faculteit wetenschappen vakgroep toegepaste wiskunde en...

Faculteit WetenschappenVakgroep Toegepaste Wiskunde en Informatica

Modellering van biochemische signaalnetwerken

Nele Delerue

Promotor: Prof. Dr. W. Govaerts

Begeleider: C. Sonck

Masterproef ingediend tot het behalen van de academische graad van master inde wiskunde, afstudeerrichting toegepaste wiskunde

Academiejaar 2010-2011

Voorwoord

Deze pagina wil ik graag wijden aan alle mensen die me bijgestaan hebben tijdens het ontstaanvan deze masterproef. Iedereen opnoemen, lijkt me wat te veel van het goede, maar ik wiltoch enkele personen expliciet vermelden.

Ik wil vooral een woord van dank richten aan mijn promotor en mijn begeleidster, namelijkProf. Dr. W. Govaerts en C. Sonck. Zij reikten mij niet alleen een onderwerp aan, maar gavenook sturing en ik had nooit het gevoel dat ik aan mijn lot overgelaten werd. Het was duidelijkdat ze er beide moeite in wilden steken en hun best deden om mijn redenering te volgen. Naeen druk eerste semester vroegen ze zelf om elke twee weken af te spreken en ik weet zekerdat deze opgelegde druk heel belangrijk voor mij is om goed te presteren. Hiernaast getuigdedit ook van hun interesse in mijn vorderingen en het was aangenaam om te merken dat zeook steeds effectief gelezen hadden wat ik gerealiseerd had. Dit ging van het controleren vande wiskunde tot het zelf implementeren van de verschillende modellen, het zelf opstellen vanandere bruikbare redeneringen tot het corrigeren van spelling, taal en zinsbouw. Als ik hetal eventjes minder zag zitten, dan kwam ik na onze tweewekelijkse afspraak vaak vol goedemoed buiten, klaar om meteen verder te werken met de nieuw verworven inzichten. Het washeel aangenaam dat ze hielpen redeneren als ik dit nodig had.

Ook Evgeni Nikolaev (Thomas Jefferson University, Jefferson Medical College, Philadelphia,PA, USA) wil ik bedanken om de artikels aan te reiken aan Prof. Dr. W. Govaerts alsonderwerp voor een masterproef.

Tot slot wil ik mijn zus, Veerle Delerue, bedanken. Hoewel ze niet steeds haar volledige en-thousiasme kon behouden bij het lezen van een masterproef in de wiskunde, heeft ze doorgezeten mij zinnige opmerkingen bezorgd voor de afwerking van mijn masterproef.

De auteur geeft de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delenvan de masterproef te kopieren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder debeperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting debron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze masterproef.

Gent, juni 2011

Nele Delerue

Inhoudsopgave

Inleiding 1

1 Biochemische achtergrond 31.1 Activeringsenergie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31.2 Hoe gaan enzymen te werk? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41.3 Het proces van (de)fosforylatie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

2 Signaalschakelaars en bistabiliteit door dubbele fosforylatie 62.1 MAPK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

2.1.1 Werking van een MAPK-cascade . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62.1.2 Toepassingsgebied van de MAPK-cascade . . . . . . . . . . . . . . . 7

2.2 Biochemische verklaring van bistabiliteit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82.3 Beschrijving van een duale fosforylatie-defosforylatiecyclus . . . . . . . . . . 82.4 Reactievergelijkingen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92.5 Uitdrukkingen voor de snelheid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112.6 Interpretatie van de uitdrukkingen voor de snelheid . . . . . . . . . . . . . . 182.7 Eigenschappen van een duale fosforylatie-defosforylatiecyclus. . . . . . . . . 182.8 Implementatie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

2.8.1 Tijdsintegratie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 212.8.2 Varieren van de MM-constanten Km1 en Km2 . . . . . . . . . . . . . 222.8.3 Varieren van de parameters kcat1 en kcat2 . . . . . . . . . . . . . . . . . 272.8.4 Besluit voor bistabiliteit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

3 Signaalschakelaars en bistabiliteit door dubbele multisite fosforylatie 303.1 Beschrijving van een duale fosforylatie-defosforylatiecyclus met multisite-bin-

dingen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 303.2 Reactievergelijkingen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 313.3 Uitdrukkingen voor de snelheid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 323.4 Implementatie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

3.4.1 Tijdsintegratie en continuatie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

4 Analyse van bistabiliteit door dubbele fosforylatie 384.1 Twee-staps cycli: beschrijving van het model . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

4.1.1 Implementatie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 414.2 Bistabiliteit in twee-staps cycli: wiskundig . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

i

Inhoudsopgave

4.2.1 Bepalen van de evenwichtstoestand . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 434.2.2 Bifurcatie-analyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

4.3 Bistabiliteit in twee-staps cycli: numeriek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 554.3.1 Parameterrestricties voor een stabiele evenwichtstoestand . . . . . . . 564.3.2 Parameterrestricties die bistabiliteit toestaan . . . . . . . . . . . . . . 574.3.3 Overzicht van equilibria en de mogelijkheid tot bistabiliteit . . . . . . 58

4.4 βmax . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

5 Bistabiliteit door driedubbele fosforylatie 615.1 Drie-staps cycli: beschrijving van het model . . . . . . . . . . . . . . . . . . 615.2 Bistabiliteit in drie-staps cycli: numeriek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65

6 Multistabiliteit door een cascade van dubbele fosforylaties 686.1 Twee-staps cycli in een cascade: beschrijving van het model . . . . . . . . . 686.2 Multistabiliteit in twee-staps cycli in een cascade: numeriek . . . . . . . . . 72

Algemeen besluit 80

Glossarium 84

A 86A.1 Appendix A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86A.2 Appendix B . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89A.3 Appendix C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90A.4 Appendix D . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90A.5 Appendix E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90A.6 Appendix F . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92

A.6.1 Oplossingen van de vergelijking∂β

∂γ= 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . 92

A.6.2 Bestaansvoorwaarden nagaan . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92A.6.3 Andere veranderlijken in βmax . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93A.6.4 Berekende waarde voor β: minimaal of maximaal? . . . . . . . . . . . 94

Bibliografie 95

ii

Inleiding

Als afstudeerrichting heb ik voor toegepaste wiskunde gekozen aangezien ik het heel inte-ressant vind om te zien hoe de vaak abstracte wiskunde ook aangewend kan worden in hetwerkelijke leven, waar de functionaliteit ervan ligt. Ik hou ervan om te zien hoe wiskundigeneen heel belangrijke rol kunnen spelen in aspecten van het leven waar de grote meerderheidvan de bevolking dit niet zou verwachten. Het was dus belangrijk voor mij dat ik dit ookwerkelijk kon toepassen in mijn masterproef en ’wiskunde met een nut’ kon produceren. Bij-komend moest er in de bacheloropleiding een minor gekozen worden en opteerde ik voor deminor biologie aangezien dit net als vele andere wetenschappen een vakgebied is dat me heelerg aanspreekt.Bij het overlopen van de mogelijke onderwerpen voor een masterproef was ik dan ook meteengeınteresseerd in het onderwerp van de modellering van biochemische signaalnetwerken. Detoepassing ervan in ziektes zoals bijvoorbeeld kanker leek me heel interessant en was een extrastimulans om dit onderwerp te kiezen. Aangezien het vakgebied chemie al tot een ver verledenbehoorde, schrok de term ’biochemisch’ me in eerste instantie een klein beetje af, maar aande andere kant leek het me ook een uitdaging om me te verdiepen in deze combinatie vantwee verschillende (en voor mij persoonlijk toch wat minder gekende) wetenschappen.

Via deze masterproef willen we beter begrijpen hoe biologisch gedrag volgt uit de organisatievan eiwitten in cascades en netwerken. We weten namelijk dat chemische signaalnetwerkenvan regulerende eiwitten ervoor zorgen dat een cel informatie kan ontvangen van signalenvan buitenaf en hierop kan reageren door zich te vermenigvuldigen, celdood te ondergaan,...Deze signaalnetwerken die via de eiwitten een signaal doorgeven, kunnen beschreven wordenaan de hand van modellen bestaande uit een stelsel van differentiaalvergelijkingen. In hetwiskundig computerprogramma Matcont kunnen we de modellen implementeren en zoekennaar evenwichtstoestanden van het model en eventuele bifurcaties van die evenwichtspun-ten bestuderen. Onze bedoeling is om eerst via numerieke experimenten, maar later ookanalytisch, verschillende vereenvoudigde modellen van signaalnetwerken te bestuderen. Metbehulp van dit onderzoek willen we onder andere aantonen dat bistabiliteit (waarbij het sys-teem kan afwisselen tussen twee stabiele toestanden, maar niet in een andere toestand kanblijven) en hysteresis (de stimulus moet een drempelwaarde overschrijden om het systeemnaar een andere stabiele toestand te brengen, waar het kan blijven als de stimulus terugdaalt) kunnen ontstaan uit een distributief kinetisch mechanisme van de twee-staps MAPKfosforylatie en defosforylatie. We voeren dit onderzoek uit op meerdere modellen en kijkenook of er eventuele multistabiliteit kan ontstaan (een systeem met meer dan twee stabieleevenwichtspunten). Op aanraden van E. Nikolaev zoeken we ook of de verschillende modellen

1

periodiek gedrag kunnen vertonen voor bepaalde parameterwaarden.

In deze masterproef komen in de verschillende hoofdstukken de verschillende bestudeerdemodellen aan bod. We hebben ervoor gekozen om de algemene structuur van elk hoofdstuksteeds in grote lijnen te behouden, zodat het onderscheid duidelijk aan het licht komt.

Aangezien dit een masterproef is voor het behalen van het diploma van master in de wiskunde,ligt de nadruk meer op wiskunde dan op biochemie. Toch is het onmogelijk om het verloopen de opbouw te volgen zonder de achterliggende biochemie te begrijpen. Hier wordt dan ookaandacht aan besteed in de tekst en de biochemische termen worden nog eens samengevat inhet glossarium dat teruggevonden kan worden op pagina 84. Dimensies bij de verschillendeconcentraties en parameterwaarden worden weggelaten in de tekst, maar staan vermeld inde tabellen met de waarden.

Deze masterproef werd voornamelijk gebaseerd op [6] en [8]. Hierbij wil ik opmerken dathet bij het onder handen nemen van deze artikels duidelijk was dat de teksten niet doorwiskundigen geschreven waren. De wiskunde was vaak onvolledig, weggestopt in de appendixen/of gewoon weggelaten, wat het voor mij zeker niet gemakkelijk maakte om de redeneringensteeds volledig te doorgronden. Resultaten die bekomen werden, stonden daarenboven vaakin een onlogische volgorde waarbij gevolgen uit bekomen uitdrukkingen vaak al voor debenodigde uitdrukkingen te vinden waren. Dit wijst er volgens mij op dat een wiskundigewel zorgde voor de berekeningen en deze bezorgde aan een biochemicus, maar deze de tekstschreef zonder verder overleg met de wiskundige. Het lijkt me dus van groot belang om eengoede samenwerking te hebben tussen de verschillende vakspecialisten en je ook voldoendein te werken in het domein van de andere wetenschapper.

Tijdens het opstellen van deze masterproef kwam ik ook meerdere problemen tegen. Zo werder in de artikels vaak onvoldoende informatie gegeven over de gebruikte modellen en de pa-rameterwaarden. Dit zorgde ervoor dat ik zelf modellen moest opstellen bij de kinetischediagrammen en ook zelf moest bepalen welke vereenvoudigingen ik invoerde. Samen met hetfeit dat er wel conclusies getrokken werden uit bifurcatiediagrammen horend bij deze model-len, maar deze figuren vaak niet expliciet gegeven werden, kon ik meermaals niet beschikkenover controlemateriaal.Ook bij het gebruik van Matcont moest soms naar oplossingen gezocht worden. Zo detecteertdit programma sommige speciale (dichtgelegen) punten niet. Een oplossing hiervoor was omde continuatie van de evenwichtspunten uit te voeren met een kleinere tolerantie of kleinerestaplengte. Als we te maken hadden met stijve problemen, konden we zien dat er zichkleine onregelmatigheden bevonden rond de equilibria. Dit werd opgelost door een numeriekemethode te selecteren die speciaal gericht is op stijve problemen.

2

Hoofdstuk 1

Biochemische achtergrond

Biochemische netwerken stellen de cel in staat om informatie te ontvangen, te verwerken ente reageren op die informatie. Dit is van levensbelang omdat de cel anders niet in staat isom zich te vermenigvuldigen, te differentieren of celdood te ondergaan. De enzymen, eenspecifieke klasse van biologische katalysatoren, spelen een essentiele rol in het reguleren vandeze processen in cellen en organismen. Hoewel zij onmogelijke reacties niet mogelijk kunnenmaken en geen invloed hebben op de positie van het equilibrium van een reactie, zijn ze nodigom reacties te versnellen en deze zo bruikbaar te maken voor het biologische systeem. Nahet proces worden de enzymen onveranderd gerecupereerd.

1.1 Activeringsenergie

Voor alle reacties geldt dat er een energiebarriere moet doorbroken worden vooraleer zijkunnen uitgevoerd worden. De energie die nodig is om de barriere te doorbreken en eenreactie in werking te stellen, wordt de activeringsenergie van de reactie genoemd.

Figuur 1.1: De invloed van enzymen op de activeringsenergie (uit [11]).

De taak van de enzymen bestaat er uit de reactiesnelheid te beınvloeden door de active-ringsenergie te verlagen (zie Figuur 1.1). Daardoor verhogen ze het aantal moleculen dat

3

1.2. Hoe gaan enzymen te werk?

de overgangsenergie bereikt en dus de energiebarrierre doorbreekt. Ze zijn niet in staat omonmogelijke reacties te katalyseren (het verschil in vrije energie tussen de substraten en hetproduct blijft namelijk gelijk), maar ze versnellen een reactie in een bepaalde richting.

1.2 Hoe gaan enzymen te werk?

Reacties hangen vaak af van toevallige botsingen van substraten in de driedimensionaleruimte. Het is duidelijk dat dit sneller zou gebeuren als die botsing in de hand zou gewerktworden en dit is de rol van de enzymen (zie Figuur 1.2): de enzymen binden de substratenop hun actieve site die zich meestal op het oppervlak van het enzym bevindt. Deze actievesites hebben een complementaire vorm aan het substraat en dit betekent dat enzymen spe-cifiek zijn. De substraten worden in een bepaalde richting vastgehouden en dicht bij elkaargebracht, waardoor de botsingen niet meer toevallig zijn.

Figuur 1.2: Werking van een enzym via induced fit (uit [19]).

Vooraleer de binding plaatsvindt, ondergaan zowel de substraten als de actieve sites eenlichte verandering (induced fit). Dit heeft een gunstig effect op de reactiviteit van bepaaldechemische resten op de substraten zodat de reactie sneller kan doorgaan. Na het proces laathet enzym het product los en keert het terug naar zijn originele staat zodat het klaar is voorde katalyse van een nieuwe reactie.

1.3 Het proces van (de)fosforylatie

ATP is de afkorting van de Engelse term ’adenosine triphosphate’ waaruit meteen duidelijk isdat er zich in deze stof drie fosfaatgroepen bevinden. ATP is meer bepaald een nucleotide datopgebouwd is uit meerdere nucleınezuren (de purine adenine, de suiker ribose en de eerdervermelde drie fosfaatgroepen).ATP zorgt voor de uitwisseling van energie tussen cellen en is een energiemolecule voorbiochemische reacties. Veel van deze reacties eisen namelijk een grote toevoeging van energie(zie activeringsenergie in paragraaf 1.1) en het grootste deel hiervan wordt voorzien door hetuiteenvallen van ATP in ADP (adenosine diphosphate) en een vrije fosfaatgroep. Hierbijverkrijgen we heel wat vrije energie, maar dan is het ook meteen duidelijk dat ADP heel watminder energie bevat dan ATP.

4

1.3. Het proces van (de)fosforylatie

De omgekeerde reactie is echter ook mogelijk: de hoogenergetische (en dus levensnoodzake-lijke) stof ATP kan terug gevormd worden uit ADP. Dit gebeurt via een proces dat oxidatievefosforylatie genoemd wordt en hierbij wordt opnieuw een binding gemaakt tussen ADP en eenvrije fosfaatgroep. Het ligt voor de hand dat hiervoor chemische energie vereist is en dezeontstaat uit het afbreken van bepaalde moleculen (opslagmoleculen genoemd, bv. vetten,zetmeel,...).De hoge vrije energie die men bekomt uit ATP wordt bijvoorbeeld gebruikt in het bioche-misch proces van de fosforylatie (zie Figuur 1.3). Bij het fosforyleren van een molecule (bv.een eiwit) wordt een fosfaatgroep (PO4) gebonden op bepaalde residuen van het moleculemits toevoeging van energie. Zoals beschreven in paragraaf 1.1 kunnen enzymen deze ac-tiveringsenergie verlagen en in het geval van de fosforylatie worden deze enzymen kinasengenoemd.Dit biochemisch proces is gemakkelijk reversibel: het eiwit kan zijn oorspronkelijke vorm te-rug aannemen nadat de fosfaatgroep verwijderd is. Dit wordt logischerwijze de defosforylatiegenoemd en de enzymen die hier een handje toesteken worden fosfatasen genoemd.

Figuur 1.3: Het proces van de (de)fosforylatie van een eiwit.

Dit proces van reversibele fosforylatie wordt heel vaak toegepast en is het meest algemenecontrolemechanisme in de cel. Het zorgt voor structurele veranderingen in het eiwit en is danook een belangrijk regulerend mechanisme. Eiwitenzymen worden op deze manier namelijkvaak geactiveerd of gedeactiveerd en door deze steeds veranderende cellulaire gedragingenontstaan moleculaire wissels die ervoor zorgen dat de cel zich anders gaat gedragen.De activiteit van een eiwit wordt dus rechtstreeks bepaald door de activiteit van de kinasen enfosfatasen die erop inwerken. Zo vinden we vaak kinasen terug die op een specifieke maniergeorganiseerd zijn, namelijk als een fosforylatie-cascade. Hierbij wordt een eerste kinasegeactiveerd door bijvoorbeeld het ontvangen van een bepaald signaal, waarna deze actievekinase een volgende kinase in de cascade fosforyleert en activeert en dit gaat zo verder tothet signaal doorgestuurd wordt door de cel.

5

Hoofdstuk 2

Signaalschakelaars en bistabiliteitdoor dubbele fosforylatie

Dit hoofdstuk is gebaseerd op [6].

2.1 MAPK

MAPK staat voor ’mitogen-activated protein kinase’. Een mitogen is een stof die de mi-tose stimuleert en de mitose is op zijn beurt een onderdeel van de celcyclus. De mitose isnamelijk de eigenlijke celdeling. ERK (Extracellular signal-regulated kinase) wordt vaak alssynoniem gebruikt voor MAPK, maar is in feite een specifieke, dierlijke MAPK. MAPKwordt geactiveerd binnen een eiwit-kinase-cascade die toepasselijk de naam ’MAPK-cascade’draagt.

2.1.1 Werking van een MAPK-cascade

De MAPK-cascade is een ketting van eiwitfosforylaties in de cel die een signaal van eenreceptor, gebonden door een groeigen op het celoppervlak, doorgeeft aan het DNA in decelkern. Elk tussenliggend enzym fungeert door zijn werking als ’aan’- en ’af’-knop voor hetnabijgelegen eiwit. Dit verloopt via een ingewikkeld proces, waarvan de belangrijkste zakenhier op een rijtje gezet worden (zie ook Figuur 2.1).Elke MAPK-cascade bestaat uit drie kinases, namelijk MAP kinase (MAPK of ERK),MAP kinase kinase (MAPKK, zoals bijvoorbeeld MEK) en MAP kinase kinase kinase(MAPKKK zoals bijvoorbeeld Raf, MKP3), die geactiveerd worden in een reeks. Eengeactiveerde MAPKKK fosforyleert MAPKK op diens serine- en threonine-residuen, de-welke op zijn beurt zorgt voor de activering van MAPK door fosforylatie op zijn threonine-en tyrosine-residuen.Om de MAPKKK geactiveerd te krijgen, worden enkele stappen uitgevoerd. Het procesbegint met een groeigen dat bindt op een receptor die zich op het oppervlak van de celbevindt. Deze receptor wordt zo in staat gesteld om zichzelf te fosforyleren op zijn tyrosine-residu. In de gefosforyleerde staat interageert de receptor met een eiwit (GRB2) dat eencomplex vormt met het eiwit SOS (Son Of Sevenless), dat op zijn beurt het G-eiwit RAS

6

2.1. MAPK

Figuur 2.1: Een vereenvoudigde versie van de MAPK/ERK baan (uit [20]).

activeert door de GDP-GTP uitwisseling te stimuleren. De geactiveerde RAS zorgt dandat de activering van MAPKKK plaatsvindt, zodat de eerder besproken opeenvolging vanfosforylaties kan uitgevoerd worden.De geactiveerde MAPK wordt verplaatst binnenin de kern waar ze transcriptiefactoren ac-tiveert en fosforyleert die uiteindelijk de genexpressie controleren.

2.1.2 Toepassingsgebied van de MAPK-cascade

MAPK-cascades zorgen voor het overbrengen van extracellulaire signalen naar de celkernwaar dan op hun beurt specifieke genen geactiveerd worden die zorgen voor de celdifferen-tiatie, -deling en -groei. Mutaties van een van de eiwitten in de baan kan zorgen voor eenpermanent verblijf in de aan-/af-staat van de activering van een bepaald eiwit. Dit ontregelthet volledige systeem en onderzoek wijst erop dat dit vaak aan de basis ligt van ongecontro-leerde celgroei en het ontstaan van oncogenen, wat op zijn beurt zorgt voor het ontstaan vankanker. Verder onderzoek naar deze cascades zou goede manieren aan het licht kunnen bren-gen om deze permanente staten om te keren. Het onderzoek naar deze cascades is bijgevolgvolop aan de gang om geneesmiddelen tegen kanker te ontwikkelen.

7

2.2. Biochemische verklaring van bistabiliteit

2.2 Biochemische verklaring van bistabiliteit

In dit en het volgende hoofdstuk zullen we aantonen dat bistabiliteit volgt uit competitieveinhibitie en verzadiging, meer precies uit:

• substraatverzadiging van minstens een van de twee enzymen,

• competitieve inhibitie van de tweede modificatiestap door het substraat van de eerstestap.

2.3 Beschrijving van een duale fosforylatie-defosforyla-

tiecyclus

Zoals beschreven bij de werking van een MAPK-cascade (zie paragraaf 2.1.1) hebben we in deMAPK-cascade te maken met de verschillende vormen MAPK, MAPKK en MAPKKK.Houden we rekening met het feit datMAPK op twee verschillende residuen kan gefosforyleerdworden (namelijk het tyrosine- of het threonine-residu), dan zien we dat er vier vormenaangenomen worden. Als we MAPK afkorten tot M, dan hebben we de volgende viergedaantes:

• M ,

• MpY : de gefosforyleerde vorm van M waar de fosfaatgroep op het tyrosine-residugehecht is,

• MpT : de gefosforyleerde vorm van M waar de fosfaatgroep op het threonine-residugehecht is,

• Mpp: de dubbel gefosforyleerde vorm van M (fosfaatgroep op beide residuen).

