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Universidade de São Paulo Instituto de Física de São Carlos
CAROLINE HOFF
ESTUDOS ESTRUTURAIS DA SEPTINA
HUMANA SEPT11
São Carlos
2008
CAROLINE HOFF
ESTUDOS ESTRUTURAIS DA SEPTINA HUMANA SEPT11
São Carlos 2008
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Física do Instituto de Física de São Carlos da Universidade de São Paulo, para obtenção do título de mestre em Ciências. Área de Concentração: Física Aplicada – Opção Física Biomolecular. Orientador: Prof. Dr. Richard Charles Garratt
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
Ficha catalográfica elaborada pelo Serviço de Biblioteca e Informação IFSC/USP
Hoff, Caroline. Estudos estruturais da septina humana SEPT11 / Caroline Hoff; orientador Richard Charles Garratt. -- São Carlos, 2008.
125 p.
Dissertação (Mestrado em Ciências - Área de concentração: Física
Aplicada – Opção Física Biomolecular) – Instituto de Física de São Carlos da Universidade de São Paulo.
1. Septina 11. 2. Clonagem. 3. Expressão. 4. Caracterização estrutural. 5. Atividade GTPásica. I. Título.
Dedico este trabalho aos meus pais João e Nadir, meu irmão Giu e ao meu noivo Caio, pelo amor, incentivo, esforço e apoio incondicional.
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador Prof. Dr. Richard Charles Garrat pela competência e ensinamentos que contribuíram valiosamente para a realização deste trabalho. A Prof. Dra. Ana Paula Ulian de Araújo pelo apoio e importante colaboração durante o mestrado. Aos meus pais, João e Nadir, por terem durante esses anos acreditado e confiado em mim. Obrigada pelo incentivo e por nunca terem duvidado da minha capacidade desde o momento em que sai do aconchego da nossa casa. Ao meu irmão Giu, meu grande amigo que no momento em que mais o precisei se mostrou uma pessoa maravilhosa. Obrigada por ter feito tão bem o seu papel de irmão. Ao meu companheiro, meu noivo Caio, que sempre esteve comigo nas horas de alegria, de tristeza, nos desabafos, na saudade de casa, nas angústias, nas incertezas. Obrigada por me proporcionar tantos momentos maravilhosos e me ajudar a superar os momentos de dificuldade, sem o seu apoio, seu amor e dedicação não teria conseguido, “meu Liebe”. Aos colegas Wanius, Joci, Daniel, Sheila, Júlio e Assuero (Sussu) pelas valiosas dicas e ajuda relevantes sobre o projeto realizado.
As técnicas e amigas do grupo de biofísica e cristalografia, Andressa, Bel (mãezinha), Gi, Suzana, Bianca e também ao Kelvin (uma figura). A minha família adquirida Sr. Fernando (Vô), D. Leila (Vó), Si, Jorge, Enzo, Marcelo, Bruna e Cacau. Vocês me ajudaram muito na realização desse sonho, obrigada por tudo. A minha querida e eterna amiga e irmã do coração Lívia (“Pequerrucha”), pela amizade, carinho e companhia. Às famílias dos queridos amigos Tio Devanei e Tia Rosi, Auro e Gisseli. Obrigada pelo carinho, pelos conselhos e por tão bem me acolherem em sua casa quando cheguei a São Carlos. Aos professores dos grupos de Biofísica e Cristalografia. Aos colegas da Biofísica e Cristalografia, amigos de churrascos, cafés, conversas e congressos. Agradeço a todos! Aos colegas e, sobretudo amigos do grupo de septinas, em especial a Nathália, Nayara, Joci, Júlio, Wanius e Ivo.
Aos meus colegas e amigos de sala, Renata, Deise, Karime, Tati, Matheus, Cláudia, Aderson e Jean.
As minhas queridas amigas Nadia Helena (cérebro), Ana Letícia (pink), Lívia Salum, Dani, Amanda e Sandra. Passamos por momentos inesquecíveis que ficarão na memória pra sempre. Aos professores Dr. Edson Roberto da Silva e Dr. Otávio Henrique Thieman pela minha ida ao grupo de Cristalografia. Aos colegas Elisandra e Fernando Alessandro pelos ensinamentos durante o meu curto estágio. Agradeço à Universidade de São Paulo, em especial ao programa de Pós-Graduação em Ciências, área de concentração Física aplicada: opção Física Biomolecular do Instituto de Física de São Carlos.
À FAPESP pelo apoio financeiro.
RESUMO
Septinas são proteínas de ligação ao nucleotídeo de guanina (GTP). Foram inicialmente
identificadas em fungos e atuam na fase final da divisão celular. Posteriormente, também
verificaram que esta família de proteínas está presente em outros eucariotos com exceção de
plantas. Septinas são purificadas de fungos Saccharomyces cerevisiae, Drosophila e cérebro
de mamíferos na forma de heterofilamentos e são constituídas de três regiões principais: um
N-terminal variável, um domínio central GTPase altamente conservado e um domínio coiled-
coil C-terminal. Sabe-se que existem pelo menos catorze genes que codificam septinas em
humanos, no entanto, há poucas informações estruturais sobre elas. Destas catorze septinas,
somente três (septinas 2, 6 e 7) tiveram parte de suas estruturas cristalográficas determinada,
principalmente os domínios GTPase. A família das septinas pode ser dividida em quatro
subgrupos baseado em similaridade seqüencial. Um deles (grupo II) é formado por SEPT6,
SEPT8, SEPT10, SEPT11 e a recém-descoberta SEPT14. A proteína SEPT11 foi descrita
pela primeira vez em 2004 e detectada em vários tecidos humanos. Faz parte de complexos
com outras septinas na formação de heterofilamentos e pode estar envolvida no transporte
tubular e filtração glomerular nos rins. Para apresentar os estudos com a proteína SEPT11 nós
a dividimos em domínios estruturais: SEPT11NG (domínios N-terminal e GTPase),
SEPT11G (domínio GTPase), SEPT11GC (domínios GTPase e C-terminal) e SEPT11NGC
(domínios N-terminal, GTPase e C-terminal). Os genes dos domínios estruturais SEPT11G e
SEPT11GC foram clonados em vetor de expressão bacteriano, e SEPT11NG em vetor de
propagação bacteriano. Tanto SEPT11G quanto SEPT11GC foram produzidos em E. coli e
purificados com sucesso. O espectro de dicroísmo celular (CD) e o emprego de técnicas
computacionais mostraram que a SEPT11 apresenta um perfil característico de proteínas do
tipo α/β coerente com a estrutura observada para SEPT6. Os estudos de espalhamento de luz
a 350 nm mostraram que a proteína sofre um forte processo de agregação em temperaturas
maiores que 30°C, parecido com outras septinas (incluindo SEPT4 e SEPT2) e condizentes
com estudos de estabilidade térmica acompanhados por CD. Resultados de cromatografia de
exclusão molecular indicam que SEPT11G foi produzida na forma de um homodímero (como
também visto para SEPT4, SEPT2 e SEPT7) e SEPT11GC na forma de um monômero.
Todos estes dados sugerem que as proteínas heterólogas descritas aqui enovelaram
corretamente e assumiram sua estrutura nativa. Porém também foi demonstrado que a
SEPT11G não apresentava nenhum nucleotídeo ligado (GDP ou GTP) mesmo quando
purificada na presença dos mesmos. Resultados de modelagem da SEPT11G baseado no
domínio GTPase da SEPT6 não revelaram nenhuma diferença significativa em torno do sítio
ativo capaz de explicar a incapacidade da SEPT11 em ligar GTP/GDP. Especulamos que no
caso da SEPT11 (e possivelmente outras septinas do grupo II), a presença de outras septinas e
a montagem do heterofilamento sejam necessárias para estabilizar a interação entre GTP e a
proteína.
Palavras-chave: Septina 11, Clonagem, Expressão, Caracterização Estrutural e Atividade
GTPásica.
ABSTRACT
Septins are GTP-binding proteins. They were originally identified in fungi and act
during the final stages of cell division. Subsequently, they were also identified in other
eukaryotic with the exception of plants. Septins are purified from Saccharomyces cerevisiae,
Drosophila, and mammalian brain in the form of heterofilaments and consist of three
principal regions: a variable N-terminal domain, a central highly conserved GTP-binding
domain and a coiled-coil domain at the C-terminus. It is known that there are at least 14
human septin genes but as yet, there is still relatively little structural information concerning
their protein products. Of these, only three (septins 2, 6 and 7) have had part of their three-
dimensional structure (principally the GTPase domain) determined by X-ray crystallography.
The septin family can be divided into four subgroups on the basis of sequence similarity. One
of them (group II) is composed of SEPT6, SEPT8, SEPT10, SEPT11 and SEPT14. SEPT11
was described for the first time in 2004 and was observed to be expressed in several human
tissues. It is described as forming part of heterofilamentous complexes with other septins and
may be involved in the glomerular filtration in the kidney. In order to characterize the
SEPT11 protein, it was initially divided into its component structural domains and several
constructs elaborated: SEPT11NG (N-terminal and GTPase domain), SEPT11G (GTPase
domain), SEPT11GC (GTPase domain and C-terminal) and SEPT11NGC (N-terminal,
GTPase and C-terminal domains). The genes corresponding to SEPT11G and SEPT11GC
were cloned in an expression vector and SEPT11NG into a bacterial propagation vector. Both
SEPT11G and SEPT11GC were successfully produced in E. coli and subsequently purified.
Both circular dichroism spectra and computational techniques indicated that SEPT11
exhibited that both proteins were of the the αβ type, as anticipated, coherent with the structure
of SEPT6. Light scattering measurements at 350 nm showed that the protein undergoes a
process of aggregation at temperatures above 30°C, similar to other septins (SEPT2 and
SEPT4) and consistent with thermal stability studies using circular dichroism. Results of size
exclusion chromatography indicated that SEPT11G formed dimers (similar to SEPT2, SEPT4
and SEPT7) and SEPT11GC apparently formed monomers only. All of these experimental
data suggest that the heterologously expressed proteins described here folded into their native
conformation. On the other hand, we also demonstrated that SEPT11G was nucleotide free
even when purified in the presence of excess GTP or GDP. Homology modeling of the
GTPase domain of SEPT11 failed to reveal any significant differences with respect to SEPT6
which would explain this lack of binding activity. We speculate that in the case of SEPT11
(and possibly other members of the group II septins) the presence of partner septins and the
formation of the heterofilaments are essential for stable nucleotide binding.
Keywords: Septin 11, Cloning, Expression, Structural Characterization and GTPase Activity.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.1 Dendrograma das septinas de mamíferos ................................................... 22
Figura 1.2 Classificação dos domínios das septinas .................................................... 24
Figura 1.3 Polimerização dos filamentos de septinas em espirais e anéis ..................
Figura 1.4 Arquitetura do trímero formado pelas septinas SEPT2, SEPT6 e SEPT7..
26
Figura 1.5 Filamento de septinas ................................................................................ 27
Figura 1.6 Microscopia eletrônica mostrando unidades hexaméricas formadas pelas
septinas SEPT2, SEPT6 e SEPT7 ............................................................
27
Figura 1.7 Diagrama esquemático da posição das septinas na superclasse P-loop
NTPase, a qual é dividida em duas classes, chamadas de SIMIBI
(partícula de reconhecimento de sinal, MinD e BioD) e TRAFAC (fator
de tradução) ..............................................................................................
29
Figura 1.8 Diagrama esquemático da SEPT11 ............................................................ 34
Figura 1.9 Caracterização do anticorpo anti-SEPT11-C para SEPT11 ....................... 35
Figura 3.1 Fórmula estrutural e molecular dos nucleotídeos de guanina .................... 58
Figura 3.2 Esquema de cristalização usando o método da gota suspensa .................... 68
Figura 3.3 Etapas envolvidas no processo de obtenção de modelos protéicos ............ 72
Figura 4.1 Resultado da amplificação do fragmento que codifica a SEPT11 ............. 75
Figura 4.2 Padrão de restrição de Sept11G e Sept11GC em pET28a (+) .................... 76
Figura 4.3 Resultado da amplificação do fragmento que codifica a SEPT11NG ....... 77
Figura 4.4 Padrão de restrição do DNA plasmidial pTZ57R/TSept11NG .................. 78
Figura 4.5 Resultado da amplificação de Sept11NGC ................................................ 80
Figura 4.6 Expressão e purificação de domínios da SEPT11 ...................................... 81
Figura 4.7 Perfil da cromatografia de exclusão molecular do domínio SEPT11G na
coluna Superdex-200 ................................................................................
82
Figura 4.8 Perfil da cromatografia de exclusão molecular do domínio SEPT11GC
na coluna Superdex-200 ...........................................................................
83
Figura 4.9 Perfil da cromatografia de exclusão molecular de SEPT11G na resina
Superdex-200 após incubação com GTP .................................................
85
Figura 4.10 Cromatografia de troca aniônica mostrando a separação do GDP e GTP
quando tratados com o método de desnaturação química com ácido
perclórico (A). Cromatograma do ácido perclórico após tratamento com
o método de desnaturação química (B) ....................................................
87
Figura 4.11 Cromatografia de troca aniônica mostrando a separação do GDP e GTP
quando tratados com o método de desnaturação térmica .........................
88
Figura 4.12 Cromatografia de troca aniônica mostrando a separação de GDP e GTP
após a desnaturação química com ácido perclórico de SEPT2 e
SEPT11.....................................................................................................
90
Figura 4.13 Cromatografia de troca aniônica mostrando a separação de GDP e GTP
após a desnaturação térmica de SEPT2 e SEPT11 ...................................
92
Figura 4.14 Cromatografia de troca aniônica mostrando a separação de GDP e GTP
após a desnaturação química com ácido perclórico da SEPT11
(sobrenadante). A amostra foi expressa e purificada na presença ou
ausência de GDP ou GTP. Os resultados mostram que SEPT11G não
libera GDP ou GTP após a desnaturação com ácido perclórico ..............
93
Figura 4.15 Cromatografia de troca aniônica mostrando a taxa de hidrólise do GTP
da SEPT11G após incubação com o nucleotídeo por tempos diferentes
(T1-T6) .....................................................................................................
94
Figura 4.16 Espectro de CD de domínios da SEPT11a 20ºC ..................................... 96
Figura 4.17 Espectro de CD de domínios da SEPT11. Monitoração do mínimo em
222 nm em função da temperatura ...........................................................
97
Figura 4.18 Variação do espalhamento de luz a 350 nm em função do tempo para os
domínios da SEPT11 ................................................................................
100
Figura 4.19 Predição da estrutura secundária da septina humana SEPT11.................. 103
Figura 4.20 Modelo da estrutura tridimensional do sítio de ligação ao nucleotídeo da
SEPT11 ....................................................................................................
104
Figura 4.21 Domínios GTPases das septinas de humanos SEPT1 a SEPT12 e
SEPT14 ....................................................................................................
106
Figura 4.22 Filamento formado pelas septinas SEPT2/7/11 ........................................ 110
LISTA DE TABELAS
Tabela 1.1 Andamento do projeto de septinas do CBME/CEPID ............................... 38
Tabela 3.1 Oligonucleotídeos senso …........................................................................ 46
Tabela 3.2 Oligonucleotídeos antisenso ...................................................................... 46
Tabela 3.3 Oligonucleotídeos utilizados para a amplificação dos fragmentos de
cDNA Sept11G, Sept11GC e Sept11NG ..................................................
47
Tabela 3.4 Reagentes utilizados na reação de PCR para amplificação dos
fragmentos de cDNA Sept11G, Sept11GC e Sept11NG ..........................
48
Tabela 3.5 Condições do ciclo da reação de PCR para amplificação de Sept11G,
Sept11GC e Sept11NG ............................................................
48
Tabela 3.6 Reagentes utilizados na reação de PCR para extensão da dupla fita de
DNA do fragmento de cDNA Sept11NGC ..............................................
49
Tabela 3.7 Condições do primeiro ciclo da reação de PCR para extensão da dupla
fita de DNA do fragmento Sept11NGC ...................................................
50
Tabela 3.8 Condições do segundo ciclo da reação de PCR para amplificação do
fragmento Sept11NGC .............................................................................
50
Tabela 3.9 Reagentes utilizados na reação de PCR para amplificação do fragmento
de cDNA Sept11NGC ..............................................................................
51
Tabela 3.10 Condições do ciclo da reação de PCR para amplificação de Sept11NGC
usando como molde os clones obtidos a partir do sistema do duplo-
híbrido ......................................................................................................
51
Tabela 4.1 Parâmetros dos domínios G e GC da SEPT11 ........................................... 101
Tabela 4.2 Comparação do conteúdo de estrutura secundária do domínio GTPase da
SEPT11 e SEPT6 .....................................................................................
107
LISTA DE ABREVIAÇÕES
ATP – Adenosina 5´-trifosfato
ADP – Adenosina 5´-difosfato
CD – Dicroísmo Circular
DH5α – Linhagem bacteriana para propagação plasmidial
DNA – Ácido Desoxirribonucléico
cDNA – Ácido Desoxirribonucléico Cíclico
DO – Densidade óptica
FAPESP – Fundação de Amparo à Pesquisa no Estado de São Paulo
GTP – Guanosina Trifosfato
GDP – Guanosina Difosfato
HPLC – Cromatografia Líquida de Elevado Desempenho
IPTG – Isopropil-thio-β-D-galactopiranosídeo
IFSC – Instituto de Física de São Carlos
LB – Luria Bertani
Ni-NTA – Coluna de Níquel
pb – pares de bases
PCR – Reação da polimerase em cadeia
PDB – Protein Data Bank
PEG – Polietilenoglicol
SEC – Cromatografia de Exclusão Molecular (Size Exclusion Chromatography)
SEPT – Septina
SDS-PAGE – Eletroforese em Gel de Poliacrilamida com Dodecil Sulfato de Sódio
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 21
1.1 Septinas ____________________________________________________________ 21
1.2 Septinas e seus domínios estruturais _____________________________________ 23
1.3 Complexos formados por septinas de mamíferos ____________________________ 25
1.4 Proteínas GTPases ___________________________________________________ 28
1.5 Septina humana SEPT11 ______________________________________________ 32
1.6 Efeito da ligação de GTP ______________________________________________ 35
2 OBJETIVOS .................................................................................................................. 40
2.1 Objetivos específicos deste trabalho______________________________________ 40
3 METODOLOGIA .......................................................................................................... 43
3.1 Amplificação dos fragmentos de cDNA codificantes da SEPT11 _______________ 45
3.1.1 Sept11G, Sept11GC e Sept11NG .............................................................................. 47
3.1.2 Sept11NGC ............................................................................................................... 49
3.2 Clonagem __________________________________________________________ 52
3.2.1 Clonagem dos fragmentos codificantes Sept11G e Sept11GC no vetor de
expressão ................................................................................................................. 52
3.2.2 Clonagem dos fragmentos codificantes Sept11NG e Sept11NGC no vetor de
propagação ............................................................................................................... 53
3.3 Transformação das ligações inserto – plasmídeo contendo Sept11G, Sept11GC,
Sept11NG e Sept11NGC em células de propagação ________________________ 53
3.4 Extração e clivagem dos DNAs plasmidiais________________________________ 54
3.5 Subclonagem do fragmento Sept11NG no vetor de expressão pET28a(+) ________ 55
3.6 Transformação das células de expressão pelos vetores pET28Sept11G,
pET28Sept11GC e pET28Sept11NG ____________________________________ 55
3.7 Indução e expressão de SEPT11G, SEPT11GC e SEPT11NG em E. coli _________ 56
3.8 Métodos cromatográficos ______________________________________________ 59
3.8.1 Cromatografia de afinidade ..................................................................................... 59
3.8.2 Cromatografia por exclusão molecular ................................................................... 61
3.8.3 Cromatografia de troca iônica ................................................................................. 62
3.9 Teste de atividade e análise do conteúdo de nucleotídeo liberado _______________ 63
3.10 Técnicas espectroscópicas ___________________________________________ 65
3.10.1 Medidas de dicroísmo circular (CD) ..................................................................... 65
3.10.2 Espalhamento de luz .............................................................................................. 66
3.11 Ensaios de cristalização _____________________________________________ 67
3.12 Técnicas computacionais _____________________________________________ 68
3.12.1 Modelagem molecular por homologia estrutural ................................................... 69
4 RESULTADOS E DISCUSSÕES ................................................................................ 73
4.1 Amplificação e clonagem ______________________________________________ 74
4.1.1 Amplificação e clonagem de Sept11G e Sept11GC em vetor de expressão
pET28a(+) ................................................................................................................ 74
4.1.2 Amplificação e clonagem do fragmento Sept11NG em vetor de propagação
pTZ57R/T .................................................................................................................. 77
4.1.3 Amplificação e clonagem do fragmento Sept11NGC em vetor de propagação
pTZ57R/T .................................................................................................................. 79
4.2 Expressão e purificação de SEPT11G e SEPT11GC _________________________ 80
4.3 Teste de atividade e análise do conteúdo de nucleotídeo liberado _______________ 85
4.4 Ensaios espectroscópicos de SEPT11G e SEPT11GC ________________________ 95
4.5 Ensaios de cristalização ______________________________________________ 101
4.6 Técnicas computacionais _____________________________________________ 101
4.6.1 Predição da estrutura secundária .......................................................................... 101
4.6.2 Modelagem molecular por homologia ................................................................... 103
4.7 Discussão geral _____________________________________________________107 5 CONCLUSÕES ........................................................................................................... 112
6 PERSPECTIVAS ....................................................................................................... 115
REFERÊNCIAS ............................................................................................................ 117
APÊNDICE ..................................................................................................................... 124
20
Capítulo 1
INTRODUÇÃO
21
1 INTRODUÇÃO
1.1 Septinas
Septinas são proteínas que atuam no estágio final da divisão celular. Foram descobertas
em 1970 por Leland H. Hartwell em estudos envolvendo fungos na fase da citocinese. O
radical "sept" foi adotado para lembrar a formação do septo, que faz o estrangulamento no
final da divisão celular, separando em duas partes o conteúdo citoplasmático. Resultados
laboratoriais revelaram quatro mutantes que impediam a ocorrência natural da citocinese a
certas temperaturas. Os genes correspondentes codificam as quatro primeiras septinas
descritas, ScCDC3, ScCDC10, ScCDC11 e ScCDC12 (2).
