farmakokinetické modelovanie a vývoj liečiv · comfa modely závisia od kvality...
TRANSCRIPT
1
11
Farmakokinetické modelovanie
a vývoj liečiv
V. Frecer
Katedra fyzikálnej chémie liečiv FaF UK
Povinne voliteľný predmet, 4. akademický rok, LS, 2P/1S
2019/2020
Prednáška 1 & 2
2
Zoznam prednášok:
• Prednáška 1,2 - Úvod do farmakokinetiky - pohyb a osud liečiva vorganizme, výskum liečiv. Molekulová štruktúra a farmakokinetické parametre
• Prednáška 3 - Fyzikálnochemické princípy distribúcie látok
• Prednáška 4 - Farmakokinetické modely dispozície liečiva
• Prednáška 5 - Kompartmentové farmakokinetické modely
• Prednáška 6 - Nelineárne farmakokinetické modely
• Prednáška 7 - Perfúzne farmakokinetické modely
• Prednáška 8 - Fyziologické farmakokinetické modely
• Prednáška 9 - Farmakokinetické modely účinku liečiva na receptor
• Prednáška 10 - Metódy predpovedania transportných vlastností látok
Obsah predmetu
1
2
2
3
Literatúra
Odporúčaná literatúra:
• ATKINS, Peter W. – DE PAULA, Julio: Physical Chemistry: Thermodynamics, Structure, and Change, 10th Ed., Oxford University Press, Oxford, UK, 2014.
• BOROUJERDI, Mehdi: Pharmacokinetics and Toxicokinetics, CRC Press, Boca Raton, FL, U.S.A. 2015.
• DOSTÁLEK, Miroslav a kol.: Farmakokinetika, Grada, Praha, ČR, 2006.
• JAMBHEKAR, Sunil S. - BREEN, Philip J.: Basic Pharmacokinetics, 2nd Ed., Pharmaceutical Press, London, UK, 2012.
• KERNS, Edward H. - DI, Li: Drug-like Properties: Concepts, Structure Design and Methods, Elsevier, Burlington, MA, U.S.A., 2008.
• PATRICK, Graham L.: An Introduction to Medicinal Chemistry, 5th Ed., Oxford University Press, Oxford, UK, 2013.
• REMKO, Milan: Molekulové modelovanie. Princípy a aplikácie, Slovak Academic Press, Bratislava, SR, 2000.
• REMKO, Milan: Základy medicínskej a farmaceutickej chémie, Slovak Academic Press, Bratislava, SR, 2005.
• ZATHURECKÝ, Ladislav a kol.: Biofarmácia a farmakokinetika, Osveta, Martin, SR, 1989.
4
Prednáška 1
Úvod do farmakokinetiky:
Pohyb a osud liečiva v organizme
Výskum liečiv
Molekulová štruktúra a farmakokineticképarametre
3
4
3
5
Farmakokinetika
Farmakokinetika – štúdium časového priebehu koncentrácie liečiva a jeho
metabolitov v organizme
Absorpcia Distribúcia Metabolizácia Exkrécia
eliminácia
Podaniep.o.i.m.s.c.
Krv
cirkulácia Pečeň
biotrans-formácia
Vylučo-vanie
močstolica
orgány
tkanivá
receptory
i.v.
absorpcia
6
Farmakokinetické termíny
Základné farmakokinetické pojmy:
◼ Absorpcia - prechod liečiva z miesta podania do krvného obehu;
podiel z dávky, ktorý prenikne črevnou stenou do krvného obehu (v %)
◼ Distribúcia – proces, počas ktorého dochádza k rozptýleniu alebo rozdeleniu
liečiva z krvného obehu do tkanív a orgánov tela
◼ Metabolizmus – chemická premena liečiva v živom organizme na iné zlúčeniny
biochemickými pochodmi enzymatického pôvodu
◼ Exkrécia – eliminácia, klírens - proces, počas ktorého sa ktorého sa organizmus
zbavuje liečiva a jeho metabolitov vylúčením von z tela;
množstvo krvi, ktoré sa zbaví liečiva za jednotku času (v ml/s)
◼ Dávka - množstvo liečiva (v g, ml, ...) podaného na dosiahnutie terapeutického
účinku
◼ Perorálna biologická dostupnosť -
podiel z dávky liečiva, ktorý sa dostane
do systémového krvného obehu
(po I. fáze metabolizácie v pečeni)
◼ Distribučný objem – podiel
dávky a počiatočnej koncentrácie
liečiva v krvnej plazme
5
6
4
7
Pohyb a osud liečiva v organizme
absorpcia
metabolizmus
distribúcia
väzba
exkrécia
liek liečivo
rozpustené
viazaný
metabolit voľný
liečivo viazané
voľné
vylúčený
vylúčené
GITkožasvalypľúca
telesné tekutinya tkanivá
močstolica
žlčdych
sliny, pot
Zathurecký L. a kol.: Biofarmácia a farmakokinetika, 1989.
biologickýúčinok
Farmakodyna-mická fáza
interakcia liečivo-
-receptorv mieste účinku
liečivo dostupné pre
účinnosť
biologická dostupnosť
Farmakokine-tická fáza
absorpcia
distribúcia
metabolizmus
exkrécia
väzba
liečivo dostupné pre
absorpciu
farmaceutická dostupnosť
Farmaceutická fáza
dezintegrácialiekovej formy
rozpúšťanieuvoľnenie aktívnej formy
Extravaskul.podanádávkaliečiva
Interakcia liečiva s organizmom:
8
Prestup liečiv biologickými membránami
Model bunkovej
membrány:
fluidná dvojvrstvafosfolilidov
(fosfatidylcholín)s proteínmi
hrúbka: 75 – 100 nm
membránovékanály - póry
priemer:~4 nm
Bates TR, Gibaldi M. Biopharmaceutics. Lea & Febiger, Philadelphia, USA, 1970.
