プレゼン資料 4 北里大学 岩月正人 - jst...1...
TRANSCRIPT
1
抗マラリア活性を有する新規リポペプチド類
北里大学 北里生命科学研究所
熱帯病研究センター
センター長 岩月 正人
2
熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）
年間罹患者数: 211,000,000 人年間死亡者数: 441,000 人
Chloroquine (1934)Artemisinin (1972)
Quinine (1820)
ハマダラカ(Anopheles spp.)
症状(発熱、悪寒、貧血、脾腫、脳マラリアなど）
被害状況（2018, WHO）
既存の抗マラリア薬（開発年）
三代感染症の一つ「マラリア」は依然として人類の脅威
マラリアの感染が起こっている国および地域
限定的ではあるが、マラリアの感染が起こっている国および地域
ref. http://www.forth.go.jp/useful/malaria.html
3
Artemisinin-based combination therapy (ACT)
・ Artemisininの欠点（半減期が短い(ヒト：2.7 hr)）を補う・ Artemisinin耐性原虫の出現を抑制する
従来技術:マラリア治療に用いられている主な薬剤
Fansidar®
Malarone®
Riamet®
AS/AQ
AS/MQ
4大友弘士ほか, 診断と治療, 98(8), 1345-1353 (2010)
近年、最後の切り札である「Artemisinin誘導体」に対する耐性原虫の出現がカンボジア、ベトナム、タイ等で報告されている。
従来技術の問題点 「薬剤耐性マラリア原虫の蔓延」
5
マラリア原虫の生活環
メロゾイト
肝臓（肝細胞）
ハマダラカ
唾液腺
中腸壁♂
♀
スポロゾイト
ガメト
ハマダラカ
♂
♀
ガメトサイト
赤血球
リング型
トロホゾイト
シゾント
ヒト血管内
マラリア原虫増殖阻害物質
6
(approved by WHO/TDR)In vitro マラリア原虫増殖阻害活性の評価系
7
190 µL 原虫浮遊液 + 10 μL サンプル溶液
原虫の乳酸デヒドロゲナーゼ(p-LDH)活性測定
培養時間： 72 時間
l原虫：熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）多剤耐性 K1 株
l培地：10% ヒト血漿加RPMI 1640培地lヘマトクリット値：2～3%、原虫感染赤血球率：0.25～1%l培地交換、赤血球添加：48～72 時間毎l培養条件：37 ℃, 混合ガス下（3% O2、 4% CO2、 93% N2）
方法
培養シャーレ
NTB + PES
青色フォルマザン色素
p-LDHピルビン酸乳酸
APAD APADH+
Otoguro K. et al. J Antibiot, 54(8), 658-663 (2001)
7
Paracamarosporium sp. FKI-7019 strainInoculated 1 loop in seed medium (100 mL)Cultured for 3 days (27ºC, 270 rpm)Transferred 1% of seed into production medium (100 mL) x 30Cultured for 4 days (27ºC, 270 rpm)Added EtOH (3 L)
50% EtOH extract Mycelia
Removed EtOH in vacuoExtracted with EtOAc（3.0 L×3）
Silica gel column chromatography
CHCl3/MeOH = 9/1 and 1/1 (487 mg)
ODS column chromatography
H2O layer
MeOH insolubleMeOH soluble (60 mg)
CHCl3/MeOH = 100/1 fr. (3.8 mg) EtOAc extract (2.22 g)
Toluene soluble
100% MeOH fr.
DNH Silica gelcolumn chromatography
FKI-7019 A 物質(1.7 mg)
(MW：1,061)
Triturated with toluene
7In vitro 抗マラリア活性IC50 0.15 µM
Paracamarosporium属FKI-7019株の光学顕微鏡写真
20 µm
糸状菌FKI-7019株が生産する抗マラリア活性物質の発酵・精製
8
1H NMR (400 MHz in DMSO-d6)
FKI-7019 A物質の1H および 13C NMRスペクトル
ppm1357 2468
13C NMR (100 MHz in DMSO-d6)
ppm180 160 140 120 100 80 60 40 20
9
2D NMR解析（COSY, HMBCなど）
ESI-MS/MS解析
改良Marfey法
FKI-7019 A物質
FKI-7019 A物質の構造決定
部分構造の決定
平面構造の決定
構成アミノ酸残基の立体化学の決定
FKI-7019 A物質
全合成 （後のスライドで詳述）
L-ValL-Alaninal
4R-Me-L-ProL-Asn
C18 sphingosine
Oleic acid
L-Thr
10
FKI-7019 A及びB物質の in vitro 抗マラリア活性
FKI-7019 B 物質FKI-7019 A 物質
CompoundIC50 (μM)
抗マラリア活性
K1 strain[a] FCR3 strain[b] Cytotoxicity (MRC-5)FKI-7019 A 物質 0.15 0.29 >23FKI-7019 B 物質 1.03 1.46 >35
Chloroquine 0.17 0.038 58[c]
Artemisinin 0.019 0.023 160[c]
[a] Chloroquine-resistant strain. [b] Chloroquine-sensitive strain. [c] J. Antibiot. 2011, 64, 183.