In deze paragraaf vereenvoudigen we dit model echter en houden we geen rekening met debindingsplaats van de fosfaatgroep. We beschouwen dus slechts een intermediair en werkenmet M , Mp en Mpp.Uit onderzoek blijkt dat de (de)fosforylatie via een distributief systeem gebeurt. Om de dub-bel gefosforyleerde vorm te bekomen, moet er met andere woorden twee keer een binding methet enzym plaatsvinden. Dit in tegenstelling tot processieve (of niet-distributieve) systemenwaarbij een enzym gebonden blijft aan zijn substraat nadat het een keer zijn werking heeftuitgevoerd en dus meerdere malen zijn functie kan vervullen terwijl er maar een binding vanenzym en substraat vereist is.

8

2.4. Reactievergelijkingen

Figuur 2.2: Cyclus van MAPK.

In Figuur 2.2 is de cyclus van MAPK weergegeven. We merken hierbij op dat de kinaseMAPKK zorgt voor de fosforylatie van zowel M als van Mp en de fosfatase MKP3 voor dedefosforylatie van Mpp en Mp. De snelheden van deze fosforylaties zijn respectievelijk v1 env2, die van de defosforylaties respectievelijk v3 en v4. In dit model nemen we eveneens aandat de som van de concentraties van alle vormen van MAPK constant is. We definieren dezetotale concentratie als Mtot en hebben dan Mtot = [M ] + [Mp] + [Mpp] = constant. Samenmet Figuur 2.2 kunnen we het volgende stelsel van vergelijkingen opstellen:

d[M ]

dt= v4 − v1,

d[Mpp]

dt= v2 − v3,

[Mp] = Mtot − [M ]− [Mpp],

(2.1)

waarbij de afgeleiden naar de tijd beschouwd worden.

2.4 Reactievergelijkingen

Uit Figuur 2.2 en het proces waarbij het enzym inwerkt op zijn substraten (zie Hoofdstuk 1),volgen de stappen in de fosforylatie zoals weergegeven in Figuur 2.3 (met P een fosfaatgroep).We houden hierbij rekening met het feit dat dit een distributief proces is.

Figuur 2.3: Symbolische weergave van de fosforylatie van M .

Een analoge figuur kan opgesteld worden voor de fosforylatie van Mp. We nemen aan dater een constante hoeveelheid ATP/ADP in overvloed aanwezig is en dat de eerste en laatste

9


stap omkeerbaar zijn. Het equilibrium in die stappen ligt dus niet specifiek langs een vande twee kanten van de reactie. Voor de middelste stap nemen we aan dat de condities zozijn dat de omgekeerde reactie verwaarloosbaar is. Dit wil zeggen dat het equilibrium zichduidelijk rechts van die pijl bevindt in de reactie.We hebben dan dus

M +MAPKK ↔M −MAPKK∗ →Mp−MAPKK ↔Mp+MAPKK,

Mp+MAPKK ↔Mp−MAPKK∗ →Mpp−MAPKK ↔Mpp+MAPKK.

We gebruiken hier een ∗ als notatie voor een complex waar substraat en enzym gebonden zijn,maar het enzym zijn taak nog niet vervuld heeft en dus nog actief is. Doordat het procesdistributief is, weten we dat het enzym zijn activiteit verliest na een inwerking, waardoor hetsterretje in de notatie verdwijnt bij het nieuw gevormde complex.De defosforylatie van Mpp en Mp m.b.v. het enzym MKP3 is analoog en is schematischweergegeven in Figuur 2.4.

Figuur 2.4: Symbolische weergave van de defosforylatie van Mp.

We beschouwen dezelfde (on)omkeerbaarheid en bekomen

Mpp+MKP3↔Mpp−MKP3∗ →Mp−MKP3↔Mp+MKP3,

Mp+MKP3↔Mp−MKP3∗ →M −MKP3↔M +MKP3.

We hebben nu vier reactievergelijkingen. Voor de fosforylatie zullen we het systeem echtervereenvoudigen. We zullen namelijk aannemen dat de tussenvormen Mp − MAPKK enMpp−MAPKK niet expliciet gevormd worden, maar dat het actieve complex na inwerkingvan het enzym meteen uiteenvalt in het oorspronkelijk enzym en de gefosforyleerde vormMp, respectievelijk Mpp. We werken dus met de volgende vier reactievergelijkingen

M +MAPKKk1

k−1

M −MAPKK∗k2

→ Mp+MAPKK,

Mp+MAPKKk3

k−3

Mp−MAPKK∗k4

→ Mpp+MAPKK,

(2.2)

Mpp+MKP3

h1

h−1

Mpp−MKP3∗h2

→ Mp−MKP3h3

h−3

Mp+MKP3,

Mp+MKP3h4

h−4

Mp−MKP3∗h5

→ M −MKP3h6

h−6

M +MKP3,

(2.3)

10

2.5. Uitdrukkingen voor de snelheid

waarbij de ki’s en de hi’s de snelheidsconstanten van de reacties voorstellen. Deze constantenzijn een maat voor hoe snel de reactie verloopt.

2.5 Uitdrukkingen voor de snelheid

Aan de hand van het model dat we tot nu toe opgesteld hebben en de gestelde voorwaar-den, willen we de Michaelis-Menten (MM) vergelijkingen (zie Glossarium) afleiden voor deverschillende snelheden die weergegeven zijn in Figuur 2.2.Als eerste gebruiken we hiervoor de reactievergelijkingen in (2.2), afgeleid voor de fosforylatievan MAPK door het inwerken van de kinase MAPKK. We willen nu een MM-vergelijkingopstellen voor de snelheid v1. Uit Figuur 2.2 kunnen we duidelijk afleiden dat dit de snelheid iswaarmee M omgezet wordt naar zijn gefosforyleerde vorm door de inwerking van MAPKK.Samen met (2.2) krijgen we de volgende uitdrukking:

v1 = k2[M −MAPKK∗].

Het is dus duidelijk dat we een uitdrukking nodig hebben voor [M −MAPKK∗].De kinase MAPKK zit gedurende de cyclus verspreid in gebonden en ongebonden vormen.Voor de totale concentratie van deze kinase volgt uit Figuur 2.2 de volgende uitdrukking:

[MAPKK]tot = [MAPKK] + [M −MAPKK∗] + [Mp−MAPKK∗]. (2.4)

Hierbij nemen we aan dat deze totale concentratie constant is en uitdrukking (2.4) zullen weverder nodig hebben in de afleiding1.We nemen nu aan dat er evenwicht is tussen de opbouw en de afbraak van de intermediairenM−MAPKK∗ en Mp−MAPKK∗ in (2.2). Dit is analoog aan de gebruikelijke benaderingdie men maakt bij het opstellen van de klassieke MM-vergelijkingen, cf. [2].Uit de eerste reactievergelijking krijgen we dan de volgende uitdrukking:

k1[M ][MAPKK] = k−1[M −MAPKK∗] + k2[M −MAPKK∗]

⇒ [M −MAPKK∗] =k1

k−1 + k2

[M ][MAPKK]

=1

Km1

[M ][MAPKK], (2.5)

waarbij we Km1 =k−1 + k2

k1

gesteld hebben. Door het evenwicht in de tweede reactieverge-

lijking van (2.2) hebben we analoog

k3[Mp][MAPKK] = k−3[Mp−MAPKK∗] + k4[Mp−MAPKK∗]

1We willen nog opmerken dat we gedurende het opstellen van de vier MM vergelijkingen bepaalde pa-rameters invoeren die afhankelijk zijn van de oorspronkelijke parameters. Op het einde van deze paragraafworden deze nog eens expliciet weergegeven.

11


⇒ [Mp−MAPKK∗] =k3

k−3 + k4

[Mp][MAPKK]

=1

Km2

[Mp][MAPKK], (2.6)

waarbij we Km2 =k−3 + k4

k3

gesteld hebben. Aangezien we een uitdrukking voor [M −MAPKK∗] willen bekomen en we gebruik kunnen maken van de uitdrukking (2.4) voor[MAPKK]tot (waarbij deze laatste een constante is), drukken we [MAPKK] en [Mp −MAPKK∗] uit in termen van [M −MAPKK∗]. Op deze manier krijgen we uit onze verge-lijking (2.4) een uitdrukking voor [M −MAPKK∗] en bijgevolg een uitdrukking voor v1.Uit (2.5) krijgen we dus

[MAPKK] = Km1[M −MAPKK∗]

[M ],

wat voor (2.6) betekent dat

[Mp−MAPKK∗] =Km1

Km2

· [Mp][M −MAPKK∗]

[M ].

We brengen nu alles samen in (2.4) en krijgen dan

[MAPKK]tot =Km1[M −MAPKK∗]

[M ]+ [M −MAPKK∗]

+Km1

Km2

· [Mp][M −MAPKK∗]

[M ]

=

(Km1

[M ]+ 1 +

Km1

Km2

[Mp]

[M ]

)[M −MAPKK∗]

=

(Km1Km2 +Km2[M ] +Km1[Mp]

Km2[M ]

)[M −MAPKK∗]

⇒ [M −MAPKK∗] =Km2[M ][MAPKK]tot

Km1Km2 +Km2[M ] +Km1[Mp].

We bekomen dus de volgende MM-vergelijking aan de hand van de invoering kcat1 = k2 (ditwordt om notatieredenen ingevoerd naar analogie met latere afleidingen):

v1 = k2[M −MAPKK∗]

= kcat1 [M −MAPKK∗]

=kcat1 Km2[M ][MAPKK]tot

Km1Km2 +Km2[M ] +Km1[Mp]

=kcat1 [M ][MAPKK]tot/Km1

1 + [M ]/Km1 + [Mp]/Km2

. (2.7)

Een analoge redenering is gevolgd bij het opstellen van de MM-vergelijking voor v2. Uit

12


Figuur 2.2 blijkt duidelijk dat dit de snelheid is waarmee de gefosforyleerde vorm van MAPK(Mp) omgezet wordt naar zijn dubbel-gefosforyleerde vorm (Mpp) door de inwerking vanMAPKK. Samen met (2.2) krijgen we dus de volgende uitdrukking:

v2 = k4[Mp−MAPKK∗].

Het is duidelijk dat we een uitdrukking nodig hebben voor [Mp−MAPKK∗].We nemen opnieuw aan dat er evenwicht is tussen de opbouw en de afbraak van de inter-mediairen M −MAPKK∗ en Mp−MAPKK∗ in (2.2) en we kunnen dus opnieuw met deuitdrukkingen (2.5) en (2.6) werken. Aangezien we nu een uitdrukking voor [Mp−MAPKK∗]willen bekomen, vormen we deze vergelijkingen om tot de volgende:

[MAPKK] = Km2[Mp−MAPKK∗]

[Mp],

[M −MAPKK∗] =Km2

Km1

[M ][Mp−MAPKK∗]

[Mp].

Brengen we opnieuw alles samen in (2.4), dan krijgen we

[MAPKK]tot =Km2[Mp−MAPKK∗]

[Mp]+Km2

Km1

· [M ][Mp−MAPKK∗]

[Mp]

+[Mp−MAPKK∗]

=

(Km2

[Mp]+Km2

Km1

[M ]

[Mp]+ 1

)[Mp−MAPKK∗]

=

(Km1Km2 +Km2[M ] +Km1[Mp]

Km1[Mp]

)[Mp−MAPKK∗]

⇒ [Mp−MAPKK∗] =Km1[Mp][MAPKK]tot

Km1Km2 +Km2[M ] +Km1[Mp].

We bekomen dus de volgende MM-vergelijking (met de invoering van kcat2 = k4):

v2 = k4[Mp−MAPKK∗]

= kcat2 [Mp−MAPKK∗]

=kcat2 Km1[Mp][MAPKK]tot

Km1Km2 +Km2[M ] +Km1[Mp]

=kcat2 [Mp][MAPKK]tot/Km2

1 + [M ]/Km1 + [Mp]/Km2

.

Na het opstellen van het schema (2.2) voor de fosforylatie van MAPK door het inwerken vande kinase MAPKK en de bijhorende MM-vergelijkingen af te leiden, stellen we nu analoog deMM-vergelijkingen op horende bij (2.3) (de defosforylatie van Mpp en Mp door het inwerkenvan de fosfatase MKP3). We willen een MM-vergelijking opstellen voor de snelheid v3. UitFiguur 2.2 kunnen we duidelijk zien dat dit de snelheid is waarmee Mpp omgezet wordt naarzijn gedefosforyleerde vorm Mp door de inwerking van MKP3. Samen met (2.3) krijgen wede volgende uitdrukking:

v3 = h2[Mpp−MKP3∗],

13


waarbij we aangenomen hebben dat de concentratie van [Mp−MKP3] steeds constant blijft.Het is duidelijk dat we ditmaal een uitdrukking nodig hebben voor [Mpp−MKP3∗].De fosfatase MKP3 zit gedurende de cyclus verspreid in zowel gebonden als ongebondenvormen. We hebben dus (zie (2.3))

[MKP3]tot =[MKP3] + [M −MKP3] + [Mp−MKP3] + [Mp−MKP3∗] (2.8)

+ [Mpp−MKP3∗],

waarbij we opnieuw veronderstellen dat de totale concentratie van deze fosfatase constant is.We nemen nu aan dat er evenwicht is tussen de opbouw en de afbraak van de intermediairenMpp−MKP3∗, Mp−MKP3, Mp−MKP3∗ en M −MKP3 in (2.3).Uit de eerste reactievergelijking van (2.3) krijgen we de volgende uitdrukkingen:

h1[Mpp][MKP3] = h−1[Mpp−MKP3∗] + h2[Mpp−MKP3∗]

⇒ [Mpp−MKP3∗] =h1

h−1 + h2

[Mpp][MKP3] (2.9)

en

h2[Mpp−MKP3∗] + h−3[Mp][MKP3] = h3[Mp−MKP3]. (2.10)

Door het evenwicht in de tweede reactievergelijking van (2.3) hebben we analoog

h4[Mp][MKP3] = h−4[Mp−MKP3∗] + h5[Mp−MKP3∗]

⇒ [Mp−MKP3∗] =h4

h−4 + h5

[Mp][MKP3] (2.11)

en

h5[Mp−MKP3∗] + h−6[M ][MKP3] = h6[M −MKP3]. (2.12)

Aangezien we een uitdrukking voor [Mpp−MKP3∗] willen bekomen en we gebruik kunnenmaken van de uitdrukking (2.8) voor [MKP3]tot (waarbij deze laatste een constante is),drukken we [MKP3], [M −MKP3], [Mp −MKP3] en [Mp −MKP3∗] uit in termen van[Mpp−MKP3∗]. Op deze manier krijgen we uit onze vergelijking (2.8) een uitdrukking voor[Mpp−MKP3∗] en bijgevolg een uitdrukking voor v3.Uit (2.9) krijgen we dus

[MKP3] =h−1 + h2

h1

[Mpp−MKP3∗]

[Mpp],

wat voor (2.11) betekent dat

[Mp−MKP3∗] =(h−1 + h2)h4

(h−4 + h5)h1

[Mp]

[Mpp][Mpp−MKP3∗].

Uit (2.10) volgt dat

[Mp−MKP3] =h2

h3

[Mpp−MKP3∗] +h−3

h3

[Mp][MKP3]

=

(h2

h3

+(h−1 + h2)h−3

h1h3

[Mp]

[Mpp]

)[Mpp−MKP3∗]

14


en uit (2.12) dat

[M −MKP3] =h5

h6

[Mp−MKP3∗] +h−6

h6

[M ][MKP3]

=

((h−1 + h2)h4h5

(h−4 + h5)h1h6

[Mp]

[Mpp]+

(h−1 + h2)h−6

h1h6

[M ]

[Mpp]

)[Mpp−MKP3∗].

We brengen nu alles samen in (2.8) en krijgen dan

[MKP3]tot =

(h−1 + h2

h1[Mpp]+

(h−1 + h2)h4h5[Mp]

(h−4 + h5)h1h6[Mpp]+

(h−1 + h2)h−6[M ]

h1h6[Mpp]+h2

h3

= +(h−1 + h2)h−3[Mp]

h1h3[Mpp]+

(h−1 + h2)h4[Mp]

(h−4 + h5)h1[Mpp]+ 1

)[Mpp−MKP3∗]

=N3

(h−4 + h5)h1h3h6[Mpp]

met

N3 =(h−1 + h2)(h−4 + h5)h3h6 + (h−1 + h2)(h−4 + h5)h3h−6[M ]

+ (h−1 + h2)

(h3h4h5 + (h−4 + h5)h−3h6 + h3h4h6

)[Mp]

+ (h−4 + h5)h1h6(h2 + h3)[Mpp]

=(h−1 + h2)(h−4 + h5)h3h6·(1 +

h−6

h6

[M ] +h3h4h5 + (h−4 + h5)h−3h6 + h3h4h6

(h−4 + h5)h3h6

[Mp] +h1(h2 + h3)

(h−1 + h2)h3

[Mpp]

).

We bekomen dus de MM-vergelijking

v3 = h2[Mpp−MKP3∗]

=(h−4 + h5)h1h2h3h6[Mpp][MKP3]tot

N3

=

h1h2(h−1+h2)

[Mpp][MKP3]tot

1 + h−6

h6[M ] + h3h4h5+(h−4+h5)h−3h6+h3h4h6

(h−4+h5)h3h6[Mp] + h1(h2+h3)

(h−1+h2)h3[Mpp]

=kcat3 [Mpp][MKP3]tot/Km3

1 + [M ]/Km5 + [Mp]/Km4 + [Mpp]/Km3

,

waarbij we Km3 =h−1 + h2

h1 + h1h2/h3

, Km4 =k−4 + k5

h4

(1 + h5/h6 + h−3(h−4 + h5)/(h3h4)

) , Km5 =

h6

h−6

en kcat3 =h2

1 + h2/h3

gesteld hebben.

Analoog willen we nu een MM-vergelijking opstellen voor de snelheid v4. Uit Figuur 2.2kunnen we duidelijk zien dat dit de snelheid is waarmee Mp omgezet wordt naar zijn gede-fosforyleerde vorm M door de inwerking van MKP3. Samen met (2.3) krijgen we de volgendeuitdrukking:

v4 = h5[Mp−MKP3∗],

15


waarbij we aangenomen hebben dat de concentratie van [M −MKP3] steeds constant blijft.Het is duidelijk dat we een uitdrukking nodig hebben voor [Mp−MKP3∗].We nemen opnieuw aan dat er evenwicht is tussen de opbouw en de afbraak van de inter-mediairen Mpp −MKP3∗, Mp −MKP3, Mp −MKP3∗ en M −MKP3 in (2.3) en wekunnen dus opnieuw met de vier uitdrukkingen (2.9) - (2.12) werken. Aangezien we nu eenuitdrukking voor [Mp−MKP3∗] willen bekomen, vormen we deze vergelijkingen om tot devolgende:

[MKP3] =h−4 + h5

h4

[M −MKP3∗]

[Mp],

[Mpp−MKP3∗] =(h−4 + h5)h1

(h−1 + h2)h4

[Mpp]

[Mp][Mp−MKP3∗],

[Mp−MKP3] =

((h−4 + h5)h1h2

(h−1 + h2)h3h4

[Mpp]

[Mp]+

(h−4 + h5)h−3

h3h4

)[Mp−MKP3∗],

[M −MKP3] =

(h5

h6

+(h−4 + h5)h−6

h4h6

[M ]

[Mp]

)[Mp−MKP3∗].

We brengen alles samen in (2.8) en krijgen dan

[MKP3]tot =

(h−4 + h5

h4[Mp]+h5

h6

+(h−4 + h5)h−6[M ]

h4h6[Mp]+

(h−4 + h5)h1h2[Mpp]

(h−1 + h2)h3h4[Mp]

= +(h−4 + h5)h−3

h3h4

+ 1 +(h−4 + h5)h1[Mpp]

(h−1 + h2)h4[Mp]

)[Mp−MKP3∗]

=N4

(h−1 + h2)h3h4h6[Mp]

met

N4 = (h−1 + h2)(h−4 + h5)h3h6 + (h−1 + h2)(h−4 + h5)h3h−6[M ]

= + (h−1 + h2)

(h3h4h5 + (h−4 + h5)h−3h6 + h3h4h6

)[Mp]

= + (h−4 + h5)h1h6(h2 + h3)[Mpp]

=(h−1 + h2)(h−4 + h5)h3h6·(1 +

h−6

h6

[M ] +h3h4h5 + (h−4 + h5)h−3h6 + h3h4h6

(h−4 + h5)h3h6

[Mp] +h1(h2 + h3)

(h−1 + h2)h3

[Mpp]

).

We bekomen dus de volgende MM-vergelijking

v4 = h5[Mp−MKP3∗]

=(h−1 + h2)h3h4h5h6[Mp][MKP3]tot

N4

=

h4h5(h−4+h5)

[Mp][MKP3]tot

1 + h−6

h6[M ] + h3h4h5+(h−4+h5)h−3h6+h3h4h6

(h−4+h5)h3h6[Mp] + h1(h2+h3)

(h−1+h2)h3[Mpp]

=kcat4 [Mp][MKP3]tot/Km4

1 + [M ]/Km5 + [Mp]/Km4 + [Mpp]/Km3

,

16


waarbij we kcat4 =h5

1 + h5/h6 + h−3(h−4 + h5)/(h3h4)gesteld hebben.

Samengevat hebben we de volgende vier MM-vergelijkingen:

v1 =kcat1 [M ][MAPKK]tot/Km1

1 + [M ]/Km1 + [Mp]/Km2

, (2.13)

v2 =kcat2 [Mp][MAPKK]tot/Km2

1 + [M ]/Km1 + [Mp]/Km2

, (2.14)

v3 =kcat3 [Mpp][MKP3]tot/Km3

1 + [M ]/Km5 + [Mp]/Km4 + [Mpp]/Km3

, (2.15)

v4 =kcat4 [Mp][MKP3]tot/Km4

1 + [M ]/Km5 + [Mp]/Km4 + [Mpp]/Km3

, (2.16)

met

kcat1 = k2,

kcat2 = k4,

Km1 =k−1 + k2

k1

,

Km2 =k−3 + k4

k3

,

kcat3 =h2

1 + h2/h3

,

kcat4 =h5

1 + h5/h6 + h−3(h−4 + h5)/(h3h4),

Km3 =h−1 + h2

h1 + h1h2/h3

,

Km4 =k−4 + k5

h4

(1 + h5/h6 + h−3(h−4 + h5)/(h3h4)

) ,Km5 =

h6

h−6

.

Ons model dat hier besproken wordt, ziet er dan uit als volgt:

17

2.6. Interpretatie van de uitdrukkingen voor de snelheid

Model 1.

d[M ]

dt= v4 − v1,

d[Mpp]

dt= v2 − v3,

[Mp] = Mtot − [M ]− [Mpp],

v1 =kcat1 [M ][MAPKK]tot/Km1

1 + [M ]/Km1 + [Mp]/Km2

,

v2 =kcat2 [Mp][MAPKK]tot/Km2

1 + [M ]/Km1 + [Mp]/Km2

,

v3 =kcat3 [Mpp][MKP3]tot/Km3

1 + [M ]/Km5 + [Mp]/Km4 + [Mpp]/Km3

,

v4 =kcat4 [Mp][MKP3]tot/Km4

1 + [M ]/Km5 + [Mp]/Km4 + [Mpp]/Km3

.

2.6 Interpretatie van de uitdrukkingen voor de snel-

heid

We hebben in ons model bij het defosforylatieschema de werkelijke desfosforylatiestappenbeschouwd, evenals de stap waar het nieuw gevormde product terug opgesplitst werd. Bijhet fosforylatieschema hebben we dit vereenvoudigd door deze twee stappen samen te nemenals een stap en te veronderstellen dat het product meteen uiteenvalt nadat het enzym zijnwerking uitgevoerd heeft. We merken uit onze MM-vergelijkingen dat dit niet echt zorgt vooreen fundamentele verandering in de uitdrukkingen. We zien echter wel dat er een extra termtevoorschijn komt in de noemer van de MM-vergelijkingen als we de extra stap beschouwenin de defosforylatie en er aangenomen wordt dat de stap van het splitsen van product enenzym wederkerig is. De katalytische constanten kcati en de MM-constanten Kmi vertoneneveneens een wat ingewikkeldere vorm.