Prestup liečiv:
▪ pasívna difúzia molekúl cez membránu (lipofilné látky, nedisociované polárne molekuly, logPo,w, pKa), hnacia sila: koncentračný gradient
▪ prestup látky pórmi bunkovej m. (rozpustné elektrolyty a ióny do priemeru póru, závisí od náboja v ústí póru, d < 4 nm, Mw < 200 Da)
▪ transport pomocou špecifických nosičov (aktívny transport proti koncentr. a elektrochem. grad., facilitovaná difúzia v smere konc. a elektrochem. grad.)
▪ pinocytóza (veľké molekuly obalené membránou)
7
8
5
9
Disociácia a prestup liečiv membránami
B[100]
OH- BH+
[1]
Spolu: [101]
B[100]
BH+ OH-
[1]
Spolu: [101]
pH = 7,0
slabá báza pKa =5,0 slabá báza pKa =5,0
B[100]
OH- BH+
[1]
Spolu: [101]
B[100]
BH+ OH-
[10000]
Spolu: [10100]
pH = 7,0 pH = 7,0 pH = 3,0
Disociácia: kys. AH + H2O H3O+ + A- báza B + H2O BH+ + OH-
pKa=-log[H3O+][A-]/[AH] Henderson-Hasselbach: pKa – pH = log[AH]/[A-]
pKa – pH = log[BH+]/[B]
pKa – pH = 5 – 7 = -2 kyselina [A-] = 100 a [AH] = 1
báza [BH+] = 1 a [B] = 100 (pKb = 14 - pKa = 14 – 5 = 9)
pKa – pH = 5 – 3 = 2 kyselina [A-] = 1 a [AH] = 100
báza [BH+] = 100 a [B] = 1
Difúzia: cez membrány len neutrálna nedisociovaná forma, rovnováha v každej fáze
10
Absorpcia liečiv
Absorpcia liečiv z GIT do krvného obehu
▪ absorpcia závisí od štruktúry a fyzikálnochemických vlastností molekúl
▪ Lipinského „Rule of five“ - perorálna biodostupnosť: Mw < 500 Da,
5 HB prot. don., 10 HB prot. akcep., logPo/w 5 (2245 perorál. liečiv z WDI, 1997)
▪ Vlastnosti, ktoré určujú ADME
- molekulová štruktúra (zloženie, topológia, 3D-štr.)
- molekulová hmotnosť Mw,
- polárny a hydrofóbny molekulový povrch Ap An,
- počet vodíkových väzieb HBpd a Hbpa,
- počet rotovateľných väzieb Nrot,
- rozdeľovací koeficient oktanol/voda logPo/v,
- rozpustnosť vo vode logSv,
- hemato/encefalický rozdeľovací koeficient logPBB,
- permeabilita Caco-2 buniek,
- väzba na proteíny v sére logKsp,
- väzba na sérum albumíny logKhsa,
- počet možných metabolických reakcií
Lipinski CR. et al. Adv. Drug Deliv. Rev. 23, 3-25 (1997).
absorbcia molekúl liečiva v tenkom čreve
molekulová štruktúra určuje fyzikálnochemické vlastnosti látok
9
10
6
11
Význam ADME vlastností pre vývoj liečiv
Podiel ADME/Tox vlastností na neúspešnom skončení projektov:
ADME
- nepriaznivý farmakokinetický profil (39 %)
Toxicita
- toxicita na zvieratách (11 %)
- nepriaznivé vedľajšie účinky u ľudí (10 %)
12
Predpovedanie ADME vlastností liečiv
Fyzikálnochemické vlastnosti určujú ADME (W. Jorgensen)
- rozdeľovací koeficient oktanol/voda logPo/v, QikProp
- rozpustnosť vo vode logSv,
- hemato/encelafický rozdeľovací koeficient logPBB,
- väzba na sérum albumíny logKhsa,
Fyzikálnochemické vlastnosti vypočítané pom. molekulovej mechaniky (MM), kvantovej chémie (QM), počítačových simulácií, ... sa korelujú s experimentálnymi veličinami (logPo/v, logSv, ...) pre veľké súbory látok (700 molekúl z toho 500 liečiv)
QikProp, Schrödinger, release 2016-4 , LLC, New York, NY,
U.S.A. 2016.
Duffy EM, Jorgensen WL. J. Am. Chem. Soc. 122, 2878-2888
(2000).
Jorgensen WL, Duffy EM. Bioorg. Med. Chem. Lett. 10, 1155-
1158 (2000).
11
12
7
131313
Výberochorenia
izolácia proteínusúvisiaceho s
ochorením
nájdenie molekulypôsobiacej na
proteín
preklinickétestovanie
syntéza účinnej látky (scale up)
formulácialieku
klinické testovanieschválenie lieku
(FDA, EMEA)
drug in clinical practice
◼ preskúmať moleklárne mechanizmy spojené s ochorením (biochémia,
identifikácia pharmacologického targetu, …)
◼ izolácia proteínu, určenie kryštálovej štruktúry, protein homology
modeling, nájdenie väzbového miesta , …
◼ racionálny dizajn liečiv, kombinatoriálna chémia, virtuálny skríning, QSAR,
identifikácia aktívnej látky (lead compound), …
◼ Vývoj nového lieku: ~15 rokov, náklady: >800 mil. US$
Fázy vývoja liečiva
14
Fázy vývoja liečiva
Bogdan B, Villiger R.: Valuation in Life Sciences, 2nd ed. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg (2007).
