los reportados para almidones de maíz común

(21.1) (Kuakpetoon y Wang, 2008) y arroz (22.7) (Patindol y Wang,

2002), los cuales mostraron un patrón de difracción tipo A.

La distribución de la longitud de cadenas de la amilopectina

desramificada, ha sido estudiada utilizando cromatografía de alta

definición por intercambio aniónico (CLARIA), equipada con un

detector de pulsos amperométricos (DPA). Amilopectinas de varios

cultivares fueron desramificadas con isoamilasa y estudiadas mediante

CLARIA-DPA. Patindol y Wang (2002), reportaron 4 grupos de cadenas,

la primera fue las cadenas tipo A y los otros tres grupos

correspondían a las cadenas B del modelo de cluster. Se encontraron

diferencias en el porcentaje de distribución de esos grupos entre los

cultivares.

54

Figura 13. Distribución de la longitud de cadena para amilopectinas desramificadas [maíz normal (A), mango (B) y plátano (C)]

55

Cuadro 2. Distribución de la longitud de las cadenas de la amilopectina.

Fuente LC Distribución (%) mayor valor

Promedio GP 6-12 GP 13-24 GP 25-36 GP 37 GP DetectableMaíz normal 21.5 24.0 50.2 12.3 13.4 80

Mango 22.3 25.7 46.1 11.6 16.6 84

Plátano 23.9 20.5 48.1 12.9 18.6 89

Promedio de dos replicas.

LC = longitud de cadena

GP = grado de polimerización

56

6.6 Cromatografía de alta resolución por exclusión de

tamaño (CLARET) acoplada a detectores de dispersión de luz

multi-ángulos (DDLMA) e índice de refracción (IR)

La masa molecular promedio (MM) y radio de giro (RG) de las

amilopectinas de almidón de maíz normal, mango y plátano, se

muestran en la Cuadro 3. Las amilopectinas de mango y maíz normal

presentaron valores similares de MM, y este fue más alto que el

calculado para amilopectina de plátano. Este patrón también se

presentó para el radio de giro de los almidones estudiados, debido

a que la amilopectina de mango mostró el valor de RG mayor (297.85

nm) y la amilopectina de plátano el valor más bajo (267.10 nm). El

valor de la MM encontrada para maíz normal, concuerda por lo

reportado en la literatura (Yoo y Jane, 2002b). La masa molecular

y radio de giro de la amilopectina de plátano presentó un valor

mayor al reportado en la literatura (Yoo y Jane, 2002b), lo cual

puede ser atribuido a la diferente especie del almidón de plátano

utilizado.

Una característica de las MM de los tres almidones, es que

disminuye conforme aumenta el contenido de amilosa, una

correlación similar ha sido encontrada en otros estudios (Yoo y

Jane, 2002b; Millán-Testa et al., 2005; y Sandhu y Lim, 2008).

Esto se atribuye, a que durante la biosíntesis del almidón, el

flujo de carbono en forma de ADP-glc (adenosin difosfato glucosa)

es dividido entre la síntesis de amilosa y amilopectina. Esto

provoca que los almidones con mayor contenido de amilosa generen

amilopectinas con menor masa molecular, debido a que la mayor

parte de ADP-glc es incorporada a las moléculas de amilosa.

Las amilopectinas de mango y maíz normal presentaron MM

similares y RG diferentes, siendo la amilopectina de mango la que

mostró un RG mayor al RG de la amilopectina de maíz normal (Cuadro

3), lo cual esta asociado con los resultados obtenidos de la

distribución de la longitud de las cadenas de amilopectina, en

57

donde se determinó que el mango tiene mayor proporción de cadenas

largas (GP 37), en comparación con el almidón de maíz normal,

por lo que ocupara un volumen mayor, debido a que los valores de

RG están asociados con el volumen de las moléculas de amilopectina

cuando estas permanecen en solución (Millard et al., 1997). Así,

la amilopectina de mango presentó un RG mayor, debido a la

estructura de sus cadenas.