2.7 Eigenschappen van een duale fosforylatie-defosfo-

rylatiecyclus.

We bekijken eerst een evenwichtstoestand, namelijk het geval waard[M ]

dt= v4 − v1 = 0. We

nemen aan dat zowel MAPKK als MKP3 verzadigd zijn door hun substraten M , respec-tievelijk Mpp. We willen onderzoeken wat er gebeurt met de concentraties van M en Mp alswe door verandering van parameters een stijging van [Mpp] ondervinden. Door het feit datMtot een constante is en er geldt dat Mtot = [M ] + [Mp] + [Mpp], zien we al meteen in dat[M ] en [Mp] niet beiden kunnen toenemen.

18

2.7. Eigenschappen van een duale fosforylatie-defosforylatiecyclus.

Aangezien we geen vrije MKP3 meer hebben in ons systeem en zowel Mpp als Mp wilbinden met dit enzym, is het duidelijk dat deze twee stoffen concurreren om de MKP3. v4

ondervindt dus competitieve inhibitie van Mpp (tegen Mp). Dit laatste kan afgeleid wordenuit de voorgaande intuıtieve interpretatie samen met Figuur 2.2, maar kan ook wiskundiggeverifieerd worden in (2.16): een stijging van [Mpp] zorgt duidelijk voor een daling van v4.Analoog kun je hieruit opmaken dat v4 ook tegengewerkt wordt door M .Een besluit dat we hieruit kunnen trekken is dat v1 ook competitieve inhibitie ondervindtvan Mp: ditmaal is de concurrentie tegen M gericht. Opnieuw is dit zowel uit Figuur 2.2 afte lezen als uit (2.13).Uit al deze resultaten kunnen we nu besluiten wat er gebeurt bij deze evenwichtstoestand als[Mpp] stijgt. We willen dan namelijk v1 = v4 behouden, maar door een stijging van [Mpp]hebben we een daling van v4 (door de competitieve inhibitie). We kunnen dit compenserendoor ofwel opnieuw een stijging van v4 te bekomen, ofwel een daling van v1 (of een combinatievan beide). Willen we v4 doen stijgen, dan kunnen we de parameterwaarden zo aanpassen dat[M ] daalt (werkt v4 tegen). Om v1 te laten dalen, kunnen we het voorkomen van competitieveinhibitie uitbuiten en er dus voor zorgen dat [Mp] stijgt.Samengevat hoort bij deze eerste evenwichtstoestand een daling van [M ] en/of een stijgingvan [Mp] als [Mpp] gaat stijgen.

We willen nu ook rekening houden met de tweede evenwichtsvoorwaarde waarbij geldt datd[Mpp]

dt=v2−v3 = 0. Aangezien we al voldoen aan onze eerste evenwichtsvoorwaarde v4 = v1,

kunnen we reeds meer zeggen over wat er gebeurt met v2 bij een stijging van [Mpp]. Uit deeerste evenwichtsvoorwaarde hadden we namelijk besloten dat

[Mpp]↗⇒{

[M ]↘[Mp]↗.

Aangezien M en Mp onderlinge competitie voeren om het enzym MAPKK, houdt dit laatstein dat er een verhoging van v2 plaatsvindt (opnieuw zowel te zien in Figuur 2.2 als in (2.14))en dat [Mpp] toeneemt. We hebben dus te maken met een positieve feedback loop: eenstijging van [Mpp] zorgt ervoor dat de productie ervan nog verhoogd wordt.Om de evenwichtstoestand te behouden, moet v3 dus stijgen om gelijk te blijven aan destijgende waarde van v2.Door de symmetrie in de cyclus die weergegeven wordt in Figuur 2.2, kunnen we meteenbesluiten dat we eveneens van een positieve feedback loop kunnen spreken als we [M ] bekijken.Ook hier impliceert een stijging van deze concentratie onder de evenwichtstoestanden dat erextra M aangemaakt wordt.Op deze manier voelen we reeds aan dat er mogelijks bistabiliteit voorkomt in dit modelwaarbij we ofwel te maken hebben met hoge [M ] en lage [Mpp], ofwel omgekeerd.

19

2.8. Implementatie

2.8 Implementatie

We onderzoeken nu dit eerste model aan de hand van een implementatie in Matcont. Aan-gezien de drie veranderlijken [M ], [Mp] en [Mpp] samen gelijk zijn aan de constante Mtot,kunnen we uit het verloop van twee veranderlijken meteen het verloop van de derde afleiden.We kiezen er hier voor om het verloop van [M ] en [Mpp] expliciet te bekijken. Ons modelwordt dan in Matcont ingegeven als in Figuur 2.5:

Figuur 2.5: Implementatie van Model 1 (zie pagina 18) in Matcont.

Voor de parameters kiezen we de waarden die na grondig onderzoek gekozen werden in [6].Hierbij merken we op dat in het artikel met verschillende waarden voor [MAPKK]tot gewerktwordt. In dit onderzoek willen we echter de continuatie van verschillende parameters bekijkenen daarom is het van belang dat de andere parameterwaarden vast gekozen worden zodateen grondige studie opgezet kan worden. Dit geldt ook voor de parameter [MAPKK]tot. Wehebben ervoor gekozen om deze parameter de vaste waarde 50 te geven gedurende de volledigeimplementatie. Ook merken we op dat er in het artikel geen parameterwaarde gegeven wordtvoor Km5. Aan de hand van tabel S1 in het supplementaire materiaal op [12] en de reeds

gedefinieerde uitdrukking Km5 =h6

h−6

, kunnen we de afgeronde waarde Km5 = 78 afleiden.

Dit werd achteraf bevestigd toen bleek dat de auteurs van [6] hun model elektronisch terbeschikking gesteld hebben in de SBML bibliotheek (Systems Biology Markup Language),[17] als de BIOMD0000000027.xml.origin file. Bij het inladen van deze file bleek daar Km5

inderdaad de waarde 78 te hebben.De gekozen parameterwaarden staan samengevat in Tabel 2.1.

20

2.8. Implementatie

Parameter Waarde DimensieKm1 50 nMKm2 500 nMKm3 22 nMKm4 18 nMKm5 78 nMkcat1 0.01 s−1

kcat2 15 s−1

kcat3 0.084 s−1

kcat4 0.06 s−1

Mtot 500 nM[MAPKK]tot 50 nM

[MKP3]tot 100 nM

Tabel 2.1: Parameterwaarden bij Model 1.

2.8.1 Tijdsintegratie

We kunnen nu de veranderingen van de concentraties in de tijd bekijken bij verschillendestartwaarden voor [M ] en [Mpp]. Hierbij kiezen we deze startwaarden willekeurig, maarhouden we er wel rekening mee dat de som van deze concentraties nooit groter is dan 500.Met het oog op verder onderzoek hebben we ervoor gekozen om de tijdsintegratie te bekijkenvoor twee verschillende waarden van Km1. We zien meteen een fundamenteel verschil in dezetwee grafieken van [Mpp] versus [M ] in Figuur 2.6.

(a) Km1 = 200 (b) Km1 = 50

Figuur 2.6: Tijdsintegratie van [Mpp] versus [M ] met parameterwaarden zoals in Tabel 2.1,met uitzondering van Km1 (Model 1).

21

2.8. Implementatie

Als we tijdsintegratie uitvoeren over een voldoende grote tijdsspanne, dan merken we opdat we in het geval van Km1 = 200 (Figuur 2.6(a)) te maken hebben met een stabielvast punt. Het systeem convergeert namelijk voor elke startwaarde naar ([M ], [Mpp]) =(48.08893352; 445.5156715). In het geval waar Km1 = 50 (Figuur 2.6(b)) vinden we een on-stabiel vast punt en twee stabiele vaste punten (bistabiliteit). In dit geval convergeert hetsysteem voor bepaalde startwaarden naar ([M ], [Mpp]) = (11.53634286; 481.9477132) en voorandere naar ([M ], [Mpp]) = (437.7299837; 49.4175348).

2.8.2 Varieren van de MM-constanten Km1 en Km2

We stellen dus vast dat het varieren van een parameter het faseportret grondig kan veran-deren. Daarom willen we nu het effect hiervan onderzoeken op het aantal equilibria en destabiliteit ervan. Aangezien we op basis van Km1 verschillende gevallen hebben kunnen on-derscheiden in Figuur 2.6, beginnen we met het effect van de parameter Km1 na te gaan.Hiervoor selecteren we de equilibria in Figuur 2.6(b) en nemen we de parameter Km1 alsveranderlijke.

Figuur 2.7: Een-parameter bifurcatiediagram bij het varieren van Km1 met de andere para-meterwaarden zoals in Tabel 2.1 (Model 1).

Om de volledige grafiek te construeren, is het noodzakelijk dat we een bifurcatiediagramopstellen vanuit de twee verschillende equilibria. Als we namelijk de equilibriumbifurcatiestekenen in het (Km1, [Mpp])-vlak merken we op dat we te maken hebben met twee niet-samenvallende takken van equilibria. Het schijnbare snijpunt van deze verschillende takkenis een transkritische bifurcatie. Hierbij kruisen twee takken van equilibria elkaar waar de enetak een overgang inhoudt van stabiele naar onstabiele equilibria en de andere van onstabielenaar stabiele.We spreken hier van takken die elkaar schijnbaar snijden omdat we dit op deze figuur nietmet zekerheid kunnen zeggen. We hebben namelijk een projectie van een vierdimensionaalsysteem op een tweedimensionale ruimte. Om te confirmeren of de takken elkaar al dan niet

22

2.8. Implementatie

snijden, zetten we ook de een-parameter bifurcatiediagrammen met varierende Km1 uit tenopzichte van [M ], respectievelijk [Mp] in Figuur 2.8.

(a) (b)

Figuur 2.8: Een-parameter bifurcatiediagrammen bij het varieren van Km1 met de andereparameterwaarden zoals in Tabel 2.1 (Model 1).

Hier wordt aangetoond dat het snijpunt wel degelijk schijnbaar was, want in het (Km1, [Mp])-vlak snijden de twee equilibriumtakken elkaar niet.

De evenwichtscurve in Figuur 2.7 heeft een limietpunt in ([M ], [Mpp], Km1) = (346.762093;137.936921; 78.006341). In dit limietpunt hebben we twee zuiver reele eigenwaarden, namelijk−0.331667 en 0. We konden op voorhand verwachten dat een van de twee eigenwaardennul zou zijn aangezien dit een eigenschap is van limietpunten. Het negatief zijn van deandere eigenwaarde wil zeggen dat het limietpunt de grens vormt tussen stabiele en onstabieleequilibria. Dit wordt ook duidelijk als we de eigenwaarden onderzoeken van de andere puntenop dit een-parameter bifurcatiediagram. We merken vooreerst op dat deze allemaal zuiverreeel zijn voor een positieve Km1. Meer bepaald hebben we in de punten gelegen op destippellijnen te maken met een negatieve en een positieve eigenwaarde en de punten op devolle lijnen hebben twee negatieve eigenwaarden. We weten dus dat de evenwichtspuntencorresponderend met de stippellijnen onstabiel zijn en deze corresponderend met de vollelijnen stabiel.

Als we dit model puur wiskundig verder ontleden, merken we op dat er zich een neutraalzadelpunt (aangeduid met H1) en twee Hopf-punten H2 en H3 in dit model bevinden (zieFiguur 2.7). Een neutraal zadelpunt wordt gekenmerkt door twee reele eigenwaarden die ophun teken na gelijk zijn. H1 bevindt zich in ([M ], [Mpp], Km1) = (−0.060936; 493.510391;−0.267592) en voldoet aan deze eigenschap aangezien ze de eigenwaarden ±1.07605 heeft. H2(in ([M ], [Mpp], Km1) = (−0.259535; 470.631445; −0.053128)) en H3 (in ([M ], [Mpp], Km1) =(509.001208; −20.546097; −29.958857)) zijn Hopf-punten aangezien we in beide met tweezuiver imaginaire eigenwaarden te maken hebben met een tegengesteld teken (0.501583i en−0.501583i, respectievelijk 0.0531013i en −0.0531013i). In H2 is de Lyapunov coefficient1.081608 · 10−3 en dus positief, wat erop wijst dat H2 een subkritisch Hopf-punt is. Door hetnegatief zijn van de eerste Lyapunov coefficient van H3 (= −1.701988 · 10−7) weten we dat

23

2.8. Implementatie

dit Hopf-punt superkritisch is.Aangezien we hier echter met een biochemisch model werken en concentraties steeds positiefmoeten zijn (wat hier niet het geval is bij [M ] en [Mpp]) en door de definitie van Km1 ookgeldt dat deze niet negatief kan zijn, hebben dit zadelpunt en deze Hopf-punten geen fysischebetekenis. Toch zouden deze Hopf-punten voor ons van belang kunnen zijn, aangezien erperiodieke banen kunnen ontstaan uit een Hopf-punt. Als deze periodieke banen zich zoudenverderzetten tot bij positieve waarden voor Km1, dan is dit van belang voor ons model. Wekunnen echter reeds opmerken dat de periodieke banen zullen ontstaan voor dalende waardenvan Km1, aangezien we bij H3 weten dat dit Hopf-punt superkritisch is. Dit houdt in dateventuele periodieke banen ontstaan aan de kant van de onstabiele equilibria en de banenzelf stabiel zijn.We onderzochten de stabiliteit van de equilibria en merkten reeds op dat we vanuit hetHopf-punt H3 bij stijgende waarden van de parameter Km1 te maken hadden met stabieleequilibria en bij dalende waarden met onstabiele, waardoor de eventuele periodieke banenzouden ontstaan aan de linkerkant van het Hopf-punt. Analoog ontstaan de periodieke banenaan de linkerkant van ons subkritisch Hopf-punt H2 aangezien dit gedeelte stabiel is. Dezevermoedens worden bevestigd met behulp van Matcont in Figuur 2.9.

(a) (b)

Figuur 2.9: Een-parameter bifurcatiediagrammen bij het varieren van Km1 met de andereparameterwaarden zoals in Tabel 2.1 (Model 1), waarbij de periodieke banen weergegevenworden. Hierbij geeft 2.9(b) een gedetailleerder beeld weer van de periodieke banen die vanuithet Hopf-punt H3 ontstaan.

Uit Figuur 2.7 kunnen we duidelijk afleiden dat we inderdaad een verschil in aantal equilibriamoesten bekomen voor de tijdsintegratie als we verschillende waarden voor Km1 beschouw-den. We kunnen meer bepaald zeggen dat we bij het constant houden van de andere para-meterwaarden drie equilibria hebben als Km1 < 78 (waarvan twee stabiele) en een stabielequilibrium als Km1 > 78.

We kunnen analoog een bifurcatiediagram opstellen voor veranderende waarden van de pa-rameter Km2 aan de hand van de equilibria in Figuur 2.6(b).

24

2.8. Implementatie

Figuur 2.10: Een-parameter bifurcatiediagram bij het varieren van Km2 met de andere para-meterwaarden zoals in Tabel 2.1 (Model 1).

In dit bifurcatiediagram (Figuur 2.10) vinden we nu twee limietpunten terug bij het varierenvan Km2, namelijk in ([M ], [Mpp], Km2) = (49.332649; 434.231791; 825.650688) en in ([M ],[Mpp], Km2) = (354.249402; 129.630555; 370.509427) met twee zuiver reele eigenwaarden−0.485888 en 0, respectievelijk −0.307781 en 0. Op dezelfde manier als in Figuur 2.7 kunnenwe afleiden dat de equilibria gelegen op het gedeelte tussen de twee limietpunten onstabielzijn en de overige equilibria stabiel.

We hebben dus te maken met een bistabiel systeem en dit systeem vertoont hysteresis.Dit houdt in dat een parameter een bepaalde drempelwaarde moet overschrijden om hetsysteem in een andere stabiele toestand te krijgen en het systeem niet noodzakelijk terugkeertnaar zijn oorspronkelijke stabiele toestand als de parameter de drempelwaarde terug in deandere richting overschrijdt. Dit kunnen we gemakkelijk aantonen op Figuur 2.10. Nemen wenamelijk een lage waarde voor de parameter Km2, dan zien we dat het systeem convergeertnaar een stabiele toestand met hoge [Mpp]. Laten we in deze stabiele toestand de parameterKm2 toenemen, dan neemt [Mpp] geleidelijk af tot Km2 de drempelwaarde 826 aanneemt inhet limietpunt. Bij het passeren van Km2 door deze drempelwaarde verspringt het systeemnaar zijn andere stabiele toestand met lage [Mpp]. Als we Km2 dan laten afnemen, blijvenwe nu echter in de stabiele toestand met lage [Mpp] tot de andere drempelwaarde Km2 = 371bereikt wordt in het andere limietpunt, waarna er terug versprongen wordt naar de anderestabiele toestand (met hoge [Mpp]). Het onstabiele gebied tussen de twee limietpunten wordtdus nooit bereikt.We kunnen ook opmerken dat we bij hoge, respectievelijk lage waarden van Km2 meteenweten naar welke stabiele toestand het systeem zal convergeren. Bij tussenliggende waarden(tussen de twee drempelwaarden Km2 = 371 en Km2 = 826) kunnen we dit niet zomaar

25

2.8. Implementatie

bepalen.We selecteren nu een van de limietpunten uit Figuur 2.7 en 2.10, continueren deze met Km1

en Km2 variabel en stellen zo een bifurcatiediagram op in het (Km1, Km2)-vlak (zie Figuur2.11).

Figuur 2.11: Continuatie van LP bij het varieren van Km1 en Km2 met de andere parame-terwaarden zoals in Tabel 2.1 (Model 1).

Hier hebben we te maken met een Cusp-punt in ([M ], [Mpp], Km1, Km2) = (248.699454;239.432353; 241.939473; 749.430954) met zuiver reele eigenwaarden −0.535044 en 0.Opnieuw vinden we in dit wiskundig model een biologisch irrelevant speciaal punt, namelijkeen Bogdanov-Takens punt dat enkel hypothetisch van tel is aangezien [M] en Km1 hier ne-gatief zijn. Dit punt is terug te vinden op ([M ], [Mpp], Km1, Km2) = (−0.277373; 482.045704;−0.262908; 855.892385).In Figuur 2.11 zijn er voor parameterwaarden binnen het afgebakende gebied drie equilibriaen erbuiten een equilibrium. Voor Km2 = 500 zien we dus inderdaad dat we 3 equilibriahebben bij Km1 < 78 en 1 equilibrium elders, zoals we uit Figuur 2.7 konden aflezen.

Een tweede twee-parameter bifurcatiediagram dat we willen opstellen is deze met verande-rende waarden voor Km1 en Mtot (zie Figuur 2.12). Opnieuw bakent de limietpuntcurve eengebied af waarvoor geldt dat er voor parameterwaarden binnen het gebied bistabiliteit is envoor waarden erbuiten slechts een stabiel equilibrium.Op deze grafiek vinden we een Cusp-punt terug in ([M ], [Mpp], Km1,Mtot) = (148.521044;151.171130; 136.584366; 307.614564) met eigenwaarden −0.78341 en 0. Verder hebben we ookte maken met een biologisch irrelevant Bogdanov-Takens punt in ([M ], [Mpp], Km1,Mtot) =(−0.161634; 261.806726;−0.152999; 271.921490).

26

2.8. Implementatie

Figuur 2.12: Continuatie van LP bij het varieren van Km1 en Mtot met de andere parame-terwaarden zoals in Tabel 2.1 (Model 1).

2.8.3 Varieren van de parameters kcat1 en kcat2

We kunnen verder nog experimenteren met het varieren van andere parameters. Dit gebeurtanaloog als in paragraaf 2.8.2, maar nu kiezen we ervoor om de invloed van de parameterskcat1 en kcat2 te onderzoeken door het opstellen van de bifurcatiediagrammen in Figuur 2.13en 2.14.

Figuur 2.13: Een-parameter bifurcatiediagram bij het varieren van kcat1 met de andere para-meterwaarden zoals in Tabel 2.1 (Model 1).

27

2.8. Implementatie

In Figuur 2.13 hebben we het een-parameter bifurcatiediagram opgesteld waarbij kcat1 als vrijeparameter beschouwd werd. We merken twee limietpunten op, namelijk in ([M ], [Mpp], kcat1 ) =(48.302882; 441.662799; 0.006181) en ([M ], [Mpp], kcat1 ) = (349.931191; 128.983760; 0.012899)met zuiver reele eigenwaarden −0.784647 en 0, respectievelijk −0.244293 en 0. De equilibriagelegen tussen de twee limietpunten zijn onstabiele equilibria (ze hebben zowel een positieveals een negatieve eigenwaarde) en de overige equilibria zijn stabiel (ze hebben twee negatieveeigenwaarden).

Figuur 2.14: Continuatie van LP bij het varieren van kcat1 en kcat2 met de andere parameter-waarden zoals in Tabel 2.1 (Model 1).

In Figuur 2.14 hebben we de continuatie van zowel kcat1 als kcat2 uitgevoerd bij Model 1. Erbevindt zich een Cusp-punt op ([M ], [Mpp], kcat1 , kcat2 ) = (137.675378; 199.319355; 0.077105;0.912146) met eigenwaarden −0.0586781 en 0. Bij parameterwaarden die zich binnen hetgebied begrensd door de LP-curves bevinden, is er bistabiliteit in het systeem. Bij para-meterwaarden die zich buiten dit gebied bevinden, hebben we te maken met een stabielequilibrium.

2.8.4 Besluit voor bistabiliteit

Uit Figuur 2.2 konden we intuıtief reeds verwachten dat we met bistabiliteit zouden te makenhebben als we aannemen dat er substraatverzadiging van de enzymen optreedt. Door dezesubstraatverzadiging en het gegeven dat de twee fosforylatiestappen (respectievelijk defos-forylatiestappen) door dezelfde kinase (respectievelijk fosfatase) uitgevoerd worden, treedter competitieve inhibitie op tussen M en Mp (om MAPKK) en tussen Mpp en Mp (omMKP3) en dit zorgt voor de stabiele toestanden van hoge [M ] en lage [Mpp] enerzijds enlage [M ] en hoge [Mpp] anderzijds (zie ook paragraaf 2.7).We bekijken nu de opgestelde figuren in paragraaf 2.8.2 en 2.8.3 en proberen die te kaderenbinnen deze intuıtieve redenering.

28

2.8. Implementatie

Als eerste zien we in Figuur 2.11 dat we voor deze specifieke parameterwaarden hebbendat Km2 > Km1 nodig is voor bistabiliteit. Uit de definitie van Km1 en Km2 kunnen weopmaken dat dit de relatieve afbraak is van het complex M − MAPKK (respectievelijkMp −MAPKK). Mp −MAPKK ondervindt dus een grotere relatieve afbraak dan M −MAPKK of er wordt met andere woorden relatief meer M −MAPKK gevormd dan Mp−MAPKK. Dit betekent dat zowel M als Mp willen binden met het enzym MAPKK en datde ongefosforyleerde vorm M meer enzymen aantrekt om mee te binden dan Mp. Deze figuurweerspiegelt bijgevolg de competitieve inhibitie van de tweede reactie door het substraat vande eerste reactie bij de fosforylatie.In Figuur 2.12 zien we de relatie Mtot > Km1 voor het verkrijgen van bistabiliteit waarbijdeze beide grootheden uitgedrukt worden in nM . Er moet dus meer vrije M , Mp en Mppzijn dan dat er M −MAPKK afgebroken wordt. Dit impliceert dat er niet genoeg enzymenaanwezig zijn om alle vrije substraten te binden of dat we met andere woorden te makenhebben met substraatverzadiging van de enzymen.Tot slot zien we in Figuur 2.14 voor het bekomen van bistabiliteit dat kcat2 > kcat1 bij dezespecifieke parameterwaarden.