Vývoj nového liečiva: ~15 rokov, náklady: >800 mil. US$
13
14
8
15
selektivita
účinnosť toxicita
metabolizmus
absorpcia
exkrécia
distribúcia
potenciálneliečivo
Vlastnosti vyžadované od liečiv
Vývoj liečiv - multidisciplinárny projekt
• genetika
• bunková a molekulárna biológia
• štruktúrna biológia
• biochémia
• počítačový molekulový dizajn
• farmaceutická chémia
• toxikológia
• farmakokinetika
• chemická technológia
• klinická farmakológia
• medicína
16161616161616
Príspevok farmakokinetiky k vývoju liečiv
Identifikácia a validácia miesta pôsobenia
Genetika, Molekulová biológia
Bioinformatika
Určenie 3D štruktúry
Kryštalografická analýza
NMR spektr., Homologické mod.
Farmaceutická chémia
Organická syntéza
Kombinatorická chémia
Chémia peptidov
Biologické testovanie
High throughput skríning
in vitro, in vivo testovanie
Molekulový dizajn
Molekulové modelovanie
Počítačová chémia
Počítačová grafika
Optimalizácia aktívnych mol.
QSAR, Toxikológia, ADME
Klinické testovanie
Farmakológia, farmakokinet.
Nájdenie aktívnych ligandov
Skríning databáz
15
16
9
171717
◼ Simulácie založené na silových poliach (force field)
◼ Kvantovochemické výpočty
◼ QSAR analýza
◼ Modelovanie proteínov na základe homológie
◼ Molekulová diverzita
◼ Dizajn kombinatorických knižníc
◼ In silico skríning
◼ Molekulové kotvenie (docking)
◼ Predpovede väzby ligandu na receptor
◼ Modely farmakofórov
◼ Predpovedanie ADME vlastností
◼ Solvatácia
◼ Analýza dát (data mining)
◼ Bioinformatika
◼ Chemoiformatika
◼ Molekulová grafika
Metódy počítačového vývoja liečiv
18
Kombinatorická (paralelná)
syntéza (rovnaká príprava)
• v tuhej fáze
• v roztoku
103-105 látok/experiment
Tradičná (sériová) syntéza
1 chemik =
~50 látok/rok
A + B AB
BmA1 B1
A2 B2
A3 B3
. .
. .
An(kyseliny)
Bm(amíny) n x m (amidy)
B1 B2
A2
A1
An
HTS
Tradičný a kombinatorický výskum liečiv
17
18
10
191919
Dizajn virtuálnych kombinatorických knižníc
3D štruktúra
proteínu
farmakofór
trieda
proteínov
žiadne
informácie
zacielená rozmanitá
Info
rmácie
o t
arg
ete
Dizajn založený
na štruktúre
Dizajn založený
na farmakofóre
Redukované knižnice
(Targeted Sets)
Prvotné knižnice
(mol. diverzita)
Veľkosť knižnice
Chemický priestor: ~1050 - 1080 látok Arpád Furka, 1981
(čas trvania vesmíru od Veľkého tresku: ~5.1018 s)
2020
Stratégie dizajnu liečiv
2020
Metódy výskumu
a vývoja liečiv
Známa aktívna látka?
Áno Nie
Známa 3D štruktúra receptora
?
Nie
A
Dizajn založený na farmakofóre, QSAR
Zacielené malé knižnice
Náhodné testovanie,
HTS
Veľké rôznorodé knižnice
Áno
B
Dizajn založený na 3D štruktúre
receptora
Zacielené malé knižnice
C
Dizajn založený na molekulových fragmentoch
Knižnice fragmentov
Tradičný dizajn:
individuálne
látky
Kombinatorický
dizajn:
knižnice látok
19
20
11
21
A) Dizajn založený na aktívnych ligandoch
(Ligand-based drug design, LBDD)
• Neznáma 3D štruktúra receptora
• Dizajn založený na známych ligandoch:
- prehľadávanie databáz ligandov (farmakofór)
- kvantitatívne vzťahy štruktúra-aktivita (QSAR)
- 3D-QSAR analýza (CoMFA)
donor
akceptor
záporný náboj
hydrofóbna
Free – Wilson QSAR analýza: biologická aktivita je výsledkom príspevkov od jednotlivých substituentov
3D vrstevnicová mapa v okolí kumarínu a inhibítorov cytochrómu P450 2A5
22
Dizajn založený na farmakofóre
Farmakofór - priestorové usporiadanie súboru funkčných skupín alebo častí molekuly, ktoré sú nositeľom jej biologickej aktivity
Použitie:
- Skríning databáz –
• nová molekulová štrukúra, ktorá zodpovedá
farmakofóru
donor
akceptor
náboj negat.
hydrofóbna
Farmakofór tymidínmonofosfát kinázyM. Tuberculosis
prekryv s navrhovaným inhibítorom
Keita M, et al.: RSC Adv. 4(99), 55853-55866 (2014).