A sigla "ScCDC" refere-se ao fungo usado nas experiências, Sc – Saccharomyces
cerevisiae. As letras CDC significam "Cell Division Cycle" (Ciclo de Divisão Celular), e
tornou-se um código para diversas proteínas detectadas nas investigações do grupo de Leland.
As septinas se organizam em filamentos formando um grande anel, cujo diâmetro
diminui gradualmente, espremendo a célula. A mitose estará concluída quando o diâmetro do
anel de septinas se tornar tão pequeno que cada célula filha possuirá sua própria membrana
plasmática. Já não se fala mais em um citoplasma, mas dois, totalmente separados pela
fronteira membranar recém-criada. Neste momento, as septinas se desorganizam e se
desfazem. São digeridas e os aminoácidos reciclados (2).
Diversas outras funções foram associadas a septinas. Notava-se que, embora houvesse
certa diversidade funcional das septinas, uma característica parecia estar sempre presente: em
todas as observações, elas formavam filamentos que impediam a mistura de conteúdos. Em
outras palavras, elas participavam da criação de divisores de ambientes, através da
22
manipulação de membranas. É o caso da citocinese, da exocitose e da esporulação. Em todos
os casos a polimerização de septinas na forma de filamentos parece ser essencial para a sua
atividade biológica.
As septinas de mamíferos (sendo as mais bem caracterizadas as de humanos e
camundongos) estão divididas em quatro grupos, considerando as seqüências de aminoácidos
(3). A Figura 1.1 mostra um dendrograma de septinas de mamíferos. Destacamos o grupo II
ao qual pertence à septina 11, proteína-alvo do nosso estudo.
Figura 1.1. Dendrograma das septinas de mamíferos. Septinas com pontos isoelétricos (pI) ácidos, neutros e básicos são respectivamente indicadas pelas cores vermelho, preto e azul. Na figura não são mostradas os genes das septinas Sept13 e Sept14 que pertencem aos grupos III e II, respectivamente e foram descritas recentemente (5). Figura adaptada da referência (3). Os números nos nós do dendrograma indicam o nível de confiança do mesmo.
Devido à variedade de nomes empregados na literatura científica para denominar as
septinas de mamíferos, Macara e colaboradores propuseram uma nomenclatura padrão (4).
Assim, optaram pela nomenclatura padrão em acordo com a Human Genome Organization
(HUGO) e Mouse Genomic Nomenclature (MGN). Para septinas de humano, aprovou-se a
nomenclatura SEPT1-SEPT14 para os genes e SEPT1-SEPT14 para os correspondentes
produtos gênicos. Para septinas de camundongo, adotou-se a nomenclatura Sept1-Sept14 para
os genes e SEPT1-SEPT14 para os correspondentes produtos gênicos. Para ficar mais clara
Grupo II
Grupo IV
Grupo III
Grupo I
23
nossa apresentação, optamos pela nomenclatura Sept11 para o cDNA ou fragmentos desse e
SEPT11 para os produtos gênicos da septina humana SEPT11.
1.2 Septinas e seus domínios estruturais
As septinas de mamíferos contêm três domínios estruturais: domínio central GTPase, N-
terminal e C-terminal. Em geral, três elementos de seqüência conservados, também
designados motivos (G1, G3 e G4), fazem parte do domínio GTPase como ilustrado na Figura
1.2 (A). Esse domínio serve para o reconhecimento do nucleotídeo e atividade GTPásica. O
domínio central GTPase é altamente conservado entre septinas da mesma espécie com uma
mínima similaridade seqüencial de 70% (3), caracterizando-se pela presença do motivo P-
loop (Walker A box ou G1) que apresenta a seqüência em septinas de humanos G[E ou Q][S
ou T]G[I ou L]GKST[L ou M] (5). Este motivo está presente também em outras GTPases
cuja função é posicionar o grupamento trifosfato do GTP de modo adequado dentro do sítio
ativo da proteína (6). O motivo G1 é o mais conservado entre os motivos de septinas e
glicinas (G) são encontradas na primeira e sexta posição em 99% a 100% e na quarta posição
em 94% de todas as septinas (5). Entretanto, existem outros motivos conservados que
conferem especificidade ao GTP: os motivos G3 e G4 que em pequenas GTPases são
responsáveis, respectivamente, pela coordenação do íon de magnésio e por reconhecer o anel
de guanina do GTP, ou seja, por proporcionar especificidade por nucleotídeo. Porém, em
alguns variantes de splicing alternativo de septinas um ou mais motivos de interação com
GTP podem estar ausentes, como é o caso das septinas SEPT4(ARTS) que não apresentam o
motivo G4 e a SEPT4 (Bradeiona α) que não apresenta nenhum dos motivos de interação com
GTP (7, 8). Outras duas regiões características de GTPases mas menos conservadas, G2 e G5,
estão presentes em pequenas GTPases e ausentes em septinas (6).
24
As seqüências de septinas de mamíferos revelam uma região polibásica próxima ao
motivo P-loop ((BN)(BN)BNN(BN)(BN)), onde B são aminoácidos básicos e N neutros.
Apesar da função fisiológica desta região polibásica in vivo, não ser conhecida (9) na SEPT4
esta região pode conferir associação à membrana e também pode ligar-se ao fosfolipídio
fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PtdIns(4,5)P2) (10) (11).
Além do domínio GTPase, as septinas de mamíferos apresentam dois outros domínios,
denominados de N-terminal e C- terminal. O domínio N-terminal é variável, como observado
na Figura 1.2 (B).
Figura 1.2. Classificação dos domínios das septinas. (A) Esquema dos domínios de uma septina. Em azul escuro, domínio N-terminal variável. Em azul claro, domínio central GTPase mostrando os três motivos de interação com nucleotídeo: G1 (P-
loop ou Walker A box), G3 e G4. Em vermelho, domínio coiled-coil evidenciado por isoleucinas/leucinas a cada sete resíduos. Em preto, região polibásica. Figura extraída da referência (9). (B) Classificação das septinas considerando seus domínios estruturais. O domínio GTPase central é altamente conservado com uma similaridade seqüencial mínima de 70%. O domínio C-terminal apresenta uma similaridade seqüencial entre 50-60%, sendo maior em septinas do mesmo grupo. Regiões não similares são indicadas no diagrama por linhas. Em destaque a SEPT11, observe que ela apresenta um C-terminal mais extenso e diferenciado (com função desconhecida). A SEPT14 que pertence ao grupo II não é mostrada na figura. Figura adaptada da referência (12).
A)
B)
Grupo I
Grupo III
Grupo IV
Grupo II
Domínio GTPase C-terminal
SEPT3 SEPT9 SEPT12
SEPT6 SEPT8 SEPT10 SEPT11
SEPT1 SEPT2 SEPT4 SEPT5
SEPT7 SEPT13
N-terminal
25
Muitas septinas possuem um C-terminal predito como um domínio coiled-coil
apresentando uma identidade seqüencial de 50-60% entre septinas de mamíferos (9). Um
domínio coiled-coil é caracterizado pela presença de leucinas (ou outros resíduos
hidrofóbicos) a cada sete resíduos, o qual pode ser relacionado com a interação proteína-
proteína (dimerização ou trimerização) (11). As septinas SEPT3, SEPT9 e SEPT12 não
apresentam o domínio coiled-coil, diferentemente das outras septinas. Alguns autores
descrevem o C-terminal como sendo dividido em duas regiões distintas, um elemento
característico de septinas (Septin-Unique Element, SUE) e uma região em coiled-coil (13). A
determinação da estrutura cristalográfica de um filamento de septinas como descrito adiante,
mostra que o SUE na verdade faz parte do domínio GTPase.
1.3 Complexos formados por septinas de mamíferos
As septinas são purificadas na forma de heterofilamentos e dificilmente agem
isoladamente mas em conjunto. O complexo formado pelas septinas SEPT2/6/7 produzido em
células de inseto é purificado na forma de filamentos em tampão de moderada para alta força
iônica, 0,1 – 0,5 M KCl acrescido de 0,1 M de imidazol, a uma concentração de
aproximadamente 0,1 mg/mL (~0,35 µM). Reduzindo-se a força iônica abaixo de 0,15 M de
KCl através de diálise, os filamentos de septinas tornam-se mais longos (14). Após longo
tempo de incubação, anéis e espirais de 0,6 ± 0,1 µM em diâmetro são predominantes, Figura
1.3. Sabendo que estas estruturas são estáveis após diluição ou alta força iônica, a
polimerização dos filamentos parece ser um processo irreversível in vitro. Portanto, não é
totalmente compreendida a importância da complexação com nucleotídeo (GDP ou GTP) ou a
sua hidrólise para a formação e estabilidade dos filamentos.
26
Figura 1.3. Polimerização dos filamentos de septinas em espirais e anéis. Filamentos formados pelas septinas de mamíferos SEPT2, SEPT6 e SEPT7. (A) Filamentos na forma de espirais; (B) e (C) Filamentos circulares. Foto obtida por microscopia eletrônica. Figura extraída da referência (14).
Em 2007 foi descrita a primeira estrutura cristalográfica (resolução de 4,0 Å) do trímero
formado pelas septinas 2, 6 e 7 (Figura 1.4). Nucleotídeos são encontrados nos sítios ativos
dos domínios GTPase de todas as subunidades. Os mapas de densidade eletrônica
demonstram que as septinas SEPT7 e SEPT2 estão ligadas ao GDP, no entanto, SEPT6
apresenta uma densidade eletrônica adicional que parece estar relacionada ao terceiro fosfato
(γ) do GTP (15). Estes resultados são compatíveis com os estudos que sugerem que o
heterofilamento das septinas 2, 6 e 7 não hidrolise por completo GTP. Tipicamente
heterofilamentos deste tipo contém uma mistura de GDP e GTP numa razão entre 2:1 e 3:1
(3).
Neste trabalho também foi demonstrado que os trímeros através de simetria
cristalográfica formam hexâmeros onde o arranjo das septinas é a seguinte: 7-6-2-2-6-7.
Assim a septina SEPT7 interage com SEPT6 por uma interface denominada N/C (por
envolver elementos de estrutura provenientes do N e C-terminal), enquanto SEPT6 e SEPT2
interagem pela interface denominada G (por ser próxima ao sítio de ligação de GTP).
Notavelmente, a interação SEPT2-SEPT2 é favorecida pelo contato N/C (Figura 1.5),
27
diferentemente do que é visto em formas isoladas da septina SEPT2 em solução onde foram
observados dímeros estabilizados via a interação na interface G (15). É importante mencionar
que o hexâmero se repetiu ao longo do cristal formando um filamento que acredita-se ser
fisiologicamente relevante. Unidades hexaméricas deste tipo também são vistas em
microscopia eletrônica do mesmo complexo, Figura 1.6. O filamento formado pelas septinas
SEPT2/6/7 pode ser desfeito por concentrações elevadas de sal, sendo que a interface N/C
entre SEPT7-SEPT7 é a que se desfaz em altas concentrações de força iônica (15).
Figura 1.4. Arquitetura do trímero formado pelas septinas SEPT2 (azul escuro), SEPT6 (vermelho) e SEPT7 (azul claro). Os nucleotídeos estão ligados ao domínio GTPase. O domínio C-terminal e boa parte do N-terminal são desordenados no cristal. Figura adaptada da referência (15).
ura 1.5 Filamento de septinas. Hexâmero formado pelas septinas SEPT2, SEPT6 e SEPT7, mostrando as interfaces de interação e os nucleotídeos ligados. Figura adaptada da referência (15).
Acredita-se que SEPT6 liga GTP para formar heterofilamentos, mas não apresenta
atividade de hidrólise do GTP, fato semelhante acontece com o heterofilamento formado por
SEPT12 e SEPT11, como mostrado adiante. Colocar as interfaces na figura
Figura 1.5. Filamento de septinas. Hexâmero formado pelas septinas SEPT2, SEPT6 e SEPT7, mostrando as interfaces de interação e os nucleotídeos ligados. Figura adaptada da referência (15).
N/C N/C
N/C G
N/C
G N/C
G G
28
Figura 1.6. Microscopia eletrônica mostrando unidades hexaméricas formadas pelas septinas SEPT2, SEPT6 e SEPT7. Figura adaptada da referência (15).
Acredita-se que SEPT6 liga GTP para formar heterofilamentos, mas não apresenta
atividade de hidrólise do GTP, fato semelhante acontece com o heterofilamento formado por
SEPT12 e SEPT11, como mostrado adiante.
Uma segunda estrutura cristalográfica do domínio GTPase da SEPT2 sozinha mostra a
mesma organização do filamento. Ou seja, parece que SEPT2 pode substituir 6 e 7 na
formação do mesmo. Estes resultados dão suporte à idéia de que septinas parecem ser
razoavelmente promíscuas (15), ou seja, a capacidade de substituir uma septina por outra no
filamento mantendo contatos iguais ou parecidos entre subunidades. Isso é compatível com
resultados demonstrados que SEPT2 pode formar homofilamentos (16).
1.4 Proteínas GTPases
Todos os sistemas biológicos têm a habilidade de processar e responder a uma enorme
quantidade de informações. A questão fundamental é entender como as células percebem e
discriminam entre os vários estímulos aos quais são expostas, traduzindo-os em uma resposta
celular adequada. Entre as várias proteínas que medeiam a resposta celular a esses sinais
encontra-se uma classe de proteínas ligadoras de GTP, conhecidas como pequenas GTPases.
As GTPases estão presentes em todas as células e envolvidas em vários processos celulares
como: síntese protéica, transporte intracelular, crescimento e diferenciação celular (17).
29
Septinas pertencem à superfamília das GTPases por possuírem motivos GTPases
conservados (Walker A box, G3 e G4) e atividade catalítica associada ao domínio central.
Além desse fato, as estruturas primárias de septinas são similares às estruturas das pequenas
GTPases (Ras, RhoA, Rab, Arf, etc.). Na Figura 1.7 mostramos um diagrama esquemático da
superclasse das P-loop NTPases a qual é dividida em duas classes, chamadas de SIMIBI
(partícula de reconhecimento de sinal, MinD e BioD) e TRAFAC (fator de tradução) na base
do estudo filogenético (18). Septinas pertencem à classe TRAFAC, a qual inclui também a
superfamília de pequenas GTPases do tipo Ras entre outras (18). É importante lembrar que
existem outras proteínas que ligam GTP ou têm atividade de GTPase, tais como tubulina e
GTP-quinases, mas que são evolutivamente distantes das pequenas GTPases e não possuem
os motivos que caracterizam estas últimas.
Diferentemente de várias enzimas, as GTPases formam complexos relativamente
estáveis com seu substrato (GTP) e seu produto (GDP). Essas proteínas contêm de quatro a
cinco elementos de seqüência conservados, também designados motivos, que fazem parte do
domínio G. Esse domínio serve para o reconhecimento do nucleotídeo e atividade GTPásica,
embora os mecanismos de hidrólise possam ser diferentes (17).
Figura 1.7. Diagrama esquemático da posição das septinas na superclasse P-loop NTPase, a qual é dividida em duas classes, chamadas de SIMIBI (partícula de reconhecimento de sinal, MinD e BioD) e TRAFAC (fator de tradução). Figura adaptada da referência (18).
30
Como mencionado anteriormente, a alça que faz contato com os grupamentos fosfatos β
e γ do nucleotídeo é conhecida como P-loop, Walker A box ou G1 e têm como motivo
conservado em septinas de humanos a seqüência G[E ou Q][S ou T]G[I ou L]GKST[L ou
M]) (5). O resíduo de lisina (K) interage com os fosfatos β e γ, enquanto o grupamento
hidroxila da serina (S) ou treonina (T) ajuda na coordenação do íon Mg+2 que é um cofator
essencial para muitas GTPases. O íon magnésio está associado com a orientação e hidrólise
da molécula de GTP (19, 20). Já o motivo conservado G3 de septinas de humanos (X[A ou
T][P ou V]G[F ou Y]G) é responsável pela coordenação do íon magnésio à GTPase, sendo X
qualquer aminoácido. O motivo G4 de septinas de humanos (N[I ou V][I ou V]PX[I ou L][A
ou G][K ou R]AD) reconhece a base nitrogenada guanina. Os motivos G2 (XTX) e G5
(EXSAQ), ausentes em septinas de humanos, ajudam na coordenação do íon magnésio à
GTPase e dão suporte ao sítio de reconhecimento da base nitrogenada (5, 6, 21, 22). Enfim, o
domínio com atividade GTPásica é caracterizado pela presença de quatro ou cinco motivos
conservados na seqüência aminoacídica das GTPases. Os motivos G2 e G5, estão presentes
em pequenas GTPases e ausentes em septinas (6).
A chave molecular GTPase é um versátil dispositivo utilizado para regular vias
bioquímicas. Estudos com a proteína EF-Tu (fator de elongação) em E. coli e proteínas G em
células de mamíferos tentam estabelecer com maior precisão as características desta chave
biológica, ou seja, a habilidade de sofrer mudança conformacional depende do nucleotídeo de
guanina. Em outras palavras, a ligação ao GTP ou GDP define os estados ativo e inativo,
respectivamente, das GTPases, atuando como uma molécula reguladora. A proteína ativada é
capaz de reconhecer uma molécula alvo para produzir um efeito característico, enquanto, a
atividade de catálise GTPase assegura que a chave permaneça ativa somente por um tempo
determinado (6).
31
Para muitas pequenas GTPases a taxa de conversão entre as formas unidas com GTP
(ativa) e GDP (inativa) é modulada por fatores externos, como fatores de troca de nucleotídeo
de guanina (GEFs – Guanine Nucleotide-Exchange Factors), inibidores de dissociação de
nucleotídeo de guanina (GIDs - Guanine Nucleotide Dissociation Inhibitors) e proteínas de
ativação GTPase (GAPs – GTPase-Activating Protein) (17). A ativação requer a dissociação
do GDP ligado à enzima, um processo que é intrinsecamente lento, o qual é acelerado pelos
GEFs. A conversão do estado ativo para inativo, por outro lado, envolve a hidrólise do GTP
para GDP, processo basicamente irreversível, também acelerado pela ligação das proteínas
GAPs. Além disso, as GIDs inibem a liberação do GDP de certas GTPases, mantendo-as no
estado inativo (17, 21).