29

Hoofdstuk 3

Signaalschakelaars en bistabiliteitdoor dubbele multisite fosforylatie


3.1 Beschrijving van een duale fosforylatie-defosforyla-

tiecyclus met multisite-bindingen

Zoals reeds aangegeven, hebben we tot nu toe onderzoek gedaan naar een model dat vereen-voudigd was en waar geen rekening gehouden werd met de bindingsplaats van de fosfaatgroepbij de fosforylatie van MAPK. Om nu meer aan te sluiten bij de werkelijkheid breiden weons onderzoek uit naar een model waar wel een onderscheid gemaakt wordt tussen de ver-schillende bindingsplaatsen (het theronine- (T) en tyrosine- (Y) residu). Opnieuw wordt ditsysteem verondersteld een distributief mechanisme te zijn en moet er dus per (de)fosforylatieeen nieuwe binding met een enzym plaatsvinden.

Figuur 3.1: Cyclus van MAPK met multisite-bindingen.

30


In Figuur 3.1 wordt de cyclus van MAPK weergegeven als we rekening houden met dezeverschillende bindingsplaatsen. Er wordt in deze cyclus aangenomen dat de kinase MEK(MAPK/ERK kinase) zowel in staat is om M tot MpY te fosforyleren als M tot MpT ,evenals MpY tot Mpp en MpT tot Mpp. De defosforylatie in de omgekeerde richting wordtuitgevoerd door MKP3 en zorgt voor de omzetting van Mpp tot MpT , van MpT tot Men van MpY tot M . In deze cyclus is de fosfatase MKP3 niet in staat om Mpp te defos-foryleren tot MpY . De fosforylaties worden uitgevoerd met snelheden v1, v2, v3 en v4 en dedefosforylaties met snelheden v5,v6 en v7 zoals af te lezen is in Figuur 3.1.We nemen opnieuw aan dat de som van de concentraties van alle vormen vanMAPK constantis, wat in dit model leidt tot de uitdrukking Mtot = [M ]+[MpY ]+[MpT ]+[Mpp] = constant.Samen met Figuur 3.1 geeft dit dan het volgend stelsel van vergelijkingen:

d[M ]

dt= −v1 − v3 + v6 + v7,

d[MpY ]

dt= v1 − v2 − v7,

d[Mpp]

dt= v2 + v4 − v5,

[MpT ] = Mtot − [M ]− [MpY ]− [Mpp],

(3.1)

waarbij de afgeleiden naar de tijd beschouwd worden.

3.2 Reactievergelijkingen

We kunnen nu opnieuw reactievergelijkingen opstellen bij dit model waarbij de aanname vaneen constante hoeveelheid ATP/ADP geldt en de (on)omkeerbaarheid van bepaalde stappen.Eveneens maken we de vereenvoudiging bij de fosforylatie dat de tussenvormen niet explicietgevormd worden en het uiteenvallen van het complex bestaande uit het enzym en de gefos-foryleerde vorm onmiddellijk gebeurt. We bekomen dan de volgende reactievergelijkingen:

M +MEKk1

k−1

M −MEKY ∗k2

→ MpY +MEK,

MpY +MEKk3

k−3

MpY −MEK∗k4

→ Mpp+MEK,

M +MEKk5

k−5

M −MEKT∗k6

→ MpT +MEK,

MpT +MEKk7

k−7

MpT −MEK∗k8

→ Mpp+MEK.

(3.2)

31


Mpp+MKP3h1

h−1

Mpp−MKP3∗h2

→ MpT −MKP3h3

h−3

MpT +MKP3,

MpT +MKP3h4

h−4

MpT −MKP3∗h5

→ M −MKP3Th6

h−6

M +MKP3,

MpY +MKP3h7

h−7

MpY −MKP3∗h8

→ M −MKP3Yh9

h−9

M +MKP3.

(3.3)

Hierbij voorzien we de actieve complexen (waarbij de (de)fosforylatie nog niet tot standgekomen is en het enzym zijn werking nog moet uitvoeren) opnieuw van een * in de notatie.In (3.2) en (3.3) is er echter nog een nieuwe notatie weergegeven. Bij complexen gevormddoor het substraat MAPK en een enzym (zowel de kinase als de fosfatase) wordt er namelijkeen letter weergegeven als bovenindex. Deze letter wijst op de plaats van de binding van hetenzym en komt zowel voor bij actieve als niet-actieve complexen. Zo zien we bijvoorbeeld inde eerste regel van (3.2) het intermediair complex M −MEKY ∗. Dit is dan het intermediairwaarbij de kinase gebonden is aan het substaat op het Y-residu en de kinase dus zal instaanvoor de fosforylatie van M naar MpY .De ki’s en hi’s zijn constanten en meer bepaald de snelheidsconstanten van de reacties.

3.3 Uitdrukkingen voor de snelheid

Op basis van (3.2) en (3.3) kunnen we nu analoog als in paragraaf 2.5 MM-vergelijkingenopstellen voor de verschillende snelheden die weergegeven zijn in Figuur 3.1. Hierbij veron-derstellen we dat [MEK]tot en [MKP3]tot constant zijn, waarbij

[MEK]tot =[MEK] + [M −MEKY ∗] + [M −MEKT∗] + [MpY −MEK∗]

+ [MpT −MEK∗],

[MKP3]tot =[MKP3] + [Mpp−MKP3∗] + [MpT −MKP3] + [MpT −MKP3∗]

+ [M −MKP3T ] + [MpY −MKP3∗] + [M −MKP3Y ].

We maken eveneens de aanname dat er evenwicht is tussen de opbouw en de afbraak van deintermediairen en bekomen zo de volgende uitdrukkingen voor de snelheid:

v1 =kcat1 [MEK]tot[M ]/Km1

1 + [M ](Km1 +Km3)/(Km1 ·Km3) + [MpY ]/Km2 + [MpT ]/Km4

, (3.4)

v2 =kcat2 [MEK]tot[MpY ]/Km2


, (3.5)



, (3.6)

v4 =kcat4 [MEK]tot[MpT ]/Km4


, (3.7)

32


v5 =kcat5 [MKP3]tot[Mpp]/Km5

1 + [Mpp]/Km5 + [MpT ]/Km6 + [MpY ]/Km7 + [M ]/Km8

, (3.8)

v6 =kcat6 [MKP3]tot[MpT ]/Km6


, (3.9)

v7 =kcat7 [MKP3]tot[MpY ]/Km7


, (3.10)

waarbij we

kcat1 = k2,

kcat2 = k4,

kcat3 = k6,

kcat4 = k8,

kcat5 =h2

1 + h2/h3

,

kcat6 =h5

1 + h5/h6 + h−3(h−4 + h5)/(h3h4),

kcat7 =h8

1 + h8/h9

,

Km1 =k−1 + k2

k1

,

Km2 =k−3 + k4

k3

,

Km3 =k−5 + k6

k5

,

Km4 =k−7 + k8

k7

,

Km5 =h−1 + h2

h1 + h1h2/h3

,

Km6 =k−4 + k5

h4

(1 + h5/h6 + h−3(h−4 + h5)/(h3h4)

) ,Km7 =

h−7 + h8

h7 + h7h8/h9

,

Km8 =h6

h−6 + h6h−9/h9

,

gesteld hebben.Deze resultaten leiden tot Model 2:

33

3.4. Implementatie

Model 2.

d[M ]

dt= −v1 − v3 + v6 + v7,

d[MpY ]

dt= v1 − v2 − v7,

d[Mpp]

dt= v2 + v4 − v5,

[MpT ] = Mtot − [M ]− [MpY ]− [Mpp],



,

v2 =kcat2 [MEK]tot[MpY ]/Km2


,



,

v4 =kcat4 [MEK]tot[MpT ]/Km4


,

v5 =kcat5 [MKP3]tot[Mpp]/Km5


,

v6 =kcat6 [MKP3]tot[MpT ]/Km6


,

v7 =kcat7 [MKP3]tot[MpY ]/Km7


,

waarbij we het verloop van [MpT ] niet expliciet beschouwen, maar dit afleiden uit het verloopvan de andere concentraties en de relatie Mtot = [M ] + [MpT ] + [MpY ] + [Mpp].

3.4 Implementatie

We onderzoeken dit model met behulp van een implementatie in Matcont en dit wordtgeımplementeerd als in Figuur 3.2.Bij de implementatie van dit model moeten uiteraard opnieuw parameterwaarden gekozenworden. Deze worden weergegeven in Tabel 3.1. De parameters in de laatste kolom wordenanaloog gekozen als aangegeven in Figuur 5 van het artikel [6] en de eerste twee kolommenzijn gebaseerd op Tabel 3 in het extra materiaal bij dit artikel dat we vinden in [12].

34

3.4. Implementatie

Figuur 3.2: Implementatie van Model 2 (pagina 34) in Matcont.

Parameter Waarde (nM) Parameter Waarde (s−1) Parameter Waarde (nM)Km1 410 kcat1 1.08 Mtot 1000Km2 40 kcat2 0.007 [MEK]tot 400Km3 20 kcat3 0.008 [MKP3]tot 180Km4 300 kcat4 0.45Km5 22 kcat5 0.084Km6 18 kcat6 0.06Km7 34 kcat7 0.108Km8 40


3.4.1 Tijdsintegratie en continuatie

Na het uitvoeren van tijdsintegratie met deze parameterwaarden en willekeurige startwaardenvoor de veranderlijken (waarbij de som maximum 1000 is) kunnen we zien dat onze veran-derlijken naar een equilibrium convergeren in ([M ], [MpY ], [Mpp]) = (0.46681315; 5.7508542;964.47253) (figuur niet weergegeven). We selecteren dit equilibrium en voeren continuatieuit met ofwel de parameter [MEK]tot vrij, ofwel de parameter [MKP3]tot vrij, waarbij deoverige parameterwaarden constant gehouden worden. Deze grafieken worden weergegevenin Figuur 3.3.

35

3.4. Implementatie

Figuur 3.3: Een-parameter bifurcatiediagram bij het varieren van [MEK]tot, respectievelijk[MKP3]tot met de andere parameterwaarden zoals in Tabel 3.1 (Model 2).

Beide grafieken kunnen op een analoge manier besproken worden. We merken namelijk opdat we twee limietpunten hebben, gelegen op ([M ], [MpY ], [Mpp]) = (4.678733; 42.377537;876.531333) en ([M ], [MpY ], [Mpp]) = (106.657539; 348.221670; 388.863128). In die puntenheeft [MEK]tot de waarde 272.003226, respectievelijk 355.541146 en [MKP3]tot 264.702743,respectievelijk 202.508207.

Als we de eigenwaarden in de verschillende punten van de equilibriumkromme bekijken, danstellen we vast dat deze allemaal zuiver reeel zijn. In de punten die gelegen zijn tussen detwee limietpunten hebben we twee negatieve eigenwaarden en een positieve en elders hebbenwe drie negatieve eigenwaarden. Bij lage en hoge parameterwaarden voor zowel [MEK]tot als[MKP3]tot hebben we dus te maken met een stabiel equilibirum. Bij waarden die daartussenliggen (tussen de twee limietpunten) kunnen we spreken van bistabiliteit waarbij er eenonstabiel equilibrium ligt tussen twee stabiele equilibria.Bij de uitgevoerde tijdsintegratie lagen beide gekozen parameterwaarden buiten het gebiedvan bistabiliteit, dus hadden we bij andere startwaarden voor de verandelijken geen anderequilibrium kunnen bekomen aangezien er in dit geval maar een equilibrium in het systeemaanwezig is.

Vertrekken we vanuit de limietpunten die vastgesteld werden in Figuur 3.3, dan kunnen wecontinuatie uitvoeren met de andere parameter vrij en dit wordt gedaan in Figuur 3.4. Wemerken hierbij op dat het niet vanzelfsprekend is om deze figuur te construeren. Matcont

geeft de foutmelding dat de stapgrootte te klein is en de grafiek wordt niet getekend. Depoging om de stapgrootte te vergroten, levert geen betere resultaten op. Dit probleem kanechter ook veroorzaakt worden doordat de limietpunten niet nauwkeurig genoeg berekendwerden en we keren dus een stap terug om de limietpunten opnieuw te berekenen met behulpvan een kleinere tolerantie. Dit kunnen we aanpassen in het kader met de naam ’Continuer’in Matcont en dit zorgt ervoor dat de numerieke methode die gebruikt wordt om de equilibri-umkromme te construeren kleinere integratiestappen gebruikt. De vergrote precisie in dezestap zorgt ervoor dat het twee-parameter bifurcatiediagram nu wel opgesteld kan worden.

36

3.4. Implementatie

Figuur 3.4: Continuatie van LP bij het varieren van [MEK]tot en[MKP3]tot met de andereparameterwaarden zoals in Tabel 3.1 (Model 2).

Alhoewel negatieve waarden van onze twee veranderende parameters fysisch niet toegela-ten zijn, worden ze toch weergegeven in Figuur 3.4. De bedoeling hiervan is dat het ze-ker duidelijk wordt dat we te maken hebben met twee verschillende limietpuntkrommen.Op beide bevindt zich een Zero Hopf-punt dat in feite een neutraal zadelpunt voorsteltdat tevens een limietpunt is. De twee neutrale zadelpunten hebben parameterwaarden([MEK]tot, [MKP3]tot) = (0; 0), waardoor ze lijken samen te vallen op deze figuur. Alswe echter de waarde van de veranderlijken nagaan in de neutrale zadelpunten, dan vindenwe deze enerzijds in ([M ], [MpY ], [Mpp]) = (106.657538; 348.221669; 388.863130) en ander-zijds in ([M ], [MpY ], [Mpp]) = (4.678732; 42.377535; 876.531338). Dit geeft meteen aandat de twee limietpuntkrommen in Figuur 3.4 elkaar kruisen en niet snijden. Beide neutralezadelpunten hebben drie eigenwaarden die 0 zijn.

In het gebied dat afgebakend is door de twee limietpuntkrommen kan er zich bistabiliteitvoordoen, terwijl de gebieden erbuiten enkel een equilibrium kunnen bevatten.

37

Hoofdstuk 4

Analyse van bistabiliteit door dubbelefosforylatie


4.1 Twee-staps cycli: beschrijving van het model

In dit hoofdstuk werken we met het niet-specifieke eiwit W in een distributief mechanismemet covalente modificatie.

Figuur 4.1: Kinetisch diagram waarbij het eiwit W drie verschillende vormen Wα, Wβ en Wγ

heeft, die gevormd worden door de inwerking van de kinase e1 en de fosfatase e2.

Het eiwit W kan drie vormen aannemen: Wα, Wβ en Wγ. Hierbij stelt Wα de niet-gefosfory-leerde vorm van het eiwit voor, Wβ de gefosforyleerde vorm van Wα en Wγ de gefosforyleerdevorm van Wβ (of dus de dubbel gefosforyleerde vorm van Wα). We nemen aan dat detwee fosforylatiestappen door hetzelfde enzym e1 uitgevoerd worden (de kinase) en de tweedefosforylatiestappen door het enzym e2 (de fosfatase).We nemen eveneens aan dat elke (de)fosforylatiestap volgend distributief MM-mechanisme

38

4.1. Twee-staps cycli: beschrijving van het model

volgt:

WS + ekaikdi

eWS

ki→ WP + e, (4.1)

waarbij kai, kdi en ki respectievelijk de samenstellings- (association), splitsings- (dissociation)en katalytische constante zijn van stap i (i ∈ {1, 2, 3, 4}). eWS is het MM-complex datgevormd werd door het enzym e en zijn substraat WS om het product WP te produceren.Hierbij nemen we aan dat de nodige energie en fosfaatgroepen in constante hoeveelheidaanwezig zijn en hiermee reeds rekening gehouden wordt in de kinetische constanten. Wemerken op dat we hier (in tegenstelling tot in paragraaf 2.4) enkel rekening houden met hetvormen van het substraat-enzym-complex en niet met het vormen van het product-enzym-complex, wat de analyse zal vereenvoudigen.Nemen we nu vi als de snelheid waarmee stap i uitgevoerd wordt, dan zien we aan de hand vanFiguur 4.1 dat de differentiaalvergelijkingen die de tijdsevolutie van dit systeem weergevenals volgt zijn:

dWα

dt= v2 − v1,

dWβ

dt= v1 − v2 − v3 + v4, (4.2)

dWγ

dt= v3 − v4.

We weten dat de enzymen zich zowel in gebonden als ongebonden vorm manifesteren en wehebben meer bepaald dat

e1T = [e1] + [e1Wα] + [e1Wβ],

e2T = [e2] + [e2Wγ] + [e2Wβ],

waarbij eiT de totale concentratie van het enzym ei voorstelt. We nemen aan dat de totaleconcentratie van de enzymen e1 en e2 gedurende de cyclus constant is. Als we nu ookaannemen dat er evenwicht is tussen de opbouw en de afbraak van de intermediairen in (4.1),dan bekomen we de volgende MM-vergelijkingen (analoge uitwerking als in paragraaf 2.5):

v1 =Vm1

[Wα]Km1

1 + [Wα]Km1

+[Wβ ]

Km3

, v3 =Vm3

[Wβ ]

Km3

1 + [Wα]Km1

+[Wβ ]

Km3

,

v2 =Vm2

[Wβ ]

Km2

1 + [Wγ ]

Km4+

[Wβ ]

Km2

, v4 =Vm4

[Wγ ]

Km4

1 + [Wγ ]

Km4+

[Wβ ]

Km2

.

Hierbij hebben we de volgende notaties ingevoerd:

Kmi =

(kdi + kikai

), i = 1, 2, 3, 4

39


en

Vm1 = k1e1T , Vm3 = k3e1T ,

Vm2 = k2e2T , Vm4 = k4e2T .

Om de wiskundige analyse te vereenvoudigen, kunnen we de concentraties van de verander-lijken Wα, Wβ en Wγ dimensieloos maken. Hierbij beschouwen we de totale concentratie vanhet eiwit. We nemen aan dat deze constant is en door het combineren van de gegevens inFiguur 4.1 en (4.1) is deze van de volgende vorm:

WT = [Wα] + [Wβ] + [Wγ] + [e1Wα] + [e1Wβ] + [e2Wγ] + [e2Wβ].

De dimensieloze concentraties van de veranderlijken worden dan weergegeven als

α =[Wα]

WT

, β =[Wβ]

WT

, γ =[Wγ]

WT

,

en deze liggen bijgevolg allemaal tussen 0 en 1. Samen met (4.2) bekomen we de volgendedifferentiaalvergelijkingen voor de dimensieloze veranderlijken voor de tijdsevolutie van ditsysteem:

dα

dt=v2 − v1

WT

,

dβ

dt=v1 − v2 − v3 + v4

WT

,

dγ

dt=v3 − v4

WT

.

Voeren we nu analoog de volgende herschaling in:

KS1 =Km1

WT

, KS2 =Km2

WT

, KS3 =Km3

WT

, KS4 =Km4

WT

,

dan kunnen we onze MM-vergelijkingen herleiden tot

v1 =Vm1

αKS1

1 + αKS1

+ βKS3

, v3 =Vm3

βKS3

1 + αKS1

+ βKS3

,

v2 =Vm2

βKS2

1 + γKS4

+ βKS2

, v4 =Vm4

γKS4

1 + γKS4

+ βKS2

. (4.3)

Voor het verdere verloop van deze analyse definieren we nog enkele dimensieloze grootheden:

r31 =Vm3

Vm1

=k3

k1

,

r24 =Vm2

Vm4

=k2

k4

,

χ14 =Vm1

Vm4

=k1

k4

e1T

e2T

.

40


Hierbij kunnen we duidelijk zien dat r31 en r24 onafhankelijk zijn van de enzym-concentraties.Tot slot wordt een nieuwe parameter Θ ingevoerd die we de asymmetrische factor noemenen die gedefinieerd wordt als

Θ := r31r24 =Vm3Vm2

Vm1Vm4

=k3k2

k1k4

.

De asymmetrische factor is met andere woorden een quotient met in de teller het productvan de katalytische constanten van de stappen die Wβ consumeren (k2 en k3) en in de noemerhet product van de katalytische constanten van de stappen die Wβ produceren (k1 en k4).

4.1.1 Implementatie

Nemen we de restrictie KS1 = KS2 = KS3 = KS4 = KS dan ziet het gebruikte model er alsvolgt uit:

Model 3.

dα

dt=v2 − v1

WT

,

dβ

dt=v1 − v2 − v3 + v4

WT

,

γ = 1− α− β,

v1 =Vm1

αKS

1 + αKS

+ βKS

,

v3 =Vm3

βKS

1 + αKS

+ βKS

,

v2 =Vm2

βKS

1 + γKS

+ βKS

,

v4 =Vm4

γKS

1 + γKS

+ βKS

,

Herschrijven we het model hier zodanig dat we de waarden voor de parameters die voor onsvan belang lijken, kunnen aanpassen, dan wordt dit model in Matcont vertaald als in Figuur4.2.We kiezen ervoor om het verloop van de veranderlijken α en β expliciet weer te geven en hetverloop van de veranderlijke γ enkel te definieren door de relatie α+β+γ = 1. Om grafiekente kunnen tekenen waarbij γ geplot wordt, wordt ook het model met α en γ als explicieteveranderlijken ingevoerd in Matcont.

41

4.2. Bistabiliteit in twee-staps cycli: wiskundig


Voor het bepalen van de parameterwaarden baseren we ons op het Ortega-model in [13]. Wezullen echter verschillende waarden voor Θ en r31 beschouwen, aangezien uit de wiskundigeanalyse het belang van Θ bleek bij het al dan niet voorkomen van bistabiliteit. De parame-terwaarde voor de totale concentratie van het eiwit W werd gekozen naar analogie met [6] ofHoofdstuk 2. Meer bepaald zien onze vaste parameterwaarden eruit als in Tabel 4.1.

Parameter Waarde DimensieKS 0.01 1χ14 1.10 1Vm1 1 nMs−1

WT 500 nM


4.2 Bistabiliteit in twee-staps cycli: wiskundig

We willen opnieuw onderzoeken hoe dit systeem evolueert na een bepaalde tijdsspanne. Aan-gezien het model goed lijkt op Model 1 dat geımplementeerd werd in paragraaf 2.8, kunnenwe reeds veronderstellen dat we bepaalde intervallen van parameterwaarden hebben waarbistabiliteit mogelijk is. In andere gebieden zullen we echter slechts een stabiel equilibriumvinden. Hoewel het numerieke gedeelte van het onderzoek naar dit model pas later gebeurt(in paragraaf 4.3), willen we dit al aantonen met de hulp van Matcont. Daartoe voerenwe tijdsintegratie uit met het model geımplementeerd in Matcont zoals in Figuur 4.2 en de

42


parameterwaarden als in Tabel 4.1. We voeren vanuit een bekomen equilibrium continuatieuit met χ14 als vrije parameter en verschillende waarden van Θ (zie Figuur 4.3).

Figuur 4.3: Een-parameter bifurcatiediagram bij het varieren van χ14 voor verschillendewaarden van Θ (Model 3) met vaste parameterwaarden r31 = 2, KS = 0.01, Vm1 = 1 enWT = 500.