21
22
12
23
Kvantitatívne vzťahy štruktúra - aktivita, QSAR
• QSAR: chemické, fyzikálne, biologické vlastnosti (aktivita) – zakódované v chemickej štruktúre
- podobné molekuly ~ podobné vlastnosti, odlišné molekuly ~ odlišné vlast.
- model aktivity
biologický účinok = f(molekulovej štruktúry)
* mechanizmus účinku
* predpovedanie aktivít analógov
Molekulová vlast. Deskriptor
Lipofilita p, logPo/w, Rt
Stérické vlastnosti Mw, Vm, tieňový ind., 3D des.
Elektronické vlast. q, sd, EHOMO, ELUMO, E.A.
Štruktúra, topológia HB, W, logZ, ,
Biologický efekt Deskriptor
Väzba na receptor štruktúrne, elektronické, topol.
Perorálna biodostupnosť lipofilita, štruktúrne, stérické d.
Metabolická aktivácia štruktúrne, elektronické d.
24
Metódy QSAR:
- L.P. Hammett, R.W. Taft disociačné konštanty aromatických kyselín
pK = pKo - .s
- S.M. Free, J.W. Wilson biol. aktivita: suma príspevkov substituentov
log(1/C) = a.(prísp.R1)+b.(prísp.R2)+...
- C. Hansch, A. Leo biol. aktivita: lipofilita, stérické a elektronické p.
log(1/C) = a.π2 + b.π + c.Es +d.s + e
Kvantitatívne vzťahy štruktúra - aktivita, QSAR
iteratívny postup výberu
deskriptorova QSAR modelu
Metódy:genetické algoritmy
neurónové sietestrojové učenie
(machine learning)a pod.
23
24
13
25
3D kvantitatívne vzťahy štruktúra-aktivita(3D-QSAR)
QSAR modely:
- 2D-QSAR modely – deskriptory odvodené z molekulovej štruktúry
- 3D-QSAR modely (CoMFA, CoMSIA, CoMMA,...) deskriptory z hodnôtmolekulových polí (MEP, hydrofóbne interakcie, ...) v okolí molekuly
CoMFA modely závisia od kvality preloženia/prekrytia (alignment) molekúl:
prekrytie podľa farmakofóruprekrytie podľa atómov
prekrytie podľa tvaru molekuly prekrytie podľa molekulových polí
26
B) Dizajn založený na štruktúre receptora
(Structure-based drug design, SBDD)
Trojrozmerná štruktúra farmakologického cieľa (miesta pôsobenia):
• röntgenová štruktúrna analýza kryštálov proteínov (Protein Data Bank, ~149 tis. 3D štr. makromolekúl, feb. 2019)
• NMR štruktúra proteínov v roztoku
• homology modelling
Výber ligandov:
• in situ modifikácie známych ligandov
• molekulové kotvenie nových molekúl(docking, in silico skríning)
IAV N1 neuraminidáza–oseltamivir (2HU0) hemagglutinin IAV H18N11 (4MC5)
25
26
14
27
Dizajn založený na štruktúre receptora - SBDD
Interakcie ligandu vo väzbovom mieste receptora a dizajn ligandu:
• komplementarita L a R (stérická, molekulových polí)
• desolvatácia L a R
• entropické efekty
A B
C D
www.kubinyi.de
väzbovémiesto
receptora
ligand 1
Odhad väzbovej afinity ligandu na receptor:
výpočet Gibbsovejvoľnej energie tvorby komplexu LR
DGo = -RTlnKi
molekulovépolia
ligand 2
tvar väzbového miesta štruktúra väzbového miesta
komplementarita ligandu a väzbového miesta
28
Dizajn založený na štruktúre receptora - SBDD
Faktory, ktoré prispievajú k rozpoznaniu a väzbe ligandu:
π-π interakcie
hydrofóbnekontakty
explicitnémolekuly vody
vodíkové väzby(smerové interakcie)
stérické interakcie
flexibilita ligandua receptora
desolvatácia ligandua receptora
peptidomimetickýinhibítor plasmepsinu II
27
28
15
292929
Modelovanie homologických proteínov
Počet dostupných 3D štruktúr makromolekúl (proteínov, nukleových kyselín, komplexov,...) je limitovaný
• PDB (160,000 X-ray a NMR štruktúr na úrovni atómového rozlíšenia), 148,000 proteínov, len 30000 sekvencií s <30% identitou
• podobná a.a. sekvencia → podobná 3D štruktúra (celkový tvar overall fold) → podobná funkcia proteínu
• štruktúra proteínov je yachvávaná viac ako sekvencie medzi homologickými proteínmi (do 30% identity sekvencií)
• modelovanie proteínov na základe homológies so známym (target) proteínom
- výber templete proteínu (nájdenie evolučných súvislostí)
- prekrytie target-templates sekvencií (alignment)(BLAST, FASTA, PFAM, protein threading RaptorX,…)
- prekrytie target-templates štruktúr a skonštruovanie modelu(generovanie kostry proteínu, modelovanie slučiek (loops), priradenie konformérov bočným reťazcom a..a., vzpresnenie) (Modeller, Jackal, SCRWL, SwissModel, …