As pequenas GTPases constituem uma grande superfamília dividida em cinco
subfamílias com base na estrutura e critérios funcionais: Ras, Rho, Rab, Arf e Ran (6). O
principal papel da subfamília da proteína Ras é na transdução de sinais, que promovem a
proliferação e transformações malignas celulares (diferenciação, morfologia e apoptose
celular). Cerca de 15% a 30% de todos os tumores humanos são causados por mutações
nessas proteínas (23, 24). As proteínas pertencentes à subfamília Rho, estão envolvidas no
processo de brotamento por meio da organização da actina do citoesqueleto em resposta a
estímulos extracelulares em células de mamíferos (25, 26). Também podem participar de
diversos eventos celulares como crescimento celular, tráfico de membranas, orientação do
axônio e extensão (27). Pequenas GTPases da subfamília Rab foram reconhecidas como
chave principal da maquinaria protéica envolvida no transporte vesicular e a dinâmica de
organelas em células eucarióticas (27). Outra subfamília pertencente ao grupo das pequenas
GTPases são as proteínas Arf envolvidas na fusão de vesículas microssomais, fusão de
endossomas, reunião da membrana nuclear e no transporte vesicular do retículo
endoplasmático para o Complexo de Golgi (28). Já as proteínas Ran controlam o transporte
32
por vesículas que orientam moléculas para entrar ou sair da célula, bem como sua passagem
entre os compartimentos celulares (29, 30).
Ainda não se sabe até que ponto os mecanismos de ação das pequenas GTPases, que
foram já muito estudadas, são conservados nas septinas. Por exemplo, os detalhes do
mecanismo de ação para a conversão entre as formas unidas com GTP (ativa) e GDP (inativa)
nas septinas não foram totalmente esclarecidos. Particularmente, a existência de GEFs, GIDs
e GAPs está em aberto e a relação entre a ligação de GTP, a sua hidrólise ou a formação de
filamentos e interação com membranas também não são claros.
As septinas não representam a única família de GTPases formadoras de filamentos.
Existem proteínas GTPases que não possuem função de sinalização e sim função estrutural. A
proteína FtsZ, por exemplo, é uma proteína essencial no maquinário de divisão celular de
procariotos (31). FtsZ é uma homóloga da proteína de eucariotos Tubulina, que pertence a
uma distinta família de proteínas GTPases que formam filamentos modulados por GTP, ou
seja, a ligação, hidrólise e troca de nucleotídeo constituem o mecanismo de regulação
responsável pela dinâmica da proteína FtsZ e dos polímeros de tubulina (32).
Similarmente à Tubulina, a atividade GTPase da proteína FtsZ é induzida pelos
contatos do monômero no próprio polímero (filamento protéico). Deste modo, a própria FtsZ
realiza o papel de sua proteína ativadora. Diferentemente de septinas, a proteína FtsZ forma
apenas filamentos constituído de monômeros idênticos.
1.5 Septina humana SEPT11
Quando iniciamos os estudos com a septina humana SEPT11 ainda não se sabia da
estrutura 3D de nenhuma septina ou domínio de septinas, sendo a estrutura publicada em
2007 como visto anteriormente.
33
A dificuldade em trabalhar com septinas de mamíferos devido, principalmente, a sua
baixa estabilidade, pode ser o motivo de poucas informações sobre a SEPT11, pois nenhum
trabalho foi publicado até o momento afirmando qual o seu papel específico. Assim como
outras septinas de mamíferos, a proteína SEPT11 possui o domínio N-terminal (aminoácidos
1-37), o domínio central GTPase (aminoácidos 38-306) e o domínio C-terminal (aminoácidos
307-429), veja Figura 1.8 (A). O domínio C-terminal da SEPT11 é maior do que as demais
septinas com 123 resíduos de aminoácidos. A região polibásica (próxima ao motivo P-loop)
também está presente na estrutura primária da SEPT11 (VNKSTSQ, aminoácidos 32-38), mas
como é o caso para as demais septinas do mesmo grupo (SEPT6, SEPT8 e SEPT10) esta
região é pobremente básica, pois possui apenas um resíduo de lisina (K). O domínio GTPase
apresenta os motivos conservados de interação com GTP: o motivo P-loop ou Walker A Box,
referente aos resíduos 48-57 (GETGIGKSTL), o motivo G3 e o motivo G4 referentes aos
resíduos 100-105 (DTVGFG) e 177-186 (NIIPIIAKAD), respectivamente (Figura 1.8 A). A
septina SEPT11 apresenta grande similaridade com as demais proteínas da família,
principalmente com as septinas SEPT6 e SEPT8 (1), como mostrado na Figura 1.8 (B). Sendo
assim, estudos sobre essas septinas podem revelar algumas características comuns entre elas
já que as septinas SEPT6, SEPT8, SEPT10 e SEPT11 fazem parte do grupo II (12).
34
Sept11
N-terminal Domínio GTPase C-terminal Total Sept1 33% 44% 35% 38% Sept2 36% 48% 35% 39% Sept3 36% 52% 27% 37% Sept4 19% 49% 31% 32% Sept5 33% 46% 23% 37% Sept6 67% 84% 81% 80% Sept7 40% 49% 41% 44% Sept8 71% 82% 65% 71% Sept9 12% 50% 26% 26%
Sept10 48% 60% 56% 61% Figura 1.8. Diagrama esquemático da SEPT11. (A) Seqüência de aminoácidos da SEPT11 e o domínio N-terminal (preto), o domínio central GTPase (azul escuro) e o domínio C-terminal (vermelho). Mostra ainda os motivos conservados de interação com GTP (G1, G3 e G4) destacados em azul claro. (B) Similaridade seqüencial da SEPT11 com as demais septinas de mamíferos. Figura extraída da referência (1).
A septina humana SEPT11 teve sua presença observada em vários tecidos humanos
como coração, cérebro, placenta, pulmão, fígado, músculo esquelético, rins, pâncreas, baço,
timo, próstata, testículo, ovário, intestino e colo, sendo que não foi observada em leucócitos.
Porém, a função desta proteína nestes tecidos ainda não é muito bem compreendida. A
expressão elevada de SEPT11-mRNA nos rins implica algum papel de SEPT11 nas funções
deste órgão tais como o transporte tubular e a filtração glomerular (1).
A)
B)
35
Em estudos recentes, foi detectada a presença da SEPT11 em várias células usando um
anticorpo policlonal de coelho específico anti-Sept11-C. Nas análises feitas com lisados de
células COS7 onde se encontram também as septinas SEPT6 e SEPT8 que são altamente
similares a SEPT11, observou-se que o anticorpo anti-Sept11-C reconheceu especificamente a
SEPT11, concluindo que o anticorpo é específico para a SEPT11, veja Figura 1.9 (A). Em
seguida, foram feitas análises para detectar a septina SEPT11 endógena no cérebro de rato e
em lisados de várias linhagens de células de mamíferos, usando também o anticorpo
específico anti-Sept11-C, Figura 1.9 (B) (1). Talvez SEPT11 tenha um papel celular genérico
importante, por ser detectada em vários tipos de células diferentes, e não tem um papel
específico como é o caso de várias outras septinas.
Figura 1.9. Caracterização do anticorpo anti-SEPT11-C para SEPT11. (A) Lisados das células COS7 que expressam transientemente SEPT9a, SEPT9b, SEPT9c, SEPT4a, SEPT2, SEPT7, SEPT11, SEPT8 e SEPT6 foram separados em um gel de poliacrilamida de 10%, usando anti-Sept11-C. (B) Lisados celulares de COS7, G361, Saos2, Neuro2a (N2A), C6D6 das células HMEC, Swiss3T3, REF52, NIH3T3, MDCK, HeLa e do cérebro do rato foi submetido à SDS-PAGE (gel de 10%) usando anti-Sept11-C. Os marcadores moleculares estão mostrados a esquerda. Figura extraída da referência (1).
1.6 Efeito da ligação de GTP
Para o melhor entendimento da função específica da SEPT11 é essencial identificar, por
exemplo, possíveis parceiros na formação de heterofilamentos. Em um trabalho recentemente
publicado foi descrita a interação da SEPT12 com a SEPT11 sendo que esta interação só
ocorre quando o nucleotídeo trifosfato (GTP) está ligado indicando que não ocorre a hidrólise
A) B)
36
do nucleotídeo (33), ou seja, a atividade de hidrólise não é requerida para a formação do
heterofilamento formado por SEPT12 e SEPT11. No entanto, o GTP não é requerido para a
formação de homo-filamentos de SEPT12. Ensaios in vitro de fusão da proteína SEPT12 com
GST mostram que SEPT12 liga GTP mas uma forma mutada (Gly56Asn do P-loop) é incapaz
de ligar o nucleotídeo (33). Também foi observado que a SEPT12 forma filamentos in vivo
(quando expressa em células HeLa) e que a forma mutada (que não liga GTP) perde a
capacidade de formar filamentos, fato semelhante ocorre com a SEPT2 mutante descrita por
Kinoshita em 1997 (34). Porém não fica claro se os filamentos in vivo são homo ou
heterofilamentos, mas acredita-se que a presença de GTP possa influenciar na constituição
desses filamentos.
SEPT12 pertence ao grupo I, que inclui SEPT3 e SEPT9 (3). Ao contrário dos outros
grupos, as septinas pertencentes a esse grupo não apresentam um C-terminal predito como
coiled-coil. Porém a relevância do coiled-coil para a formação do filamento ainda não foi
esclarecida uma vez que esta região da molécula está completamente desordenada na estrutura
cristalográfica (15). O que a estrutura revela é que os contatos principais entre subunidades do
filamento são mediados pelo domínio GTPase.
SEPT11 pertence a outro grupo (II), onde estão incluídas as septinas SEPT6, SEPT8,
SEPT10, SEPT11 e mais recentemente a SEPT14. Um estudo anterior mostrou que SEPT9 e
SEPT11 são co-imunoprecipitadas de cérebro de porco com anticorpos anti-SEPT9 ou anti-
SEPT11 (1), sugerindo uma interação direta ou indireta entre as duas. Como comentado
acima em outros estudos com a SEPT12, que pertence ao mesmo grupo da SEPT9, foi
observado que ela interage com SEPT11, e que esta interação foi abolida pela mutação G45A
(Gly45Ala) no motivo de ligação a GTP da SEPT12. Uma mutação correspondente no motivo
de ligação a GTP da SEPT11 impediu a interação de SEPT11 com SEPT5 (35), e uma
mutação similar com SEPT5 impediu a interação com SEPT8 (9). No entanto, a mutação
37
(Gly56Asn no P-loop) na SEPT12 não perturbou a interação de SEPT12 com si própria (33).
Em resumo podemos considerar que a ligação do GTP está provavelmente, associada à
formação de filamentos e a interação entre septinas de uma forma geral. Possivelmente, a
ligação (e eventual) hidrólise do GTP leva a uma mudança conformacional o que levaria a
polimerização.
Considerando os dados abordados acima, estudos sobre o mecanismo de ação da septina
SEPT11 são relevantes para o entendimento de como esta proteína pode estar relacionada
com importantes processos fisiológicos. Particularmente interessante são as evidências citadas
acima da sua interação com membros do grupo I (SEPT3, SEPT9 e SEPT12), sendo que a
única estrutura cristalográfica disponível para um heterofilamento não inclui nenhum membro
deste grupo.
Finalmente deve-se destacar que os estudos descritos nesta dissertação estão inclusos
em um projeto de maior alcance que visa melhor entender todos os membros da família de
septinas humanas a nível molecular. Assim, o projeto tornou-se uma das linhas centrais de
pesquisa do Centro de Biologia Molecular e Estrutural (CBME)/CEPID junto com o
Laboratório Nacional de Luz Sincroton de Campinas. A Tabela 1.1 mostra o atual estágio
global do projeto.
38
Tabela 1.1 - Andamento do projeto de septinas do CBME/CEPID.
Septinas C
lona
gem
E
xpre
ssão
P
urif
icaç
ão
C
rist
aliz
ação
Det
erm
inaç
ão
Est
rutu
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Esp
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pia/
SA
XS
Est
udos
F
unci
onai
s
SEPT1
SEPT2 NGC2,
NG2, G2; GC2; C2
NGC2, NG2, G2;
GC2;
NGC2, NG2, G2;
GC2;
NGC2; GC2; G2
NGC2
G2; GC2;
NG2, Y2H
SEPT3 NGC3, G3,GC3
NGC3, G3, GC3
GC3 Y2H
SEPT4 N4, NGC4, G4, GC4,
C4
N4, NGC4, G4, C4
N4, NGC4,
G4, C4
NGC4 G4, N4, C4, GC4
G4, Y2H
SEPT5 NGC5,
NG5; G5; GC5; C5
NGC5, NG5; G5; GC5; C5
G5; GC5; G5 Y2H
SEPT6 NGC6, GC6, G6
NGC6, G6, GC6
NGC6, G6,GC6
G6 G6 G6
Y2H SEPT7 NGC7, G7 NG7,G7 G7 G7 G7 Y2H
SEPT8 NGC8, G8,GC8
G8, GC8 GC8 GC8
Y2H
SEPT9 NGC9? G9 Y2H
SEPT10 NGC10, G10, GC10
G10 G10 G10 NGC10
Y2H
SEPT11 NG11, G11 GC11
G11, GC11
G11, GC11
G11, GC11
G11
SEPT12 SEPT13
39
Capítulo 2
OBJETIVOS
40
2 OBJETIVOS
Septinas são uma importante família de proteínas envolvidas em vários processos
celulares essenciais. Até o momento, existem poucas informações na literatura científica
sobre septinas de mamíferos e mais especificamente sobre a septina SEPT11. Somente cinco
trabalhos foram publicados sobre a SEPT11 e na maioria dos casos eles mostram a formação
de heterofilamentos com outras septinas. Neste trabalho de mestrado nos propomos iniciar a
caracterização dos domínios da septina humana SEPT11, dentro do contexto do projeto de
foco do CBME/CEPID. Devido à importância dessas moléculas, esforços estão sendo feitos
para tentar entender a relação entre a atividade GTPase (união e hidrólise do substrato),
associação com a membrana, formação de filamentos, redundância dos complexos e o
envolvimento de septinas em diversos processos celulares.
2.1 Objetivos específicos deste trabalho
Considerando todos os pontos abordados, os objetivos específicos foram:
I. Clonar e subclonar os domínios G, GC, NG da proteína septina humana SEPT11 e
a proteína inteira através de biblioteca de cDNA;
II. Expressar todos os domínios da proteína SEPT11 em E. coli e purificar o produto
recombinante;
III. Realizar o estudo da estabilidade dos domínios da septina SEPT11 utilizando
espectroscopias de dicroísmo circular e fluorescência;
IV. Determinar a existência de atividade GTPásica para SEPT11.
41
V. Realizar ensaios de cristalização para obtenção de cristais da septina humana
SEPT11, para subseqüente determinação de sua estrutura tridimensional.
42
Capítulo 3
METODOLOGIA
43
3 METODOLOGIA
No capítulo III abordaremos as principais técnicas utilizadas no estudo da septina
humana SEPT11. Inicialmente vamos descrever a metodologia empregada para a obtenção
dos clones utilizados neste trabalho e a expressão dos domínios da proteína SEPT11. Em
seguida, trataremos da purificação dos produtos recombinantes obtidos. As técnicas utilizadas
para o teste de atividade e análise do conteúdo de nucleotídeo unido a SEPT11G serão
discutidas na terceira. Já a caracterização e análise estrutural serão discutidas na quarta parte
deste capítulo.
PARTE I - CLONAGEM E EXPRESSÃO
A clonagem do DNA se baseia em transplantar um gene de um organismo para o outro,
formando organismos recombinantes (37). Um importante fato foi a descoberta das enzimas
de restrição, que clivam seqüências específicas tanto do DNA alvo (inserto) quanto do DNA
vetor (plasmídeo) por hidrólise da ligação fosfodiéster (38). Enzimas denominadas “ligases”
ligam o inserto no DNA vetor, onde essa nova molécula formada será introduzida em uma
célula bacteriana por uma técnica descrita como transformação, passando a se chamar
organismo recombinante, permitindo a obtenção de um número elevado de cópias de DNA de
interesse (39).
Os plasmídeos são moléculas circulares de DNA que se replicam autonomamente e
possuem genes de resistência a antibióticos, úteis na seleção de células que incorporarão o
plasmídeo. Tais plasmídeos podem ser separados em dois grupos distintos: plasmídeos de
clonagem, utilizados para propagar o gene clonado, e plasmídeos de expressão que, além de
44
propagar o gene, apresentam região promotora possibilitando a expressão da proteína
recombinante.
Assim como a técnica de PCR, o seqüenciamento de DNA tem revolucionado a
genética molecular, tornando possível uma nova abordagem para o estudo e análise dos genes
(39). O seqüenciamento de DNA também utiliza o mecanismo da síntese de DNA pela DNA
polimerase, assim necessita de “primers” (iniciadores), do DNA molde e dos dNTPs e
ddNTPs. Os ddNTPs são desoxirribonucleotídeos que não apresentam a hidroxila no carbono
3, dessa forma interrompem o crescimento da cadeia, gerando fragmentos de diferentes
tamanhos marcados no último nucleotídeo. Os fragmentos de DNA marcados são separados
por eletroforese em gel de poliacrilamida e sua leitura é realizada num seqüenciador
automático (40).
À medida que mais genes foram sendo clonados e seqüenciados e sua organização
estrutural elucidada, maior atenção foi sendo dada às vias de expressão de tais genes (39). O
sistema de expressão é regulado em resposta a sinais moleculares, onde a concentração do
produto gênico é aumentada ou diminuída por processos conhecidos como indução e
repressão, respectivamente. A transcrição é mediada e regulada por interações DNA -
proteínas, especialmente as componentes da RNA-polimerase, a qual inicia a transcrição por
sítios conhecidos como promotores, encontrados próximos a regiões que iniciam a síntese de
RNA a partir do DNA molde. Os genes de procariontes possuem um mecanismo simples de
coordenar a regulação dos seus genes que são agrupados no cromossomo e transcritos juntos
com seu promotor denominados de operons.
45
3.1 Amplificação dos fragmentos de cDNA codificantes da SEPT11
Sabendo da dificuldade em trabalhar com septinas inteiras, achamos interessante ter
construções de diferentes domínios isolados e em conjunto para otimizar a chance de
caracterizar a molécula pelo menos parcialmente. O ideal é trabalhar com a molécula inteira,
mas devido aos problemas encontrados nossa estratégia foi tentar obter as construções que
serão descritas a seguir.
Visando a obtenção do cDNA da SEPT11 pelo método da Reação em Cadeia da
Polimerase (PCR – Polymerase Chain Reaction) foram sintetizados oligonucleotídeos
(primers) específicos para a amplificação da ORF (Open Reading Frame) que codifica a
SEPT11 (aqui chamada de Sept11NGC). Os oligonucleotídeos foram desenhados pela Prof.
Dra. Ana Paula Ulian de Araújo, baseados na seqüência depositada no GenBank com o
número de acesso NM_018243, e estão representados nas Tabelas 3.1 e 3.2. Os fragmentos de
DNA codificando as seqüências parciais da SEPT11, correspondentes aos domínios protéicos,
foram chamados de Sept11G, Sept11GC, Sept11NG e Sept11NGC. As denominações “N”,
“G” e “C” referem-se aos domínios N-terminal, de ligação em GTP e C-terminal,
respectivamente.
46
Tabela 3.1 - Oligonucleotídeos senso sintetizados pela empresa Invitrogen Custom Primers. Em azul estão destacados os sítios de restrição reconhecidos por endonucleases específicas.
Tabela 3.2 - Oligonucleotídeos antisenso sintetizados pela empresa Invitrogen Custom Primers. Em azul estão destacados os sítios de restrição reconhecidos por endonucleases específicas.