Het is meteen duidelijk dat de nieuw ingevoerde parameter Θ een invloed heeft op het aantalequilibria in het systeem. Aan de hand van deze figuur kunnen we aantonen dat we ergenseen waarde voor Θ zouden moeten vinden die de overgang van een equilibrium naar drieequilibria (bistabiliteit) inhoudt en dus het bifurcatiepunt bepaalt. In Figuur 4.3 zien wenamelijk dat we bij een kleine Θ (bv. Θ = 1) te maken hebben met een stabiel equilibriumvoor alle waarden van χ14. Voor een grotere Θ (bv. Θ = 4) is er een gebied van waardenvan χ14 waarbij twee stabiele equilibria mogelijk zijn met een onstabiel equilibrium tussende twee stabiele.Tussen Θ = 1 en Θ = 4 ligt er dus een waarde voor Θ waar we ons bifurcatiepunt terugvindenen dit willen we in deze paragraaf wiskundig onderzoeken.

4.2.1 Bepalen van de evenwichtstoestand

In een eerste stap zoeken we naar de evenwichtspunten. In een evenwichtstoestand geldtdat de rechterleden van (4.2) gelijkgesteld mogen worden aan 0 aangezien we hier te makenhebben met behoud van de verschillende vormen van het substraat. We hebben dan v1 = v2

en v3 = v4. Kijken we nu naar de uitdrukkingen voor deze snelheden in (4.3), dan merkenwe op dat de noemers van v1 en v3 gelijk zijn, evenals de noemers van v2 en v4. Als we dus

de quotientenv1

v3

env2

v4

beschouwen, worden de termen uit de noemers weggedeeld. Uit de

gelijkheden v1 = v2 en v3 = v4, volgdend uit het behoud van de stoffen, kunnen we de relatie

43


v1

v3

=v2

v4

halen. Als we de vergelijkingen uit (4.3) invullen in deze gelijkheid bekomen we

v1

v3

=v2

v4

⇔Vm1

αKS1

Vm3βKS3

=Vm2

βKS2

Vm4γ

KS4

⇔ α

KS1

KS3

β

γ

KS4

KS2

β=Vm2Vm3

Vm1Vm4︸︷︷︸Θ

⇔ KS2KS3

KS1KS4

αγ

β2= Θ. (4.4)

Om het model verder te vereenvoudigen, nemen we aan dat de concentratie van de verschil-lende vormen van het eiwit die voorkomen veel groter is dan de totale concentratie van detwee katalysatoren, m.a.w. WT � e1T en WT � e2T . Dit betekent dus dat alle enzymenverzadigd zijn door het eiwit en dat [WS] � [eWS], waarbij de concentraties van deze com-plexen constant verondersteld werden in de MM-vergelijkingen. De laatste vier termen vanWT = [Wα]+ [Wβ]+ [Wγ]+ [e1Wα]+ [e1Wβ]+ [e2Wγ]+ [e2Wβ] zijn dan verwaarloosbaar t.o.v.de eerste drie termen. Laten we deze termen dus wegvallen en maken we de vergelijkingdimensieloos door beide leden te delen door WT , dan krijgen we

α + β + γ = 1. (4.5)

We maken opnieuw een vereenvoudiging van dit model door aan te nemen dat de MM-constanten van de kinase, respectievelijk van de fosfatase gelijk zijn, d.i. KS1 = KS3 enKS2 = KS4. Rekening houden met deze veronderstelling zorgt ervoor dat (4.4) equivalent ismet

αγ

β2= Θ. (4.6)

Uit (4.5) en (4.6) kunnen we nu een uitdrukking afleiden voor α en β in functie van γ en Θ.Zonderen we namelijk α af uit deze twee uitdrukkingen en stellen we deze gelijk aan elkaar,dan bekomen we

1− β − γ =β2Θ

γ

⇔β2Θ + βγ + γ2 − γ = 0

⇒β =−γ ±

√γ2 − 4Θγ2 + 4Θγ

2Θ.

We weten dat de concentraties α, β en γ door hun definities in het interval [0, 1] liggenen uit de definitie van Θ volgt ook dat deze positief is. Daaruit volgt dat γ2 ≤ γ, of dus−4Θγ2 + 4Θγ ≥ 0. De wortel van de berekende discriminant is bijgevolg minstens γ.

Voor een positieve β moet de berekende teller door het positief zijn van Θ dus ook positiefzijn, wat door

√γ2 − 4Θγ2 + 4Θγ ≥ γ enkel kan als het plusteken gekozen wordt in de teller

44


van β. We hebben

β =−γ +

√γ2 − 4Θγ2 + 4Θγ

2Θ⇒ α = 1− β − γ

=2Θ + γ −

√γ2 − 4Θγ2 + 4Θγ − 2Θγ

2Θ· 2γ

2γ

=

(−γ +

√γ2 − 4Θγ2 + 4Θγ

)2

4Θγ.

Ook voor χ14 kunnen we een uitdrukking berekenen, hetzij in functie van γ, Θ, KS1 en KS2.

Hiervoor gebruiken we de definitie van χ14, namelijk χ14 =Vm1

Vm4

en de voorwaarde voor de

evenwichtstoestand v3 = v4. Combineren van de aanname dat KS1 = KS3 en KS2 = KS4

met (4.3), geeft ons

Vm3β

KS1 + α + β=

Vm4γ

KS2 + γ + β

⇒Vm4 =Vm3β(KS2 + γ + β)

γ(KS1 + α + β),

en dus

χ14 =Vm1

Vm4

=Vm1γ(KS1 + α + β)

Vm3β(KS2 + γ + β)

=αγ + βγ + γKS1

r31β(KS2 + β + γ)

=β2Θ + βγ + γKS1

r31β(KS2 + β + γ),

waarbij de voorlaatste stap volgt uit de definitie van r31 en de laatste uit αγ = β2Θ (uit (4.6)).Samengevat bekomen we dus de volgende drie uitdrukkingen bij een evenwichtstoestand:

α =

(−γ +

√γ2 − 4Θγ2 + 4Θγ

)2

4Θγ,

β =−γ +

√γ2 − 4Θγ2 + 4Θγ

2Θ, (4.7)

χ14 =βγ + β2Θ + γKS1

r31β(β + γ +KS2).

45


4.2.2 Bifurcatie-analyse

We nemen bijkomend aan dat KS1 = KS2 = KS en hebben dan χ14 =βγ + β2Θ + γKS

r31β(β + γ +KS).

Aangezien β uitgedrukt wordt in termen van γ en Θ (zie (4.7)) kunnen we χ14 weergeven alsfunctie van γ door vaste waarden te kiezen voor Θ, KS en r31 (zie Figuur 4.4).

Figuur 4.4: χ14 als functie van γ met KS = 0.01 en r31 = 2 voor drie verschillende parame-terwaarden Θ: (A) Θ = 1/2, (B) Θ = 4, (C) Θ = 1.062 (m.b.v. Maple).

Als we kijken naar Figuur 4.4, dan zien we dat we bij grafiek A geen bistabiliteit hebben.Bij grafiek B daarentegen merken we op dat er een interval van waarden van χ14 bestaatwaarvoor het systeem wel bistabiliteit vertoont. Dit leiden we af door het aantal mogelijkewaarden voor γ te bekijken bij een vaste waarde voor χ14. In grafiek A bestaat er bij een vasteχ14 slechts een mogelijke waarde voor γ, terwijl er in grafiek B een gebied is waar er bij eenvaste χ14 drie mogelijke waarden voor γ bestaan (twee stabiele equilibria met een onstabielequilibrium ertussen). Grafiek C vormt hier de overgang tussen de twee mogelijkheden endit is dus de grafiek waar we kunnen spreken van een bifurcatiepunt.Uit de figuur kunnen we nu duidelijk opmaken dat het fundamentele verschil tussen de

drie grafieken te vinden is in de uitdrukking∂χ14

∂γ. Deze uitdrukking heeft namelijk geen

nulpunten in grafiek A (er geldt meer bepaald dat∂χ14

∂γ> 0), terwijl er in grafiek B twee

nulpunten te vinden zijn van∂χ14

∂γen in grafiek C een nulpunt. Voor het bifurcatiepunt

zoeken we dus een oplossing voor

∂χ14

∂γ= 0. (4.8)

46


Nulpunten van de vergelijking in (4.8)

Met behulp van het wiskundig computerprogramma Maple kunnen we nu de nulpunten vandeze afgeleide berekenen (zie A.1):

γ1,2 =1

2

(1 +

√(1 +KS)KS

Θ− 1 +KS(4Θ− 1)± A1

), (4.9)

γ3,4 =1

2

(1−

√(1 +KS)KS

Θ− 1 +KS(4Θ− 1)± A2

), (4.10)

met

A1 =

√KS

2(−4Θ + 1) + Θ− 1 + 2√KS

√KS + 1

√Θ− 1 +KS(4Θ− 1)

Θ− 1 +KS(4Θ− 1),

A2 =

√KS

2(−4Θ + 1) + Θ− 1− 2√KS

√KS + 1

√Θ− 1 +KS(4Θ− 1)

Θ− 1 +KS(4Θ− 1).

Voorwaarde voor een reele oplossing

Vooreerst merken we op dat er in het bifurcatiepunt wel degelijk een reele wortel voor (4.8)moet bestaan, of dat minstens een van de voorgaande uitdrukkingen (4.9) en (4.10) voorγi, i ∈ {1, 2, 3, 4}, met andere woorden reeel moeten zijn. Uit de tweede term van de γ’s ende uitdrukking (1 +KS)KS > 0 volgt dan dat er moet gelden:

Θ− 1 +KS(4Θ− 1) > 0

⇔ (1 + 4KS)Θ > 1 +KS

⇔

Θ >

1 +KS

1 + 4KS

als KS > −1

4

Θ <1 +KS

1 + 4KS

als KS < −1

4

Aangezien we uit de definitie van KS weten dat deze positief is, is de voorwaarde van detweede ongelijkheid onmogelijk. We hebben dus voor eender welke fysisch mogelijke waardevan KS dat

Θ >1 +KS

1 + 4KS

(>

1

4

). (4.11)

Dit is meteen een voorwaarde die nodig is gedurende de volledige bespreking om te kunnenspreken van een bifurcatiepunt.

Reduceren van oplossingen door ze te laten samenvallen

Nu hadden we in (4.9) en (4.10) vier mogelijke waarden voor γ waar∂χ14

∂γ= 0. In het

bifurcatiepunt moeten we echter twee samenvallende waarden voor γ overhouden binnen hetinterval ]0, 1[ die voldoen aan deze uitdrukking.

47


Een eerste logische stap is om te kijken wanneer γ1 en γ2, respectievelijk γ3 en γ4 samenvallenof met andere woorden wanneer A1 = 0, respectievelijk A2 = 0. Rekening houdend met devoorwaarde (4.11) kunnen we opmerken dat de noemers van A1 en A2 positief zijn. Devoorwaarde impliceert ook dat de laatste wortel in de laatste term van de teller van A1 enA2 bestaat. Daaruit blijkt dat de laatste term in de teller van A1 (respectievelijk A2) positief(respectievelijk negatief) is. We hebben bijgevolg

A1 = 0 ⇒ KS2(−4Θ + 1) + Θ− 1 moet negatief zijn,

A2 = 0 ⇒ KS2(−4Θ + 1) + Θ− 1 moet positief zijn.

We vinden dus het onderscheid in

KS2(−4Θ + 1) + Θ− 1 = 0

⇔ (1− 4KS2)Θ = 1−KS

2

⇔ Θ =1−KS

2

1− 4KS2 .

Willen we een oplossing voor A1 = 0, dan hebben we de volgende voorwaarden:

KS2(−4Θ + 1) + Θ− 1 < 0

⇔

Θ <

1−KS2

1− 4KS2 0 < KS <

12

Θ >1−KS

2

1− 4KS2 KS >

12

(4.12)

Willen we een oplossing voor A2 = 0, dan hebben we de volgende voorwaarden:

KS2(−4Θ + 1) + Θ− 1 > 0

⇔

Θ >

1−KS2

1− 4KS2 0 < KS <

12

Θ <1−KS

2

1− 4KS2 KS >

12

(4.13)

Voor 0 < KS <1

2geldt:

1−KS2

1− 4KS2 ∈ ]1,+∞[, terwijl we voor KS >

1

2hebben dat

1−KS2

1− 4KS2 ∈

]−∞, 1

4

[. Dit laatste leidt samen met het tweede geval in (4.13) tot de on-

gelijkheid Θ <1

4, wat in tegenstrijd is met de eerder gestelde voorwaarde Θ >

1

4uit (4.11).

We zien dus in dat A2 = 0 geen oplossing heeft als KS >1

2.

We gaan nu de vergelijking A1 = 0 van naderbij bekijken:

A1 = 0⇔KS2(−4Θ + 1) + Θ− 1 = −2

√KS

√KS + 1

√Θ− 1 +KS(4Θ− 1)

i⇔KS4(−4Θ + 1)2 + 2KS

2(−4Θ + 1)(Θ− 1) + (Θ− 1)2

= 4KS (KS + 1) (Θ− 1 +KS(4Θ− 1))

ii⇔Θ1 =(1 +KS)2

(2KS − 1)2∨ Θ2 =

(1 +KS)2

(2KS + 1)2. (4.14)

48


Voor ii werd Maple gebruikt (zie A.2).De equivalentie i werd bekomen door beide leden te kwadrateren en is enkel geldig mits eraan bepaalde bestaansvoorwaarden voldaan is:

• BV 1 (volgt uit het noodzakelijk positief zijn van de term onder het wortelteken):Θ − 1 + KS(4Θ − 1) > 0. Deze voorwaarde is automatisch voldaan door de gesteldevoorwaarde in (4.11).

• BV 2 (volgt uit het negatief zijn van het rechterlid): KS2(−4Θ + 1) + Θ− 1 ≤ 0. We

gaan deze voorwaarde na in de verschillende mogelijke gedaantes voor Θ en vullen metandere woorden Θ1 en Θ2 uit (4.14) in in deze uitdrukking en bekijken hun teken. Wedoen dit met behulp van Maple en geven de code weer in A.3:

◦

KS2(−4Θ1 + 1) + Θ1 − 1 = −6KS(KS + 1)

2KS − 1

{< 0⇔ KS >

12

> 0⇔ KS <12

(4.15)

◦

KS2(−4Θ2 + 1) + Θ2 − 1 = −2KS(KS + 1)

2KS + 1< 0 (4.16)

Een analoge redenering kan opgebouwd worden voor het oplossen van de vergelijking A2 = 0.Hier hebben we echter als tweede bestaansvoorwaarde dat moet gelden: KS

2(−4Θ + 1) +Θ− 1 > 0. Θ1 is dus enkel een oplossing van deze vergelijking als KS <

12, terwijl Θ2 wegens

deze tweede bestaansvoorwaarde nooit een oplossing is.

We kunnen volgende besluiten samenvatten uit de berekeningen in deze deelparagraaf:

• A1 = 0 heeft 1 wortel Θ2 als KS <1

2,

• A1 = 0 heeft 2 wortels Θ1 en Θ2 als KS >1

2,

• A2 = 0 heeft 1 wortel Θ1 als KS <1

2,

• A2 = 0 heeft geen wortels als KS >1

2.

Consequentie voor de veranderlijken en fysische relevantie

In het bifurcatiepunt hebben we dus de volgende waarden voor γ, waarbij gebruik gemaaktwerd van Maple (zie A.4):

49


• in Θ1:

◦

γ1,2 =1

2+

1

2

√(2KS − 1)2

3

(uit Θ1 is enkel oplossing van A1 = 0 als KS >1

2volgt hier: 2KS − 1 > 0)

=1

2+

2KS − 1

6

=1 +KS

3.

◦

γ3,4 =1

2− 1

2

√(2KS − 1)2

3

(uit Θ1 is enkel oplossing van A2 = 0 als KS <1

2volgt hier: 2KS − 1 < 0)

=1

2− 1− 2KS

6

=1 +KS

3.

• in Θ2:

◦

γ1,2 =1

2+

1

2(2KS + 1)

= 1 +KS.

◦

γ3,4: bestaat niet in Θ2 aangezien Θ2 geen wortel is van A2.

We merken op dat de twee overgebleven γ’s (γ1 en γ2) beschouwd in Θ2 geen rol spelen inons model. We weten namelijk dat KS > 0 en door de definitie van γ geldt dat deze kleineris dan 1, wat onmiddellijk tot een tegenspraak leidt, namelijk γ1,2 = 1 + KS > 1 in ditbifurcatiepunt.De enige fysiek mogelijke oplossing tot nu toe is dus Θ1. We moeten geen rekening meerhouden met de eerder gevonden oplossing Θ2.Opnieuw door het gebruik van Maple vinden we in A.5 dat in het bifurcatiepunt geldt:

• als KS >1

2:

γ =1 +KS

3en daaruit volgt dat β = −(KS − 2)(2KS − 1)

3(KS + 1),

α =(KS − 2)2

3(KS + 1)en χ14 = − 2(K2

S + 2KS + 1)(KS + 1)2

(2K2S + 10KS − 1)(2KS − 1)(KS − 2)r31

,

50


• als KS <1

2:

γ =1 +KS

3en daaruit volgt dat β =

1− 2KS

3, α =

1 +KS

3= γ en

χ14 = − KS + 1

r31(2KS − 1).

Houden we voor KS >1

2rekening met het feit dat α, β, γ ∈]0, 1[, dan kunnen we besluiten

dat voor een geldig bifurcatiepunt de restrictie KS < 2 moet genomen worden (uit α, γ < 1,β > 0).

Eliminatie van een laatste mogelijke oplossing

We bekijken dit eerste geval

(voor KS >

1

2

)opnieuw en gaan nu op een andere manier te

werk. We onderzoeken de voorwaarde A1 = 0 in het interval KS ∈]

1

2, 2

[. Vooreerst bekijken

we wat dit wil zeggen voor γ

(en meer bepaald γ1,2 in KS =

1

2

).

In (4.14) zien we meteen dat Θ1 niet bestaat in KS =1

2aangezien de noemer dan 0 wordt.

We hebben dus Θ2 als enige wortel van A1 = 0 in KS =1

2. In KS =

1

2geldt dan:

Θ2 =(1 +KS)2

(2KS + 1)2

=

(32

)2

22=

9

16

⇒ γ1,2 =1

2

(1 +

√32· 1

2

− 716

+ 12· 5

4

)=

1

2

(1 +√

4)

=3

2

In KS =1

2geldt bijgevolg dat γ > 1, wat niet toegelaten is als we met een werkelijk biologisch

model werken.

Willen we nu een bifurcatiepunt voor KS binnen ons interval

]1

2, 2

[, dan is het noodzakelijk

dat we voor dit punt een γ vinden die kleiner is dan 1. Doordat γ1,2 continu is in zijn domein

en γ1,2 > 1 in KS =1

2, hebben we een waarde voor KS en Θ nodig waarbij A1 = 0 en γ1,2 = 1,

zodat de overgang naar γ1,2 < 1 binnen ons interval mogelijk is.Door de uitdrukking van γ1,2 bij A1 = 0 (zie (4.9)) zien we dat de voorwaarde voor γ1,2 = 1

te vinden is in de tweede term, namelijk F (KS) :=(1 +KS)KS

Θ− 1 +KS(4Θ− 1)= 1. Voor deze net

51


gedefinieerde uitdrukking F (KS) wisten we al dat F

(1

2

)= 4, wat er door het groter zijn

dan 1 voor zorgde dat ook γ1,2 > 1.

Onze opdracht bestaat er nu in om een oplossing KS te vinden met

{A1 = 0,

F (KS) = 1:

A1 = 0⇔ −KS2(−4Θ + 1)−Θ + 1 = 2

√KS

√KS + 1

√Θ− 1 +KS(4Θ− 1) (4.17)

F (KS) = 1⇔ (1 +KS)KS = Θ− 1 +KS(4Θ− 1) (4.18)

• In het rechterlid van (4.17) vinden we onder de wortels van de middenste factoren hetlinkerlid van (4.18) terug. Vervangen we dit in (4.17), dan krijgen we de volgendeuitdrukking:

−KS2(−4Θ + 1)−Θ + 1 = 2 (Θ− 1 +KS(4Θ− 1))

⇔ (4K2S − 1− 2− 8KS)Θ = K2

S − 1− 2− 2KS

⇔ Θ =K2S − 2KS − 3

4K2S − 8KS − 3

, (4.19)

mits de bestaansvoorwaarde

4K2S − 8KS − 3 6= 0

⇔ KS 6=8± 4

√7

8

⇔ KS 6= 1±√

7

⇔ KS 6= −1.64575 ∧ KS 6= 3.64575.

Aangezien we aan het werken zijn binnen KS ∈]

1

2, 2

[moeten we verder geen rekening

houden met deze bestaansvoorwaarde.

• Doordat we ook het rechterlid van (4.18) terugvinden in het rechterlid van (4.17) (onderde wortel van de laatste term), kunnen we dit op een analoge manier vervangen in (4.17):

−KS2(−4Θ + 1)−Θ + 1 = 2KS(KS + 1)

⇔ (4K2S − 1)Θ = 2KS(KS + 1) + (KS − 1)(KS + 1)

⇔ Θ =(3KS − 1)(KS + 1)

4K2S − 1

, (4.20)

mits de bestaansvoorwaarde

4K2S − 1 6= 0

⇔ (2KS − 1)(2KS + 1) 6= 0

⇔ KS 6= −1

2∧ KS 6=

1

2

vervuld is. Opnieuw is dit een bestaansvoorwaarde die niet van belang is binnen onsinterval.

52


We hadden reeds eerder aangezien dat A1 = 0 twee oplossingen had voor Θ als KS > 12.

Aangezien we een stelsel aan het oplossen zijn waarbij zowel aan deze vergelijking (4.17)moet voldaan zijn als aan (4.18) (waarbij deze laatste lineair is in Θ) merken we op dat Θmaar een unieke oplossing kan hebben. Het is dus noodzakelijk dat onze berekende waardenvoor Θ in (4.19) en (4.20) samenvallen en aangezien dit uitdrukkingen zijn in KS, kunnenwe daaruit meteen de waarde voor KS halen waarbij aan dit stelsel voldaan is.

K2S − 2KS − 3

4K2S − 8KS − 3

=3K2

S + 2KS − 1

4K2S − 1

⇔ 4K4S − 8K3

S − 13K2S + 2KS + 3 = 12K4

S − 16K3S − 29K2

S + 2KS + 3

⇔ K2S(8K2

S − 8KS − 16) = 0

⇔ K2S −KS − 2 = 0

⇔ KS = −1 ∨ KS = 2.

Met dit eerste geval moet geen rekening gehouden worden door de voorwaarde KS > 0.

We hebben dus dat γ = 1 voor KS = 2, wat samen met γ =3

2voor KS =

1

2ervoor zorgt

dat we geen biologisch toegestaan bifurcatiepunt bekomen voor KS ∈]

1

2, 2

[.

Besluit voor het bifurcatiepunt

Samen met het eerder uitgesloten gebied hebben we dus geen fysisch relevant bifurcatiepunt

voor KS >1

2en in ons gezochte bifurcatiepunt geldt dat:

KS <1

2,

Θ =(1 +KS)2

(2KS − 1)2,

γ =1 +KS

3= α, (4.21)

β =1− 2KS

3,

χ14 = − KS + 1

r31(2KS − 1).