- hodnotenie modelu (What If, ProCheck, PSQS, Ramachandran plot,…)
303030
Sali A, Kuriyan J.: Trends Biochem. Sci. 22, M20–M24 (1999)
Kvalita homologických modelov závisí najmä na:
- výber template proteínov
- prekrytie a sekvencií a ichpodobnosť k template proteínom
- rozlíšenie kryštálovej štruktúrytemplate proteínu
- metóda modelovania a vypresnenia modelovej štruktúry
Modelovanie homologických proteínov
29
30
16
31
Väzbová afinita ligandu na receptor
Modely väzby ligand-receptor:
- Teória zámku a kľúča (Lock and key)- Teória indukovaného prispôsobenia (Induced fit theory)
ligand (L) + receptor (R) → ligand-receptor (LR) komplex
+
Farmakodynamický efekt ligandu:
kas kf kdis [LR] [L]L + R LR LR* Kd = —— Rel. odozva = —— = ————
kdis k-f kas [Ro] [L] + Kd
väzbová afinita farmakol. disociačná účinok závislý na dávke Lefekt konštanta
[L] – konc. voľného ligandu
Väzbová afinita L: lnKd = DGo/RT vlastnosť komplexu LR
32
Predpovedanie väzbovej afinity ligandov
Molekulové modelovanie – výpočet väzbovej afinity – modelovanie LRaq
pKd = -log10Kd = aDGcom,aq/2,303RT + b
Termodynamický cyklus:
DGcom,g
Lg + Rg LRg plynná fáza
Gsol(L) Gsol(R) Gsol(LR)
DGcom,aq
Laq + Raq LRaq vodný roztok
Gibbsova voľná energia tvorby LRaq:
DGcom,aq = [Gg(LR) - Gg (L) - Gg (R)] + [Gsol(LR) - Gsol(L) - Gsol(R)]
kde:Gg = Etot + termálne korekcie vnútornej energie a entropie
31
32
17
33
Výpočet interakcií ligand-receptor
• Energie molekúl a medzimolekulové interakcie:
- kvantovochemické met. (QM)
- molekulovo mechanické met. (MM, force fields)
- hybridné QM/MM metódy
- hodnotiace funkcie (scoring functions)
• Molekulové simulácie, štatistický spriemernené veličiny:
- MC simulácie, MD simulácie
- konformačné prehľadávanie
• Solvatácia:
- explicitné modely (diskrétne molekuly rozpúšťadla)
- implicitné mod. (GBSA - Still et al., PB - Honig et al., PCM - Miertuš et al.)
• Modely odhadu DGcom,aq využívané vo výskume liečiv:
- MM-PBSA/GBSA (Kollman et al.)
- LIE (Åqvist et al.)
- MM-PCM (Frecer, Miertuš)
- …
34
Metódy počítačovej chémie
Kvantovochemické metódy (ab initio, semiempirické, DFT)
Schrödingerova rovnica
ĤΨ(r1,…,rn,R1,…,RN) = EΨ(r1,…,rn,R1,…,RN)
Ĥ – Hamiltonov operátor celkovej e., Ψ – vlnová funkcia (pozorovateľné fyzikálne
veličiny), E – energia molekuly, ri, Ri – polohové vektory elektrónov a jadier
I. R. Levine
hyperplocha E(r,R)
Science 2007;315:1561-1565.
propanal
33
34
18
3535
Metódy počítačovej chémie
Molekulová mechanika - potenciálna energia molekuly
U(x1,…,x3N) = ½∑vkv(l-lo)2 + ½∑uku(θ-θo)
2 +
+ ½∑tVnt[1+cos(nω-γ)] +
+ ½∑i∑j(qiqj/εrij) +
+ ½∑i∑j[Aij/rij12-Bij/rij
6] +
Konštanty silového poľa (force field): parametrizácia (experiment, ab initio výpočty)
+ ½∑i∑j[Cij/rij12-Dij/rij
1 0]
Molecules 2014;19(10):15735
väzbová
neväzbová
elektrostatická
disperzno-repulzná
36
Metódy počítačovej chémie
Hybridné kvantomechanické/molekulovo mechanické metódy (QM/MM):
• Väzbové miesto – QM región
Schrödingerova rovnica: ĤΨ = EΨ
• Telo proteínu – MM región
molekulová mechanika: E = väzbové + neväzbové členy
• Solvent – MM región
- explicitná hydratácia (MM)
- implicitná hydratácia – klasické modely (Born, Jano, PCM, PB, GBSA, ....)
• Prepojenie QM a MM častí proteínu (dummy atómy, atomóvé frozen orbitály, ...)
Nobelova cena za chémiu 2013: QM/MM metódyM. Karplus, A. Warshel, M. Levitt
35
36
19
37
Model implicitnej solvatácie(Polarizable Continuum Model, PCM)
MEP na molekulovom povrchu imidazolu
Solvent – spojité homogénne polarizovateľné médium (dielektrická konštanta)
Reakčné pole – elst. interakcia s molekulou v kavite
Kvantovochemický model a:
Gsol,els = <Ψ|Ĥo+VRF|Ψ> - <Ψo|Ĥo|Ψo> - ½ <Ψ|VRF|Ψ>
Klasický model b:
Gsol,els = ½ j (qj VRF,j – mj ●ERF,j)
a Miertus S., Scrocco E., Tomasi J. Chem. Phys. 55(1), 117-129 (1981).
Miertus S., Tomasi J. Chem. Phys. 65(2), 239-245 (1982).
b Frecer V., Miertus S. Int. J. Quant. Chem. 42(5), 1449-1469 (1991).