OLIGONUCLEOTÍDEOS SENSO (forward)
SEPT11 Seqüência
G CGGCTAGCGGATTCTGTTTCAACATCCTTTGTGTTGGTG
NheI
GC CGGCTAGCGGATTCTGTTTCAACATCCTTTGTGTTGGTG
NheI
NG CGGCTAGCATGGCCGTGGCCGTGGGGAGACCGTCTAATG
NheI
NGC CGGCTAGCATGGCCGTGGCCGTGGGGAGACCGTCTAATG
NheI
OLIGONUCLEOTÍDEOS ANTISENSO (reverse)
SEPT11 Seqüência
G CCTCGAGTTACCCCATCTCTTCAAGCTTAC
XhoI
GC CCCTCGAGTTATGTGAAGCTTGCATTTTTCTTATCCTTG
XhoI
NG CCTCGAGTTACCCCATCTCTTCAAGCTTAC
XhoI
NGC CCCTCGAGTTATGTGAAGCTTGCATTTTTCTTATCCTTG
XhoI
47
3.1.1 Sept11G, Sept11GC e Sept11NG
Para amplificação dos fragmentos de DNA codificantes dos domínios protéicos, os
oligonucleotídeos forward foram desenhados com base na extremidade respectiva ao N-
terminal 5' acrescido de um sítio de restrição para a endonuclease NheI, já os
oligonucleotídeos reverse foram desenhados com base na extremidade C-terminal 3',
acrescido de um sítio de restrição para a endonuclease XhoI. Os oligonucleotídeos utilizados
para a amplificação de tais fragmentos estão mostrados na Tabela 3.3.
Tabela 3.3 - Oligonucleotídeos utilizados para a amplificação dos fragmentos de cDNA Sept11G, Sept11GC e Sept11NG. O tamanho de cada amplificado está destacado em vermelho.
Fragmento Oligonucleotídeo forward Oligonucleotídeo reverse
Sept11G (807 pb) SEPT11GC-NheI SEPT11G-XhoI
Sept11GC (1176 pb) SEPT11GC-NheI SEPT11NGC-XhoI
Sept11NG (918 pb) SEPT11NGC-NheI SEPT11G-XhoI
Através da técnica de PCR, foram obtidas cópias dos genes em estudo já com sítios de
digestão para clonagem nos vetores escolhidos, seguindo as condições descritas na Tabela
3.4.
Para a amplificação, os seguintes DNAs moldes foram usados:
I. Sept11GC e Sept11NG - biblioteca de cDNA de cérebro fetal humano;
II. Sept11G – produto da amplificação de Sept11GC a partir da biblioteca de cDNA;
48
Tabela 3.4 - Reagentes utilizados na reação de PCR para amplificação dos fragmentos de cDNA de Sept11G,
Sept11GC e Sept11NG.
REAGENTES CONCENTRAÇÃO
Tampão PCR 10X (High Fidelity) + MgCl2 1X
Oligonucleotídeo forward 50 pmol
Oligonucleotídeo reverse 50 pmol
dNTPs 0,2 mM
DNA molde 100 ng
Taq DNA polimerase (High Fidelity) 1,5 U
H2O Y*
Volume final = 50 µL
*quantidade suficiente para completar o volume final da reação de 50 µL
A reação de amplificação foi colocada em um termociclador MJ PTC-100TM
Programable Thermal Controller de acordo com as condições descrita na Tabela 3.5. Variou-
se a temperatura de anelamento para amplificação dos diferentes fragmentos: Sept11G (63оC),
Sept11GC (70оC) e Sept11NG (58оC).
Tabela 3.5 - Condições do ciclo da reação de PCR para amplificação de Sept11G, Sept11GC e Sept11NG.
CICLO 1x 35x 1x
TоC 94 94 Y* 68 68
TEMPO 2 min 1min 30s 1 min 15 min
* temperatura de anelamento
Os produtos da PCR foram analisados por eletroforese em gel de agarose 1% corados
com brometo de etídio (0,5 µg/mL) em tampão TAE [1X] (8 mM Tris-acetato, 0,2 mM EDTA
49
pH 8,0). Em seguida, os fragmentos amplificados foram purificados com o kit Wizard SV Gel
and PCR Clean-Up System (Promega), de acordo com as recomendações do fabricante.
3.1.2 Sept11NGC
Para amplificação de Sept11NGC (1287pb) foram usados os oligonucleotídeos forward,
SEPT11NGC e reverse, SEPT11NGC, descritos nas Tabelas 3.1 e 3.2.
Através da técnica de PCR, foram obtidas cópias do fragmento de DNA de interesse
acrescido de sítios de reconhecimento de endonucleases para posterior digestão e clonagem
nos vetores escolhidos.
Devido à dificuldade encontrada em amplificar Sept11NGC (ORF inteira),
primeiramente fizemos uma reação de extensão, sem adicionar os oligonucleotídeos (Tabela
3.6). Nesta reação, porém, não utilizamos a biblioteca de cDNA de cérebro fetal humano na
amplificação e sim os moldes previamente obtidos da amplificação de Sept11GC e Sept11NG,
que serviram como moldes para estender a fita de DNA e amplificar o fragmento Sept11NGC.
Tabela 3.6 - Reagentes utilizados na reação de PCR para extensão da dupla fita de DNA do fragmento de cDNA de Sept11NGC.
REAGENTES CONCENTRAÇÃO
Tampão PCR 10X (High Fidelity) + MgCl2 1X
dNTPs 0,2 mM
DNAs moldes 100 ng
Taq DNA polimerase (High Fidelity) 1,5 U
H2O Y*
Volume final = 50 µL
*quantidade suficiente para completar o volume final da reação de 50 µL
50
A reação totalizando 50 µL, foi colocada em um termociclador e submetida ao
programa esquematizado na Tabela 3.7.
Tabela 3.7 - Condições do primeiro ciclo da reação de PCR para extensão da dupla fita de DNA do fragmento Sept11NGC.
CICLO 1x 10x 1x
TоC 94 94 65 68 68
TEMPO 2 min 1min 30s 2 min 5 min
Logo após a primeira etapa da reação de PCR adicionamos os oligonucleotídeos à
reação.
• Oligonucleotídeo forward SEPT11NGC-NheI (50 pmol);
• Oligonucleotídeo reverse SEPT11NGC-XhoI (50 pmol);
A reação de amplificação totalizando 52 µL, foi novamente colocada em um
termociclador e submetida ao programa esquematizado na Tabela 3.8.
Tabela 3.8 - Condições do segundo ciclo da reação de PCR para amplificação do fragmento Sept11NGC.
CICLO 1x 25x 1x
TоC 94 94 65 68 68
TEMPO 2 min 1min 30s 1 min 5 min
Como veremos mais adiante nos resultados, o DNA foi amplificado a partir da reação
citada, porém não conseguimos obter clones do fragmento Sept11NGC. Sendo assim,
realizamos novas reações de PCR usando como DNA moldes clones obtidos pelo sistema de
duplo-híbrido. Dois moldes diferentes foram testados. A Tabela 3.9 mostra a reação de PCR
realizada.
51
Tabela 3.9 - Reagentes utilizados na reação de PCR para amplificação do fragmento de cDNA de Sept11NGC.
REAGENTES CONCENTRAÇÃO
Tampão PCR 10X (High Fidelity) + MgCl2 1X
Oligonucleotídeo forward 50 pmol
Oligonucleotídeo reverse 50 pmol
dNTPs 0,2 mM
DNAs moldes (duplo-híbrido) 100 ng
Taq DNA polimerase (High Fidelity) 1,5 U
H2O Y*
Volume final = 50 µL
*quantidade suficiente para completar o volume final da reação de 50 µL
A reação totalizando 50 µL, foi em um termociclador e submetida ao programa
esquematizado na Tabela 3.10.
Tabela 3.10 - Condições do ciclo da reação de PCR para amplificação de Sept11NGC usando como molde os clones do duplo-híbrido.
CICLO 1x 35x 1x
TоC 94 94 65 68 68
TEMPO 2 min 1min 30s 2 min 15 min
Os produtos da PCR foram analisados através de eletroforese em gel de agarose 1%
corados com brometo de etídio em tampão TAE [1X]. Os fragmentos amplificados foram
purificados com o kit Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System conforme recomendações
do fabricante.
52
O sistema do duplo-híbrido consiste em um ensaio genético criado em levedura para
detectar interações proteína-proteína (41). Este sistema pode ser usado para identificar
proteínas que se ligam a uma proteína de interesse ou para delinear resíduos críticos para uma
interação (41). Os clones obtidos pelo sistema do duplo-híbrido correspondentes à SEPT11
foram gentilmente cedidos pela aluna de doutorado Joci Neuby.
3.2 Clonagem
3.2.1 Clonagem dos fragmentos codificantes Sept11G e Sept11GC no vetor de expressão
Após a amplificação dos fragmentos de DNA de Sept11G e Sept11GC, cerca de 1,5 µg
do produto de PCR foram utilizados na digestão com as endonucleases NheI (3 U) e XhoI (4
U), em tampão de digestão [1X] e BSA 1,5 µg. A mistura foi incubada a 37°C, por 6 h. Em
seguida, foi necessária uma purificação em gel de agarose 1% (corado com brometo de etídio)
utilizando-se o kit Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega). O DNA digerido e
purificado foi então quantificado em gel de agarose 1% para proceder à ligação. Também o
vetor bacteriano pET28a(+) foi linearizado através de uma dupla restrição com as enzimas
NheI e XhoI, purificado e quantificado em gel de agarose 1%.
A mistura de ligação contendo o DNA purificado (inserto) e o vetor pET28a(+)
linearizado foi incubada a 4°C por 12 h e utilizou-se 150 ng do inserto, 50 ng do DNA
plasmidial linearizado, enzima T4 DNA ligase [1U], tampão de ligação para a concentração
final de [1X] e água MilliQ para o volume final de 10 µL.
53
3.2.2 Clonagem dos fragmentos codificantes Sept11NG e Sept11NGC no vetor de
propagação
Para os fragmentos Sept11NG e Sept11NGC, a etapa de construção do vetor de
expressão foi precedida pela clonagem de tais DNAs num plasmídeo de propagação devido a
dificuldade de inseri-los diretamente no vetor de expressão bacteriano pET28a(+).
Assim, os fragmentos amplificados Sept11NG e Sept11NGC foram clonados no vetor de
propagação pTZ57R/T. Sendo assim, após a amplificação e purificação, realizamos uma
mistura de ligação contendo o DNA purificado (inserto) e o vetor pTZ57R/T. A reação de
ligação foi incubada a 4°C por 12 h, utilizou-se 150 ng do inserto, 50 ng do DNA plasmidial,
enzima T4 DNA ligase (1U), tampão de ligação para a concentração final de [1X] e água
MilliQ para o volume final de 10 µL.
3.3 Transformação das ligações inserto – plasmídeo contendo Sept11G, Sept11GC,
Sept11NG e Sept11NGC em células de propagação
Após a ligação dos insertos em seus respectivos vetores foi realizada a transformação de
células de E.coli com a mistura de ligação.
Em uma primeira abordagem, optou-se pelo uso de células competentes de E. coli
DH5α (transformação do DNA recombinante pET28Sept11G e pET28Sept11GC) e células
ultra-competentes de E.coli TOP10 (transformação do DNA recombinante
pTZ57R/TSept11NG e pTZ57R/TSept11NGC), para a propagação e manutenção do
plasmídeo. Todo o volume de ligação foi adicionado em 50 µL de células competentes
previamente descongeladas permanecendo no repouso por 30 minutos em gelo. O choque
térmico, que facilita a entrada do DNA exógeno na célula, foi realizado a 42оC durante 1 a 2
54
minutos. Em seguida, as células competentes ficaram em repouso por 3 minutos em gelo e
adicionou-se 200 µL de meio LB líquido. A mistura foi incubada a 37оC, sob agitação por 60
minutos e, posteriormente, plaqueada em meio LB contendo 50 µg/mL de canamicina no caso
em que o vetor foi pET28a(+) e 100 µg/mL de ampicilina quando o vetor utilizado foi o
pTZ57R/T. A seleção dos plasmídeos recombinantes pTZ57R/TSept11NG e
pTZ57R/TSept11NGC foi realizada também pela adição de 0,5mM de IPTG e 80 µg/mL de
X-gal no meio de cultura. As placas foram incubadas a 37оC por 14 horas. Colônias
transformantes foram inoculadas em 5 mL de meio LB contendo antibiótico para seleção e
incubadas a 37оC, sob agitação por 14 horas.
Além da seleção das células transformantes através da resistência ao antibiótico, o vetor
de clonagem pTZ57R/T permite a seleção pela coloração das colônias branca/azul. As
colônias azuis são formadas por bactérias que receberam o plasmídeo selvagem (sem o
inserto), enquanto que as brancas apontam a perda da função ß-gal indicando que as bactérias
podem ter recebido o inserto (42).
3.4 Extração e clivagem dos DNAs plasmidiais
Para o procedimento de extração e purificação dos DNAs plasmidiais, a partir de células
E. coli transformadas foi usado o Kit Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System
(Promega).
A eficiência da clonagem e extração do DNA foi verificada através de eletroforese em
gel de agarose 1% marcado com brometo de etídio em tampão TAE [1X]. Após a extração,
cada clone foi seqüenciado em um seqüenciador automático. O seqüenciamento confirmou a
clonagem dos insertos (Sept11G, Sept11GC e Sept11NG) dentro do correto quadro de leitura
55
dos vetores. O seqüenciamento da clonagem do inserto Sept11NGC não foi satisfatório e,
portanto, não demos continuidade aos experimentos com esta construção.
Na intenção de transferir o cDNA de Sept11NG do pTZ57R/T para o pET28a(+)
realizou-se digestão do DNA plasmidial pTZ57R/TSept11NG recombinante.
Aproximadamente 1 µg do DNA plasmidial foi utilizado na digestão com as endonucleases
NheI (3 U) e XhoI (4 U), em tampão de digestão [1X] e BSA 1,5 µg. A mistura foi incubada a
37°C, por 6 h.
O vetor pET28a(+) foi linearizado com as mesmas enzimas de restrição como descrito
acima. Os insertos e vetores digeridos foram purificados em gel de agarose 1%.
3.5 Subclonagem do fragmento Sept11NG no vetor de expressão pET28a(+)
Os DNAs recombinantes pET28Sept11G e pET28Sept11GC foram obtidos a partir da
reação de ligação com a enzima T4 DNA ligase, como mostrado anteriormente (item 3.2.1).
Já o DNA recombinante pET28Sept11NG foi obtido a partir da reação de ligação de
aproximadamente 12 h a 4°C, onde utilizamos 150 ng do inserto, 50 ng do DNA plasmidial
linearizado, enzima T4 DNA ligase (1U), tampão de ligação para a concentração final de [1X]
e água MilliQ para o volume final de 10 µL.
3.6 Transformação das células de expressão pelos vetores pET28Sept11G,
pET28Sept11GC e pET28Sept11NG
Após a confirmação da clonagem, os vetores de expressão pET28Sept11G,
pET28Sept11GC e pET28Sept11NG foram utilizados na transformação em células de
expressão de E. coli BL21 (DE3). O termo DE3 significa que a linhagem contém o lisógeno λ
56
DE3 que carrega o gene que codifica a T7 RNA polimerase sob o controle do promotor
lacUV5. As colônias recombinantes foram analisadas através de eletroforese em gel de
agarose 1% com tampão TAE [1X] e confirmaram a presença do inserto para expressão.
Para o plaqueamento da mistura de transformação das placas que receberam a ligação
pET28Sept11G, pET28Sept11GC e pET28Sept11NG, utilizou-se o antibiótico canamicina (50
µg/mL). As placas foram incubadas a 37оC por 14 horas. Colônias transformantes foram
inoculadas em 5 mL de meio LB contendo antibiótico para seleção e incubadas a 37оC, sob
agitação por 14 horas.
O DNA plasmidial foi extraído pelo Kit Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification
System e a análise da extração foi feita por eletroforese em gel de agarose 1% corado com
brometo de etídio em tampão TAE [1X].
Alíquotas dos inóculos foram estocadas e congeladas a – 80°C suplementadas com 25%
de glicerol para conservação das mesmas.
3.7 Indução e expressão de SEPT11G, SEPT11GC e SEPT11NG em E. coli
Os vetores do sistema pET possuem marcadores seletivos de resistência a antibióticos,
uma origem de replicação, um sítio de clonagem múltipla e diferentes seqüências adjacentes
que codificam para uma variedade de peptídeos acessórios que podem ser usados na detecção
da proteína alvo.
Os plasmídeos do sistema pET foram desenvolvidos especificamente para a clonagem e
expressão de proteínas recombinantes em E. coli e apresentam alto grau de eficiência. Genes
clonados em plasmídeos do sistema pET estão sob o forte controle dos sinais de transcrição
do fago T7. Assim, a expressão da proteína de interesse depende da presença da enzima T7
RNA polimerase. O vetor de expressão bacteriano pET28a(+) permite a expressão da proteína
57
de interesse com uma cauda N-terminal, contendo seis resíduos de histidina (6xHis) dando a
proteína alta afinidade para interação com resinas cromatográficas contendo íons metálicos
como Ni2+ ou Co2+.
Foram realizados experimentos de expressão e solubilidade dos domínios SEPT11G,
SEPT11GC e SEPT11NG na linhagem de E. coli BL21 (DE3).
Uma colônia isolada dos transformantes foi inoculada em 5 mL de meio LB acrescido
de 50 µg/mL de canamicina., incubada a 37оC, sob agitação por 5 h. Em seguida, transferiu-
se os 5 mL da cultura para um frasco com 500 mL de meio de cultura LB, que foi incubado a
37° C sob agitação até a cultura atingir densidade óptica de aproximadamente DO600 0,7. A
indução foi então conduzida por adição de 0,4 mM de IPTG e incubação a 20°C, sob
agitação por 12 h. Antes de adicionar IPTG, 200 µL de cultura foram separados como
controle da indução.
Após a indução as células foram recuperadas por centrifugação a 6 000 x g, 4оC por 15
minutos e o “pellet” foi ressuspendido em 20 mL de tampão A (25 mM Tris/HCl pH 7.8, 10%
glicerol).
Para os domínios G e GC da proteína SEPT11 realizou-se testes com o tampão A na
presença e ausência de 50 µM de GDP (Figura 3.1 A) ou GTP (Figura 3.1 B) e 1 mM de
MgCl2, já que não sabíamos se a proteína SEPT11 liga e hidrolisa o GTP para GDP e se o
MgCl2 (o íon Mg+2 é um cofator importante para algumas pequenas GTPases) interfere na
ligação da proteína com o nucleotídeo e se isso a torna mais estável.
Após ressuspender o “pellet”, acrescentou-se lisozima 0,5 mg/mL deixando a mistura
em gelo durante 30 minutos. A lisozima age sob a parede celular da bactéria desestruturando a
mesma. Para romper definitivamente as células utilizou-se ultra-som (sonicação). Sonicou-se
a mistura 9 vezes de 20 segundos cada (potência média), com intervalos de 40 segundos (em
gelo). Após a lise, a mistura foi submetida a uma nova centrifugação a 20000 x g por 20
58
Anel purínico (guanina)
Anel purínico (guanina)
minutos e 4°C. O precipitado (fração insolúvel) foi separado do sobrenadante (fração
solúvel), sendo que o precipitado foi ressuspendido com o mesmo volume de tampão A. A
expressão e solubilidade da proteína foram analisadas através de eletroforese em gel de
poliacrilamida desnaturante (SDS-PAGE 15%).
A) GDP
B) GTP
Figura 3.1. Fórmula estrutural e molecular dos nucleotídeos de guanina. (A) GDP e; (B) GTP.
Monossacarídeo (pentose)
Monossacarídeo (pentose)
59
PARTE II – PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA HUMANA SEPT11G E SEPT11GC
3.8 Métodos cromatográficos
As propriedades físico-químicas peculiares a cada proteína, tais como: solubilidade,
carga iônica e massa molecular são de fundamental importância para proceder à purificação
de proteínas de modo que tenhamos um alto rendimento da proteína pura, sem ter que passar
por muitos passos de purificação, o que levaria a perda significativa da amostra (40).
Tipicamente, a estratégia usada para a purificação de proteínas segue três passos:
captura, purificação intermediária e polimento. Na fase da captura, como o próprio nome
sugere, é importante “capturar” a proteína de interesse e separá-la rapidamente das outras
proteínas presentes no extrato lisado, evitando a manifestação de enzimas proteolíticas que
degradariam a proteína alvo. Na purificação intermediária, o principal objetivo é separar a
proteína de interesse dos contaminantes. E a última fase, denominada polimento, resulta em
retirar os últimos traços de contaminantes.
