ACARA IV

PENGUJIAN AKTIVITAS ENZIM DENGAN FLUORESCEIN DIACETAT (FDA)

HYDROLYSIS ASSAY

Abstraksi

Enzim merupakan biomolekul yang dapat mempercepat (katalis) reaksi kimia yang disebut reaksi enzimatis dimana substrat akan diubah menjadi molekul lain yang disebut produk. Hampir seluruh proses metabolisme makhluk hidup membutuhkan enzim untuk mempercepat reaksi sehingga dapat mempertahankan kehidupan. Pengujian aktivitas enzim suatu mikroorganisme air dilakukan dengan FDA hydrolysis assay dimana digunakan substrat fluorescein diacetat. Hasil pengujian didapatkan untuk sampel air selokan, air sawah dan air laut menghasilkan fluorescein sebesar -0.0067 µg/mL, -0.00657 µg/mL dan -0.0068 µg/mL sehingga dapat disimpulkan tidak terdapat fluorescein yang dihasilkan dan seluruh sampel air tidak memiliki mikroorganisme yang memiliki enzim untuk memotong FDA.

Kata kunci: Enzim, aktivitas enzim, FDA assay.

I. Pendahuluan

a. Latar Belakang

Metabolisme merupakan suatau reaksi kimia yang terjadi didalam tubuh makhluk

hidup. Reaksi metabolisme yang terjadi dilakukan untuk memperoleh energi, menyimpan

energi, memproduksi atau memecah suatu zat dan memasukkan atau mengeluarkan zat – zat.

Tentunya dalam suatu reaksi kimia terdapat suatu energi untuk memulai hingga mengakhiri

proses tersebut terjadi. Pada makhluk hidup hidup dikenal adanya suatu biomolekul yang

dapat melakukan kinerja katalisator yang disebut enzim.

Keberadaan enzim membantu makhluk hidup dalam menjalankan kehidupannya.

Adanya proses evolusi menjadikan enzim memiliki kemampuan yang optimal untuk setiap

organisme tertentu. Pada umumnya enzim tersusun atas protein dan molekul lainnya

(anorganik maupun organik). Kinerja enzim banyak dipengaruhi berbagai macam faktor.

Faktor tersebut dapat membantu kinerja enzim atau dapat menurunkan aktivitas enzim hingga

menghilangkan aktivitas enzim.

Kondisi lingkungan yang berbeda mempengaruhi enzim yang dihasilkan serta

kemampuan yang dimiliki enzim tersebut. Hal tersebut pada dasarnya sebagai kemampuan

bertahan diri dari suatu kondisi lingkungan. Seperti pada mikroorganisme pada kondisi

ekstremofil yang dapat menghasilkan enzim yang dapat tahan pada kondisi yang ekstrem

contohnya enzim DNA polimerase. Kemampuan enzim tersebut dimanfaatkan untuk

digunakan dalam proses PCR dimana proses tersebut menggunakan suhu tinggi contoh enzim

tersebut seperti Taq polymerase, Pfu polymerase dan lain-lain (Chandrasekaran and Kumar,

2011).

b. Tujuan

1. Mengetahui metode perhitungan aktivitas enzimatik

2. Mengetahui aktivitas enzimatik mikroorganisme pada air laut, air selokan dan air sawah.

II. Tinjauan Pustaka

Enzim merupakan molekul yang dapat mempercepat (katalis) reaksi kimia. Reaksi

yang terjadi disebut reaksi enzimatis dimana substrat akan diubah menjadi molekul lain yang

disebut produk. Hampir seluruh proses metabolik membutuhkan enzim untuk mempercepat

reaksi sehingga dapat mempertahankan kehidupan. Seperti yang telah diketahui

mikroorganisme memiliki kemampuan dalam memproduksi berbagai macam enzim. Enzim

yang dihasilkan dapat berupa eksoenzim maupun endoenzim, eksoenzim merupakan enzim

yang dapat dibawa keluar sel atau berfungsi diluar sel sedangkan endoenzim berfungsi

didalam sel. Adanya eksoenzim memungkinkan mikroorganisme untuk merombak terlebih

dahulu suatu substrat sebelum diserap melalui membran sel yang selanjutnya digunakan

dalam proses metabolisme (Black, 1999). Enzim diketahui dapat mengkatalis lebih dari

5.300 tipe reaksi biokimia. Enzim kebanyakan berupa protein akan tetapi beberapa enzim

berupa RNA molekul. Seperti sifat katalis, enzim dapat meningkatkan reaksi dengan

mengurangi energi aktifasi. Enzim pada organisme multiselular (mamalia atau tanaman)

memiliki sifat yang spesifik dengan keberadaan pada bagian tubuh tertentu, organ atau

jaringan tertentu (Schomburg et.al., 2013).