11
新技術の特徴・従来技術との比較（１）
• 従来技術の問題点であった薬剤耐性マラリア原虫に対してin vitro及び in vivoで抗マラリア活性を示す新規リポペプチド類を糸状菌培養液から発見した。
• 現在用いられているマラリア治療薬とは異なる骨格を有することから新たな作用機序で効果を示すと期待している（作用機序の解析を実施中）。
12
O
HN
OH
HO
Me
Me
NH
O HN
NH2
OO
NH
Me MeO
N
Me
ONH
HO MeO
11
7
7Me
L-Ala
L-Asn
疎水性タグによるFKI-7019 A 物質の全合成（１）
13
疎水性タグによるFKI-7019 A 物質の全合成（２）
Condensationwith oleic acid 20% TFA/DCM
75%(crystallization & silica gel column)
RT, 3 h
ONHOAJIP
ONH2
NH2
O
ONHOAJIP
O HN
NH2
O ONH
ON
ONH
Ot-BuO
7
7 ONHO
H
O HN
NH2
O ONH
ON
ONH
OHO
7
7
L-Val
(2S, 4R)-4-MePro
L-Thr
oleic acid
L-Val
(2S, 4R)-4-MePro
L-Thr
oleic acid
1) Condensation withFmoc-Val-OH
2) Deprotection
1) Condensation withFmoc-4MePro-OH
2) Deprotection
1) Condensation withFmoc-Thr(t-Bu)-OH
2) Deprotection
ONHOAJIP
O HN
NH2
O ONH
ON
ONH2
Ot-BuL-Val
(2S, 4R)-4-MePro
L-Thr
99% (2 steps)(crystallization)
98% (2 steps)(crystallization)
96% (2 steps)(crystallization)
95%(crystallization)
14
疎水性タグによるFKI-7019 A 物質の全合成（３）
15
O
HN
OH
HO
Me
Me
NH
O HN
NH2
OO
NH
Me MeO
N
Me
ONH
HO MeO
11
7
7Me
疎水性タグによるFKI-7019 A 物質の全合成（４）
FKI-7019 A 物質
16
FKI-7019 誘導体の in vitro 抗マラリア活性
CompoundIC50 (μM)
抗マラリア活性
K1 strain[a] FCR3 strain[b] Cytotoxicity (MRC-5)FKI-7019 A 物質 (天然品) 0.15 0.29 >23FKI-7019 A 物質 (合成品) 0.30 0.55 >23
aldehyde 0.008 0.013 >32Weinreb amide 12.5 >15.2 >30carboxylic acid >16.0 N/A >32
Chloroquine 0.17 0.038 58[c]
Artemisinin 0.019 0.023 160[c]
[a] Chloroquine-resistant strain. [b] Chloroquine-sensitive strain. [c] J. Antibiot. 2011, 64, 183.
O
HO
FKI-7019 A 物質 aldehyde Weinreb amide Carboxylic acid
17
FKI-7019 A物質とアルデヒド体のin vivo 抗マラリア活性
In vivo antimalarial activity (i.p. administration on P. berghei N strain-infected mice)Compound Dosage Route Inhibition
FKI-7019 A 物質 30 mg/kg/day x 4 days (n = 5) i.p. 52.4%
aldehyde 30 mg/kg/day x 4 days (n = 5) i.p. 99.8%
Artesunate 30 mg/kg/day x 4 days (n = 5) i.p. 89.9%
FKI-7019 A 物質aldehyde
18
新技術の特徴・従来技術との比較（１）
• 従来技術の問題点であった薬剤耐性マラリア原虫に対してin vitro及び in vivoで抗マラリア活性を示す新規リポペプチド類を糸状菌培養液から発見した。
• 現在用いられているマラリア治療薬とは異なる骨格を有することから新たな作用機序で効果を示すと期待している（作用機序の解析を実施中）。
• 疎水性タグを用いたリポペプチド類の全合成に成功した。• 構築した全合成法で量的供給および新規誘導体の調製も達成した。
新技術の特徴・従来技術との比較（２）
19
WF10225Aカルパイン阻害活性
JP1997-221497
抗真菌活性J. Nat. Prod., 78, 468-475 (2015)
WF10225B
Cavinafungin A Cavinafungin B
FKI-7019 A物質と類似の構造を有する既知リポペプチド類
20
想定される用途
• 新規リポペプチド類をリードとした新たなマラリア治療薬の開発が期待される。
• 類似の構造を有する既知のリポペプチド類が（１）カルパイン阻害活性
（２）抗真菌活性、抗ウイルス活性
を示すことが報告されていることから、
マラリア以外を標的とした薬剤の開発も期待される。
21
99.8%阻害30 mg/kg x 4 i.p.Aldehyde FKI-7019 A物質
52.4%阻害30 mg/kg x 4 i.p.
7019YH-new analogs
>50%阻害5 mg/kg x 4 p.o.
7019A-new analogs
全合成法による誘導体創製追加（予定）範囲
0%阻害60 mg/kg x 4 p.o. 0%阻害60 mg/kg x 4 p.o.
特許出願範囲
FKI-7019 A物質とアルデヒド体のin vivo 抗マラリア活性
22
実用化に向けた課題
• 現在、腹腔内投与でin vivo抗マラリア活性を示す誘導体創製には成功。
• 今後、経口投与でもin vivo抗マラリア活性を示す誘導体創製が必要。
23
企業への期待
• 未解決の「経口投与でもin vivo抗マラリア活性を示す誘導体創製」については、ナノ粒子化などの可溶化技術でも克服できると考えている。
• 公益事業としてマラリア治療薬の創製を目指している企業との共同研究（本リード最適化）
24
本技術に関する知的財産権
• 発明の名称 ：FKI-7019物質およびその製造方法• 出願番号 ：特願2018-211679• 出願人 ：学校法人北里研究所
• 発明者 ：大村 智、乙黒一彦、岩月正人
石山亜紀、穗苅玲、砂塚敏明
廣瀬友靖、林裕美
塩見和朗、深澤航、野中健一