La amilopectina de mango y maíz normal tuvieron una

densidad mayor a la del plátano (Cuadro 3). Esto se relaciona con

el tipo de cristalinidad, ya que los almidones de maíz y mango

tuvieron una cristalinidad tipo A, la cual presenta un

empaquetamiento más compacto (debido al contenido de agua y

longitud de las cadenas de amilopectina), en comparación con la

cristalinidad tipo C mostrada por el almidón de plátano. Por lo

cual, entre mayor es la densidad molecular la molécula es mas

compacta.

Estudios en amilopectinas de diversas fuentes botánicas han

mostrado MM en un intervalo entre 5.4 x 107 y 1.1 x 108 g/mol y

valores de RG entre 171 y 242 nm (Aberle et al., 1994). La

amilopectina de maíz, solubilizada utilizando calentamiento con

microondas por 35 s, mostró MM de 2.2 x 108 g/mol y RG de 229 nm

(Bello-Pérez et al., 1998). Amilopectinas de diversas fuentes

botánicas presentaron MM entre 2.9 x 107 y 3.5 x 108 g/mol, y RG

entre 95-340 nm (You et al., 1999); y MM entre 1.3 – 56.8 x 108

g/mol, y RG entre 201-782 nm (Yoo y Jane, 2002b). Las

amilopectinas de almidón de Tef [Eragrostis tef (Zucc.) Trotter]

provenientes de diversas cultivares, presentaron MM en un

intervalo de 1.0 a 1.4 x 108 g/mol, y RG entre 156 y 205 nm

(Bultosa et al., 2008). Estos estudios emplearon el sistema

CLARET-DDLMA-IR similar al utilizado en este trabajo.

58

Cuadro 3. Peso molecular (MM), radio de giro (RG) y () densidad

molecular de amilopectinas de diferentes fuentes

botánicas.

Amilopectina

Fuentes MM x 10 8 (g/mol)a RG (nm)

a (g/mol/nm3)b

Maíz normal 5.154 ± 0.065 281.10 ± 1.980 23.20Mango 5.013 ± 0.177 297.85 ± 1.202 18.97Plátano 3.371 ± 0.179 267.10 ± 5.515 17.69

a Promedio de dos replicas

b = (MM / RG3)

59

6.7 Calorimetría de barrido diferencial

Las características de gelatinización de los almidones

estudiados se presentan en el Cuadro 4. El almidón de plátano

presentó las mayores temperaturas (To, Tp, Tc) y entalpía (H) de

gelatinización, seguido por el almidón de mango y maíz normal. La

transición observada corresponde al proceso de fusión de las

dobles hélices de la amilopectina y a la perdida de cristalinidad

(Cooke y Gidley, 1992).

Yuan et al. (1993), reportaron que los valores altos de H

para el almidón ceroso ae, se atribuía al alto porcentaje de

cadenas largas que presentaba; por otra parte, Jane et al., (1999)

y Patindol y Wang (2002), infirieron que las ramificaciones con

cadenas larga en la amilopectina, podrían minimizar la tendencia

de la amilosa para formar complejos e interlazarse con otras

ramificaciones, manteniendo así la integridad de los gránulos de

almidón durante su calentamiento, lo cual podría resultar en una

temperatura de gelatinización mayor. Estos estudios concuerdan con

lo encontrado para los almidones de plátano, mango y maíz normal,

ya que el almidón de plátano presentó una mayor temperatura y

entalpía de gelatinización, así como una mayor proporción de

cadenas largas en comparación con los almidones de mango y maíz

normal.

Además, el almidón de plátano presentó el mayor porcentaje

de cristalinidad, comparado con los almidones de maíz normal y

mango, lo que podría estar relacionado con la entalpía de

gelatinización (Tang et al., 2001), ya que un valor alto de

entalpía de gelatinización, puede sugerir que una mayor cantidad

de energía fue requerida para fundir los cristales formados por

las cadenas de amilopectina (Patindol y Wang, 2002).