Miertus S., Frecer V. J. Math. Chem. 10(1), 183-204 (1992).
vdW kavita - aminopropanón
38
Molekulové simulácie
• Experimentálne biologické aktivity:
Ki, IC50 - termodynamické veličiny merané pre veľké súbory molekúl
(V = 1μL, c = 1 μM 6·1011 molekúl enzýmu pri [T, p])
(makroskopické veličiny spriemernené cez najpravdepodobnejšie konfigurácie štatistického súboru v termálnej rovnováhe)
• Predpovedanie Ki, IC50 pomocou výpočtov väzbovej afinity (lnKi = -DG°bin/RT):
spriemernenie DG°bin cez štatistický súbor rôznych konfigurácií: DG°bin
• Výpočet termodynamických veličín - molekulové simulácie:
- Monte Carlo simulácie
- molekulová dynamika
dihydrofolátreduktázav periodickom boxe s vodou
37
38
20
39
Monte Carlo simulácie
• MC simulácie:
- prehliadanie konfiguračného priestoru (sampling) pomocou generovania stavov Ai (náhodnými zmenami vnútorných súradníc)
- výpočet spriemernených fyz. chem. veličín: A = 1/n·∑i
nAi
- konfigurácia Ai+1 sa generuje z konfigurácie Ai (Markov chain)
- konfigurácia Ai+1 sa prijme do štatistického súboru ak: Ei+1 < Ei
ak : Ei+1 > Ei generátor náhodných čísel (0<R<1)
Boltzmannova pravdepodobnosť stavu Ai+1 (Metropolis importance sampling)
• R > exp[-(Ei+1-Ei)/kT] Ai+1 sa prijme
• R < exp[-(Ei+1-Ei)/kT] Ai+1 sa odmietne
Tapia L, et al.: Bioinformatics 23(13), i539-i548 (2007).
Evolúcia populáciíkonformácií pri
zbalení proteínu (protein folding)
Monte Carlo simulácia
40
Molekulová dynamika
• Molekulová dynamika:
- metóda štatistickej mechaniky: simulácia vývoja zložitých systémov, výpočet časovo spriemernených fyzikálnochemických veličín
- generovanie MD trajektórií (konfigurácií systému) - numerická integrácia Newtonových pohybových rovníc (dt = 1 fs) v konštantne sa meniacom potenciáli (silovom poli):
fxi = miaxi = mi(d2xi/dt2) = -∂U(x1,…,x3N)/∂xi
axi(t) = fxi/mi vxi(t+dt) = vxi(t) + axi(t)·dt
xi(t+dt) = xi(t) + vi(t)·dt + ½ ai(t)·dt2
U(x1,…,x3N) – potenciálna energia (FF)
xi = xi(t), vi = vi(t) i= 1, ..., 3N
trajektória
van Eijk M, et al.: J. Biol. Chem. 287, 26666-26677 (2012).
časový priebeh RMSD slučky prasacieho a ľudského
surfactant protein D (collectin)
39
40
21
41
Molekulová dynamika
• Aplikácie molekulovej dynamiky:
- výpočet termodynamických veličín systému - stredné hodnoty štat. súb.
Ā = 1/n·∑i
nAi
- kinetické veličiny
- konformačné prechody
- vypresnenie štruktúry systému
- sledovanie dynamického chovania makromolekúl: termálne fluktuácie
Programy: CHARMM, AMBER, GROMOS, NAMD, GROMACS, MacroModel, Tinker, ...
Snímky proteínu v rôznych časových okamihoch MD simulácie
Dôsledkom termálnych fluktuácií je, že proteíny „dýchajú“,
čo môže viesť aj k prechodom medzi rôznymi konformáciami
42
Molekulové kotvenie (Docking)
• Virtuálny (in silico) skríning knižnice látok:
- 3D štruktúra makromolekulového receptora
- väzbové miesto ligandu
- kotvenie: generovanie póz (poloha a konformácia ligandu vo väzbovom mieste receptora)
- hodnotiace funkcie (scoring functions)
- hodnotenie (bodovanie) póz
- selekcia perspektívnych ligandovpre syntézu a testovanie
Plasmodium falciparum enoyl-acyl carrier protein reductase
Aktívne centrumPfENR
Prekrytie generovaných póz vybraných analógov triclosanu
Frecer V., Megnassan E., Miertus S. Eur. J. Med. Chem. 44(7), 3009-3019 (2009).
41
42
22
43
Molekulové kotvenie (Docking)
• Hodnotiace funkcie (scoring functions) :
- založené na potenciálových funkciách (AMBER, CHARMM, MMFF, OPLS, ..)fyzikálne „správne“, vhodné pre organické molekuly,
- empirické založené na početnosti výskytu určitého druhu interakcií
- knowledge-based analýza kryštálových štruktúr komplexov LR,preferujú najčastejšie interakcie a geometrie
• Známe hodnotiace funkcie:
AutoDock, LigScore, ChemScore, GlideScore, PLP, PMF, LUDI, FlexXMMFF(tot, vdW), OPLS(tot, vdW), HINT, ICM, Validate, DrugScore, ...
• Kotvenie do rigidného a flexibilného receptora
Kitchen, D. B., et al.: Nat. Rev. Drug Discov. 3, 935-949 (2004).
Moitessier, N. et al.: Brit. J. Pharmacol. 153, 7-26 (2008).
44
C) Dizajn založený na molekulových fragmentoch
(Fragment-based drug design, FBDD)
• Ligand sa konštruuje z „fragmentov“ vo väzbovom mieste receptora
- fragment - malá molekula (<300 Da), slabšia väzba v kapse aktívneho centra, pospájanie linkermi do väčšej molekuly (500-700 Da)
- zachovanie pozícií fragmentov v molekule
Hajduk PJ, et al.: J. Am. Chem. Soc. 119(25), 5818-5827 (1997).