Enzim adalah biomolekul yang tersusun atas protein dam ko-faktor. Pada umumnya

enzim berbentuk bulat seperti protein lainnya enzim juga tersusun atas rantai asam amino

linear yang kemudian melipat dan membentuk struktur tiga dimensi. Susunan asam animo

mempengaruhi struktur dan aktivitas enzim tersebut dalam melakukan proses katalisasi

(Anfinsen, 1973). Struktur enzim dapat terdenaturasi ketika terkena panas dan zat kimia

pendenaturasi (asam kuat atau basa kuat). Enzim yang telah terdenaturasi akan hilang

kemampuannya (Petsko and Ringe, 2003).

Kemampuan enzim terletak pada bagian pada sisi aktifnya yaitu berupa bagian

pengikatan dimana enzim hanya dapat mengikat substrat tertentu saja dan bagian katalisasi

yang akan melakukan suatu reaksi kimia. Pada bagian tersebut hanya terdiri dari struktur

yang kecil berkisar 2-4 asam amino. Asam amino lainnya berfungsi dalam menjaga bentuk

sisi aktif. Asam amino pada umumnya tidak berperan secara langsung terhadap proses

katalisasi akan tetapi kofaktor yang berperan (Suzuki, 2015).

Enzim harus mengikat substrat terlebih dahulu sebelum melakukan katalisasi. Substrat

yang terikat hanya substrat tertentu saja. Hal tersebut disebabkan enzim memiliki sifat lock

and key dimana sisi pelekatan memiliki bentuk yang spesifik dan hanya substrat sesuai

dengan sisi pelekatan yang dapat melekat. Akan tetapi teori tersebut telah disempurnakan

dengan induced fit model (Daniel Koshland, 1958) dimana sisi aktif suatu enzim bersifat agak

lentur/ fleksibel. Sehingga saat substrat ingin melekat pada sisi aktif, sisi tersebut akan

mengalami perubahan hingga sesuai dengan substrat tersebut (Vasella et.al., 2002).

Proses evolusi yang menjadikan optimalisasi enzim untuk selektif dan effesien dalam

katalisasi reaksi biokimia. Data terbaru menunjukan adanya peningkatan enzim dalam

melakukan siklus kataliknya dengan penikatan substrat, transformasi kimia dan produk yang

dihasilkan. Pada umumnya kemampuan katalisasi enzim terjadi dengan kemampuan enzim

dalam menstabilisasi keadaan transisi , mengurangi pembatas reaktan sehingga dicapainya

bagian produktif. Enzim dalam melakukan kinerjanya memerlukan waktu terlama untuk

membantu reaktan hingga bagian transisinya. Sehingga enzim akan mengoptimalkan dalam

proses pelekatan substrat,reaksi kimia dan menghasilkan produk (Ma and Nussinov, 2010).

III. Metodologi

Praktikum mikrobiologi air acara IV berjudul “Pengujian Aktivitas Enzim dengan

Fluorescein diacetat assay (FDA) Hydrolysis Assay” dilaksanakan pada tanggal 9 Maret

2015. Praktikum dilaksanakan pada Labolatorium mikrobiologi umum dengan alat dan bahan

yang dipergunakan yaitu sampel air, buffer fosfat, medium TSA, fluorescein diacetat,

kloroform:methanol (2:1), tabung falcon, tabung kimax, kertas filter, spektofotometer,

sentrifuse, vortex, cawan petri, pinset, mikropipet, tip, milipore filtration dan vacuum

manifold. Sampel air yang dipergunakan berasal dari air sawah, laut dan selokan.