3.8.1 Cromatografia de afinidade
Esse tipo de cromatografia é freqüentemente realizada em coluna composta por um
ligante fixado covalentemente a uma matriz, capaz de interagir especificamente com a
proteína de interesse. A matriz deve ser quimicamente inerte, com alta porosidade e
resistência mecânica.
No experimento de cromatografia por afinidade, ao passar a mistura protéica pelo
complexo matriz-ligante ocorre interação entre a proteína alvo e o ligante imobilizado. As
demais proteínas são retiradas da coluna por várias etapas de lavagem. A eluição da proteína
60
de interesse ocorre com a aplicação de um competidor com maior afinidade pelo sítio ativo da
proteína ou em maior concentração do que o ligante preso na resina. Alternativamente, pode-
se promover alterações nas características da solução presente na coluna e, dessa forma,
diminuir a afinidade entre a proteína e o ligante possibilitando a eluição da proteína de
interesse (40).
O domínio SEPT11NG não foi expresso, conforme resultados apresentados adiante,
pois nenhum produto de massa molecular esperado foi detectado. Sendo assim, não
realizamos ensaios de purificação com esta construção.
Na purificação de SEPT11G e GC, foi utilizado 2mL da resina de níquel (Ni-NTA da
Qiagen) previamente equilibrada com tampão A: 25 mM Tris/HCl pH 7.8, 10% glicerol na
ausência ou presença de GDP ou GTP (50 µM) e MgCl2 (1 mM).
Estabelecido o protocolo de expressão e lise celular das proteínas, realizou-se a
purificação de SEPT11G e GC na coluna de níquel (cromatografia de afinidade) da seguinte
forma: a) a fração solúvel foi adicionada à coluna após ser filtrada em filtro de papel; b)
lavamos a coluna com 10mL (5 volumes) do tampão A; c) com a finalidade de retirar os
contaminantes de baixa afinidade, lavou-se novamente a resina com 20 mL do tampão A
acrescido de 5 mM de imidazol seguida de lavagem com 10 mL do tampão A acrescido de 10
mM de imidazol. Todas as lavagens foram realizadas com tampão A contendo ou não GDP ou
GTP e o cloreto de magnésio; e) para retirar o excesso de GDP ou GTP e MgCl2 retidos na
resina, lavamos a mesma com 40 mL do tampão A puro, isso nos permite afirmar que na
eluição da proteína não tenha GDP ou GTP e MgCl2 livres em solução, ou seja, somente
estarão presentes ligados à proteína e; f) eluímos a proteína com 10 mL do tampão A
acrescido de 200 mM de imidazol.
Uma alíquota de todas as frações foi retirada e preparada para análise por eletroforese
desnaturante (SDS-PAGE 15%).
61
3.8.2 Cromatografia por exclusão molecular
A cromatografia por exclusão molecular é composta em sua fase estacionária por um
polímero com poros de tamanho variado. As moléculas de maior massa molecular não
conseguem penetrar nos poros e são arrastadas pela fase móvel, enquanto que moléculas de
menor massa molecular penetram nos poros e são retidas por mais tempo. As diferentes
proteínas serão eluídas em diferentes volumes de retenção, de acordo com sua massa
molecular (40).
Os domínios SEPT11G e GC foram submetidos a esse tipo de cromatografia, utilizando
colunas Superdex-200 preparativas (Amersham-Pharmacia), usando o sistema Äkta Explorer-
10 (Amersham-Pharmacia).
As proteínas recuperadas na cromatografia de afinidade SEPT11G e SEPT11GC foram
submetidas à cromatografia de exclusão molecular em colunas Superdex-200 para separá-las
dos contaminantes de alto peso molecular ainda presentes nas amostras. O fluxo utilizado na
gel filtração foi de 0,5 mL/min de tampão A, monitorado pela absorbância em 280 nm e
frações de 1 mL foram coletadas. As frações recuperadas, contendo SEPT11G e GC
recombinantes, foram preparadas para posterior análise em eletroforese desnaturante (SDS-
PAGE 15%).
A cromatografia de exclusão molecular também foi utilizada para avaliar o grau de
oligomerização de SEPT11G e SEPT11GC, realizada em colunas Superdex-200 (Amersham-
Pharmacia), acopladas ao sistema Äkta Explorer-10 (Amersham-Pharmacia). As amostras de
proteína purificadas foram aplicadas à coluna e seu volume de eluição foi comparado ao
volume de eluição dos padrões de massa molecular: ferritina (440kDa), aldolase (158kDa),
conalbumina (75kDa), ovalbumina (45kDa), anidrase carbônica (30kDa), ribonuclease A
(13,7kDa) e aprotinina (6,5kDa). O volume de eluição relativo foi calculado da seguinte
62
forma: K av = (V e – V 0)/(V c – V 0), onde V e é o volume de eluição, V 0 é o volume do
void e V c é o volume da coluna. As massas moleculares de SEPT11G e SEPT11GC foram
estimadas por meio da curva de calibração de K av versus log(M).
3.8.3 Cromatografia de troca iônica
Nesse tipo de cromatografia ocorre a separação de substâncias contendo grupos
ionizáveis (como algumas das cadeias laterais de resíduos de aminoácidos encontradas em
proteínas ou os grupos fosfatos de nucleotídeos) e tem como base o intercâmbio de íons entre
a fase móvel e resinas contendo grupos funcionais do tipo ácido sulfônico (resina aniônica ou
trocadora de cátions) ou amônio quaternário (resina catiônica ou trocadora de ânions). A
afinidade de cada molécula por grupos carregados na coluna é afetada pelo pH, que
determina o estado de ionização da molécula e pela concentração de sais ionizáveis livres que
competirão com o soluto pelo solvente (40).
Na intenção de avaliar o conteúdo de nucleotídeo unido à proteína após purificação as
proteínas SEPT11G e SEPT2NG (gentilmente cedida pelo aluno de doutorado Julio Cesar
Pissuti Damalio e usada como controle positivo), foram submetidas à cromatografia de troca
iônica, usando a coluna Protein Pak DEAE 5 PW (Waters), resina aniônica de 1 mL. No
entanto, não usamos esta cromatografia para purificação das proteínas e sim para avaliar a
atividade GTPásica delas através da separação do nucleotídeo (GDP ou GTP) unido a
proteína e que será liberado após a desnaturação química e térmica (item 4.3). A
cromatografia de troca iônica foi realizada em um cromatógrafo Alliance 2695 (Waters).
63
PARTE III – TESTE DE ATIVIDADE
3.9 Teste de atividade e análise do conteúdo de nucleotídeo liberado
A maioria dos métodos que avaliam a atividade GTPase das septinas envolve uma série
de passos difíceis, como a necessidade de utilização de nucleotídeos radioativos. Portanto,
uma das razões do lento processo no estudo de septinas é a falta de uma técnica eficiente,
rápida e simples. Sendo assim, propomos dois métodos alternativos que avaliam o conteúdo
de nucleotídeo unido à SEPT11G após purificação. O primeiro método, e mais eficiente,
baseia-se na liberação do nucleotídeo por desnaturação química com ácido perclórico, tal
procedimento foi modificado e aprimorado segundo o método proposto por Seckler e
colaboradores (43). Já o segundo procedimento usado para avaliar a liberação do conteúdo de
nucleotídeo unido à proteína foi realizado por desnaturação térmica a 100 ºC. O ensaio de
desnaturação térmica já foi realizado com a SEPT6 pela aluna de doutorado Tatiana Arruda
Campos Brasil de Souza do Laboratório Nacional de Luz Sincroton (LNLS).
Em ambos os procedimentos foi testada a SEPT11G na concentração de 14 µM,
purificada na presença de GTP. De acordo com o primeiro método, a quantidade de
nucleotídeo unido foi determinada incubando a amostra de SEPT11G com ácido perclórico
gelado (concentração final 0,5 M) por 10 minutos a 0ºC. A proteína desnaturada foi removida
por centrifugação (10 min., 14000 x g, 4ºC). Uma alíquota do sobrenadante foi neutralizada
com a adição de 1/6 do volume de 1 M K2HPO4, 0,5 M de ácido acético e 1/6 do volume de 3
M de KOH a 0ºC [47]. Formou-se um precipitado e a amostra foi novamente centrifugada
(10 min., 14000 x g, 4ºC) para retirada do precipitado. O sobrenadante foi removido e
armazenado a 20ºC por 1h. Em seguida, a amostra foi novamente centrifugada (10 min.,
14000 x g, 4ºC). O sobrenadante foi medido espectrofotometricamente (λ = 254 nm) e o
64
conteúdo de nucleotídeo (GDP ou GTP) liberado determinado utilizando uma coluna de troca
aniônica Protein Pak DEAE 5 PW (Waters) e analisada em um cromatógrafo Alliance 2695
(Waters). Os tampões utilizados foram: tampão A (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0); tampão B (Tris-
HCl 50 mM, pH 8,0, 1 M NaCl).
Já no segundo método, SEPT11G foi desnaturada (1 min., 100ºC). Em seguida
centrifugada 16000 x g durante 10 minutos em um concentrador de 10kDa. O “flowthrough”
foi medido espectrofotometricamente (λ = 254 nm) e o conteúdo de nucleotídeo liberado
(GDP ou GTP) determinado utilizando a mesma coluna de troca aniônica e analisada em um
cromatógrafo Alliance 2695 (Waters). Os tampões utilizados foram: tampão A (Tris-HCl 50
mM, pH 8,0); tampão B (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, 500 mM NaCl).
Paralelamente, realizamos os dois métodos com uma amostra da SEPT2NG (controle
positivo), gentilmente cedida pelo aluno de doutorado Julio Cesar Pissuti Damalio. Usamos
como controle positivo a SEPT2NG, pois sabemos que ela hidrolisa o GTP e é muito estável
[13]. A amostra de SEPT2NG (12 µM) foi purificada com tampão contendo GTP (seguindo o
mesmo protocolo de expressão e purificação da SEPT11G). Além de SEPT2NG fizemos
controles positivos com GTP (10 µM) e GDP (10 µM) isolados, uma mistura de GTP/GDP
(10 µM cada) e também com o ácido perclórico (0,5 M). Os controles GDP e GTP foram
tratados com o método de desnaturação química e térmica. Já o ácido perclórico (outro
controle negativo) foi tratado com o método de desnaturação química.
65
PARTE IV – CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL
Nesse item do capítulo três são descritas as metodologias utilizadas na caracterização
dos domínios estruturais SEPT11G e GC da septina humana SEPT11.
A concentração da proteína recombinante, em todos os casos, foi determinada através
da absorção no comprimento de onde de λ = 280 nm, em um espectrofotômetro Hitachi U-
200, utilizando o coeficiente de extinção teórico (ε) calculado através da análise da
composição de aminoácidos (44). O coeficiente de extinção teórico foi obtido através de um
conjunto de programas encontrados no Expasy (Expert Protein Analysis System), como
descrito anteriormente.
3.10 Técnicas espectroscópicas
3.10.1 Medidas de dicroísmo circular (CD)
A espectroscopia de dicroísmo circular (CD) é uma ferramenta sensível, para estimar a
porcentagem das componentes presentes na estrutura secundária de proteínas em solução (45).
Esta técnica baseia-se no desvio da luz circularmente polarizada incidente em compostos
assimétricos (quirais). Em proteínas, estes grupos assimétricos envolvem principalmente as
ligações peptídicas, as cadeias laterais de alguns aminoácidos e grupos prostéticos (46).
Um feixe de luz circularmente polarizado pode ser considerado como dois feixes de
onda plana, linearmente polarizados, ortogonais entre si e fora de fase por 90о. A onda
linearmente polarizada pode ser decomposta em duas componentes individuais circularmente
polarizadas: uma à esquerda e a outra à direita. Quando a luz incide em um composto
assimétrico, esta é absorvida e cada um dos componentes interage de forma distinta em
66
relação a absortividade. Dessa maneira pode-se então definir o CD como a propriedade que
consiste na interação distinta para a luz circularmente polarizada a direita e para a luz
circularmente à esquerda emitida com igual intensidade, e o sinal de CD como sendo a
diferença entre a absorção da luz circularmente polarizada à esquerda e à direita (46).
As análises de CD foram realizadas em um espectropolarímetro J-715 (Jasco Inc.,
Japão), utilizando-se uma cubeta cilíndrica de quartzo com 1 mm de caminho óptico. Um total
de 4 varreduras, no intervalo de comprimento de onda de 200 nm a 250 nm, foram efetuadas e
promediadas para determinação de uma média. A fim de analisar a estabilidade térmica das
proteínas variou-se a temperatura de cada análise de 5°C a 80°C para SEPT11G com medidas
de 5 em 5°C e de 10°C a 90°C para SEPT11GC com medidas de 2 em 2°C. Em todos os
casos, a proteína recombinante analisada estava em solução tampão A 25mM Tris-HCl, pH
7,8 e 10% Glicerol na concentração de aproximadamente 10 µM. Para obter informações
estruturais, os dados de CD foram desconvoluídos usando os programas CONTIN, SELCON3
e CDSSTR do pacote de programas CDPro (47, 48).
3.10.2 Espalhamento de luz
As análises de espalhamento de luz foram realizadas em um fluorímetro K2 ISS
equipado com um sistema de controle de temperatura, utilizando cubetas de 1 cm de caminho
óptico. As amostras foram iluminadas em um comprimento de onda de λ = 350 nm, e a
variação da intensidade espalhada foi coletado num ângulo de 90º. A proteína analisada
estava em tampão 25 mM Tris-HCl, pH 7,8 e Glicerol 10%, na concentração aproximada de 5
µM e as análises foram feitas em temperaturas diferentes, 15°C, 18°C, 30°C, 37°C e 40°C a
fim de avaliar a estabilidade térmica da proteína.
67
3.11 Ensaios de cristalização
A determinação da estrutura tridimensional de uma proteína por difração de raios X
exerce um papel importante no estudo de sistemas biológicos.
A estratégia utilizada para induzir a cristalização de macromoléculas constitui em
conduzir lentamente o sistema a um estado de supersaturação. Este é um ambiente favorável
que maximiza as interações e diminui a repulsão entre as moléculas em solução. Dessa forma,
as moléculas podem se arranjar de maneira ordenada e periódica dando origem a um cristal.
Existem vários métodos utilizados para a obtenção do cristal de proteína, dentre eles o
método de Difusão de Vapor, baseado no processo de equilíbrio entre duas soluções, através
da passagem das espécies voláteis da solução menos concentrada para a mais concentrada
(49).
Neste método, a técnica mais utilizada é a gota suspensa (50), no qual a gota da solução
de proteína mais o agente precipitante e aditivos é colocada sobre uma lamínula de vidro
siliconizada e, posteriormente fixada em um reservatório hermeticamente fechado, contendo a
solução de cristalização em maior volume e mais concentrada. Os cristais tendem a se formar
à medida que a concentração da proteína e do agente precipitante aumenta lentamente na gota
e os solventes voláteis passam dessa para a solução do poço (Figura 3.2).
Os domínios estruturais SEPT11G e SEPT11GC da SEPT11 foram submetidos aos
ensaios de cristalização após a obtenção da proteína purificada e concentrada à
aproximadamente, 5mg/mL. Foi adicionado 500 µL de cada solução precipitante em cada
poço. Em uma lamínula siliconizada fez-se uma gota contendo 2 µL de solução precipitante
(solução do poço) mais 2 µL da solução de proteína. Os experimentos de cristalização foram
realizados em caixas de cristalização contendo cada uma, 28 câmaras de troca de vapor e
realizados em ambientes isolados com temperatura constante de 18оC.
68
Figura 3.2. Esquema de cristalização usando o método da gota suspensa. A) Lamínula de vidro siliconizada. B) Modelo de um poço de cristalizalição. Figura extraída da referência (50).
Para a realização destes experimentos foram utilizados como agentes precipitantes para
SEPT11G os fatoriais: Crystal Screen II, 48 condições de cristalização (Hampton Research) e
Nextal Tubes – PEGs Suite 96 condições de cristalização (Qiagen). Para SEPT11GC
utilizamos os fatoriais: Crystal Screen I, 48 condições de cristalização (Hampton Research) e
Crystal Screen II , 48 condições de cristalização (Hampton Research).
3.12 Técnicas computacionais
Técnicas de bioinformática foram utilizadas, neste trabalho, com o objetivo de se
estudar as características pertinentes de SEPT11G e SEPT11GC e também da sua estrutura
secundária. Um conjunto de programas encontrados no Expasy (Expert Protein Analysis
System, http://ca.expasy.org) foi usado para determinar o coeficiente de extinção molar e
outras características da proteína como a massa molecular, o ponto isoelétrico, os resíduos
florescentes e o número de aminoácidos. Já para predição de estrutura secundária (51)
empregamos o programa PSIPRED (Protein Structure Prediction Server,
69
http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred). Tais técnicas junto com a modelagem por homologia, que
será descrita em seguida, são úteis na ausência de uma estrutura cristalográfica que é o caso
da SEPT11.
3.12.1 Modelagem molecular por homologia estrutural
Neste trabalho realizamos também a estratégia de modelagem molecular por homologia
estrutural. Esta técnica baseia-se no conhecimento de que a conformação estrutural de uma
proteína é mais conservada que sua seqüência de aminoácidos durante o processo evolutivo, e
que pequenas mudanças na seqüência, em geral, resultam em, apenas, sutis modificações na
estrutura tridimensional (52). A modelagem molecular por homologia estrutural usa proteínas
homólogas com estruturas resolvidas como molde na construção de modelos de proteínas que
não possuem estrutura resolvida. Neste tipo de estudo o grau de confiabilidade do processo é
altamente dependente do grau de similaridade entre as seqüências (53).
As estruturas tridimensionais de proteínas homólogas são conservadas durante o
processo de evolução, sobretudo no que diz respeito aos resíduos funcionais, pois a
conservação da estrutura é crucial para a manutenção e desempenho de funções específicas.
As maiores divergências entre proteínas homólogas ocorrem com mais freqüência em regiões
próximas da superfície, ou seja, nos “loops”, sem estrutura secundária definida. Em geral, os
resíduos localizados no interior das proteínas variam com menor freqüência, e quando o
fazem, ocorrem, normalmente, com menor distinção de propriedades físico-químicas.
Habitualmente, certo conjunto de resíduos de aminoácidos que compreendem o núcleo da
proteína e os principais elementos de estrutura secundária permanece mais conservado dentro
de uma família de proteínas homólogas (54).
70
Como visto anteriormente, a estrutura cristalográfica do hexâmero formado pelas
septinas SEPT2, SEPT6 e SEPT7 foi recentemente depositado do PDB (15). Sendo assim
usamos como proteína-molde a septina SEPT6 para construir uma estrutura para a septina
SEPT11 alvo do nosso estudo. Sabemos que SEPT11 e SEPT6 apresentam, além de uma alta
identidade seqüencial (80% entre SEPT11 e SEPT6 e 71% entre SEPT11 e SEPT8), uma
possível similaridade de função por pertencerem ao mesmo grupo de genes, o que favorece os
estudos com modelagem molecular por homologia estrutural.
Geralmente, o processo de obtenção de um modelo protéico através da execução da
estratégia da modelagem molecular por homologia estrutural envolve quatro etapas principais
(Figura 3.2), entre elas: 1) Busca de proteínas homólogas; 2) Alinhamento das seqüências; 3)
Construção e otimização dos modelos e; 4) Validação dos modelos virtuais (53). No nosso
caso, um procedimento exaustivo de modelagem não foi pertinente uma vez que o objetivo
era examinar apenas a região do sítio de ligação do GTP para encontrar eventuais diferenças
em relação à SEPT6. Deve-se destacar que devido à baixa resolução da estrutura molde
(SEPT6 extraída do heterofilamento de SEPT2/6/7) não foram depositadas coordenadas
correspondentes à maioria das cadeias laterais da estrutura, sendo muito deficiente neste
sentido e, portanto, como molde para modelagem por homologia. Logo, nosso intuito foi
apenas de gerar um modelo que permitisse ter uma noção da estrutura da SEPT11
particularmente na região do sítio de ligação ao nucleotídeo.