Ki = 17 mM Ki = 20 μM
Ki = 15 nM
SAR by NMRvývoj nepetidických
inhibítorov metaloproteinázy
stromelysin
fragment 1 fragment 2
linker
www.kubinyi.de
43
44
23
45
Dizajn založený na molekulových fragmentoch
Hunk A, et al.: Angew. Chemie Int. Ed. 48(45), 8452-8456 (2009).
inhibítor panthotenát syntázy M. tuberculosis
vyvinutý pomocou FBDD
• FBDD sa skladá z 3 krokov:
- dizajn kvalitnej knižnice fragmentov
- molekulové kotvenie, hodnotenie a zoradenie fragmentov
- nárast, kombinácia a spájanie fragmentov do výsledného ligandu
• Softvér pre FBDD:
- GRID, MCSS, SPROUT, MUSIC, LUDI, SkelGen, Superstar, SEED, FFLD, GANDI, eHiTS, Caveat, HOOK, Recore, Allegrow, Confirm, MED-SuMo, LEGEND, GROWMOL, LigBuilder, SMoG, HOOK, PRO_LIGAND, SPLICE/RACHEL, CLIX, LORE, GEMINI, ...
46
Príklady dizajnu bioaktívnych látok s využitím molekulového modelovania
45
46
24
47
Kubinyi H., In: Computer Applications in Pharmaceutical Research and Development, Ekins S. (Ed.), John Wiley & Sons, Inc., (2006).
Liečivá vyvinuté pomocou metód molekulového modelovania:
▪ Dorzolamide (Trusopt – Merck, 1995)Inhibítor karbonickej anhydrázyterapia glaukómu, očné kvapky
▪ Imatinib (STI-571, Gleevec, Glivec – Novartis, 2001)
Inhibítor tyrozín kinázy, terapia nádorových ochorení (chronická myelogénna leukémia)
▪ Nelfinavir (AG1343, Viracept - Aguron Pharm., Pfizer, 1997)
Inhibítor aspartickej proteázy HIV-1 vírusuterapia HIV-1 infekcie a AIDS
Príklady úspešného molekulového dizajnu liečiv
48
Prípadové štúdie – počítačový dizajn liečiv
47
48
25
49
Príklad 1. Dizajn inhibítorov proteázy HIV-1 vírusu
Dizajn peptidomimetických inhibítorov aspartickej proteázy HIV-1 (HIV PR)
kryštálová štruktúra HIV PR s inhibítorom XV-638 (1BV9)
HIV PR esenciálny enzýmnevyhnutný pre dozrievanie vírusov
Vybrané inhibítory HIV-PRschválené FDA
HIV-1 vírus
50
Získaná rezistencia HIV-1 vírusov
mutácie, ktoré spôsobujú získanú rezistenciu HIVvírusov na inhibítory PR
Virálna rezistencia na liečivá vzniká pod selekčným tlakom:
- známe mutácie PR
R8K, R8Q, V32I, K45I, M46I/M46L/M46F, I47V, G48V, F53L, A71V, V82A/V82I/V82T, I84V, L89M a kombinácie
Potreba vyvíjať nové inhibítory, ktoré pôsobia na širšie spektrum mutantov HIV PR
49
50
26
51
SBDD: Peptidomimetické inhibítory
- SBDD inhibítorov, kryštálová štruktúra komplexu PR-I z PDB
- Vypresnenie štruktúry komplexov: MM, MD
- MM a PCM: predpovedanie väzbovej afinity (DGcom)
- QSAR model pre tréningový set: pIC50 = -logIC50 = a.DGcom + b
- Derivatizácia in situ najlepších inhibítorov z trening. setu
- Počítačová predikcia ADME vlastností analógov
- Selekcia najlepších analógov pre syntézu
-5
-3
-1
1
-2 8 18 28
pIC
50
ex
p
DDGcom
Training Set: correlation equation
pIC50 = -0.1577·ΔΔGcom + 0.1536n = 10, r2 = 0,86, σ = 0,59, F-test = 44,6
Tréningový set inhibítorov
Frecer V, Berti F, Benedetti F, Miertus S. J. Mol. Graphics Modell. 27(3), 376-378 (2008).
Inhibítor FP23 v aktívnom centre HIV PR
Peptidomimetické inhibítory HIV PR
Tri série C2-symetrických HIV PR inhibítorov:
- obsahujú nerozštiepiteľné izostéry peptidickej väzby
(pripravené v spolupráci s Univerzitou v Terste, Taliansko)
dihydroxyetyléndiamínové jadro--Phe-Ψ[CHOH-CHOH]-Phe--
hydroxyetyléndiamínové jadro--Phe-Ψ[CH2-CHOH]-Phe--
dihydroxyetyléndiamínové jadro--Phe-Ψ[CHOH-CHOH]-Pro--
Lopinavir, Abbott Laboratories
51
52
27
53
Peptidomimetické inhibítory HIV PR
dihydroxyetylénediamínové jadro --Phe-Ψ[CHOH-CHOH]-Phe--
12 štruktúr navrhnutých
Frecer V, Miertus S, Tossi A, Romeo D. Drug Des. Disc. 15(4), 211-231 (1998).
Burello E, Bologa C, Frecer V, Miertus S. Mol. Phys. 100(19) 3187-3198 (2002).