Cara pengerjaan diawali dengan persiapan sampel uji dengan meletakan kertas filter

pada milipore filtration, kemudian dilakukan penyaringan dengan dimasukannya sampel air

pada cup milipore bagian atas kemudian disedot dengan bantuan vacuum manifold. Kertas

filter yang telah digunakan diambil dengan pinset dan dimasukan kedalam cawan petri yang

telah diisi medium TSA kemudian diinkubasi selama 1-2 jam (masing-masing sampel dibuat

2 ulangan). Kemudian dilakukan pengujian FDA dengan disiapkan 7 tabung falcon yang

telah dimasukan kertas filter sebelumnya. Buffer fosfat kemudian ditambahkan sebanyak 20

mL dan FDA sebanyak 0.1 mL. Inkubasi pada suhu 30oC selama 30-60 menit kemudian

ditambahkan kloroform:metanol (2:1) 20 mL. Sentrifugasi tabung (5000 x g) selama 5 menit

kemudian supernatant 5 mL diambil pada setiap tabung falcon dan hitung nilai OD490 dengan

digunakannya spektofotometer. Pembuatan kurva standar dilakukan dengan digunakannya

campuran buffer fosfat dan fluorescein pada tabung kimax. Perbandingan campuran

fluorescein dan buffer fosfat sebesar 0 µL : 1000 µL, 250 µL : 750 µL, 500 µL: 500 µL, 750

µL : 250 µL dan 1000 µL : 0 µL. Larutan setiap tabung kemudian diambil 4 mL dan dihitung

nilai OD490 dengan spektofotometer serta tentukan persamaan linier y = ax + b dari kurva

yang dihasilkan. Selanjutnya persamaan tersebut digunakan untuk penentuan larutan

fluorescein yang terhidrolisis oleh aktivitas enzim dari mikroorganisme sampel air yang diuji.

IV. Hasil dan Pebahasan

a. Hasil

Tabel 1. Fluorescein yang dihasilkan dari masing-masing sampel air

Sampel Konsentrasi Fluorescein

Air sawah -0.00657 = 0

Air laut -0.00682 = 0

Air selokan -0.00666 = 0

0 0.005 0.01 0.015 0.020

0.5

1

1.5

2

2.5f(x) = 124.210294889434 x + 0.867180685380349R² = 0.53622996629015

OD

ODLinear (OD)

Konsentrasi

Nila

i OD

Grafik 1. Kurva standar

b. Pembahasan

Fluorescein diacetate (FDA) hydrolysis assay merupakan salah satu metode untuk

mengetahui aktifitas suatu enzim pada populasi mikrobia dan dapat digunakan untuk

memperkirakan keseluruhan aktiitas mikrobia pada sampel suatu lingkungan. Pengujian ini

tidak spesifik dikarenakan sifatnya yang sensitive terhadap aktifitas beberapa enzim seperti

lipase, esterase dan protease. Pengujian menggunakan FDA dilakukan dengan mencampur

sampel dengan FDA dan buffer kemudian diinkubasi selama 1-2 jam.

Prinsip kerja pengujian FDA dengan menghaslkan molekul fluorescein bewarna

kuning kehijauwan akibat adanya aktifitas enzim yang memotong molekul FDA. Kuantitas

enzim kemudian dapat diketahui dengan mengukur intesitas warna yang didapat dengan

spektofotometer. Pengujian dengan metode FDA tidak umum dilakukan untuk pengujian

sampel air akan tetapi dengan suatu modifikasi dapat dipergunakan untuk menganalisis

sampel air. Penggunaan prosedur filtrasi untuk mendapatkan bakteri pada suatu membran dari

suatu air. Sampel air dilakukan filtrasi dengan filter berpori-pori berukuran 0.45 µm. Filter

yang telah digunakan akan terdapat bakteri pada sampel air kemudian dilakukan pengujian

FDA.

Tahap-tahap yang dilakukan dalam pengujian FDA dengan sampel air tidak jauh

berbeda dengan sampel tanah. Perbedaan yang dilakukan hanya pada sampel air dilakukan

filtrasi, filtrasi dilakukan dengan menggunakan filter milipore, vakum manifold, dan forsep

steril. Filter yang digunakan berpori-pori berukuran 0.45 µm dengan diameter 47 mm dan

berupa membran polikarbon. Proses kerja diawali dengan mensterilisasi forsep dengan

ethanol 70% dan dilewati pada api bunsen. Fakum manifold kemudian disusun dengan

meletakan filter diantara tabung. Pada wadah/ cup teratas air sampel dimasukan hingga 100

mL (batas maksimum). Hubungkan selang tabung bagian bawah dengan pompa vakum

kemudian fakum dihidupkan. Air akan terisap dan melewati membran filter sehingga

mikroorganisme yang berada dalam air akan terjebak pada membran. Tutup seluruh katup

jika masih terdapat air yang belum terisap. Cup kemudian dilepas dan filter diambil

menggunakan forsep steril. Membran filter dimasukan kedalam tabung falcon steril yang

kemudian dilakukan pengujian FDA. Proses filtrasi dilakukan secara aseptis agar tidak

terdapat kontaminasi jasad lain (bukan dari sampel). Filtrasi dengan membran filter tersebut

dapat melewati air tanpa ikut terbawanya mikroorganisme (ukuran E.coli 2µm (Anonim,

2002). Filtrasi perlu menggunakan bantuan vakum agar air sampel mudah terserap dan lebih

cepat, serta vakum yang digunakan harus sesuai sehingga tidak terlalu kuat yang dapat

merusak membran filter atau terlalu lemah sehingga tidak membantu air untuk melewati

filter.