Voorwaarden voor bistabiliteit

We hebben eerder berekend dat α + β + γ = 1 en door het positief zijn van deze driedimensieloze concentraties kunnen we de volgende voorwaarden berekenen:

α, γ ∈]0, 1[⇔ 0 <1 +KS

3< 1

⇔ 0 < 1 +KS < 3

⇔ −1 < KS < 2,

53


β ∈]0, 1[⇔ 0 <1− 2KS

3< 1

⇔ 0 < 1− 2KS < 3

⇔ −1 < −2KS < 2

⇔ 1

2> KS > −1.

Uit de definitie van KS volgt dat deze noodzakelijk positief moet zijn. Een restrictie die hier

opgelegd wordt zodat we te maken hebben met een bifurcatiepunt, is KS <1

2(en dit hadden

we eerder in ons onderzoek ook al bekomen).Samengevat hebben we dus te maken met bistabiliteit bij parameterwaarden waarbij aan de

voorwaarde KS <1

2voldaan is en ook geldt dat Θ >

(1 +KS)2

(1− 2KS)2. Dit wordt geıllustreerd in

Figuur 4.5.

Figuur 4.5: Verloop van de asymmetrische factor Θ als functie van de Michaelis constanteKS in het bifurcatiepunt.

Bereik veranderlijken en parameterwaarden in het bifurcatiepunt

Aan de hand van dit restrictie-interval KS ∈]0,

1

2

[en de vergelijkingen in (4.21) kunnen we

het bereik van de andere parameterwaarden en veranderlijken bepalen in het bifurcatiepunt:

54

4.3. Bistabiliteit in twee-staps cycli: numeriek

• KS → 0:

Θ→ 1

α = γ → 1

3

β → 1

3

χ14 →1

r31

.

• KS →1

2:

Θ→ +∞

α = γ → 1

2β → 0

χ14 → +∞.

We hebben dus de volgende voorwaarden voor de parameterwaarden van het bifurcatiepunt:

Θ ∈]1,+∞[

α, γ ∈]

1

3,1

2

[β ∈

]0,

1

3

[χ14 ∈

]1

r31

,+∞[.

Uit het besluit over Θ kunnen we als nodige voorwaarde voor bistabiliteit stellen dat Θ > 1

in dit geval (namelijk KS1= KS2= KS3= KS4= KS). Doordat Θ =k2k3

k1k4

, is het noodzakelijk

voor bistabiliteit dat k2k3 > k1k4. Een voorwaarde voor bistabiliteit is dus dat het productvan de katalytische constanten van de fosforylatie en de defosforylatie van Wβ groter moet zijndan het product van de katalytische constanten van de fosforylatie van Wα en de defosforylatievan Wγ.

4.3 Bistabiliteit in twee-staps cycli: numeriek

In de voorgaande paragraaf bekeken we enkele voorwaarden die nodig waren voor het bereikenvan bistabiliteit in een twee-staps cyclus. We willen deze voorwaarden nu numeriek nagaanen experimenteren daarom met verschillende parameterwaarden voor dit model in Matcont

(zie ook paragraaf 4.1.1).

55


4.3.1 Parameterrestricties voor een stabiele evenwichtstoestand

Aangezien we hier de vaste waarde KS = 0.01 gekozen hebben en deze kleiner is dan 1/2,weten we uit de wiskundige analyse in paragraaf 4.2 dat het systeem een evenwichtstoestand

heeft voor parameterwaarden die voldoen aan Θ <(1 +KS)2

(1− 2KS)2. De kritieke waarde van Θ in

het bifurcatiepunt is in dit geval (KS = 0.01) 1.06 en lagere waarden zouden dus moeten leidentot een evenwichtstoestand. We tonen dit numeriek aan in Figuur 4.6 door verschillendebifurcatiediagrammen te tekenen bij het varieren van χ14, waarbij we verschillende waardenkiezen voor Θ en r31. We houden er wel rekening mee dat Θ steeds onder de kritieke grensvan 1.06 blijft.

Figuur 4.6: Een-parameter bifurcatiediagram van respectievelijk α, β en γ bij het varierenvan χ14 met de andere parameterwaarden zoals in Tabel 4.1 en aangeduid op de grafiek(Model 3).

In Figuur 4.6 zien we dat de ultrasensitiviteit niet enkel afhankelijk is van de waarde van KS,maar dit ook bepaald wordt door de afstand van de asymmetrische factor Θ tot zijn kritischewaarde. Onder ultrasensitiviteit verstaan we het fenomeen waarbij een kleine storing op eenbepaalde parameter een grote impact heeft op een veranderlijke, wat we hier kunnen aflezendoor de stijlheid van de grafieken. Bij Θ = 1 zien we een meer abrupte overgang van hoge αnaar lage α, die gepaard gaat met de abrupte overgang van lage γ naar hoge γ.

56


4.3.2 Parameterrestricties die bistabiliteit toestaan

We weten dat er bij parameterwaarden die voldoen aan Θ >(1 +KS)2

(1− 2KS)2een interval para-

meterwaarden voor χ14 bestaat dat bistabiliteit impliceert bij deze vaste waarde KS = 0.01.We hebben dan meer bepaald twee stabiele evenwichtstoestanden en een onstabiele. We to-nen dit opnieuw numeriek aan door de verschillende bifurcatiediagrammen te tekenen bij hetvarieren van χ14 waarbij we verschillende waarden kiezen voor Θ en r31. Θ is in dit gevalgroter dan de kritieke grens van 1.06 gekozen (Figuur 4.7).

Figuur 4.7: Een-parameter bifurcatiediagram van respectievelijk α, β en γ bij het varierenvan χ14 met de andere parameterwaarden zoals in Tabel 4.1 en aangeduid op de grafiek(Model 3).

In Figuur 4.7 hebben we steeds met twee limietpunten te maken en door het beschouwenvan de eigenwaarden merken we inderdaad dat het deel van de equilibriumkromme tussen detwee limietpunten onstabiel is en de andere delen stabiel.

57


4.3.3 Overzicht van equilibria en de mogelijkheid tot bistabiliteit

Zoals in de voorgaande paragrafen duidelijk aangetoond werd met behulp van verschillendeimplementaties en berekeningen, zijn er gebieden in de ruimte van de parameters waarinbistabiliteit mogelijk gemaakt wordt naast het voorkomen van een equilibrium. Zo zagen wein paragraaf 4.3.1 dat er bepaalde waarden waren voor Θ (in het geval van KS = 0.01 meerbepaald waarden voor Θ die kleiner zijn dan 1.06) waar we ongeacht van de waarde voor χ14

slechts een equilibrium terug vinden in ons systeem. In paragraaf 4.3.2 vonden we dan voorΘ > 1.06 dat het aantal equilibria afhankelijk was van de waarde van χ14 en dat er gebiedenzijn waar bistabiliteit mogelijk is.We kunnen hieruit afleiden wat we verwachten te zien als we een twee-parameter bifurcatie-diagram opstellen met Θ en χ14 als vrije parameters. Bij Θ > 1.06 (in het geval KS = 0.01)kunnen we verwachten dat er twee limietpuntkrommen zijn die het gebied afbakenen waarer bistabliliteit mogelijk is, terwijl we voor Θ < 1.06 geen limietpuntkrommen zullen opmer-ken. Deze vorm van limietpuntkrommen impliceert een Cusp-punt in het hoekpunt van delimietpuntkrommen en deze vermoedens worden bevestigd als we deze continuatie uitvoerenin Figuur 4.8, waarbij we r31 = 2 gesteld hebben.

Figuur 4.8: Continuatie van LP bij het varieren van Θ en χ14 en de andere parameterwaardenzoals in Tabel 4.1 en r31 = 2 (Model 3).

Het Cusp-punt bevindt zich in (α, β,Θ, χ14) = (0.336957; 0.326667; 1.062162; 0.515306), waarwe inderdaad de berekende kritieke waarde voor Θ in terug vinden.

58

4.4. βmax

4.4 βmax

Uit de voorgaande numerieke experimenten blijkt dat β bij evenwicht een bovengrens heeftdie lager is dan de door het model opgelegde waarde 1 (zie Figuur 4.6 en 4.7). Deze maximalewaarde lijkt af te hangen van de gekozen waarde voor Θ. We willen nu expliciet berekenen watdeze maximale waarde is. Dit kunnen we doen door de afgeleide van β naar de veranderlijkeχ14 te berekenen en te kijken wanneer deze nul is. Als we kijken naar (4.7), dan merken wemeteen op dat deze afgeleide niet zo simpel te berekenen is aangezien de veranderlijke χ14

niet voorkomt in de uitdrukking voor β, maar dit wel omgekeerd het geval is. We herschrijvenonze te berekenen uitdrukking dus als volgt:

∂β

∂χ14

= 0⇔∂β∂γ

∂χ14

∂γ

= 0.

Deze uitdrukking heeft een oplossing als de teller gelijk is aan nul en de noemer niet. Inparagraaf 4.2 hebben we al berekend wanneer de noemer gelijk is aan nul. We houden ditnu in ons achterhoofd bij het berekenen van de uitdrukking waar de teller nul is. Opnieuwzullen we ons hier onnodig rekenwerk besparen door gebruik te maken van het wiskundigcomputerprogramma Maple. De resultaten worden weergegeven in A.6. Deze appendixwordt opgesplitst in verschillende stukjes, zodat de redenering nog steeds duidelijk te volgenis achter het programmeerwerk.We berekenen dus eerst oplossingen voor de uitdrukking

∂β

∂γ= 0 (4.22)

in A.6.1 en houden er rekening mee dat Θ > 0. We hebben dan twee oplossingen voor (4.22),

namelijk γ =2Θ +

√Θ

−1 + 4Θen γ = −−2Θ +

√Θ

−1 + 4Θ.

Nu willen we nagaan of er voldaan is aan de verschillende bestaansvoorwaarden en of deoplossingen dus wel mogelijk zijn.

• BV 1: β moet reeel zijn als ze beschouwd wordt in de berekende γ’s. Door de aan-wezigheid van een term onder de wortel in de uitdrukking voor β is deze voorwaardeequivalent met de voorwaarde dat de term onder de wortel niet-negatief is, of metandere woorden γ2 − 4Θγ2 + 4Θγ ≥ 0. Het is dezelfde term die voorkomt onder het

wortelteken in de uitdrukking voor∂β

∂γ.

• BV 2: In A.6.1 worden de oplossingen van (4.22) gezocht door de vergelijking B = 0te berkenenen. Als we de berekening van Maple hier volgen, dan komt dit neer op hetzoeken van de oplossing van de vergelijking 2

√γ2 − 4Θγ2 + 4Θγ = 2γ − 8Θγ + 4Θ.

Maple zal hier beide leden kwadrateren om tot een oplossing te komen, maar hierbijwordt niet nagegaan of het rechterlid wel degelijk positief is, wat noodzakelijk is doorhet positief zijn van het linkerlid. Als tweede bestaansvoorwaarde hebben we dus nodigdat 2γ − 8Θγ + 4Θ > 0.

59

4.4. βmax

Deze bestaansvoorwaarden worden nagegaan in A.6.2.We houden dus een oplossing γ over die voldoet aan (4.22):

γ = −−2Θ +√

Θ

−1 + 4Θ

= − −√

Θ(2√

Θ− 1)

(2√

Θ− 1)(2√

Θ + 1)

=

√Θ

2√

Θ + 1.

Met behulp van deze waarde voor γ kunnen we nu eveneens de andere veranderlijken bere-kenen in dit punt (zie A.6.3).

β =1

2√

Θ + 1,

α =

√Θ

2√

Θ + 1= γ,

χ14 =

√Θ + Θ + 2ΘKS +

√ΘKS(

1 +√

Θ + 2√

ΘKS +KS

)r31

=

√Θ(

1 +√

Θ + 2√

ΘKS +KS

)(

1 +√

Θ + 2√

ΘKS +KS

)r31

=

√Θ

r31

=

√r24√r31

,

waarbij de laatste gelijkheid volgt uit de definitie van de asymmetrische factor Θ = r31r24.We merken op dat dit een oplossing is voor (4.22), maar we nog niet berekend hebben of diteen oplossing is waarbij β minimaal of maximaal is. We kunnen wel al intuıtief vermoedendat dit een maximale waarde is als we kijken naar Figuur 4.6 en 4.7. Voor de effectieveberekening echter bekijken we de tweede afgeleide van β naar γ in A.6.4 en zien we dat wedoor het negatief zijn van deze tweede afgeleide te maken hebben met een maximale waardevoor β, namelijk βmax = 1

2√

Θ+1. Deze is enkel afhankelijk van de asymmetrische factor Θ

en wordt bereikt in χ14 =

√r24√r31

. De overige concentraties in dit specifieke punt zijn dan

α = γ =

√Θ

2√

Θ + 1.

60

Hoofdstuk 5

Bistabiliteit door driedubbelefosforylatie


5.1 Drie-staps cycli: beschrijving van het model

In dit hoofdstuk werken we met het niet-specifieke eiwit W in een distributief mechanismemet covalente modificatie.

Figuur 5.1: Kinetisch diagram waarbij het eiwit W vier verschillende vormen Wα, Wβ, Wγ

en Wδ heeft die gevormd worden door de inwerking van de kinase e1 en de fosfatase e2.

We nemen nu aan dat het eiwit W vier vormen kan aannemen, namelijk Wα, Wβ, Wγ en Wδ.Hierbij stelt Wα de niet-gefosforyleerde vorm van het eiwit voor, Wβ de gefosforyleerde vormvan Wα, Wγ de gefosforyleerde vorm van Wβ (of dus de dubbel gefosforyleerde vorm van Wα)en Wδ de gefosforyleerde vorm van Wγ (of dus de driedubbel gefosforyleerde vorm van Wα).We nemen aan dat de drie fosforylatiestappen door hetzelfde enzym e1 gekatalyseerd worden(de kinase) en de drie defosforylatiestappen door het enzym e2 (de fosfatase).

61

5.1. Drie-staps cycli: beschrijving van het model

We veronderstellen dat elke (de)fosforylatiestap volgend distributief MM-mechanisme volgt:

WS + ekaikdi

eWS

ki→ WP + e, (5.1)

waarbij kai, kdi en ki respectievelijk de samenstellings-, splitsings- en katalytische constantezijn van stap i, i ∈ {1, . . . , 6}. eWS is het MM-complex dat gevormd werd door het enzyme en zijn substraat WS om het product WP te produceren. Hierbij wordt verondersteld datde nodige energie en fosfaatgroepen in constante hoeveelheid aanwezig zijn en ingerekendwerden in de kinetische constanten. We merken op dat we hier (in tegenstelling tot in [6] ofHoofdstuk 2) enkel rekening houden met het vormen van het substraat-enzym-complex enniet met het vormen van het product-enzym-complex, wat de analyse zal vereenvoudigen.

Nemen we nu vi als de snelheid waarmee stap i uitgevoerd wordt, dan zien we aan de hand vanFiguur 5.1 dat de differentiaalvergelijkingen die de tijdsevolutie van dit systeem weergevenals volgt zijn:

dWα

dt= v2 − v1,

dWβ

dt= v1 − v2 + v4 − v3, (5.2)

dWγ

dt= v3 − v4 + v6 − v5,

dWδ

dt= v5 − v6.

We weten dat de enzymen zich zowel in gebonden als ongebonden vorm manifesteren en wehebben meer bepaald dat

e1T = [e1] + [e1Wα] + [e1Wβ] + [e1Wγ],

e2T = [e2] + [e2Wδ] + [e2Wγ] + [e2Wβ],

waarbij eiT de totale concentratie van het enzym ei voorstelt. We nemen aan dat de totaleconcentratie van het enzym e1 en e2 gedurende de cyclus constant is. Als we nu ook veron-derstellen dat er evenwicht is tussen de opbouw en de afbraak van de intermediairen in (5.1),dan bekomen we de volgende MM-vergelijkingen (analoge uitwerking als in paragraaf 2.5):

v1 =Vm1

[Wα]Km1

1 + [Wα]Km1

+[Wβ ]

Km3+ [Wγ ]

Km5

, v2 =Vm2

[Wβ ]

Km2

1 + [Wδ]Km6

+ [Wγ ]

Km4+

[Wβ ]

Km2

,

v3 =Vm3

[Wβ ]

Km3

1 + [Wα]Km1

+[Wβ ]

Km3+ [Wγ ]

Km5

, v4 =Vm4

[Wγ ]

Km4

1 + [Wδ]Km6

+ [Wγ ]

Km4+

[Wβ ]

Km2

,

v5 =Vm5

[Wγ ]

Km5

1 + [Wα]Km1

+[Wβ ]

Km3+ [Wγ ]

Km5

, v6 =Vm6

[Wδ]Km6

1 + [Wδ]Km6

+ [Wγ ]

Km4+

[Wβ ]

Km2

.

62



Kmi =

(kdi + kikai

), i = 1, 2, 3, 4, 5, 6

en

Vm1 = k1e1T , Vm2 = k2e2T ,

Vm3 = k3e1T , Vm4 = k4e2T ,

Vm5 = k5e1T , Vm6 = k6e2T .

Om de wiskundige analyse te vereenvoudigen, kunnen we de concentratie van de veranderlij-ken Wα, Wβ, Wγ en Wδ dimensieloos maken. Hierbij beschouwen we de totale concentratievan het eiwit. We nemen aan dat deze constant is en door het combineren van de gegevensin Figuur 5.1 en (5.1) is deze van de volgende vorm:

WT = [Wα] + [Wβ] + [Wγ] + [Wδ] + [e1Wα] + [e1Wβ] + [e1Wγ] + [e2Wδ] + [e2Wγ] + [e2Wβ].

De dimensieloze concentraties van de veranderlijken worden dan weergegeven door

α =[Wα]

WT

, β =[Wβ]

WT

, γ =[Wγ]

WT

, δ =[Wδ]

WT

,

en deze liggen bijgevolg allemaal tussen 0 en 1. Samen met (5.2) bekomen we de volgendedifferentiaalvergelijkingen voor de dimensieloze veranderlijken voor de tijdsevolutie van ditsysteem:

dα

dt=v2 − v1

WT

,

dβ

dt=v1 − v2 + v4 − v3

WT

,

dγ

dt=v3 − v4 + v6 − v5

WT

,

dδ

dt=v5 − v6

WT

.

Voeren we nu analoog de volgende herschaling in:

KS1 =Km1

WT

, KS2 =Km2

WT

, KS3 =Km3

WT

, KS4 =Km4

WT

, KS5 =Km5

WT

, KS6 =Km6

WT

,

dan kunnen we onze MM-vergelijkingen herleiden tot

v1 =Vm1

αKS1

1 + αKS1

+ βKS3

+ γKS5

, v2 =Vm2

βKS2

1 + δKS6

+ γKS4

+ βKS2

,

v3 =Vm3

βKS3

1 + αKS1

+ βKS3

+ γKS5

, v4 =Vm4

γKS4

1 + δKS6

+ γKS4

+ βKS2

, (5.3)

v5 =Vm5

γKS5

1 + αKS1

+ βKS3

+ γKS5

, v6 =Vm6

δKS6

1 + δKS6

+ γKS4

+ βKS2

.

63


Voor het verdere verloop van deze analyse definieren we nog enkele dimensieloze parameters:

r31 =Vm3

Vm1

=k3

k1

, r24 =Vm2

Vm4

=k2

k4

,

r53 =Vm5

Vm3

=k5

k3

, r46 =Vm4

Vm6

=k4

k6

,

χ16 =Vm1

Vm6

=k1

k6

e1T

e2T

.

r31, r24, r53 en r46 zijn hierbij duidelijk onafhankelijk van de enzym-concentraties.Ook hier maken we de vereenvoudiging datWT � e1T en WT � e2T en dus dat [WS]� [eWS].De laatste zes termen van WT = [Wα] + [Wβ] + [Wγ] + [Wδ] + [e1Wα] + [e1Wβ] + [e1Wγ] +[e2Wδ] + [e2Wγ] + [e2Wβ] zijn bijgevolg verwaarloosbaar t.o.v. de eerste vier termen, duskunnen we deze termen laten wegvallen. Door het dimensieloos maken van de vergelijking(beide leden delen door WT ) krijgen we

α + β + γ + δ = 1. (5.4)

Model 4.

dα

dt=v2 − v1

WT

,

dγ

dt=v3 − v4 + v6 − v5

WT

,

dδ

dt=v5 − v6

WT

,

β = 1− α− γ − δ,

v1 =Vm1

αKS1

1 + αKS1

+ βKS3

+ γKS5

,

v2 =Vm2

βKS2

1 + δKS6

+ γKS4

+ βKS2

,

v3 =Vm3

βKS3

1 + αKS1

+ βKS3

+ γKS5

,

v4 =Vm4

γKS4

1 + δKS6

+ γKS4

+ βKS2

,

v5 =Vm5

γKS5

1 + αKS1

+ βKS3

+ γKS5

,

v6 =Vm6

δKS6

1 + δKS6

+ γKS4

+ βKS2

.

64

5.2. Bistabiliteit in drie-staps cycli: numeriek

5.2 Bistabiliteit in drie-staps cycli: numeriek

De voorgaande resultaten leiden tot Model 4.De implementatie van dit model in Matcont is weergegeven in Figuur 5.2 en de bijhorendeparameterwaarden in Tabel 5.1.


Parameter Waarde DimensieVm1 1 nMs−1

KS 0.01 1χ16 1.5 1WT 500 nM


In Figuur 5.3 bekijken we het bifurcatiediagram met χ16 als vrije parameter voor verschillendewaarden van Θ.

65


Figuur 5.3: Een-parameter bifurcatiediagram bij het varieren van χ14 met de andere para-meterwaarden zoals in Tabel 5.1 en aangeduid op de grafieken (Model 4).

Er is geen fundamenteel verschil met Model 3 dat numeriek onderzocht werd in paragraaf 4.3.We hebben opnieuw een grens voor Θ waaronder we een equilibrium hebben voor alle waardenvan χ16 en boven die grens hebben we een interval van waarden voor χ16 waar bistabiliteitmogelijk is, terwijl er buiten dat interval terug slechts plaats is voor een equilibrium. Zittenwe in het geval waar slechts een equilibrium mogelijk is (Θ beneden zijn grens) dan zijn alleequilibria stabiel. Boven die grens hebben we echter twee limietpunten waartussen onstabieleequilibria voorkomen, erbuiten zijn ze stabiel.

Het verschil in aantal equilibria lezen we ook af als we een twee-parameter bifurcatiediagramtekenen waarbij de parameters Θ en χ16 vrij genomen worden (zie Figuur 5.4).

Het Cusp-punt bevindt zich in (α, β, δ,Θ, χ16) = (0.252575; 0.247475; 0.252425; 1.020202;0.510101). Hieruit kunnen we zonder de analytische berekening afleiden dat de kritieke grensvoor Θ tussen een equilibrium of de mogelijkheid tot meerdere equilibria ligt bij Θ = 1.020202.

66


Figuur 5.4: Continuatie van LP bij het varieren van Θ en χ16 met de andere parameterwaar-den zoals in Tabel 5.1 en r31 = 2 (Model 4).

In Hoofdstuk 4 hadden we te maken met een twee-staps cyclus die leidde tot bistabiliteit. InHoofdstuk 5 voegden we nu een extra stap toe aan het systeem met het idee in het achter-hoofd om misschien multistabiliteit (en dus meer dan twee stabiele equilibria) te detecteren.Ondanks experimenten met verschillende parameterwaarden werd echter steeds ten hoogstebistabiliteit teruggevonden in dit model.

67

Hoofdstuk 6

Multistabiliteit door een cascade vandubbele fosforylaties


6.1 Twee-staps cycli in een cascade: beschrijving van

het model

In dit hoofdstuk wordt het derde model besproken uit [8]. Dit is meer bepaald het modeldat in dit artikel weergegeven wordt als Figuur 8(B) (hier Figuur 6.1).