60

Los datos de CBD del almidón retrogradado se presentan en

el Cuadro 5. Los parámetros de retrogradación (To, Tp, Tc, H y

%R) encontrados para el almidón de plátano, fueron mayores en

comparación con los almidones de mango y maíz normal. El mecanismo

de retrogradación es un proceso que involucra varios factores:

diferencias en la proporción e interacción de las moléculas de

amilopectina y amilosa, a la distribución de la longitud de las

cadenas y tamaño molecular de la amilopectina (Eliasson and

Gudmunsson, 1996), contenido de lipidos, fosfolípidos y

monoesteres de fosfato (Jane et al., 1999). El almidón de plátano

retrogradado durante 7 dias a 4 °C, presentó mayor estabilidad

térmica, en comparación con los almidones mango y maíz normal,

debido a que se desorganizó a una mayor temperatura y con alta

entalpía. Este patrón indica que un mayor perfeccionamiento de los

cristales fue desarrollado en el almidón de plátano, en

comparación con los otros almidones. Sin embargo, es importante

mencionar que la temperatura de pico de las muestras almacenadas,

fueron menores que las determinadas en el estudio de

gelatinización, debido a que durante el fenómeno de retrogradación

se forman cristales pequeños y/o imperfectos, los cuales se

desorganizan a menor temperatura (Paredes-López et al., 1994;

Bello-Pérez et al., 2005c). El almidón de plátano presentó el

valor de entalpía de retrogradación más alto. Este patrón

concuerda con el mayor nivel de cadenas largas (GP 37)

encontrado en el almidón de plátano. El almidón de mango mostró

el grado de retrogradación mas bajo, lo cual se atribuye a la alta

proporción de cadenas cortas de la amilopectina (Shi y Seib, 1992;

Yuan et al., 1993). El almidón de plátano presentó un grado de

retrogradación más alto; se han reportado una retrogradación

rápida del almidón de plátano, porque después de 14 horas de

almacenamiento aparecen algunos picos de cristalinidad; sin

embargo, el polimorfismo de almidón de plátano retrogradado es

tipo A (Bello-Pérez et al., 2005c).

61

Cuadro 4. Propiedades térmicas de gelatinización de almidón1

Fuente TO (C) TP (C) TC (C) ∆H (J/g)

Maíz normal 63.9 ± 0.2a 68.7 ± 0.3a 73.2 ± 0.4a 13.4 ± 0.3a

Mango 66.5 ± 0.2b 71.3 ± 0.3b 76.1 ± 0.3s 14.0 ± 0.7a

Plátano 70.9 ± 0.6c 76.5 ± 0.9c 83.3 ± 1.0c 16.5 ± 0.7b

1 = Temperatura de inicio (TO), Temperatura de pico (TP), Temperatura de conclusión (TC), cambio de entalpía (∆H).Valores promedio de 3 replicas.

* Letras iguales indican que no existe diferencias estadísticas significativas (p 0.05).

62

Cuadro 5. Propiedades térmicas de retrogradación de almidón1

Fuente T0 (C) TP (C) TC (C) ∆H (J/g) % R

Maíz normal 37.3 ± 0.5a 50.2 ± 0.2a 61.5 ± 0.8a 7.2 ± 0.6a,b 53.6a

Mango 39.9 ± 2.3b 52.7 ± 1.4a 62.3 ± 0.1a 5.4 ± 0.0a 38.4b

Plátano 42.1 ± 0.6b 56.5 ± 2.4b 67.7 ± 0.4b 9.4 ± 1.9b 56.9a

1 = Temperatura de inicio (TO), Temperatura de pico (TP), Temperatura de conclusión (TC), cambio de entalpía (∆H). Porcentaje de retrogradación (%R). Valores promedio de 3 replicas.

* Letras iguales indican que no existe diferencias estadísticas significativas (p 0.05).