5454
hydroxyetylénediamínové jadro --Phe-Ψ[CH2-CHOH]-Phe--
32 štruktúr navrhnutých
Frecer V. Miertus S. Macromol. Chem. Phys. 203(10-11), 1650-1657 (2002).
Frecer V, Jedinak A, Tossi A, Berti F, Benedetti F, Romeo D, Miertus S. Lett. Drug Des. Disc. 2(8), 638-646 (2005).
T17 v aktívnom centre HIV PR
Peptidomimetické inhibítory HIV PR
53
54
28
555555
Dihydroxyetylénediamínové jadro --Phe-Ψ[CHOH-CHOH]-Pro--
79 štruktúr navrhnutých
Frecer V, Berti F, Benedetti F, Miertus S. J. Mol. Graphics Modell. 27(3), 376-378 (2008).
FP23 najlepší navrhnutý kandidát
FP23 v katalytickom centre HIV PR
priaznivé ADME vlastnosti
Peptidomimetické inhibítory HIV PR
56
Experimentálne overenie predpovedaných inhibičných účinností anti-HIV
peptidomimetík: skupina F. Benedetti a F. Berti, Univerzita v Terste
Potvrdené inhibičné konštanty v oblasti nízkych nanomolárnych koncentrácií
Syntéza a testovanie inhibítorov HIV PR
Frecer V, Jedinák A, Tossi A, Berti F, Benedetti F, Romeo D, Miertus S. Lett. Drug Des. Disc. 2(8), 638-646 (2005).
Berti F, Frecer V, Miertus S.: Curr. Pharm. Des. 20(3), 3398-3411 (2014).
55
56
29
5757
zvýšenýdrug-likecharakter
Syntéza a testovanie inhibítorov HIV PR
Experimentálne overenie predpovedaných inhibičných účinností anti-HIV
peptidomimetík: skupina F. Benedetti a F. Berti, Univerzita v Terste
Potvrdené inhibičné konštanty v oblasti nízkych nanomolárnych koncentrácií
Frecer V, Berti F, Benedetti F, Miertus S. J. Mol. Graphics Modell. 27(3), 376-378 (2008).
Berti F, Frecer V, Miertus S.: Curr. Pharm. Des. 20(3), 3398-3411 (2014).
5858
Plasmodium falciparum – virulentná forma malárie v krajinách tretieho sveta
Rezistentné formy P. falciparum – potrebné nové “dostupné” liečivá zacielené proti novým farmakologickým targetom
Target - enzýmy FAS-II biochemickej syntézy mastných kyselín
enoyl-acyl carrier protein reduktáza esenciálny enzým FAS-II pathway (PfENR)
kryštálová štruktúra PfENR s peptidomimetickým inhibítorom TCL11
Freundlich JS, et al. J. Biol. Chem. 282(35), 25436-25444 (2007).
séria PfENR inhibítorov odvodených od triclosanu, aktívne v nanomolárnych koncentráciách
Príklad 2. Kombinatorický dizajn inhibítorov
Anopheles gambiae
57
58
30
5959
- predpoveď väzbovej afinity: kotvenie inhibítorov do kryštálovej štruktúry PfENR-TCL11 (IC50 =76 nM)
- QSAR model pre tréningový set: pIC50 = -logIC50 = a.LUDI + btarget specific scoring function LUDI (prispôsobená pre PfENR)
- predpoveď ADME vlastností
- QSAR model aplikovaný na in silico skríning kombinatorickej knižniceanalógov
inhibítory PfENR tréningového setu
pIC50 = -6.3473 + 0.0069·LUDI
n = 16, R2 = 0.83, F-test = 65.7
Enoyl-acyl carrier protein reduktáza - P. falciparum
aktívne centrum PfENR
V. Frecer, E. Megnassan, S. Miertus, Eur. J. Med. Chem. 44(7), 3009-3019 (2009).
6060
Kombinatorická knižnica inhibítorov
60
Peptidomimetický skafold, 3 R-groups
počiatočná diversity library
40 (R1) x 23 (R2) x 11 (R3) =
= knižnica10120 analógov
zacielená knižnica
8 (R1) x 5 (R2) x 3 (R3) =
= knižnica120 analógov
R-groups zacielenej (výslednej) knižnice
Kombinatorická knižnica - 3 substitučné miesta R1, R2, R3
8 R1 5 R2 3 R3
59
60
31
61
Navrhnuté inhibítory PfENR
Vybrané štruktúry najlepších kandidátov na inhibítory PfENR
Frecer V, Megnassan E, Miertus S. Eur. J. Med. Chem. 44(7), 3009-3019 (2009).
TCL-40-9-11 preložená s TCL11
Predpovedaná IC50 = 13 nM
62
Ďakujem za pozornosť
61
62
32
63
Spolupracovníci:ICS-UNIDO, UCM University of TriesteS. Miertuš D. Romeo
F. BenedettiInternational Fellows F. BertiE. Burello (Italy) A. TossiS. DeNardi (Italy) S. PriclC. Bologa (USA) A. Jedinák (Slovakia) National University of SingaporeA. Nair (India) J.L. DingE. Megnassan (Ivory Coast) B. HoM. Keita (Ivory Coast) D.H.P. LowM. Kabeláč (Czech Rep.) D. Cerin (Slovenia) University of MilanR. Kothamarti (India) P. SeneciL. Owono (Cameroon) T. Udommaneethanakit (Thailand) Xeptagen, VeniceT. Rungrotmongkol (Thailand) G. FassinaM. Malaisree (Thailand) P. PengoD. Kong (China) L. Beneduce
63