Figuur 6.1: Kinetisch diagram waarbij de eiwitten W en Z drie verschillende vormen Wα, Wβ

en Wγ, respectievelijk Zα, Zβ en Zγ kunnen aannemen die gevormd worden door de inwerkingvan de kinase e1 en de fosfatase e2, respectievelijk Wγ en e3.

68

6.1. Twee-staps cycli in een cascade: beschrijving van het model

Uit deze figuur kunnen we volgend stelsel van differentiaalvergelijkingen opstellen:

dWα

dt= v2 − v1,

dWβ

dt= v1 − v2 + v4 − v3,

dWγ

dt= v3 − v4, (6.1)

dZαdt

= v6 − v5,

dZβdt

= v5 − v6 + v8 − v7,

dZγdt

= v7 − v8,

waarbij vi de snelheid is van de reactie in stap i (i = 1, . . . , 8).Hoewel Wγ ook gebruikt wordt in stap 5 en 7 (als kinase) wordt het verbruik van Wγ in dezestappen niet opgenomen in de differentiaalvergelijking voor de verandering van Wγ. Dit is teverantwoorden door het eerder gestelde feit dat een enzym onveranderd gerecupereerd wordteens het zijn werking vervuld heeft, zodat we niet kunnen spreken van verlies of winst vanWγ in stap 5 of 7. In de vergelijkingen voor Zα, Zβ en Zγ speelt Wγ de rol die e1 speelt inde vergelijkingen voor Wα, Wβ en Wγ.Opnieuw aan de hand van Figuur 6.1 en rekening houdend met het distributief gedrag verkrij-gen we de volgende reactievergelijkingen voor de (de)fosforylatie van de verschillende vormenvan de eiwitten W en Z:

Wα + e1

ka1

kd1

e1Wα

k1

→ Wβ + e1,

Wβ + e1

ka3

kd3

e1Wβ

k3

→ Wγ + e1,

Wγ + e2

ka4

kd4

e2Wγ

k4

→ Wβ + e2,

Wβ + e2

ka2

kd2

e2Wβ

k2

→ Wα + e2,

69


Zα +Wγ

ka5

kd5

WγZα

k5

→ Zβ +Wγ,

Zβ +Wγ

ka7

kd7

WγZβ

k7

→ Zγ +Wγ,

Zγ + e3

ka8

kd8

e3Zγ

k8

→ Zβ + e3,

Zβ + e3

ka6

kd6

e3Zβ

k6

→ Zα + e3,

waarbij kai, kdi en ki respectievelijk de samenstellings-, splitsings- en katalytische constantezijn van stap i, i ∈ {1, . . . , 8}. Bij deze reactievergelijkingen veronderstellen we dat de nodigeenergie en fosfaatgroepen in constante hoeveelheid aanwezig zijn en ingerekend werden in dekinetische constanten.We stellen de MM-vergelijkingen van dit wat uitgebreider model op en nemen hierbij aan dater evenwicht is tussen de opbouw en de afbraak van de intermediairen in de reactievergelij-kingen. Op die manier krijgen we op het eerste zicht heel vergelijkbare uitdrukkingen metdeze in Model 3.

v1 =Vm1

αWKS1

1 + αWKS1

+ βWKS3

, v2 =Vm2

βWKS2

1 + γWKS4

+ βWKS2

,

v3 =Vm3

βWKS3

1 + αWKS1

+ βWKS3

, v4 =Vm4

γWKS4

1 + γWKS4

+ βWKS2

, (6.2)

v5 =Vm5

αZKS5

1 + αZKS5

+ βZKS7

, v6 =Vm6

βZKS6

1 + γZKS8

+ βZKS6

,

v7 =Vm7

βZKS7

1 + αZKS5

+ βZKS7

, v8 =Vm8

γZKS8

1 + γZKS8

+ βZKS6

.


Kmi =

(kdi + kikai

), i = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8

en

Vm1 = k1e1T , Vm5 = k5[Wγ],

Vm2 = k2e2T , Vm6 = k6e3T ,

Vm3 = k3e1T , Vm7 = k7[Wγ],

Vm4 = k4e2T , Vm8 = k8e3T .

70


We merken op dat we hier wel een fundamenteel verschil hebben met de eerder ingevoerdemodellen. Bij het constant houden van de verschillende parameterwaarden bleven de nieuwingevoerde parameters Vmi constant onder de tijdsintegratie. Hier geldt dit opnieuw voorbepaalde Vmi’s, maar andere (meer bepaald Vm5 en Vm7) zijn veranderlijk bij tijdsintegratie.Ze zijn namelijk beiden afhankelijk van [Wγ] die enkel constant beschouwd wordt in deevenwichtsoestand v3 = v4 (zie differentiaalvergelijking in (6.1)).Om te werken met dimensieloze concentraties van de veranderlijken voeren we een herschalingdoor, meer bepaald werden volgende grootheden en parameters ingevoerd:

αW =[Wα]

WT

, βW =[Wβ]

WT

, γW =[Wγ]

WT

,

αZ =[Zα]

ZT, βZ =

[Zβ]

ZT, γZ =

[Zγ]

ZT,

KSi =Kmi

WT

, i ∈ {1, . . . , 4},

KSi =Kmi

ZT, i ∈ {5, . . . , 8},

waarbij WT de totale concentratie is van W en ZT de totale concentratie van Z. Beidetotale concentraties worden constant verondersteld en door het combineren van de gegevensin Figuur 6.1 en de opgestelde reactievergelijkingen zien deze totale concentraties er als volgtuit:

WT = [Wα] + [Wβ] + [Wγ] + [e1Wα] + [e1Wβ] + [e2Wγ] + [e2Wβ] + [WγZα] + [WγZβ], (6.3)

ZT = [Zα] + [Zβ] + [Zγ] + [WγZα] + [WγZβ] + [e3Zγ] + [e3Zβ]. (6.4)

Ook bij dit model worden dimensieloze grootheden ingevoerd voor het verdere verloop vande analyse, namelijk:

r31 =Vm3

Vm1

=k3

k1

, r24 =Vm2

Vm4

=k2

k4

,

r75 =Vm7

Vm5

=k7

k5

, r68 =Vm6

Vm8

=k6

k8

, (6.5)

ΘW = r31r24, ΘZ = r75r68,

χ18 =Vm1

Vm8

=k1

k8

e1T

e3T

.

Als laatste maken we de vereenvoudiging dat er veel meer eiwitten aanwezig zijn in ons modeldan enzymen, waardoor er veel meer vrije eiwitten te vinden zijn dan eiwitten die gebondenzijn in een complex. Op deze manier zijn de laatste zes termen in de uitdrukking voor WT

(zie (6.3)) verwaarloosbaar t.o.v. de eerste drie termen, analoog voor de laatste vier termenin de uitdrukking voor ZT (zie (6.4)). We kunnen deze termen dus laten wegvallen in (6.3)en (6.4) en na het dimensieloos maken van beide vergelijkingen krijgen we

αW + βW + γW = 1, (6.6)

αZ + βZ + γZ = 1. (6.7)

71

6.2. Multistabiliteit in twee-staps cycli in een cascade: numeriek

6.2 Multistabiliteit in twee-staps cycli in een cascade:

numeriek

Samengevat bekijken we het volgende model (waarbij we de herschaling doorgevoerd hebbenin de differentiaalvergelijkingen uit (6.1)):

Model 5.

dβWdt

=v1 − v2 + v4 − v3

WT

,

dγWdt

=v3 − v4

WT

,

αW = 1− βW − γW ,dβZdt

=v5 − v6 + v8 − v7

ZT,

dγZdt

=v7 − v8

ZT,

αZ = 1− βZ − γZ ,

v1 =Vm1

αWKS1

1 + αWKS1

+ βWKS3

,

v2 =Vm2

βWKS2

1 + γWKS4

+ βWKS2

,

v3 =Vm3

βWKS3

1 + αWKS1

+ βWKS3

,

v4 =Vm4

γWKS4

1 + γWKS4

+ βWKS2

,

v5 =Vm5

αZKS5

1 + αZKS5

+ βZKS7

,

v6 =Vm6

βZKS6

1 + γZKS8

+ βZKS6

,

v7 =Vm7

βZKS7

1 + αZKS5

+ βZKS7

,

v8 =Vm8

γZKS8

1 + γZKS8

+ βZKS6

.

Samen met de invoering van bepaalde parameters die afhangen van de oorspronkelijk inge-voerde parameters (zie (6.5)) vertaalt dit zich in Matcont tot het systeem in Figuur 6.2.

72


Figuur 6.2: Implementatie van Model 5 in Matcont.

Hierbij hebben we de parameter Vm5 ingevoerd als Vm5 = k5 · γW ·WT . Dit volgt meteen uit

de uitdrukkingen Vm5 = k5[Wγ] en γW =[Wγ]

WT

.

Voor de keuze van de parameters hebben we ons eerst gebaseerd op Figuur S1 uit het extramateriaal bij [8] die we terugvinden in [14]. Daaruit hebben we de gegeven waarden voorΘW , ΘZ en KS overgenomen. Aan de hand van deze figuur kozen we ervoor om χ18 = 14te nemen, aangezien we bij deze waarde meteen meerdere evenwichtspunten terugvinden.Doordat we echter niet weten of we met hetzelfde model werken doordat de vergelijkingenen eventuele vereenvoudigingen van het model niet weergegeven zijn in het artikel ([8]),is het niet zeker dat dit in ons model ook zo is. Voor de andere parameters kiezen wegelijkaardige waarden als in de voorgaande modellen, namelijk Vm1 = 1, Vm4 = 1, k5 = 0.006,WT = 500 en ZT = 500. Analoog met de voorgaande modellen kiezen we r31 =

√ΘW

en r75 =√

ΘZ . Om een poging te doen om de parameters te optimaliseren, voeren weopeenvolgende continuaties uit, steeds naar verschillende parameters. Bij elk een-parameter

73


bifurcatiediagram kiezen we dan een nieuwe waarde voor de parameter door deze gelijk testellen aan een waarde waarbij zich een maximum aantal evenwichtspunten bevinden. Wevoeren dit uit voor alle parameters, waarna we opnieuw beginnen met de continuatie eneventuele aanpassing van de eerste parameters totdat we parameterwaarden gekozen hebbendie het maximum aantal evenwichtspunten bereiken in hun bifurcatiediagram. Uiteindelijkbekomen we op deze manier de parameterwaarden die weergegeven zijn in Tabel 6.1.

Parameter Waarde Dimensie Parameter Waarde DimensieΘW 30 1 Vm1 1.4 nMs−1

r31 5.4772 1 Vm4 1 nMs−1

ΘZ 50 1 k5 0.004 s−1

r75 7.0711 1 WT 500 nMχ18 1 1 ZT 500 nMKS 0.01 1


Zoals steeds beginnen we de numerieke analyse met het uitvoeren van een tijdsintegratie.Deze figuur wordt niet weergegeven in dit verslag, maar wordt wel gebruikt om equilibria teontdekken en deze te selecteren voor de verdere continuatie.In Figuur 6.3 zullen we vooreerst de continuatie van de evenwichtspunten uitvoeren naar deparameter Vm1.In Figuur 6.3(a) geven we een algemeen overzicht van de continuatie van equilibiria met vrijeparameter Vm1 in Model 5. We merken op dat we te maken hebben met twee neutrale zadel-punten (op de figuur aangegeven als ’H’) en zes limietpunten. We overlopen de grafiek doorrechts onderaan te beginnen en de equilibriumkromme te volgen. In Figuur 6.3 nummerenwe alle speciale punten in de volgorde waarop ze bereikt worden en we stellen aan de handvan die nummering Tabel 6.2 op met de waarden van de variabelen en de parameter Vm1 inde speciale punten. In Figuur 6.3(d) wordt het deel van het bifurcatiediagram weergegevenmet γZ ∈ [−0.001; 0.002] zodat het duidelijk is dat LP6 niet als eerste speciaal punt bereiktwordt als we rechts onderaan starten op de equilibriumkromme.

βW γW βZ γZ Vm1

LP1 0.003853 0.995700 0.014074 0.010150 0.668345LP2 0.000313 0.999684 0.014074 0.975776 5.957370LP3 0.018291 0.971377 0.000278 0.999719 0.374618H1 0.073895 0.238098 0.012215 0.980175 1.410262LP4 0.073797 0.237084 0.014074 0.975776 1.412845LP5 0.057449 0.822115 0.014074 0.010150 0.551830H2 0.057611 0.821129 0.012671 0.008199 0.553018LP6 0.018291 0.010332 0.000011 0.000000 2.669412

Tabel 6.2: Waarden van de variabelen en de parameter Vm1 in de speciale punten uit Figuur6.3.

In Figuur 6.3(b) en Figuur 6.3(c) wordt een ingezoomd stuk weergegeven van Figuur 6.3(a).

74


(a) (b)

(c) (d)

Figuur 6.3: Een-parameter bifurcatiediagram bij het varieren van Vm1 met de andere para-meterwaarden als in Tabel 6.1 (Model 5).

75


Het algemeen overzicht gaat bij deze figuren verloren, maar we kunnen op deze manier be-ter uitmaken met hoeveel equilibria we voor een bepaald interval parameterwaarden Vm1 temaken hebben en we zien dat we tot zes equilibria kunnen hebben. Dit vinden we bijvoor-beeld terug bij Vm1 = 0.68. We zien namelijk in Figuur 6.3(c) al vier snijpunten met deequilibriumkromme als we een rechte trekken waarvoor geldt dat Vm1 = 0.68, wat reeds vierequilibria impliceert. We mogen echter het algemeen overzicht in Figuur 6.3(a) of 6.3(b) nietvergeten, waarbij we nog een vijfde en zesde equilibrium vinden.

We willen nu uiteraard ook de stabiliteit van de verschillende equilibria nagaan. Dit doen weaan de hand van de eigenwaarden in de verschillende punten en deze van de speciale puntenvinden we terug in Tabel 6.3.

EW 1 EW 2 EW 3 EW 4LP1 −0.399961 −0.233414 −0.0803419 0LP2 −6.1504 −1.15165 −0.698267 0LP3 −2.60738 −0.376687 −0.0880907 0H1 −0.184398 −0.0575021 −0.00332566 0.00332566LP4 −0.1656 −0.0576225 0 0.00333409LP5 −0.192722 −0.0447309 0 0.00275327H2 −0.208601 −0.0446729 −0.00274853 0.00274853LP6 −3.7673 −0.533255 −0.23515 0

Tabel 6.3: Eigenwaarden van de speciale punten uit Figuur 6.3.

Hieruit kunnen we meteen vaststellen dat de limietpunten een eigenwaarde hebben die gelijkis aan nul, wat een vereiste is om te kunnen spreken van een limietpunt. Bij de punten dieaangeduid worden met ’H’ zien we telkens twee reele eigenwaarden die op een teken na gelijkzijn, wat erop wijst dat dit neutrale zadelpunten zijn.Bekijken we nu ook de eigenwaarden van de andere punten in Figuur 6.3(a) en houden we errekening mee dat de equilibria enkel stabiel zijn als ze vier negatieve eigenwaarden hebben,dan kunnen we de volledige stabiliteit van het bifurcatiediagram bespreken. Beginnen we dusrechts onderaan in Figuur 6.3(a) dan bevinden we ons op een stabiel stuk tot LP1, waarnaer overgegaan wordt tot een onstabiel stuk en deze onstabiliteit terug verloren gaat in LP2.Tussen LP2 en LP3 zijn de equilibria opnieuw stabiel tot ze in LP3 terug onstabiel worden.Deze onstabiliteit blijft behouden in H1, LP4, LP5 en H2 en in LP6 is er terug overgang naarstabiliteit.De eigenwaarden van de verschillende limietpunten gaven aan wanneer de stabiliteit zouomslaan. Hebben we namelijk allemaal negatieve eigenwaarden als we kijken naar de niet-nul-eigenwaarden, dan betekent dit dat er een overgang is van stabiliteit naar onstabiliteit(of omgekeerd) in dat limietpunt, terwijl we weten dat de (on)stabiliteit behouden blijft alshet limietpunt ook strikt positieve eigenwaarden heeft.

Hernemen we nu opnieuw het voorbeeld waar Vm1 = 0.68, dan vinden we van boven naaronder een stabiel equilibrium, twee onstabiele, opnieuw een stabiel en een onstabiel en eenstabiel equilibrium. In tegenstelling tot de voorgaande modellen (zie Model 3 en 4) hebben

76


we hier dus te maken met multistabiliteit, we hebben namelijk drie stabiele equilibria voorbijvoorbeeld Vm1 = 0.68

We kunnen op een analoge manier een onderzoek uitvoeren bij de continuatie naar Vm4 endit wordt weergegeven in Figuur 6.4.

Figuur 6.4: Een-parameter bifurcatiediagram bij het varieren van Vm4 met de andere para-meterwaarden als in Tabel 6.1 (Model 5).

Bij het varieren van de parameter Vm4 hebben we twee neutrale zadelpunten (opnieuw aan-gegeven met ’H’) en drie limietpunten. Onderzoek naar de waarden van de variabelen en deparameter Vm4 in deze speciale punten geeft ons Tabel 6.4, waarbij we de nummering gekozenhebben als we links bovenaan starten in ons bifurcatiediagram (zie ook Figuur 6.4).

βW γW βZ γZ Vm4

LP1 0.018291 0.971377 0.001128 0.998808 3.737142H1 0.073727 0.236368 0.012213 0.980179 0.989626LP2 0.073587 0.234929 0.014074 0.975776 0.987047LP3 0.018291 0.971377 0.059980 0.267454 3.737142H2 0.016643 0.974832 0.059855 0.265528 3.728131


Uit Figuur 6.4 zien we ook dat we maximaal vier equilibria kunnen onderscheiden bij eenvrije parameter Vm4. Voor het onderzoek naar de stabiliteit bekijken we de eigenwaarden(zie Tabel 6.5).

77


EW 1 EW 2 EW 3 EW 4LP1 −2.23861 −0.338426 −0.329207 0H1 −0.183078 −0.0571093 −00330543 0.00330544LP2 −0.164095 −0.0571315 0 0.00330881LP3 −0.329207 −0.100758 0 0.00497047H2 −0.351877 −0.101136 −0.00499283 0.00499282


Doordat we zowel in H1 als in H2 opnieuw twee eigenwaarden hebben die op een teken nagelijk zijn, zijn dit eveneens neutrale zadelpunten. Bekijken we de tekens van de eigenwaardenvan de limietpunten van naderbij, dan merken we meteen op dat er zich maar een punt bevindtop deze grafiek waar er sprake is van een wisseling van stabiliteit, namelijk in LP1. Dit wordtbevestigd als we de overige eigenwaarden bekijken. Als we links bovenaan starten dan vindenwe namelijk stabiele equilibria tot we in LP1 komen en we overgaan naar onstabiele equilibria.Voor de rest van de equilibriumkromme blijven de equilibria onstabiel.Een laatste onderzoek in dit model doen we aan de hand van de vrije parameter χ18. In ditgeval ziet het een-parameter bifurcatiediagram eruit als in Figuur 6.5.

Figuur 6.5: Een-parameter bifurcatiediagram bij het varieren van χ18 en de andere parame-terwaarden als in Tabel 6.1 (Model 5).

In Figuur 6.5 hebben we twee limietpunten LP1 en LP2, waarvan de corresponderende waar-den van de variabelen en χ18 weergegeven zijn in Tabel 6.6 en de eigenwaarden in Tabel6.7.

78


βW γW βZ γZ χ18

LP1 0.001490 0.998443 0.014074 0.975776 0.235295LP2 0.001490 0.998443 0.014074 0.010150 2.088971


We hebben dus maximaal drie equilibria en voor de eigenwaarden geldt er:

EW 1 EW 2 EW 3 EW 4LP1 −1.17557 −0.6974 −0.235473 0LP2 −1.17557 −0.235473 −0.234057 0


Uit de eigenwaarden volgt dat de equilibria van stabiliteit veranderen in LP1 en LP2 en datwe in het gebied tussen deze twee limietpunten drie equilibria hebben, meer bepaald eenonstabiel equilibrium tussen twee stabiele equilibria.Hier valt ons op dat niet voor alle parameters een interval van multistabiliteit aanwezig is:in het geval van het varieren van χ18 hebben we opnieuw bistabiliteit, in tegenstelling tot hetbifurcatiediagram dat opgesteld werd met een vrije parameter Vm1.Als laatste wil ik hierbij opmerken dat ik duidelijk een verschillende grafiek bekom van dezedie gegeven wordt in Figuur S1 in [14]. Dit kan te wijten zijn aan het feit dat ik misschieneen ander model gebruik dan de makers van deze figuur (door het aannemen van anderevereenvoudigingen bij het opstellen ervan), maar het kan eveneens te wijten zijn aan eenandere keuze van parameterwaarden.

79

Algemeen besluit

Bij het schrijven van deze masterproef hebben we heel wat meer geleerd over de werkingvan biochemische signaalnetwerken. Uit de verschillende bestudeerde modellen kunnen weopmerken dat de organisatie en de structuur van de verschillende cycli heel belangrijk zijnvoor de werking van het systeem. We vinden namelijk voor twee-staps cycli, twee-staps cyclimet multisite bindingen en drie-staps cycli de mogelijkheid tot bistabiliteit, terwijl bij twee-staps cycli die in een cascade geordend zijn en waarbij een bepaalde stof zowel als substraatals enzym optreedt, zelfs multistabiliteit mogelijk is. In de eerste gevallen werken we dus opeen niveau en merken we ongeacht het aantal cycli bistabiel gedrag op. Door het toevoegenvan een tweede niveau, waarbij met andere woorden een cascade gevormd wordt, krijgen wemultistabiliteit. Dit laatste is onafhankelijk van de aanwezigheid van feedbackloops tussende verschillende niveaus in de cascade.

Hierbij willen we wel opmerken dat er heel wat parameters meespelen in de verschillendemodellen en de waarden en combinaties hiervan ook cruciaal zijn voor het aantal evenwichts-punten van elk model. Door ons wiskundig onderzoek in paragraaf 4.2 hebben we aangetoonddat een berekende grenswaarde bij bepaalde parameters zorgt voor het onderscheid tussen demogelijkheid van bistabiliteit en het voorkomen van een enkel stabiel equilibrium. Door eeninvloed uit te oefenen op deze verschillende parameterwaarden in werkelijke biochemischesystemen kunnen we de uitkomst van de cyclus dus in grote mate bepalen. Hierbij moe-ten we wel rekening houden met de vooropgestelde voorwaarden van de verzadiging van eenenzym door zijn substraat en moeten de fosforylatiestappen of de defosforylatiestappen alle-maal door dezelfde kinase of dezelfde fosfatase uitgevoerd worden. Door deze voorwaardenwordt de vereiste competitieve inhibitie en positieve feedback mogelijk, wat kan leiden totbistabiliteit.

Het voorkomen van deze multistabiliteit verklaart dat een bepaald biochemisch model vaakmeerdere functies kan uitvoeren. De netwerken die zich in de cel bevinden zorgen er opdeze manier namelijk voor dat het overbrengen van signalen via een en dezelfde baan kanresulteren in verschillende biologische processen.

Hoewel E. Nikolaev in het verder onderzoek naar deze artikels een mogelijkheid zag tot hetvinden van oscillaties in deze specifieke signaalnetwerken, vonden wij dit niet terug tijdensons onderzoek als we enkel rekening houden met biologisch relevante situaties. We merkenop dat B. N. Kholodenko dit wel detecteerde in [4] voor een MAPK cascade, maar hij voegdeeen negatieve feedback loop toe aan het model en vermeldt dat dit in combinatie met ultra-

80

sensitiviteit van de MAPK cascade kan leiden tot oscillaties. Aangezien dit in onze modellenniet aanwezig is, lijkt het niet onlogisch dat we geen biologisch relevante oscillaties ontdekkenin deze masterproef.