63

6.8 Análisis rápido de la viscosidad.

Las propiedades de formación de pasta del almidón son

afectadas por los contenidos de amilosa, lípidos y por la

distribución de cadena de la amilopectina. La amilopectina

contribuye al hinchamiento del gránulo de almidón, mientras que la

amilosa y lípidos inhiben el hinchamiento (Tester y Morrison

1990). La distribución de la longitud de cadenas de la

amilopectina y el tamaño molecular de la amilosa produce un efecto

sinergístico sobre la viscosidad de las pastas de almidón (Jane y

Chen, 1992). Por lo cual el efecto de las características

estructurales sobre las propiedades de formación de pasta es

complejo. Cuando las dispersiones de almidón son calentadas

utilizando una velocidad de calentamiento constante, la viscosidad

aumenta hasta obtener un valor máximo (Figura 14). Los valores de

la temperatura de formación de pasta de los almidones estudiados,

fueron obtenidos en el siguiente orden maíz normal plátano

mango (Cuadro 6).

Los valores de viscosidad pico obtenidos, mostraron que el

almidón de plátano presentó el valor mas alto y al maíz normal el

mas bajo. La diferencia entre la temperatura de inicio de

gelatinización (To), obtenida con CBD y la temperatura de

formación de pasta obtenida con ARV, fue mayor en el almidón de

maíz que para los almidones de mango y plátano, debido a que el

hinchamiento del granulo pudo ser inhibido por la presencia de

complejos amilosa – lípidos.

La viscosidad pico del almidón de mango fue obtenida a una

temperatura menor, que para los almidones de plátano y maíz

normal, y puede observarse una platea, hasta que la temperatura

del sistema se mantuvo a 95 °C. La altura de los picos refleja la

habilidad de los gránulos de almidón para hincharse libremente

antes de su rompimiento físico (Singh et al., 2003). Cuando el

almidón es calentado en exceso de agua, sus gránulos se hinchan y

64

al mismo tiempo parte de sus componentes (principalmente amilosa

y algunas cadenas externas de la amilopectina) son solubilizadas,

dando lugar a partículas hinchadas y dispersas en una fase

continua (Thebaudin et al., 1998). Este patrón se relaciona con la

distribución de las cadenas de la molécula de amilopectina, más

que con su MM (Shibanuma et al., 1996).

Durante la fase de calentamiento constante a 95 C, una

disminución de la viscosidad fue encontrada para los tres

almidones, debido al rompimiento de algunos gránulos. Stevenson et

al. (2006a) encontraron una correlación entre la viscosidad de

rompimiento (BreakDown) de los gránulos y la distribución de la

longitud de las cadenas de la amilopectina. Sus resultados

mostraron que los almidones con amilopectinas con mayor porcentaje

de cadenas largas (GP 37), menor cantidad de cadenas con GP 13-

24, y con un alto contenido de amilosa aparente, presentaron

valores bajos de viscosidad de rompimiento, debido a que, durante

el hinchamiento del gránulo, estos tres factores ayudan a mantener

su integridad.

Durante la fase de enfriamiento, se presentó un incremento

en la viscosidad, debido a la reorganización de las cadenas

solubilisadas durante la fase de calentamiento y fase de

sostenimiento, produciendo una red que retiene una mayor cantidad

de moléculas de agua (Mali et al., 2003; Gimeno et al., 2004) y

dan las características de una pasta.

Los valores de viscosidad de recuperación (setback) están

asociados con los contenidos de amilosa (Thitripraphunkul et al.,

2003). Almidones con altos contenidos de amilosa presentan mayores

viscosidades de recuperación, lo cual concuerda por lo reportado

para los almidones en este estudio.

65

Figura 14. Perfiles de viscosidad de los almidones maíz normal (o), mango (∆) y plátano (), obtenidos con un analizador rápido de la viscosidad. (8 % bs).