O domínio GTPase é a região que possui maior identidade em septinas. Obtivemos um
alinhamento somente entre os domínios GTPase de SEPT6 e SEPT11 com o programa
Clustal-X (55) usando parâmetros default, e verificamos que há 87% de identidade
seqüencial.
Numa segunda etapa, o software MODELLER (56) foi usado para obtermos um modelo
de estrutura tridimensional da SEPT11. Usamos script default com a ferramenta Automodel,
71
incluindo os átomos pertencentes ao ligante, GTP da SEPT6. Ao criar este modelo, foi
necessário excluir as regiões faltantes na estrutura molde (SEPT6).
Após a construção do modelo com o MODELLER, a região do sítio ativo foi examinada
visualmente e onde pertinente, conformações alternativas para as cadeias laterais na região
foram examinadas usando a opção Mutagenesis do programa PyMol (57).
Figura 3.3. Etapas envolvidas no processo de obtenção de modelos protéicos. Utilização da estratégia de modelagem molecular por homologia estrutural.
72
Capítulo 4
RESULTADOS E DISCUSSÕES
73
4 RESULTADOS E DISCUSSÕES
Inúmeros fatores limitam o progresso no caminho da compreensão da bioquímica de
septinas. Entre estes, inclui-se a necessidade de ótimos sistemas de expressão, os quais
permitam a produção de quantidades suficientes de material homogêneo e biologicamente
ativo para subseqüente caracterização, incluindo cristalização. As dificuldades na expressão
recombinante e purificação de uma septina humana recombinante devem-se provavelmente à
baixa estabilidade do produto, com tendência a agregar e precipitar. A maioria das septinas
expressas são descritas na literatura científica como insolúveis quando expressas
individualmente em bactérias ou células de eucariotos (58). Este comportamento também foi
verificado em nosso protocolo de expressão e purificação, porém, conseguimos além da
proteína insolúvel uma quantidade suficiente dos seus domínios SEPT11G e SEPT11GC na
fração solúvel para subseqüente caracterização, incluindo análises espectroscópicas. No
entanto, não conseguimos obter o mesmo resultado com SEPT11NG, que não foi expressa
quando realizamos o mesmo protocolo dos demais domínios.
Neste capítulo serão descritos os resultados dos experimentos de amplificação,
clonagem, expressão, purificação, análise estrutural e caracterização da proteína humana
SEPT11.
74
4.1 Amplificação e clonagem
4.1.1 Amplificação e clonagem de Sept11G e Sept11GC em vetor de expressão pET28a(+)
As amplificações dos fragmentos Sept11G (807 pb) e Sept11GC (1176 pb) que
codificam os domínios SEPT11G e SEPT11GC, respectivamente, foram obtidos com sucesso
apresentando o tamanho esperado baseado na seqüência depositada no GenBank. Na
amplificação foi utilizada a técnica de PCR através de oligonucleotídeos sintetizados
contendo sítios para clivagem das enzimas de restrição NheI e XhoI, para posterior clonagem
em vetor de expressão pET28a(+). A reação de PCR foi realizada variando-se as
temperaturas, possibilitando a escolha da melhor condição para amplificação dos fragmentos
Sept11G e Sept11GC conforme a Figura 4.1 (A) e (B). Uma amostra foi escolhida para dar
continuidade aos experimentos com os fragmentos amplificados.
Após a inserção dos fragmentos no plasmídeo de expressão pET28a(+) a clonagem foi
confirmada pela análise do padrão de restrição (digestão), como mostrado na Figura 4.2 (A) e
(B). Sendo assim, obtivemos os plasmídeos recombinantes pET28aSept11G e
pET28aSept11GC.
75
Figura 4.1. Resultado da amplificação do fragmento que codifica a SEPT11. Análise realizada em gel de agarose 1% TAE (1X). (A) Sept11G. 1. Padrão em pares de bases (1Kb DNA Ladder - Fermentas). 2 e 3. Amplificação de Sept11G, variando-se a temperatura de anelamento, como demonstrado na tabela. (B) Sept11GC. 1. Marcador em pares de bases (1Kb DNA Ladder - Fermentas). 2 a 7. Produtos das reações de amplificação variando-se a temperatura de anelamento. As bandas visualizadas nas colunas 2 a 5. Correspondem ao excesso de primer não utilizado na reação.
1 2 3
Sept11G
807 pb
Coluna Temperatura (°C) 2 58,5 3 63,0
A)
1000 pb
Coluna Temperatura (°C) 2 60,8 3 63,5 4 66,0 5 68,1 6 69,7 7 70,5
B)
Sept11GC
1176 pb
1 2 3 4 5 6 7
1000 pb
76
1000 pb
Figura 4.2. Padrão de restrição de Sept11G e Sept11GC em pET28a (+). Análise realizada em gel de agarose 1% e TAE (1X). (A) Clivagem do DNA plasmidial pET28aSept11G. 1. Marcador em pares de bases (1Kb DNA Ladder - Fermentas). 2 a 7. DNA plasmidial de colônias transformantes digeridas com as enzimas de restrição NheI e XhoI. (B) Clivagem do DNA plasmidial pET28aSept11GC. 1. Marcador em pares de bases (1Kb DNA Ladder - Fermentas). 2 e 3. Representam os DNAs plasmidiais de colônias transformantes digeridas com as enzimas de restrição NheI e XhoI.
Os clones transformantes que apresentaram os insertos de 807 pb (Sept11G) e 1176 pb
(Sept11GC) foram seqüenciados confirmando a presença dos genes sintéticos inseridos no
vetor. A estrutura primária deduzida codifica uma cadeia polipeptídica de 269 resíduos de
aminoácidos para o domínio GTPase (G) e 392 resíduos para o domínio GTPase mais C-
terminal (GC) com 100% de identidade com a seqüência da SEPT11 (429 resíduos de
aminoácidos ao todo). É importante destacar que a região polibásica formada pelos
A)
B)
Sept11G 807 pb
1 2 3 4 5 6 7
pET28a(+) 5369 pb
Sept11GC 1176 pb
1 2 3
pET28a(+) 5369 pb
1000 pb
77
Coluna Temperatura (° C) 2 55,0 3 56,5 4 58,3 5 60,6 6 63,2 7 65,9 8 68,5 9 71,0
10 73,1
aminoácidos (VNKSTSQ) não pertence ao domínio GTPase, ou seja, os primers foram
desenhados para delimitar o início do domínio GTPase a partir do aminoácido Glutamina
(Q38).
A fidelidade da seqüência foi confirmada pelo seqüenciamento e isso permitiu a
continuidade do trabalho partindo agora para os procedimentos de expressão e purificação.
4.1.2 Amplificação e clonagem de Sept11NG em vetor de propagação pTZ57R/T
A amplificação de Sept11NG (918 pb) que codifica o domínio SEPT11NG, também foi
obtido com sucesso apresentando o tamanho esperado, baseado na seqüência depositada no
GenBank. Na amplificação por PCR foram usados oligonucleotídeos contendo sítios de
reconhecimento para clivagem pelas enzimas de restrição NheI e XhoI, para posterior
clonagem em vetor de propagação pTZ57R/T. A reação de PCR foi realizada variando-se as
temperaturas, possibilitando a escolha da melhor condição para amplificação do fragmento
Sept11NG, veja Figura 4.3.
Figura 4.3. Resultado da amplificação do fragmento que codifica a SEPT11NG. Análise realizada em gel de agarose 1% TAE (1X). 1. Marcador em pares de bases (1Kb DNA Ladder - Fermentas). 2 a 10. Produtos das reações de PCR realizadas com variação da temperatura de anelamento.
Sept11NG
918 pb
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1000 pb
78
Após a inserção dos fragmentos no plasmídeo de propagação pTZ57R/T a clonagem foi
confirmada pela análise do padrão de restrição (digestão), como mostrado na Figura 4.4.
Sendo assim, obtivemos o plasmídeo recombinante pTZ57R/TSept11NG.
Figura 4.4. Padrão de restrição do DNA plasmidial pTZ57R/TSept11NG. Análise realizada em gel de agarose 1% e TAE (1X). 1. Marcador em pares de bases (1Kb DNA Ladder - Fermentas). 2, 3, 6 e 7. Representam os DNAs plasmidiais das colônias transformantes digeridos com as enzimas de restrição NheI e XhoI. Colunas 4 e 5. DNAs plasmidiais das colônias transformantes não foi digerido.
O clone transformante que apresentou o inserto de 918 pb (Sept11NG) foi seqüenciado
confirmando a presença do fragmento inserido no vetor. A estrutura primária deduzida
codifica uma cadeia polipeptídica de 306 resíduos de aminoácidos para os domínios N-
terminal e GTPase (NG) com 100% de identidade com a seqüência da SEPT11.
A subclonagem do gene Sept11NG foi realizada com sucesso em vetor de expressão
bacteriano pET28a(+). Este vetor foi escolhido por permitir a expressão da proteína de
interesse fusionada a um peptídeo carreador contendo 6 histidinas que facilita a purificação
subseqüente.
Realizamos ensaios de expressão e indução, porém os resultados não foram satisfatórios
para dar continuidade aos experimentos. A proteína SEPT11NG não foi expressa tanto na
forma solúvel como insolúvel, fato ainda não esclarecido. No entanto, a existência de códons
raros pode dificultar o reconhecimento do gene subclonado pela bactéria. Observamos que há
1 2 3 4 5 6 7
Sept11NG 918pb
1000 pb
pTZ57R/T 2886 pb
79
quatro códons raros muito próximos no início da seqüência da SEPT11NG que codificam os
aminoácidos Gly6, Arg7, Arg14 e Gly23. A existência de códons raros para E. coli na
seqüência da SEPT11NG, pode levar a terminação precoce da tradução (59).
4.1.3 Amplificação e clonagem de Sept11NGC em vetor de propagação pTZ57R/T
Neste caso, o protocolo de amplificação para Sept11NGC foi diferente dos demais, pois
não usamos a biblioteca de cDNA de cérebro fetal humano (vários testes foram realizados
sem sucesso usando essa biblioteca). Portanto, nesta reação utilizamos os moldes previamente
obtidos de Sept11GC e Sept11NG e dois clones obtidos a partir do sistema do duplo-híbrido.
A amplificação do fragmento de Sept11NGC (1287 pb) apresentou o tamanho esperado, veja
Figura 4.5 (A) e (B).
Os vetores pTZ57R/T, TOPO e pET28a(+) e as células competentes DH5α, TOP10 e
NEB10 foram testadas para clonagem de Sept11NGC, porém, em nenhuma das reações
obteve-se o clone transformante.
80
Sept11NGC
1287 pb
Figura 4.5. Resultado da amplificação de Sept11NGC. (A) Amplificação usando como moldes os clones Sept11GC e Sept11NG. 1. Marcador em pares de base (1Kb Plus DNA Ladder - Invitrogen). 2. Amplificação do gene Sept11NGC. (B) Amplificação usando como moldes dois clones obtidos a partir do sistema do duplo-híbrido. 1. Marcador de massa molecular (1Kb Plus DNA Ladder - Invitrogen). 2 e 3. Amplificação do gene Sept11NGC.
4.2 Expressão e purificação de SEPT11G e SEPT11GC
Como descrito anteriormente, realizamos ensaios de expressão na presença ou ausência
de GDP ou GTP e MgCl2 no tampão A, pois até o momento não sabíamos se a SEPT11 liga
GDP ou GTP in vitro. Porém, os testes de expressão, assim como a purificação e análise
estrutural não apresentaram diferenças significativas quando na presença ou ausência do
nucleotídeo (GDP ou GTP) e MgCl2 no tampão A. Sendo assim, vamos apresentar somente os
resultados na ausência destes compostos no tampão A.
Coluna Temperatura (° C) 2 65,0
Coluna Temperatura (° C) 2 65,0 3 65,0
A)
B)
1 2 3
1 2
Sept11NGC
1287 pb 1000 pb
1000 pb
81
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 2 3 4 5 6 7 8 9
A análise de expressão dos domínios SEPT11G (~ 30 kDa) e SEPT11GC (~ 45 kDa)
foi realizada em SDS-PAGE 15%, como mostrado na Figura 4.6 (A) e (B), na qual é possível
observar a expressão dos domínios após a indução com IPTG. As bandas purificadas por
cromatografia de afinidade têm a massa esperada para os domínios SEPT11G e GC. A maior
porção do domínio SEPT11G é solúvel, apesar de ocorrer perda para o precipitado (“pellet”).
Figura 4.6. Expressão e purificação de domínios da SEPT11. SDS-PAGE 15% ilustrando extratos totais e purificados de E. coli BL21 (DE3) hospedando o plasmídeo de interesse. (A) SEPT11G. 1. Padrão de massa molecular (em kDa). 2. Cultura não induzida + lisozima. 3. Fração solúvel 4. Fração insolúvel. 5. Material não ligado na resina. 6 a 9. Lavagens da coluna com imidazol. 10. SEPT11G eluída com 200 mM de imidazol. (B) SEPT11GC. 1. Padrão de massa molecular (em kDa). 2. Cultura não induzida. 3. Fração solúvel. 4. Fração insolúvel. 5. Material não ligado na resina. 6 a 8. Lavagens da coluna com imidazol. 9. SEPT11GC eluída com 200mM de imidazol.
A cromatografia de exclusão molecular na coluna Superdex-200 foi usada no intuito de
eliminar possíveis agregados da proteína e contaminantes restantes do passo anterior. As
A)
B)
97 66 45 30 20 14
SEPT11G ~ 30 kDa
97 66 45 30 20 14
SEPT11GC ~ 45 kDa
82
1 2
SEPT11G
2
1
97 66 45
30
20
14
Figuras 4.7 e 4.8 mostram os resultados da cromatografia de exclusão molecular e o estado de
oligomerização de SEPT11G e SEPT11GC, respectivamente.
5 10 15 20 25 30 350
100
200
300
400
500
Abs
280n
m (
mA
U)
Frações eluídas (mL)
Figura 4.7. Perfil da cromatografia de exclusão molecular do domínio SEPT11G na coluna Superdex-200. O pico 1 é referente à SEPT11G, de massa molecular aparente de aproximadamente 60kDa. O pico 2 é referente ao imidazol. A direita acima está inserida a curva de calibração da coluna Superdex-200. A esquerda está inserido o resultado do SDS-PAGE (15%) para o pico 1: 1. Padrão de massa molecular (em kDa); 2. SEPT11G, aproximadamente 2,6 mg/L, destacado em azul.
83
97 66 45 30
20
14
1
2
SEPT11GC 1 2
0 5 10 15 20 25 30 35
0
10
20
30
40
50
60
70
Abs
280n
m (
mA
U)
Frações eluídas (mL)
Figura 4.8. Perfil da cromatografia de exclusão molecular do domínio SEPT11GC na coluna Superdex-200. O pico 1 é referente à SEPT11GC, de massa molecular aparente de 45kDa. O pico 2 é referente ao imidazol. A esquerda acima está inserida a curva de calibração da coluna Superdex-200. A direita está inserido o resultado do SDS-PAGE (15%) para o pico 1: 1. Padrão de massa molecular (em kDa); 2. SEPT11G aproximadamente 1,8 mg/L, destacado em azul.
O perfil de eluição de SEPT11G (Figura 4.7), mostrou um pico correspondente a massa
molecular aparente de aproximadamente 60 kDa, de acordo com a curva de calibração. Este
valor obtido equivale, aproximadamente, ao dobro do esperado para o monômero (30 kDa),
indicando assim que SEPT11G é, provavelmente, homodimérica em solução, nas condições
analisadas. Já a Figura 4.8 (B) mostra o perfil de eluição de SEPT11GC com um único pico,
84
de massa molecular aparente de 45 kDa, este valor equivale ao tamanho aproximado, de um
monômero, indicando que SEPT11GC é mais provavelmente monomérica em solução, nas
condições analisadas. Podemos observar um pequeno “ombro” do lado esquerdo, que
corresponde a uma pequena fração de agregados de SEPT11G e SEPT11GC, pois no gel de
SDS-PAGE estes ombros correspondem à proteína uma vez que migra de forma igual ao pico
principal. Estes “ombros” também foram observados para a SEPT4 (60). O rendimento da
purificação para SEPT11G foi de aproximadamente 2,6 mg de proteína por litro de cultura e
para SEPT11GC aproximadamente 1,8 mg de proteína por litro de cultura.
A estrutura cristalográfica do domínio GTPase da SEPT2 mostra que ela é dimérica em
solução e a interface do dímero é do tipo G (15). Uma associação similar poderia explicar o
fato do domínio GTPase da SEPT11 ser dimérico em solução. Além disso, resultados
apresentados com o domínio GTPase da SEPT4 (SEPT4G) mostram que ela também forma
um homodímero estável em solução (60). No caso da septina Cdc11 (presente em leveduras)
foi verificado que o domínio GTPase é importante na associação com ela mesmo, indicando
que este domínio pode mediar esta interação (61). Resultados com as septinas SEPT3, SEPT5
e SEPT7 do nosso grupo mostram que elas também são diméricas em solução (resultados não
publicados) como o observado para as septinas SEPT11, SEPT4 e SEPT2. Portanto, todas
estas evidências sugerem que domínios GTPase tendem a se associar em dímeros em solução
quando expressas em sistemas heterólogos. Portanto, os resultados com a SEPT11G são
compatíveis com o que já foi visto na literatura e sugere que a proteína enovelou
corretamente.
Mostramos ainda um teste para observar se o estado de oligomerização da SEPT11G é
modificado após um tempo de incubação com GTP. Cerca de 10 µM da proteína pura (após
cromatografia de afinidade e exclusão molecular) foi incubada com GTP 50 µM por 1 h a
85
0ºC. Em seguida, passamos a amostra novamente na cromatografia de exclusão molecular
(Superdex-200), veja Figura 4.9.
Podemos observar um excesso de nucleotídeo que foi eluído na fração de 18 mL,
aproximadamente (pico 2). Os espectros de absorção são mostrados em dois comprimentos de
onda, já que GDP e GTP apresentam dois picos de absorção, um máximo em 254nm e o outro
em 280nm. Podemos observar que a posição e o perfil do pico correspondente a SEPT11G
não mudou indicando que SEPT11G não é influenciada pela presença de excesso de GTP.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 320
100
200
300
400
500
600
Abs
280n
m (
mA
U)
Frações eluídas (mL)
254nm 280nm
Figura 4.9. Perfil da cromatografia de exclusão molecular de SEPT11G na resina Superdex-200 após incubação com GTP. O pico 1 é referente à SEPT11G. O pico 2 é referente ao GTP ou GDP.
4.3 Teste de atividade e análise do conteúdo de nucleotídeo liberado
Como mencionado anteriormente, a dificuldade em avaliar a atividade GTPase das
septinas é uma fato que interfere no progresso do estudo destas proteínas. Os métodos
1
2
SEPT11G
GDP ou GTP
86
descritos neste trabalho avaliam o conteúdo de nucleotídeo liberado da proteína após
desnaturação química com ácido perclórico e desnaturação térmica a 100ºC.
Na desnaturação química das septinas SEPT2NG e SEPT11G o conteúdo de
nucleotídeo (GDP ou GTP) liberado foi determinado utilizando uma coluna de troca aniônica
(Protein Pak DEAE 5 PW) e analisada em um cromatógrafo Alliance 2695 (Waters). Ótimas
separações de GDP e GTP foram obtidas, e os nucleotídeos identificados através dos tempos
de migração, em comparação com padrões (controles) previamente definidos. Para tal,
usamos os nucleotídeos GTP e GDP e o ácido perclórico tratados da mesma forma que as
proteínas SEPT2NG e SEPT11G seguindo o protocolo de desnaturação química e térmica. O
monitoramento dos ensaios foi realizado em dois comprimentos de onda distintos, pois
sabemos que GDP e GTP apresentam dois picos de absorção, um máximo em 254nm e o
outro em 280nm.
O cromatograma mostrando a separação de GDP e GTP, após tratamento com o método
de desnaturação química, está ilustrado na Figura 4.10 (A). Os picos correspondentes ao GDP
e GTP foram observados em, aproximadamente, 8 min e 8.5 min, respectivamente, com um
tempo total de análise de 13 min. O cromatograma do ácido perclórico é mostrado na Figura
4.10 (B). Podemos observar que o ácido perclórico também apresentou absorção em 254 nm,
porém foi observado em 3 min, aproximadamente, sendo assim foi possível separá-lo do GDP
e GTP.