Penumbuhan isolat pada membran filter sebelum dimasukan kedalam tabung falcon

memungkinkan dilakukan. Penumbuhan berguna untuk menambah jumlah isolat agar

aktivitas enzim mikroorganisme tersebut cukup dalam pengujian FDA. Penumbuhan dapat

dilakukan pada media TSA (Trypticase Soy Agar) dan diinkubasi selama 1-2 jam. Akan

tetapi penuhbuhan mikroorganisme perairan pada media agar hanya dapat menumbuhkan

±10% dari total mikroorganisme pada sampel tersebut.

Pengujian FDA dilakukan dengan menggunakan tabung falcon yang telah terisi

membran filter. Buffer fosfat kemudian ditambahkan sebanyak 20 mL kedalam tabung lalu

divorteks. FDA ditambahkan sebanyak 0.1 mL kedalam tabung dan homogenkan secara hati-

hati. Tabung falcon kemudian diinkubasi pada suhu 30oC selama 30-60 menit dengan

gojokan 200 rpm. Penambahan 20 mL 2:1 kloroform/methanol dengan cepat dan hati-hati

setelah dilakukan inkubasi. Tabung falcon kemudian dilakukan sentrifugasi (5000 x g selama

5 menit) yang bertujuan memisahkan buffer dan masa organik. Nilai absorbansi setiap tabung

diukur dengan menggambil 5 mL supernatant dan dilakukan pengukuran dengan

spektofotometer λ = 490 nm.

Penggunaan buffer membantu mikroorganisme tetap stabil pada larutan FDA.

Fluorescein diacetate (FDA) merupakan substrat esterase yang dapat digunakan dalam

pengujian kemampuan suatu mikroorganisme dalam melakukan aktivitas enzimatiknya. FDA

yang telah terhidrolisis akan menghasilkan fluorescein (Anonim, 1992). Penggunaan

kloroform dan methanol membantu dalam memisahkan biomassa mikroorganisme atau zat

organik lainnya sehingga fluorescein dapat terpisah seutuhnya (pemisahan dilakukan dengan

cara sentrifugasi (Anonim, 2004.).

Pembuatan kurva standar dilakukan untuk menentukan banyaknya FDA yang

terhidrolisis oleh aktivitas enzim pada suatu sampel. Pembuatan dilakukan dengan

menggunakan fluorescein kemudian dilakukan pengenceran dengan konsentrasi berbeda-beda

dan sesuai dengan standar. Larutan fluorescein dengan konsentrasi berbeda-beda dibuat pada

tabung kimax dan dilakukan perhitungan OD490 kemudian dibuat kurva. Persamaan akan

didapat dari terbentuknya kurva standar y = ax ± b (x = konsentrasi fluorescene y = OD yang

dihasilkan) (Grafik. 1). Jumlah fluorescein akan semakin tinggi seiring semakin besarnya

aktivitas enzim suatu sampel.

Hasil yang didapat sampel air sawah dapat menghasilkan fluorescein tertinggi

sebanyak -0.00657 µg/mL, fluorescein yang dihasilkan air selokan dan air laut sebesar -

0.0067 µg/mL dan -0.0068 µg/mL (Tabel. 1). Hasil tersebut menujukan tidak terdapatnya

aktivitas enzim pada sampel yang digunakan karena hasil yang didapat < 0 (tidak terdapat

fluorescein yang dihasilkan). Sampel air tidak mengandung jasad mikroorganisme yang

memiliki enzim yang dapat memotong FDA (esterase, protease dan lipase). Hal tersebut

dapat disebabkan pada proses penumbuhan di media TSA tidak terjadi pertumbuhan hingga

banyak mikroorganisme yang mati dikarenakan agar memiliki gradien yang tinggi dan tidak

sesuai untuk mikroorganisme air. Kualitas alat spektofometer dalam membaca nilai OD

(Obtical Density) sangat menentukan hasil.