We hebben wel duidelijk het fenomeen van ultrasensitiviteit opgemerkt in onze modellen.Een kleine mutatie in een van de parameters kan een groot effect hebben op de uitkomst vaneen cascade. De voortplanting van het signaal doorheen de volledige baan leidt ertoe datkleine veranderingen in de input een grote invloed hebben op het eindresultaat.

81

Verder onderzoek

We merken op dat we heel wat vereenvoudigingen hebben doorgevoerd in onze modellen (ge-lijkstellen van de Michaelis-constanten, intermediairen in evenwicht, verwaarloosbare com-plexen, snelheid die bijvoorbeeld door de verzadiging niet afhankelijk is van de reactanten,...).Het spreekt voor zich dat we ook onderzoek zouden moeten voeren naar modellen waarbijdeze vereenvoudigingen niet gemaakt zijn, om meer bij de werkelijkheid aan te sluiten. Ookcomplexere vormen van cascades, waarbij rekening gehouden wordt met de werkelijke voor-afgaande signalen, lijken me noodzakelijk om het werkelijke biochemisch proces volledig tedoorgronden en hier ook op in te kunnen spelen met behulp van geneesmiddelen. Zo hebbenwe bijvoorbeeld in paragraaf 3.4.1 duidelijk gemerkt dat de hoeveelheid van [MEK]tot en[MKP3]tot een niet te onderschatten invloed heeft op de uitkomst van het systeem. Hetaanpassen van deze hoeveelheden zou dus in de hand kunnen gewerkt worden en zorgen voorandere (en betere) effecten en uitkomsten.

Het lijkt ons heel belangrijk om te blijven werken met numerieke simulaties en deze voorzoveel mogelijk verschillende parameterwaarden uit te voeren. Het is duidelijk dat er heelveel verschillende combinaties bestaan en het vaak onmogelijk lijkt om deze allemaal na tegaan. Toch kan er heel wat informatie gewonnen worden uit deze simulaties. We kunnenechter enkel een minimum aantal stabiele equilibria halen uit deze experimenten als niet allecombinaties van parameterwaarden uitgeprobeerd worden. Daarom lijkt het me van grootbelang om samen met deze simulaties ook verder wiskundig onderzoek uit te voeren op meeringewikkelde modellen, zodat we eveneens het maximale aantal stabiele equilibria kunnenberekenen. De numerieke simulaties kunnen dan als een belangrijk controlemiddel gebruiktworden.

In [9] wordt er gewezen op het belang van verder onderzoek naar complexe interacties eneigenschappen van eiwitten die als een deel van grote biochemische netwerken binnen eenkankercel functioneren. Het onderzoek naar deze modellen wordt dus gelinkt aan de zoektochtnaar nieuwe efficiente geneesmiddelen tegen kanker. In dit artikel wordt nadruk gelegd opde grote hoeveelheid experimentele informatie die beschikbaar is over individuele eiwitten,maar het gebrek aan informatie over hun interacties in grote netwerken. Het doel in dekankerstudie is om de moleculaire basis van het ontstaan en het verderzetten van bepaaldekankersoorten beter te begrijpen en deze informatie te gebruiken voor behandelingen. Ditartikel handelt over kankersoorten die ontstaan door het voorkomen van pathologische RAS(cf. paragraaf 2.1.1), wat een gemuteerde vorm is van het wildtype-RAS. Een studie naarde reductie van RAS-signalering in netwerken met oncogenische RAS-mutanten waarbij de

82

reductie van wildtype-RAS beperkt blijft, wordt door de onderzoekers in deze studie beoogd.Hierbij leggen de auteurs de nadruk op het belang van een geneesmiddel dat werkt op hetvolledige netwerk en niet enkel op het specifieke eiwit.

Ook in [10] wordt er gekeken naar het ontstaan van kanker, maar hierbij wordt eveneens debistabiliteit betrokken. Er worden verscheidene experimenten uitgevoerd op menselijk been-mergcellen en de cellulaire differentiatie wordt onderzocht. Dit houdt een reeks beslissingenin over het lot van de cel en elk ervan wordt normaal als irreversibel beschouwd in hogereorganismen. Nu blijkt uit deze onderzoeken dat er vaak toch een deel plasticiteit terugge-vonden wordt en er dus invloed kan uitgeoefend worden op deze differentiatie. Dit besluitwerd bekomen doordat de aandacht verschoven werd naar een kwantitatieve analyse van deinteracties tussen de verschillende individuele componenten in een biologisch systeem en hoedeze interacties evolueren in de tijd. De studie van hoe menselijke stamcellen osteogenische(staat in voor de aanmaak van beendercellen) en myogenische (staat in voor de aanmaak vanspiercellen) differentiatie ondergaan, toont aan dat een bistabiel wisselmechanisme samen metfeedback regulatie dominerend kan zijn voor deze celdifferentiatie. Door het experimenterenmet behandelde cellen werden verschillende dosissen van een bepaald eiwit (in dit onderzoekBMP2) toegevoegd en werd er opgemerkt dat er een groot verschil te zien was als de dosisBMP2 een bepaalde drempelwaarde overschreed (hysteresis). Dit hield meer bepaald de over-gang in van een ongedifferentieerde toestand van de cel naar een gedifferentieerde toestand.Dit betekent dat er een keuze is tussen myogenische versus osteogenische differentiatie onderverschillende condities. Er werd opgemerkt dat MAPK-inhibitie zorgt voor de osteogenischedifferentiatie en MAPK-activatie noodzakelijk is voor de myogenische activatie. Dit wil meerbepaald zeggen dat het myogenisch vermogen onderdrukt wordt bij de inhibitie van MAPK,maar er wel osteogenische stimulatie is. Bij een blijvende MAPK-inhibitie zorgt dit voor eenopstapeling van beendercellen en een tekort aan spiercellen. Ook brengt dit onderzoek hetgoede nieuws dat de myogenische activiteit herwonnen kan worden na osteogenese, wat vanlevensbelang is voor het vinden van geneesmiddelen tegen kanker.

Het onderzoek naar deze interessante materie is nog volop aan de gang is (de artikels [9]en [10] dateren beide uit 2009) en de onderzoekers hebben een heel specifieke toepassingin gedachten bij dit onderwerp, namelijk het vinden van efficiente geneesmiddelen om eenzware en veel voorkomende ziekte als kanker te genezen. Een samenwerking van verschil-lende onderzoeksgebieden zoals wiskunde, biochemie, farmaceutica,... is hierbij vereist enhet resultaat kan van groot belang zijn binnen de gehele maatschappij.

83

Glossarium

Actieve site: plaats aan het oppervlak van het enzym waarop het substraat bindt en eenchemische reactie ondergaat.

Activeringsenergie: de energie die een systeem nodig heeft om een reactie te starten (zieook paragraaf 1.1).

ADP: adenosinedifosfaat, ontstaat uit ATP door het wegnemen van een fosfaatgroep.

ATP: adenosinetrifosfaat, de belangrijkste energiedragende verbinding in cellen van levendeorganismen.

Bistabiliteit: een systeem met twee stabiele toestanden waarbij een grondige storing vereistis om van de ene evenwichtstoestand naar de andere over te gaan.

Competitieve inhibitie: het fenomeen waarbij een inhibitor en een substraat streven naareen binding op de actieve site van een enzym en elkaar zo tegenwerken.

Covalente binding = atoombinding: een binding tussen atomen waarbij deze atomen eenof meerdere gemeenschappelijke elektronenparen hebben.

Defosforylatie: het biochemisch proces van het verwijderen van een fosfaatgroep van eenenzym of een andere organische molecule (zie ook paragraaf 1.3).

Distributief mechanisme: het modificatieproces waarbij een enzym zijn substraat na eenmodificatie terug loslaat en er dus een nieuwe binding moet optreden vooraleer er een nieuwemodificatie kan uitgevoerd worden (niet-processief).

Enzym: een eiwit dat zich als biologische katalysator gedraagt.

Feedback mechanisme: een ketting van gebeurtenissen waarin een bepaalde stap eenvoorgaande stap controleert of beınvloedt (positief of negatief).

Fosfaatgroep: het negatief geladen ion PO3−4 bestaande uit een fosforatoom en vier zuur-

stofatomen.

Fosfatase: een enzym dat de binding van fosfaatgroepen met organische moleculen verbreekttijdens de defosforylatie.

Fosforylatie: het biochemisch proces van het binden van een enzym of een andere organischemolecule met een fosfaatgroep (zie ook paragraaf 1.3).

84

Hydrolyse: de splitsing van een chemische verbinding die veroorzaakt wordt door de opnamevan water.

Induced fit: een verandering in de samenstelling van het enzym door substraatbinding.

Inhibitor: een molecule die een enzym verhindert te werken op de gewone manier.

Katalysator: een stof die de snelheid van een chemische reactie verhoogt, waarbij dezekatalysator onveranderd uit de chemische reactie gerecupereerd wordt.

Kinase: een enzym dat fosfaatgroepen van ATP kan overdragen op organische moleculentijdens de fosforylatie.

MAPK: mitogen-activated protein kinase (zie ook paragraaf 2.1).

Michaelis-Menten vergelijking: de vergelijking die de wiskundige analyse van de snelhe-den van reacties beschrijft van een substraat S met een enzym E tot een enzym-substraat-complex ES dat reageert tot een product P (E + S ES → E + P ). Standaard wordt danaangenomen dat [S] >> [E] en dat de opbouw en de afbraak van de concentratie van hetintermediair ES in evenwicht is. De Michaelis-Menten vergelijking van deze simpele reac-

tievergelijking ziet er dan uit als volgt: v = vmax[S]

[S] +Km

, waarbij v de snelheid van de

reactie is, vmax de maximale snelheid en Km de MM-constante.

MM: Michaelis-Menten.

Multistabiliteit: een systeem met meer dan twee stabiele toestanden.

Negatieve feedback regulatie: een reactiepad waarbij een product zijn eigen aanmaaktegenwerkt.

Positieve feedback regulatie: een reactiepad waarbij een product zijn eigen aanmaakbevordert.

Processief mechanisme: het enzym blijft gebonden aan zijn substraat zodat er herhalingenvan de katalytische gebeurtenis kunnen optreden totdat het eindproduct gevormd is.

Substraat: een molecule dat in een enzymreactie gebonden wordt met het enzym en omgezetwordt tot een product.

85

Bijlage A

A.1 Appendix A

> restart:

> b:=(-g+sqrt(g^2-4*t*g^2+4*t*g))/(2*t):

> chi:=(b*g+b^2*t+g*K)/(r*b*(b+g+K)):

> A:=diff(chi,g):

> a:=solve(A=0,g):

> m:=allvalues(a):

> g1:=simplify(m[1]);

/ (1 + K) K \1/2

|-----------------|

\4 K t - 1 + t - K/ / /

g1 := 1/2 + ---------------------- + |- |

2 \ \

/ (1 + K) K \1/2 2 2

4 |-----------------| t K - 2 K

\4 K t - 1 + t - K/

/ (1 + K) K \1/2 2 / (1 + K) K \1/2

- |-----------------| K - 2 K - |-----------------| t

\4 K t - 1 + t - K/ \4 K t - 1 + t - K/

/ (1 + K) K \1/2\ / // (1 + K) K \1/2

+ |-----------------| | / ||-----------------|

\4 K t - 1 + t - K/ / / \\4 K t - 1 + t - K/

\\1/2

(4 K t - 1 + t - K)|| /2

//


86

A.1. Appendix A

/ (1 + K) K \1/2

|-----------------|

\4 K t - 1 + t - K/ / /

g2 := 1/2 + ---------------------- - |- |

2 \ \

/ (1 + K) K \1/2 2 2

4 |-----------------| t K - 2 K

\4 K t - 1 + t - K/

/ (1 + K) K \1/2 2 / (1 + K) K \1/2

- |-----------------| K - 2 K - |-----------------| t

\4 K t - 1 + t - K/ \4 K t - 1 + t - K/

/ (1 + K) K \1/2\ / // (1 + K) K \1/2

+ |-----------------| | / ||-----------------|

\4 K t - 1 + t - K/ / / \\4 K t - 1 + t - K/

\\1/2

(4 K t - 1 + t - K)|| /2

//


/ (1 + K) K \1/2

|-----------------|

\4 K t - 1 + t - K/ / /

g3 := 1/2 - ---------------------- + |- |

2 \ \

/ (1 + K) K \1/2 2 2

4 |-----------------| t K + 2 K

\4 K t - 1 + t - K/

/ (1 + K) K \1/2 2 / (1 + K) K \1/2

- |-----------------| K + 2 K - |-----------------| t

\4 K t - 1 + t - K/ \4 K t - 1 + t - K/

/ (1 + K) K \1/2\ / // (1 + K) K \1/2

+ |-----------------| | / ||-----------------|

\4 K t - 1 + t - K/ / / \\4 K t - 1 + t - K/

\\1/2

(4 K t - 1 + t - K)|| /2

//

87

A.1. Appendix A


/ (1 + K) K \1/2

|-----------------|

\4 K t - 1 + t - K/ / /

g4 := 1/2 - ---------------------- - |- |

2 \ \

/ (1 + K) K \1/2 2 2

4 |-----------------| t K + 2 K

\4 K t - 1 + t - K/

/ (1 + K) K \1/2 2 / (1 + K) K \1/2

- |-----------------| K + 2 K - |-----------------| t

\4 K t - 1 + t - K/ \4 K t - 1 + t - K/

/ (1 + K) K \1/2\ / // (1 + K) K \1/2

+ |-----------------| | / ||-----------------|

\4 K t - 1 + t - K/ / / \\4 K t - 1 + t - K/

\\1/2

(4 K t - 1 + t - K)|| /2

//

We hebben dus

γ1 =1

2+B

2+

√−4BΘKS

2−2KS2−BKS2−2KS−BΘ+B

B(4KSΘ−1+Θ−KS)

2,

γ2 =1

2+B

2−

√−4BΘKS

2−2KS2−BKS2−2KS−BΘ+B


2,

γ3 =1

2− B

2+

√−4BΘKS

2+2KS2−BKS2+2KS−BΘ+B


2,

γ4 =1

2− B

2−

√−4BΘKS

2+2KS2−BKS2+2KS−BΘ+B


2,

met

B =

√(1 +KS)KS

(4KSΘ− 1 + Θ−KS).

88

A.2. Appendix B

Na deling van teller en noemer van het quotient onder de wortel van de laatste term door B,bekomen we dan uiteindelijk

γ1 =1

2

(1 +

√(1 +KS)KS

Θ− 1 +KS(4Θ− 1)+ A1

),

γ2 =1

2

(1 +

√(1 +KS)KS

Θ− 1 +KS(4Θ− 1)− A1

),

γ3 =1

2

(1−

√(1 +KS)KS

Θ− 1 +KS(4Θ− 1)+ A2

),

γ4 =1

2

(1−

√(1 +KS)KS

Θ− 1 +KS(4Θ− 1)− A2

),

waarbij we

A1 =

√KS

2(−4Θ + 1) + Θ− 1 + 2√KS

√KS + 1

√Θ− 1 +KS(4Θ− 1)

Θ− 1 +KS(4Θ− 1),

A2 =

√KS

2(−4Θ + 1) + Θ− 1− 2√KS

√KS + 1

√Θ− 1 +KS(4Θ− 1)

Θ− 1 +KS(4Θ− 1)

gesteld hebben.

A.2 Appendix B

> w:=K^2*(-4*t+1)+t-1+2*sqrt(K)*sqrt(K+1)*sqrt(t-1+K*(4*t-1)):

> s:=solve(w=0,t):

> o1:=factor(s[1]);

2

(1 + K)

o1 := ----------

2

(2 K - 1)

> o2:=factor(s[2]);

2

(1 + K)

o2 := ----------

2

(2 K + 1)

89

A.3. Appendix C

A.3 Appendix C

> t:=(K+1)^2/(2*K-1)^2:

> simplify(K^2*(-4*t+1)+t-1);

6 K (K + 1)

- -----------

2 K - 1

> t:=(K+1)^2/(2*K+1)^2:

> simplify(K^2*(-4*t+1)+t-1);

2 K (K + 1)

- -----------

2 K + 1

A.4 Appendix D

> t:=(K+1)^2/(2*K-1)^2:

> simplify((1+K)*K/(t-1+K*(4*t-1)));

2

(2 K - 1)

----------

9

> t:=(K+1)^2/(2*K+1)^2:

> simplify(((1+K)*K)/(t-1+K*(4*t-1)));

2

(2 K + 1)

A.5 Appendix E

> t:=(K+1)^2/(2*K-1)^2:

> assume(K>1/2);

> g:=simplify(1/2+1/2*sqrt((1+K)*K/(t-1+K*(4*t-1))));

K~

g := 1/3 + ----

3

> b:=simplify((-g+sqrt(g^2-4*t*g^2+4*t*g))/(2*t));

90

A.5. Appendix E

(K~ - 2) (2 K~ - 1)

b := - -------------------

3 (K~ + 1)

> a:=simplify(b^2*t/g);

2

(K~ - 2)

a := ----------

3 (K~ + 1)

> chi:=simplify((b*g+b^2*t+g*K)/(r*b*(b+g+K)));

2 2

2 (K~ + 2 K~ + 1) (K~ + 1)

chi := - -----------------------------------------

2

(2 K~ + 10 K~ - 1) (2 K~ - 1) (K~ - 2) r

> assume(K<1/2);

> g:=simplify(1/2-1/2*sqrt((1+K)*K/(t-1+K*(4*t-1))));

K~

g := 1/3 + ----

3

> b:=simplify((-g+sqrt(g^2-4*t*g^2+4*t*g))/(2*t));

(2 K~ + 3 signum(K~ + 1) - 1) (2 K~ - 1)

b := -1/6 ----------------------------------------

K~ + 1

> b:=(1-2*K)/3:

> a:=simplify(b^2*t/g);

K~

a := 1/3 + ----

3


K~ + 1

chi := - ------------

r (2 K~ - 1)

91

A.6. Appendix F

A.6 Appendix F

A.6.1 Oplossingen van de vergelijking∂β

∂γ= 0

> restart:

> assume(t>0);

> b:=(-g+sqrt(g^2-4*t*g^2+4*t*g))/(2*t):

> B:=diff(b,g);

2 g - 8 t~ g + 4 t~

-1 + ----------------------------

2 2 1/2

2 (g - 4 t~ g + 4 t~ g)

B := ---------------------------------

2 t~

> g12:=solve(B=0,g);

1/2 1/2

2 t~ + t~ -2 t~ + t~

g12 := ------------, - -------------

-1 + 4 t~ -1 + 4 t~

A.6.2 Bestaansvoorwaarden nagaan

We stellen eerst g gelijk aan de eerste oplossing:

>

> g:=(2*t+t^(1/2))/(-1+4*t):

We gaan BV 1 na voor g1:

>

> r1:=simplify(g^2-4*t*g^2+4*t*g):

> is(r1>0);

true

Nu we weten dat voldaan is aan BV 1, gaan we ook BV 2 na voor g1:

>

> l1:=simplify(2*g-8*t*g+4*t):

> is(l1>0);

false

We weten nu dat deze term niet overal positief is, maar we moeten nog

92

A.6. Appendix F

controleren of er eventueel gebieden zijn waarin deze term wel positief

is en deze oplossing g1 dus geldig is in een deelgebied:

> is(l1<0);

true

Er is geen deelgebied waar deze oplossing bestaat, want de term is overal

negatief en dus onmogelijk gelijk aan de wortel in het linkerlid.

>

We doen hetzelfde voor de tweede oplossing g2:

> g:=-(-2*t+t^(1/2))/(-1+4*t);

1/2

-2 t~ + t~

g := - -------------

-1 + 4 t~

> r2:=simplify(g^2-4*t*g^2+4*t*g):

> is(r2>0);

true

b is dus overal gedefinieerd als ze beschouwd wordt in deze tweede

oplossing g2.

Nu rest ons nog BV 2:

> l2:=simplify(2*g-8*t*g+4*t):

> is(l2>0);

true

A.6.3 Andere veranderlijken in βmax

> g:=sqrt(t)/(2*sqrt(t)+1):

> b:=simplify(b);

1

b := -----------

1/2

2 t~ + 1

> a=simplify(1-b-g);

93

A.6. Appendix F

1/2

t~

a = -----------

1/2

2 t~ + 1


1/2 1/2

t~ + t~ + 2 t~ K + t~ K

chi := -----------------------------

1/2 1/2

(1 + t~ + 2 t~ K + K) r

A.6.4 Berekende waarde voor β: minimaal of maximaal?

> restart:

> assume(t>0);

> b:=(-g+sqrt(g^2-4*t*g^2+4*t*g))/(2*t):

> B:=diff(b,g):

> C:=diff(B,g):

> g:=sqrt(t)/(2*sqrt(t)+1):

> simplify(C);

2

- -----

1/2

t~

94

Bibliografie

[1] G. Dejaegher, cursus Beginselen van de celbiologie en genetica, hoofdstuk 3: De energe-tische en chemische huishouding van de cel, Universiteit Gent (2007)

[2] S.P. Ellner, J. Guckenheimer, Dynamic Models in Biology (Princeton University Press,2006).

[3] W. Govaerts, cursus Toegepaste Wiskundige Evolutiemodellen, universiteit Gent (2009)

[4] B. N. Kholodenko, Negative feedback and ultrasensitivity can bring about oscillationsin the mitogen-activated protein kinase cascades, FEBS Journal 267 (2000), 1583-1588.

[5] Yu. A. Kuznetsov, Elements of Applied Bifurcation Theory, Applied Mathematical Sci-ences 112, Third Edition (Springer, 2004).

[6] N.I. Markevich, J.B. Hoek, B.N. Kholodenko, Signaling switches and bistability arisingfrom multisite phosphorylation in protein kinase cascades, The Journal of Cell Biology164, 3 (2004), 353-359.

[7] C.K. Mathews, K.E. van Holde, K.G. Ahern, Biochemistry (Third edition) (AddisonWesley Longman, 2000).

[8] F. Ortega, J.L. Garces, F. Mas, B.N. Kholodenko, M. Cascante, Bistability from dou-ble phosphorylation in signal transduction: Kinetic and structural requirements, FEBSJournal 273 (2006), 3915-3926.

[9] E. C. Stites, K. S. Ravichandran, A Systems Perspective of Ras Signaling in Cancer,Clin Cancer Res 15, 5 (2009), 1510-1513.

[10] L. Wang, B. L. Walker, S. Iannaccone, D. Bhatt, P. J. Kennedy, W. T. Tse, Bistableswitches control memory and plasticity in cellular differentiation, PNAS 106, 16 (2009),6638-6643.

[11] http://163.16.28.248/bio/activelearner/06/ch6c1.html

[12] http://jcb.rupress.org/content/164/3/353

[13] http://jjj.biochem.sun.ac.za/database/

[14] http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1742-4658.2006.05394.x/

suppinfo

95

Bibliografie

[15] http://sourceforge.net/projects/matcont/

[16] http://www.blackwell-synergy.com

[17] http://www.ebi.ac.uk

[18] http://www.medicinenet.com

[19] http://www.mun.ca/biology/scarr/Induced-Fit_Model.html

[20] http://www.nature.com/

[21] http://www.scq.ubc.ca/

[22] http://www.wikipedia.org/

96

faculteit wetenschappen vakgroep toegepaste wiskunde en...

Documents