O cromatograma mostrando a separação de GDP e GTP, após tratamento com o
método de desnaturação térmica, está ilustrado na Figura 4.11. Os picos correspondentes ao
GDP e GTP, assim como na desnaturação química, foram observados em 8 min e 8.5 min,
respectivamente, com um tempo total de análise de 13 min. Concluímos que os dois métodos
de desnaturação (química com ácido perclórico e térmica a 100°C) forneceram um protocolo
de separação do GDP e GTP.
87
GTP
GDP
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
Abs
254n
m(m
AU
)
Tempo (min)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
0,000
0,005
0,010
0,015
0,020
0,025
0,030
0,035
0,040
Abs
254n
m(m
AU
)
Tempo (min)
Ácido perclórico
Figura 4.10. Cromatografia de troca aniônica mostrando a separação do GDP e GTP quando tratados com o método de desnaturação química com ácido perclórico (A). Cromatograma do ácido perclórico após tratamento com o método de desnaturação química (B).
B)
A)
88
GTP
GDP
Tanto no método de desnaturação química quanto de desnaturação térmica foi usada
uma mistura de GDP e GTP (10 µM de cada) para demonstrar a capacidade de separá-los.
Para identificar a natureza dos dois picos, os nucleotídeos foram testados separadamente,
assim permitindo distingui-los sem ambigüidade.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
Abs
254n
m(m
AU
)
Tempo (min)
Figura 4.11. Cromatografia de troca aniônica mostrando a separação do GDP e GTP quando tratados com o método de desnaturação térmica.
Amostras do sobrenadante de SEPT2NG (controle positivo da atividade) e SEPT11G
submetidas à desnaturação química e térmica, tiveram seu conteúdo de nucleotídeo liberado
analisado, como mostrado nas Figuras 4.12 e 4.13, respectivamente. As amostras de proteína
usadas nestes experimentos foram obtidas após as cromatografias de afinidade e exclusão
molecular. No tampão de eluição da proteína na coluna de afinidade, não havia GTP (todos os
passos anteriores foram realizados na presença de GTP no tampão), portanto, se a proteína
tivesse afinidade pelo nucleotídeo ele estaria ligado, e qualquer excesso de GTP livre em
89
solução foi retirado pela cromatografia de exclusão molecular que foi o último passo da
purificação, ou seja, na amostra final não tem GDP/GTP livre e a liberação do nucleotídeo
após a desnaturação só vai ocorrer se ele estiver ligado à proteína.
O cromatograma do sobrenadante SEPT2NG mostra que a proteína liberou GDP após
desnaturação química, Figura 4.12 (A). Porém, observamos que no cromatograma do
sobrenadante da proteína humana SEPT11G, desnaturada com ácido perclórico, não ocorreu
liberação de GDP ou GTP, Figura 4.12 (B), ou seja, nenhum pico foi observado em 8 min
(GDP) e em 8.5 min (GTP), como observado para a SEPT2NG.
Estes resultados mostram que SEPT2NG hidrolisou todo o GTP ligado, pois
observamos um único pico em 8 min que indica a presença somente de GDP, confirmando
assim a capacidade de ligar nucleotídeo e atividade hidrolítica da SEPT2NG, sugerindo que a
catálise (mas não a liberação do produto, GDP) ocorre na ausência de adicionais proteínas
auxiliares in vitro (com uma taxa mensurável em uma escala de tempo da ordem de
minutos/horas). Contudo a possível existência de fatores de troca e/ou proteínas de ativação
podem afetar significativamente a cinética de hidrólise de GTP pela SEPT2NG e outras
septinas in vivo. Por outro lado, SEPT11G não apresentou nenhum pico de nucleotídeo
liberado e o cromatograma mostrado pelo material liberado da desnaturação química da
SEPT11G foi similar com o apresentado pelo ácido perclórico somente, Figura 4.10 (B).
90
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
Abs
254n
m(m
AU
)
Tempo (min)
GDP/GTP SEPT2NG
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
Abs
254n
m(m
AU
)
Tempo (min)
GDP/GTP SEPT11G
Figura 4.12. Cromatografia de troca aniônica mostrando a separação de GDP e GTP após a desnaturação química com ácido perclórico de SEPT2 e SEPT11. (A) Sobrenadante de SEPT2NG. Cromatograma mostrando a liberação do GDP após desnaturação com ácido perclórico. B) Sobrenadante de SEPT11G. Cromatograma mostrando que a SEPT11G não libera GDP ou GTP após a desnaturação com ácido perclórico.
A)
B)
GDP
GTP
GDP
GTP
91
Do mesmo modo, quando a proteína SEPT2NG foi desnaturada por temperatura a
100ºC, foi observado um pico após 8 min de corrida correspondente ao GDP, Figura 4.13 (A).
No entanto, quando a SEPT11G passou pelo mesmo procedimento nenhum pico foi
observado em 8 min (GDP) ou 8.5 min (GTP), aproximadamente, Figura 4.13 (B).
Podemos observar que o cromatograma do material liberado da SEPT2NG após a
desnaturação térmica não apresentou tempo de eluição exatamente igual aquele observado na
cromatografia da amostra obtida pelo método de desnaturação química. Assim, o pico
correspondente ao GDP liberado pela SEPT2NG na desnaturação térmica está ligeiramente
deslocado e apresenta um “ombro” indicando que a metodologia de desnaturação química
provavelmente é a mais indicada uma vez que o tratamento térmico poderia levar a
degradação do nucleotídeo.
92
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
GDP/GTP SEPT2NG
Abs
254n
m(m
AU
)
Tempo (min)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
GDP/GTP SEPT11G
Abs
254n
m(m
AU
)
Tempo (min)
Figura 4.13. Cromatografia de troca aniônica mostrando a separação de GDP e GTP após a desnaturação térmica de SEPT2 e SEPT11. (A) Sobrenadante de SEPT2NG. Cromatograma mostrando a liberação do GDP após desnaturação a 100ºC. B) Sobrenadante de SEPT11G. Cromatograma mostrando que a SEPT11G não libera GDP ou GTP após a desnaturação a 100ºC.
A)
B)
GTP
GDP
GTP
GDP
93
Realizamos o procedimento de desnaturação química com ácido perclórico com
amostras de SEPT11G expressas e purificadas por cromatografia de afinidade na presença de
GDP e MgCl2 durante a expressão e purificação por cromatografia de afinidade. Novamente
foi observado que o domínio estrutural SEPT11G não liberou nucleotídeo, (Figura 4.14).
Observamos que o cromatograma do sobrenadante da SEPT11G expressa e purificada
com GDP e MgCl2, foi semelhante ao observado quando a SEPT11G foi expressa e purificada
com GTP, ou seja, segundo os resultados aqui apresentados SEPT11G não liga GDP nem
GTP.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
GDP/GTP SEPT11G com GTP SEPT11G com GDP
Abs
254n
m(m
AU
)
Tempo (min)
Figura 4.14. Cromatografia de troca aniônica mostrando a separação de GDP e GTP após a desnaturação química com ácido perclórico da SEPT11G (sobrenadante). A amostra foi expressa e purificada na presença de GDP ou GTP. Os resultados mostram que SEPT11G não libera GDP ou GTP após a desnaturação com ácido perclórico.
O fato de não observarmos a liberação de GDP ou GTP pela proteína SEPT11G após
desnaturação química e térmica é intrigante. Realizamos um experimento para avaliar a
hidrólise do GTP para GDP em função do tempo de incubação com GTP e observar se a
GTP
GDP
94
proteína hidrolisa e libera o nucleotídeo (GDP) rapidamente, já que não observamos a
liberação do nucleotídeo após a desnaturação química e térmica da SEPT11G. O experimento
consistiu em incubar SEPT11G com GTP e após os tempos (T1 = 10 min; T2 = 20 min; T3 =
30 min; T4 = 40 min; T5 = 50 min; e T6 = 60 min) retirar alíquotas e submetê-las ao método
de desnaturação química com ácido perclórico (descrito previamente). Em seguida,
analisamos o conteúdo de nucleotídeo liberado utilizando uma coluna de troca aniônica
(Protein Pak DEAE 5 PW) em um cromatógrafo Alliance 2695 (Waters). Na Figura 4.15,
mostramos o cromatograma do sobrenadante da SEPT11G.
Figura 4.15. Cromatografia de troca aniônica mostrando a taxa de hidrólise do GTP da SEPT11G após incubação com o nucleotídeo por tempos diferentes (T1-T6). Os resultados mostram que SEPT11G não hidrolisou GTP após os tempos de incubação com o nucleotídeo. Para avaliar o conteúdo de nucleotídeo unido à proteína nós realizamos o método de desnaturação química com ácido perclórico.
Podemos observar que não houve hidrólise de GTP e liberação de GDP em função do
tempo de incubação com o nucleotídeo, pois nenhuma diferença foi observada após os tempos
T1 - T6 de incubação com GTP. Talvez a proteína necessite de fatores de troca para realizar a
0 2 4 6 8 10 12 14
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
Abs
254n
m(m
AU
)
Tempo (min)
T1 (10') T2 (20') T3 (30') T4 (40') T5 (50') T6 (60') GDP/GTP
GTP GDP
95
hidrólise do nucleotídeo, no entanto, isso não é visto para a SEPT2NG que hidrolisou GTP
para GDP sem a necessidade desses fatores de troca in vitro.
4.4 Ensaios espectroscópicos de SEPT11G e SEPT11GC
Após a clonagem, seqüenciamento e expressão de SEPT11G e GC, realizamos ensaios
de caracterização da estrutura dos domínios SEPT11G e GC através das técnicas
espectroscópicas de dicroísmo circular (CD) e variação do espalhamento de luz com a
finalidade de avaliar a estrutura secundária e terciária e ainda a estabilidade térmica e
¨unfolding¨ dos domínios recombinantes SEPT11G e GC.
Os ensaios de CD e fluorescência foram realizados com todas as amostras (expressas
com ou sem GDP ou GTP e MgCl2), porém, não houve variações nos resultados. Isto é
compreensível com os resultados descritos anteriormente que mostram que a SEPT11 não liga
GTP quando expressa em sistema heterólogo.
Os resultados de CD indicaram que SEPT11G e SEPT11GC são compostos de uma
mistura de estrutura secundária α/β similar ao observado em muitas pequenas GTPases e para
a SEPT4G e GC (60). A Figura 4.16 (A) e (B) mostra o espectro de CD de SEPT11G e
SEPT11GC, respectivamente, com uma elipticidade se tornando positiva em torno de 200nm
e dois mínimos negativos ao redor de 211 nm e 222 nm para SEPT11G e 209 nm e 221 para
SEPT11GC, típicos de proteínas com alto conteúdo de hélices α. As diferenças dos mínimos
entre SEPT11G e GC podem ser atribuídas ao domínio C-terminal.
A desconvolução dos espectros foi realizada utilizando os programas CONTIN,
SELCON3 e CDSSTR do pacote de programas CDPro (47, 48). Os valores de estrutura
secundária avaliados indicaram que SEPT11G apresenta 29% de hélices-α, 22% de folhas-β e
49% de coil. Já SEPT11GC apresentou 48% de hélices-α, 8% de folhas-β e 44% de coil.
96
Comparando SEPT11G com SEPT11GC, os resultados foram satisfatórios já que era esperado
encontrar mais hélices-α na SEPT11GC já que o C-terminal é tido como um coiled-coil.
200 210 220 230 240 250-40
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
C
D(m
deg)
λ (nm)
200 210 220 230 240 250
-16
-14
-12
-10
-8
-6
-4
-2
0
CD
(m
deg)
λ (nm)
Figura 4.16. Espectro de CD de domínios da SEPT11a 20ºC. (A) SEPT11G. (B) SEPT11GC.
B)
A)
97
A Figura 4.17 (A) e (B) mostra a diminuição do mínimo em 222 nm do espectro de CD
dos domínios protéicos SEPT11G e SEPT11GC como função do aumento da temperatura,
com o intuito de monitorar a estabilidade térmica da SEPT11.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100-45
-40
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
CD
222 (
mde
g)
Temperatura (C)
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
-16
-14
-12
-10
-8
-6
-4
-2
CD
222 (
mde
g)
Temperatura (C)
Figura 4.17. Espectro de CD de domínios da SEPT11. Monitoração do mínimo em 222 nm em função da temperatura. (A) SEPT11G (curva vermelha). (B) SEPT11GC (curva azul).
A)
B)
98
Analisando o resultado da Figura 4.17, verificamos uma diminuição do mínimo com o
aumento da temperatura indicando perda de estrutura secundária para SEPT11G e
SEPT11GC.
No caso de SEPT11G parece que há um desenovelamento cooperativo com uma
transição da forma enovelada para desenovelada centrado em 37ºC, sugerindo que o
desenovelamento deste domínio pode ser descrito por um modelo de dois estados.
No caso de SEPT11GC a temperatura de transição é mais elevada, sugerindo que o
domínio C-terminal ajuda na estabilidade da estrutura. Parece que a temperatura de transição
é mais “suave” e há evidência de um pequeno ombro (em torno de 30ºC) indicando a possível
existência de um intermediário durante o desenovelamento.
Trabalhos realizados no nosso grupo com a SEPT4 mostram a existência de um
intermediário durante o desenovelamento do domínio G e GC tanto quando induzido por
temperatura quanto uréia (62). Fato semelhante acontece com a SEPT2 (proteína de estudo do
aluno de doutorado Julio Cesar Pissuti Damalio). Estes trabalhos mostram também que tanto
no caso da SEPT2 quanto SEPT4 o intermediário (que é rico em folhas-β) tem uma tendência
de formar amilóides rapidamente in vitro. Curiosamente, estas duas septinas, que demonstram
claramente um intermediário durante o desenovelamento, já foram associadas com depósitos
de amilóides in vivo (3) incluindo associações com doenças de Alzheimer e Parkinson. Por
outro lado, no caso da SEPT11 (e outras) não há ainda relatos na literatura da associação com
doenças e amilóides. Esta observação precisa ser mais bem investigada, mas sugere que
possam existir diferenças importantes no comportamento biofísico de uma septina para outra
que eventualmente sejam relevante para sua associação com doenças degenerativas.
Os espectros de CD aparentemente mostram que SEPT11G está enovelada corretamente
e o fato de ser eluída solúvel como um dímero também suporta a idéia de estar bem
enovelada, sendo assim acreditamos que SEPT11G encontra-se na sua forma conformacional
99
correta e, portanto, o fato de não ocorrer liberação do nucleotídeo (como visto no item 4.3),
pode sugerir que SEPT11 não precisa ligar GTP para a formação do homodímero.
Em conjunto com as análises de dicroísmo circular (CD), realizamos um estudo da
estabilidade térmica dos domínios SEPT11G e SEPT11GC empregando a técnica de
espalhamento de luz a 350 nm em ângulo fixo, veja Figura 4.18 (A) e (B), respectivamente.
Podemos observar que o espalhamento de luz é constante como função do tempo para
temperaturas inferiores a 30ºC. Contudo, um grande aumento do espalhamento de luz é
verificado para temperaturas maiores que 30ºC (na Figura apresentamos os resultados de
SEPT11G para as temperaturas de 37ºC e 40ºC e SEPT11GC para a temperatura de 37ºC).
Estes resultados indicam que os domínios SEPT11G e SEPT11GC provavelmente sofrem um
forte processo de agregação mesmo em temperaturas próximas da fisiológica (37ºC). Estes
resultados são coerentes ao observado pela SEPT4G e SEPT4GC que também sofrem um
processo de agregação em temperaturas acima de 30ºC (60).
Há certa relação entre os resultados de CD e os de espalhamento de luz apresentados
aqui. Observamos que a temperatura em que os domínios G e GC sofrem agregação acontece
em torno da temperatura de desenovelamento (em torno de 37ºC). Para SEPT11G o processo
de agregação parece ser mais rápido que para SEPT11GC compatível com os resultados de
dicroísmo circular onde a transição da forma enovelada para a desenovelada de SEPT11G
acontece a temperaturas mais baixas.
100
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 40000
200
400
600
800
1000
Var
iaçã
o do
esp
alha
men
to d
e lu
z (u
.a.)
Tempo (s)
15oC 30oC 37oC 40oC
0 1000 2000 3000 4000 5000
25
50
75
100
125
150
175
200
225
Var
iaçã
o do
esp
alha
men
to d
e lu
z (u
.a.)
Tempo (s)
18oC 30oC 37oC
Figura 4.18. Variação do espalhamento de luz a 350 nm em função do tempo para os domínios da SEPT11. (A) SEPT11G. (B) SEPT11GC.
A)
B)
101
4.5 Ensaios de cristalização
Com os domínios SEPT11G e GC da proteína SEPT11 purificados e concentrados (~ 5
mg/mL) foram realizados testes de cristalização a 18ºC utilizando os fatoriais: Crystal Screen
II (Hampton Research) e Nextal Tubes – PEGs Suite (Qiagen) para SEPT11G e Crystal
Screen I e Crystal Screen II (Hampton Research) para a SEPT11GC. Nenhum cristal foi
observado e na maioria das gotas observou-se a presença de precipitado amorfo.
4.6 Técnicas computacionais
Características importantes da SEPT11 e seus domínios estruturais GTPase e C-terminal
foram obtidas através do uso de um conjunto de programas do Expasy (Expert Protein
Analysis System, http://ca.expasy.org), veja Tabela 4.1.
Tabela 4.1 - Parâmetros dos domínios G e GC da SEPT11. Massa molecular (M.M), coeficiente de extinção teórico (ε), ponto isoelétrico (pI), resíduos florescentes (R) e número de aminoácidos (aa).
M.M. (Da) ε (M-1 cm-1) pI R aa
SEPT11 49.398,2 21.890 6.36 1W, 20F, 11Y 429
SEPT11G 30.871,4 20.400 6.17 1W, 12F, 10Y 269
SEPT11GC 45.489,9 21.890 6.48 1W, 19F, 11Y 392
4.6.1 Predição da estrutura secundária
Como citado anteriormente, septinas são constituídas de um N-terminal variável
seguido por um domínio de ligação a GTP e finalizando por um domínio coiled-coil (11). Na
102
Figura 4.19, apresentamos os resultados de predição de estrutura secundária, utilizando o
programa PSIPRED, obtidos na análise da seqüência de aminoácidos da SEPT11.
O programa de predição da estrutura secundária PSIPRED prediz que o N-terminal (1-
37) da proteína SEPT11 possui aproximadamente 70% de estruturas não regulares (coils) e
30% de hélices α. Com base na comparação com a estrutura de outras GTPases, o domínio
GTPase (38-306) da SEPT11 é esperado conter uma mistura de estruturas α/β, consistente
com os espectros de CD obtidos experimentalmente para o domínio GTPase. Tais domínios,
em pequenas GTPases por exemplo, tipicamente possuem aproximadamente 40% de hélices α
e 30% de folhas β (6). Em certa concordância, a predição de estrutura secundária resultou em
aproximadamente 40% de hélices α, 22% de folhas β e 38% de estruturas não regulares para o
domínio GTPase da SEPT11. O C-terminal (307-429) da SEPT11 é maior do que outras
septinas (veja Figura 4.19), e a predição de estrutura secundária prediz ser composto por
aproximadamente 81% de hélices α e 19% de estruturas não regulares, como esperado para
uma região em coiled-coil.
103
Figura 4.19. Predição da estrutura secundária da septina humana SEPT11. (PSIPRED - Protein Structure Prediction Server). Em vermelho estão destacados os motivos estruturais G1, G3 e G4 do domínio GTPase da SEPT11. Em verde são mostradas as hélices-alfa. Em rosa as fitas-beta e em azul a região polibásica. As estruturas não regulares são denominadas com a letra C (coil).