Pada pembentukan kurva standar didapat persamaan yang digunakan dalam

perhitungan jumlah fluorescein dan regresi sebesar 0.5362. Nilai regresi yang didapatkan

tidak mendekati 1 sehingga dapat disimpulkan dalam pembuatan larutan fluorescein standar

tidak terjadi saling terhubungan sehingga kurva standar yang dihasilkan kurang baik.

Sebaiknya pembuatan kurva standar dilakukan kembali hingga didapat nilai regresi

menedekati 1.

V. Kesimpulan

a. Kesimpulan

Metode perhitungan aktivitas enzimatik dapat dilakukan dengan metode kolorimetri.

Salah satunya dengan menggunakan metode FDA (fluorescein diacetat) assay, dalam

pengujian tersebut digunakan FDA sebagai substrat yang akan dirombak oleh

mikroorganisme dengan enzimnya dan mengasilkan senyawa fluorescein (kuning-

kehijauwan). Perhitungan aktivitas enzim ditentukan oleh banyaknya fluorescein dihasilkan,

dengan cara membuat larutan fluorescein standar kemudian dibentuk kurva hingga

didapatkan persamaan. Persamaan yang telah didapat digunakan untuk menghitung

konsentrasi fluorescein dengan menggunakan nilai OD490 didapat.

Pengujian yang telah dilakukan diketahui konsentrasi fluorescein yang dihasilkan < 0

atau sama dengan 0. Hal tersebut menunjukan tidak terjadinya reaksi enzimatis yang

dilakukan mikroorganisme dalam memotong substrat FDA. Kesimpulan yang didapat saat ini

mikroorganisme pada sampel air yang digunakan tidak dapat memproduksi enzim protease,

lipase dan esterase.

b. Saran

Pengujian hidrolisis fluorescein diacetate (FDA) sangat dipengaruhi nilai OD490 yang

dihasilkan. Oleh karena itu kualitas peralatan (spektofotometer dan kuvet) selain itu

keterampilan dalam melaksanakan pengujian menjadi faktor penting. Pembuatan kurva

standar haruslah yang terbaik dengan nilai regresi mendekati 1 (ex: 0.9xx) sehingga

persamaan linear (y = ax ± b) yang terbentuk akan sangat baik dan dapat digunakan dalam

menentukan konsentrasi fluorescein yang dihasilkan. Persiapan sampel yang akan diuji tidak

seharusnya ditumbuhkan pada media agar mengingat sampel yang digunakan adalah air

sehingga dalam proses pertumbuhannya hanya mikroorganisme tertentu saja yang dapat

tumbuh.

Daftar Pustaka

Anfinsen, C. 1973 . Principles that govern the folding of protein chains. Science 181 (4096),

pp: 223–230.

Anonim. 1992. Fluorescein Diacetate (FDA). <www.lifetechnologies.com>, diakses 15

Maret 2015.

Anonim. 2004. Fluorescein diacetate hydrolysis assay. Laboratory for Environmental

Pathogens Research, Department of Environmental Sciences, University of Toledo.

Anonim. 2002 . Introducing Microbes . <www.microbiologyonline.org.uk>, diakses 15 Maret

2015.

Black J G. 1999. Microbiology : Principles and Explorations. New Jersey : Prentince Hall.

Chandrasekaran, M. and Kumar. 2011. Marine Microbial Enzymes. Biotechnologi 9, pp: 1-

15.

Ma, B. and R. Nussinov. 2010. Enzyme dynamics point to stepwise conformational selection

in catalysis. Current Opinion in Chemical Biology 14, pp: 652–659.

Petsko GA, Ringe D. 2003. Chapter 1: From sequence to structure “Protein structure and

function”. New Science, London.

Schomburg, I., A. Chang, S. Placzek, C. So¨hngen, M. Rother, M. Lang, C. Munaretto, S.

Ulas, M. Stelzer, A. Grote, M. Scheer and D. Schomburg. 2013. BRENDA in 2013:

integrated reactions, kinetic data, enzyme function data, improved disease

classification: new options and contents in BRENDA. Nucleic Acids Research 41, pp:

764-772.

Suzuki H. 2015. “Chapter 7: Active Site Structure". How Enzymes Work: From Structure to

Function. CRC Press, pp: 117–140.

Vasella A, Davies G, Böhm M. 2002. Glycosidase mechanisms. Current Opinion in Chemical

Biology 6 (5): 619–629.