66

Cuadro 6. Propiedades de formación de pasta de almidón, determinado mediante un analizador rápido

de la viscosidad.1

Viscosidad (RVU)

Fuente

Temperatura de

formación de

pasta (°C) Pico

Rompimiento

(BreakDown) Final

Recuperación

(Set Back)

Maíz normal 84.3 ± 0.889a 149.8 ± 0.5a 68.3 ± 0.8a 145.1 ± 0.7a 63.6 ± 1.0a

Mango 71.3 ± 0.2b 194.1 ± 3.2b 50.2 ± 3.4b 239.1 ± 2.7b 95.2 ± 2.0b

Plátano 79.3 ± 0.3c 215.8 ± 2.7c 33.5 ± 2.2c 323.7 ± 6.3b 141.4 ± 5.4c

1 promedio de tres replicas.

* Letras iguales indican que no existe diferencias estadísticas significativas (p 0.05).

67

6.9 Relación estructura función.

La distribución de las cadenas de la amilopectina del almidón

de plátano, presentó una mayor proporción de cadenas largas, lo cual

esta relacionado con un patrón de difracción de rayos X tipo B- ó C-.

Debido al arreglo de estas cadenas en una estructura cristalina, la

hidrólisis enzimática de este tipo de almidón se ve disminuida, esta

característica del almidón de plátano puede ser utilizada para la

producción de almidón resistente (Aparicio-Saguilan et al., 2005)

Además, el almidón de plátano puede ser adicionado a varios

productos alimenticios, tales como: galletas, bisquetes, pastas, etc.

Los cuales son elaborados en condiciones de baja humedad, con lo cual

no se lleva a cabo una gelatinización completa del almidón y se

conserva parte de su estructura granular nativa hasta el momento de

ser consumidos. Esto produce un alimento con baja digestibilidad del

almidón, el cual es considerado un alimento nutraceútico, el cual

tiene efectos benéficos sobre la salud.

El almidón de mango mostró una mayor proporción de cadenas

cortas, lo cual repercutió sobre el porcentaje de retrogradación,

presentándose un bajo porcentaje, por lo que se sugiere que el

almidón de mango sea utilizado en panificación, ya que este

retardaría el endurecimiento de los productos y se mantendrían suaves

por más tiempo.

Otra característica del almidón de mango, es que debido al

alto porcentaje de cadena cortas, las temperaturas de formación de

pasta y de gelatinización son menores, lo que permitiría una

dispersión de la pasta almidón a bajas temperaturas y proveería una

textura suave (sin grumos) al alimento, debido a la ausencia de

gránulos de almidón sin gelatinizar. Además, el almidón de mango

68

presenta una viscosidad mayor (en comparación con el almidón de

maíz), por lo que puede ser aprovechado para la elaboración de

salsas, sopas y aderezos

La baja temperatura de formación de pasta (71 °C) del almidón

de mango, presenta ventajas sobre los almidones de cereales, tales

como el maíz y arroz, cuya temperatura de formación de pasta es

mayor por 10-12 °C y almidones de trigo, cebada y centeno con

temperaturas de formación de pasta mayores por 18-25 °C, por lo cual,

las industrias alimenticias pueden ahorrar energía para obtener

viscosidades similares y los consumidores pueden beneficiarse con una

textura menos granulosa, la cual se obtiene cuando los almidones no

son procesados a temperaturas mayores a los 80 °C (Thomas y Atwell,

1998)

Los gránulos de almidón de mango son más pequeños que el

almidón de maíz, y debido a la ausencia de gránulos mayores a 10 m

de diámetro, se sugiere que este podría tener aplicaciones como un

sustituto de grasa.

69

VII. CONCLUSIONES

- Se encontró que la amilopectina de plátano mostró valores de MM,

RG y menores en comparación a los mango, esto se relaciona con

el tipo de cristalinidad, lo que indica que existe una

estructura y mecanismo biosintético distinto.

- El almidón de plátano presentó una mayor entalpía de

gelatinización y alta viscosidad de empastado, debido al alto

contenido de amilosa y mayor porcentaje de cadenas largas que

presenta la molécula de amilopectina.

- Los resultados obtenidos para los diferentes almidones

estudiados, pueden ser importantes para sugerir aplicaciones

específicas con la finalidad de desarrollar nuevos

productos.

70

VII. BIBLIOGRAFIA

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