4.6.2 Modelagem molecular por homologia
Uma das chaves para compreender a bioquímica de septinas é a obtenção de
informações moleculares detalhadas em nível estrutural (3). Poucas estruturas tridimensionais
completas de septinas ou de seus domínios estão relatadas na literatura. Portanto, existem
poucas informações a respeito de como a ligação e hidrólise do GTP podem afetar as
104
estruturas tridimensionais de septinas. Por outro lado, esta sensível regulação é conhecida por
ser crítica para a compreensão do funcionamento de outras GTPases. A intenção de criar um
modelo foi para identificar eventuais diferenças no sítio de ligação ao nucleotídeo entre
SEPT11 e SEPT6 que poderiam explicar o fato da SEPT11 aparentemente não ligar
nucleotídeo, uma vez que ainda não foram obtidos cristais. Na Figura 4.20 mostramos um
modelo da estrutura tridimensional do sítio de ligação ao nucleotídeo dentro do domínio
GTPase da SEPT11.
Figura 4.20. Modelo da estrutura tridimensional do sítio de ligação ao nucleotídeo da SEPT11. Figura obtida por modelagem molecular por homologia estrutural (septina-molde SEPT6). Sobreposição do modelo da SEPT11 e a estrutura cristalográfica da SEPT6 na região do sítio de ligação ao GTP (SEPT11 em rosa e SEPT6 em azul) para mostrar as diferenças observadas. Os motivos G1, G3 e G4 de ligação ao nucleotídeo também são mostrados.
G3
Da direita à esquerda: Thr-Ile-Val. Seqüência que antecede o G3, bem conservada no grupo II.
G4
G1
Asp62
105
A estrutura cristalográfica do domínio GTPase da SEPT6 (resolução de 4.0 Å) (15)
apresenta 78 resíduos com cadeia lateral completa (27%), 167 resíduos apenas até o carbono β
(57%), 1 resíduo sem cadeia lateral, 45 resíduos sem estrutura determinada (15%), com um
total de 291 resíduos de aminoácidos.
Com o modelo, baseado numa estrutura pobre, é possível ter apenas uma noção da
distribuição espacial dos resíduos mais importantes. O importante é que a modelagem serviu
para construir as cadeias laterais que faltavam, com isso facilitamos a identificação de
eventuais resíduos de importância funcional próximos ao GTP. Como pode ser visto na Figura
4.20 não há diferenças significativas que possam explicar o fato de SEPT11 não ter ligado o
GTP como descrito no item 4.3. A única diferença encontrada na região é a Ser62 na SEPT6
que na SEPT11 é substituída por um Asp62 (aminoácido destacado na figura). Dificilmente
esta substituição poderia acarretar uma falta na capacidade de ligar nucleotídeo uma vez que
septinas de outros grupos que sabidamente ligam nucleotídeo (SEPT 2 e SEPT4 por exemplo)
também apresentam um ácido aspártico nesta posição.
Por outro lado, o modelo também pode ser usado para avaliar diferenças entre o grupo
II como um todo em comparação com as demais septinas. O interesse nisso seria tentar
explicar o porquê da falta de hidrólise do GTP em SEPT6, como visto na estrutura
cristalográfica do complexo SEPT2/6/7 (15). Assim sendo, observamos que as proteínas
pertencentes ao grupo II (SEPT6, SEPT8, SEPT10, SEPT11 e SEPT14) apresentam
diferenças em dois resíduos de aminoácidos (em azul) presentes nos motivos de ligação ao
nucleotídeo, G1 e G3 (veja Figura 4.21).
No motivo G1 as septinas do grupo II apresentam uma treonina (T) (resíduo 12 do
domínio GTPase) no lugar de uma serina (S) presente nas demais septinas, e no motivo G3
uma valina (V) (resíduo 64 do domínio GTPase) está presente nas septinas do grupo II e uma
prolina (P) nas demais septinas. Sabemos que SEPT6 não hidrolisa GTP para GDP (15) e isso
106
pode ser devido às mudanças nos resíduos de aminoácidos presentes no domínio de ligação ao
nucleotídeo. A importância dos resíduos identificados poderia ser testada futuramente por
mutagênese sítio dirigida.
sept6 VGFDSLPDQLVNKSVSQGFCFNILCVGETGLGKSTLMDTLFNTKFEGEPATHTQP-----GVQLQSNTYDLQESNVRLKLTIVSTVGFGDQINKE
sept8 VGFDSLPDQLVSKSVTQGFSFNILCVGETGIGKSTLT----------EEASHHEA-----CVRLRPQTYDLQESNVQLKLTIVDAVGFGDQINKD
sept10 VGFESLPDQLVNRSIQQGFCFNILCVGETGIGKSTLIDTLFNTNFEDYESSHFCP-----NVKLKAQTYELQESNVQLKLTIVNTVGFGDQINKE
sept11 VGFDSLPDQLVNKSTSQGFCFNILCVGETGIGKSTLMDTLFNTKFESDPATHNEP-----GVRLKARSYELQESNVRLKLTIVDTVGFGDQINKD
sept14 FGFECLPNQLVSRSIRQGFTFNILCVGETGIGKSTLIDTLFNTNLKDNKSSHFYS-----NVGLQIQTYELQESNVQLKLTVVETVGYGDQIDKE
sept1 VGFAALPNQLHRKSVKKGFDFTLMVAGESGLGKSTLINSLFLTNLYEDRQVPEASARLTQTLAIERRGVEIEEGGVKVKLTLVDTPGFGDSVDCS
sept2 VGFANLPNQVHRKSVKKGFEFTLMVVGESGLGKSTLINSLFLTDLYPERVIPGAAEKIERTVQIEASTVEIEERGVKLRLTVVDTPGYGDAINCR
sept4 VGFATLPNQVHRKSVKKGFDFTLMVAGESGLGKSTLVNSLFLTDLYRDRKLLGAEERIMQTVEITKHAVDIEEKGVRLRLTIVDTPGFGDAVNNT
sept5 VGFATLPNQVHRKSVKKGFDFTLMVAGESGLGKSTLVHSLFLTDLYKDRKLLSAEERISQTVEILKHTVDIEEKGVKLKLTIVDTPGFGDAVNNT
sept7 VGFANLPNQVYRKSVKRGFEFTLMVVGESGLGKSTLINSLFLTDLYSP-EYPGPSHRIKKTVQVEQSKVLIKEGGVQLLLTIVDTPGFGDAVDNS
sept13 -----MP----------------IMLSESGLGKLTLINSLFLTDLYSP-EYPGPSQRIKKT--VEQSKVLIKEGGIQLLLTIVDTPGFGDAVDNS
sept3 IGIDTIIEQMRKKTMKTGFDFNIMVVGQSGLGKSTLVNTLFKSQVSRKASSWNREEKIPKTVEIKAIGHVIEEGGVKMKLTVIDTPGFGDQINNE
sept9 VGIDSILEQMRRKAMKQGFEFNIMVVGQSGLGKSTLINTLFKSKISRKSVQPTSEERIPKTIEIKSITHDIEEKGVRMKLTVIDTPGFGDHINNE
sept12 VGIEAVLDQLKIKAMKMGFEFNIMVVGQSGLGKSTMVNTLFKSKVWK-SNPPGLGVPTPQTLQLHSLTHVIEEKGVKLKLTVTDTPGFGDQINND
Figura 4.21. Domínios GTPases das septinas de humanos SEPT1 a SEPT14. Em azul destacamos os resíduos de aminoácidos diferenciados das septinas do grupo II em relação às demais septinas, adaptação da figura criada pelo aluno de mestrado Daniel Leite.
Em SEPT6, desde a seqüência GFCFN (depois da região polibásica) até o motivo
LEEMG (no final do domínio GTPase), temos 268 resíduos, dos quais 43% pertencem a
hélices-α, 19% formam fitas-β e os 38% restantes estão em regiões de “loops”. Na Tabela 4.2
mostramos os resultados da desconvolução de espectros de CD e da predição da estrutura
secundária (PSIPRED) do domínio GTPase da SEPT11 comparados com o conteúdo de
estrutura secundária do domínio GTPase da SEPT6. Segundo estes dados podemos observar
que o domínio GTPase da SEPT11 tem conteúdos de estrutura secundária muito parecidos
com o domínio GTPase da SEPT6, como era para se esperar. Os resultados obtidos pela
LEGENDA
VERDE Hélices-alfa
VERMELHO Fitas-beta
AMARELO Região polibásica
AZUL Resíduos diferenciados (grupo II)
CORTADO Resíduos das SEPTS 2, 6 e 7 sem coordenadas cristalográficas no PDB
CINZA Motivos conhecidos
G1 G3
107
desconvolução dos dados é um pouco diferente dos demais, porém, levando em consideração
a margem de erro e a dificuldade em obter resultados exatos devido à presença de uma
mistura de estrutura secundária do tipo αβ, a concordância parece aceitável. Novamente a
coerência dos dados sugere que a SEP11G descrita neste trabalho se enovelou corretamente,
pois o dado experimental (CD) está de acordo com os valores esperados na teoria.
Tabela 4.2 - Comparação do conteúdo de estrutura secundária do domínio GTPase da SEPT11 e SEPT6. Para determinar o conteúdo de estrutura secundária de SEPT11G utilizamos o pacote de programas CDPro para desconvolução dos espectros de CD e também o programa PSIPRED, já para a determinação do conteúdo de estrutura secundária da SEPT6 utilizamos a seqüência de aminoácidos obtida pela estrutura cristalográfica.
Hélice- α (%) Folha- β (%) Coil (%)
SEPT11G (CDPro)
29 22 49
SEPT11G (PSIPRED)
40 22 38
SEPT6 43 19 38
4.7 Discussão geral
O papel da atividade GTPase das septinas apresenta-se como um desafiante problema
na bioquímica de septinas e poucos estudos foram realizados para tentar elucidar o papel de
ligação e hidrólise do nucleotídeo in vivo. No entanto, esforços estão sendo realizados para
introduzir in vitro condições para entender a relação entre atividade GTPase, associação com
a membrana, formação de filamentos e o envolvimento de septinas em processos celulares
como exocitose e citocinese (3, 8).
Assim como as outras septinas, o domínio GTPase da proteína SEPT11 apresenta em
sua seqüência primária o motivo P-loop ou Walker A Box, referente aos resíduos 10-19
(GETGIGKSTL) do domínio de ligação ao nucleotídeo, também conhecido como motivo G1.
108
Outros dois motivos característicos de proteínas de ligação a GTP estão presentes no domínio
GTPase da SEPT11: o motivo G3 e o motivo G4 referentes aos resíduos 62-67 (DTVGFG) e
139-148 (NIIPIIAKAD), respectivamente (5). A presença de motivos como estes, em geral,
apresentam-se como uma impressão digital indicando a possível atividade GTPásica da
proteína (11). Estes motivos também são encontrados na SEPT6 que é sequencialmente
parecida com SEPT11 e sabidamente liga GTP, mas é deficiente em atividade GTPásica. A
observação da ausência de GDP/GTP ligada a SEPT11 é, portanto intrigante.
Sugerimos algumas alternativas para explicar o fato de não observarmos a liberação de
GDP ou GTP pela proteína SEPT11G após desnaturação uma vez que várias evidências
sugerem que a SEPT11G foi obtida na forma nativa e corretamente enovelada. Estes
evidências incluem (1) expressão solúvel na forma de um dímero (como o esperado), (2)
espectro de dicroísmo circular compatível com uma estrutura nativa do tipo α/β e (3) uma
estabilidade térmica parecida com outros domínios GTPase de septinas. Além disso, a
modelagem molecular não sugere nenhuma diferença significativa em relação à SEPT6 que
poderia explicar a falta da capacidade de ligar nucleotídeos. Por tudo isso, podemos sugerir
algumas alternativas: i) SEPT11G não foi enovelada corretamente (apesar dos resultados
obtidos) e pode não estar na sua forma biologicamente ativa; ii) SEPT11G não liga
nucleotídeo (GDP/GTP) in vivo, pois nada impede que as septinas entre si apresentem
características diferentes. A estrutura do heterofilamento formado por SEPT2/6/7 mostra que
as interações entre subunidades necessárias para a formação do filamento não envolvem
contatos com o nucleotídeo, é possível que algumas septinas sejam capazes de agir na
ausência do mesmo. Sendo assim, SEPT11G pode não ter a capacidade de ligar e hidrolisar
GDP/GTP; iii) a SEPT11 pode ser cataliticamente ativa e libera GDP rapidamente sem
precisar de fatores de troca (o experimento demonstrado na Figura 4.15 descarta esta
hipótese); iv) a capacidade da SEPT11 de ligar nucleotídeo pode depender da presença de
109
todos os domínios (SEPT11NGC) uma vez que os dados apresentados aqui se referem apenas
ao domínio GTPase e; v) pode ser que a proteína SEPT11G sozinha não seja capaz de ligar
GTP mas que necessita da presença de outras septinas (na forma do heterofilamento) para
adquirir alta afinidade pelo nucleotídeo. Esta última proposta parece-nos melhor explicar
todos os dados relatados nesta dissertação.
Como mencionamos anteriormente, SEPT11 apresenta 80% de identidade seqüencial
com SEPT6, que teve sua estrutura cristalográfica depositada recentemente como parte de um
heterofilamento com SEPT2 e SEPT7 (15). Baseados num estudo anterior que mostra a
atividade de hidrólise do trímero formado por SEPT2/6/7, foi relatado que a relação de
nucleotídeo GDP:GTP era na proporção entre 2:1 e 3:1 (3), ou seja, nem todo o GTP ligado
estava sendo hidrolisado e somente com a estrutura do trímero obtida posteriormente a este
estudo, foi observado que apenas SEPT6 tinha GTP ligado ao sítio ativo e SEPT2 e SEPT7
tinham GDP ligado. Sendo assim, foi proposto que é a SEPT6 que não apresenta atividade
hidrolítica (15). No entanto, nenhum trabalho foi publicado até o momento sobre a capacidade
de SEPT6 (ou qualquer outra septina do grupo II), isoladamente, ligar e hidrolisar GTP. As
observações relatadas aqui para SEPT11 eventualmente são comuns para os demais membros
do grupo II, ou seja, que a ligação do nucleotídeo é dependente da formação do
heterofilamento ou vice-versa. Esta proposta precisa ser mais bem investigada
experimentalmente.
Sabe-se que no caso do heterofilamento formado pelas septinas SEPT6 e SEPT7, a
hidrólise do GTP depende da formação do filamento (3). Nós propomos que no caso da
SEPT11 um fenômeno similar acontece só que neste caso, a própria ligação do nucleotídeo
depende da heteropolimerização.
Mostramos na Figura 4.22 um esquema que resume a presente proposta e envolve a
formação de um filamento hipotético formado por SEPT2/11/7, uma vez que a SEPT11
110
sabidamente é capaz de substituir SEPT6 nos filamentos canônicos do tipo SEPT2/6/7. Já foi
comprovado experimentalmente que SEPT2 e SEPT7 são capazes de ligar (e no caso de
SEPT2, hidrolisar) nucleotídeo fora do filamento. Como sugerido nesta dissertação, SEPT11
só liga (e hidrolisa ou não) o nucleotídeo após (ou durante) a formação do heterofilamento.
Baseado no que acontece no caso do filamento SEPT2/6/7 o esquema apresenta os
monômeros da SEPT2 interagindo via a interface G no dímero em solução, já quando na
presença da SEPT11 ocorre uma “preferência” pelo uso desta interface entre SEPT2 e
SEPT11, sendo que SEPT2 interage consigo mesma pela interface N/C no heterofilamento.
Figura 4.22. Filamento formado pelas septinas SEPT2/7/11. A figura mostra os homodímeros da SEPT2 (azul) SEPT7 (verde) e SEPT11 (vermelho) e os nucleotídeos ligados. No caso de SEPT11 não há GDP ou GTP ligado, pois acreditamos que ela ligue o nucleotídeo após a interação com outras septinas.
111
Capítulo 5
CONCLUSÕES
112
5 CONCLUSÕES
O estudo dos domínios estruturais da SEPT11 realizado neste trabalho refletiu na
obtenção de resultados e informações sobre essa proteína já que pouco se sabe sobre ela na
literatura. Este trabalho pode ainda auxiliar no estudo futuro dos mecanismos de ação de
septinas, como ligação e hidrólise do GTP e na compreensão do papel da SEPT11 na filtração
glomerular e transporte tubular (1), por exemplo.
Assim sendo, procuramos realizar uma análise estrutural e bioquímica dos domínios G e
GC da proteína humana SEPT11 além do ensaio de atividade in vitro. Portanto, tivemos que
clonar, expressar, purificar e caracterizar várias construções com a finalidade de gerar
“reagentes” para estudos estruturais e funcionais.
Os primeiros testes de amplificação com os domínios da SEPT11 obtiveram sucesso, e
as construções SEPT11G, GC e NG foram obtidas. Também a clonagem dos fragmentos em
vetor pET28a(+) e pTZ57R/T foram realizadas com sucesso. Sabe-se da grande dificuldade
em expressar as septinas humanas na forma solúvel, contudo SEPT11G e GC foram
expressas, na presença ou ausência de GDP ou GTP e MgCl2, em quantidades suficientes na
forma solúvel, para os ensaios estruturais e de atividade. Por outro lado, encontramos grande
dificuldade em expressar a SEPT11NG. SEPT11G foi obtida na forma de um estável
homodímero e SEPT11GC na forma de um monômero. Subseqüentemente, foram realizados
ensaios que permitiram fazer uma análise da estrutura secundária através de técnicas
computacionais e dicroísmo circular (CD), e também a análise da estabilidade térmica das
SEPT11G e GC usando a técnica de espalhamento de luz a 350 nm. Os resultados de CD e
predição da estrutura secundária indicaram que SEPT11 é composta de uma estrutura
misturada de α/β. Já a variação do espalhamento de luz a 350 nm em função do tempo indicou
113
a formação de agregados da SEPT11 em temperaturas acima de 30ºC. Um preliminar modelo
estrutural da SEPT11 foi obtido através da modelagem molecular por homologia estrutural
usando como molde a proteína SEPT6. No teste de atividade onde avaliamos a liberação do
nucleotídeo ligado a proteína, após desnaturação química e térmica, verificamos que
SEPT11G não liberou GDP ou GTP. Levantamos a hipótese que SEPT11G dependa de
outras septinas para formar o heterofilamento e assim ligar e hidrolisar ou não o nucleotídeo.
O modelo da estrutura cristalográfica da SEPT11G permite dizer que nenhuma diferença
significativa que possa explicar o fato de SEPT11G não ligar GTP foi observada. Se este
fenômeno é verdadeiro ou não precisa ser investigado mais a fundo, pois cultiva a
possibilidade de ser um artefato de uma proteína não enovelada corretamente. Observamos
ainda, que a ausência ou presença de GDP ou GTP e MgCl2 não interferiu significativamente
nos resultados de expressão, purificação, análise estrutural e nos testes de atividade da
proteína SEPT11.
Os resultados apresentados neste trabalho devem fornecer uma base útil para os estudos
biofísicos futuros da SEPT11, incluindo a base estrutural para sua participação nas doenças e,
ajudando também na elucidação das diferenças entre septinas, enriquecendo assim os estudos
estruturais que vêem sendo realizados com essas proteínas.
114
Capítulo 6
PERSPECTIVAS
115
6 PERSPECTIVAS
� Clonar, expressar e purificar a proteína SEPT11 inteira;
� Expressar e purificar SEPT11NG ;
� Realizar experimentos de espectroscopia como dicroísmo circular (CD) e
espalhamento de luz com a proteína SEPT11 inteira e com o domínio NG;
� Realizar novos ensaios de atividade por desnaturação química e térmica incluindo
outras septinas;
� Continuar com os ensaios de cristalização da SEPT11 sozinha e na forma de
heterocomplexos, principalmente na substituição de SEPT6 por SEPT11 no trímero
formado por SEPT2/6/7, ou ainda, com parceiros estruturalmente identificados via
duplo-híbrido;
� Realizar um ensaio de atividade que avalie a taxa de hidrólise do GTP e liberação de
GDP pelo tempo.
116
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117
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APÊNDICE
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APÊNDICE
Vetores de propagação e expressão bacterianos usados neste trabalho.
A) Esquema do vetor de propagação bacteriano pTZ57R/T, Figura A.
B) Esquema do vetor de expressão bacteriano pET28a(+), Figura B.
Figura A Esquema mostrando o vetor de propagação bacteriano pTZ57R/T (Figura extraída do site www.fermentas.com).
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Figura B Esquema mostrando o vetor de expressão bacteriano pET28a(+) (Figura extraída do site www.novagen.com).