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ノロウイルスによる胃腸炎集団発生について― 北海道，2009/10 シーズン ―

Outbreaks of Gastroenteritis Caused by Norovirus in Hokkaido, 2009/10 Season

吉澄　志磨　　　三好　正浩　　　後藤　明子　　　石田勢津子

Shima Yoshizumi, Masahiro miYoshi, Akiko Goto and Setsuko ishida

Key words：norovirus（ノロウイルス）；outbreak（集団発生）；genotype（遺伝子型）

　ノロウイルス（Norovirus，以下NV）は，冬季に多く発生がみられるウイルス性急性胃腸炎の主な原因ウイルスである1）．NVは経口感染によりヒトの小腸で増殖し，感染者の吐物や糞便とともに排泄される．そのNVが手指等を介して別のヒトの口に入る，または周囲のヒトが飛沫を吸い込むなどにより，NVのヒトからヒトへの感染（以下，感染症事例）が引き起こされる．一方，NVは食中毒の病因ウイルスとしても知られている．生あるいは加熱不十分な状態の二枚貝や，調理従事者の手指等を介してNVに汚染された食品の喫食が感染の原因となる2）．北海道で発生した食中毒事例では，ここ数年，調理従事者を介した食品汚染を原因とする事例が大部分を占めている3–6）．　当所腸管系ウイルス科では，北海道におけるNVの流行状況を把握するため，集団胃腸炎事例を対象とした分子疫学的解析を実施し，データを蓄積している．今回は，2009/10 シーズンに北海道において発生した集団胃腸炎事例について，解析結果を報告する．

方 法

１．対象事例　2009 年 10 月から 2010 年 7 月の間に北海道内で発生し，当科においてウイルス検査を実施した集団胃腸炎 81 事例（糞便 575 検体，吐物 4検体，食品 35 検体，拭き取り 27検体）を対象とした．２．NV遺伝子の検出方法　厚生労働省通知の方法7）に準じてNV遺伝子の検出を 行 っ た． す な わ ち，QIAamp Viral RNA Mini Kit（QIAGEN社製）を用いてRNAを抽出し，DNaseI で処理した後，random hexamer を用いて cDNA合成を行った．その後，糞便及び吐物については，P1/P3, NV82・SM82/NV81, COG1F/G1–SKR及び COG2F/G2–SKRプライマーを使用した Polymerase Chain Reaction （PCR）法により，NV遺伝子の増幅を行った．食品及び拭き取り検

道衛研所報 Rep. Hokkaido Inst. Pub. Health, 60, 61-65（2010）

体については，1st PCR に COG1F/G1–SKR及び COG2F/G2–SKRを，nested PCRにG1–SKF/G1–SKR及びG2–SKF/G2–SKRを使用して増幅を試みた．すべての検体の PCR増幅産物について，ダイレクトシークエンス法により塩基配列を決定した．３．NV遺伝子型の分類　NVの遺伝子型は，VP1 の N/S ドメインの塩基配列をもとに，Kageyama らの方法8）及び片山の遺伝子型番号9）

に従って分類した．系統樹解析は，ClustalX を用いた近隣結合法により行った．４．Genogroup（G）II/4 株のクラスター分類　検出されたNVの遺伝子型がGII/4 と同定された事例からそれぞれ 1または 2検体を選出し，Reverse Transcription （RT）– PCR 法により，ポリメラーゼ領域からVP1 領域全長について増幅を行った．増幅プライマーには P1/3IIR–44）もしくは P1/G2–SKR及び G2–SKF/3IIR–4 を使用した．この増幅産物を用いてダイレクトシークエンスを行い，ポリメラーゼ領域（793 塩基，Lordsdale  position：4312–5104）及び VP1 の P2サブドメインを含む領域（GII–5a/GII–2Ra4）間の 568 塩基，Lordsdale position：5876–6443）の塩基配列を決定した．系統樹解析はClustalX を用いた近隣結合法により行い，系統樹の評価のため，1, 000 回の施行によるブートストラップ値を求めた．

結果及び考察

１．2009/10 シーズンのNV検出事例数　対象とした集団胃腸炎 81 事例のうち，NVが検出された事例は表 1に示す 72 事例であった．このうち食中毒と断定された事例は 9事例（12. 5％）であった．感染症事例のうち，保育所で発生した 1事例からはＡ群ロタウイルスも検出された（ 6検体中NV陽性 3検体，Ａ群ロタウイルス陽性 3検体）．NVが検出されなかった 9事例のうち

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6 事例からはＡ群ロタウイルスが検出され，残り 3事例については胃腸炎ウイルス及び食中毒原因細菌のいずれも検出されなかった．２．NVによる集団胃腸炎事例の月別発生状況　図 1に，最近 5シーズンの月別事例発生数（道立衛研検査分）を示した．2009/10 シーズンは 11 月及び 12 月の事例数が例年に比べて大幅に減少し，事例発生ピークは例年より 1～ 3カ月遅れて 2月に認められた．３．食中毒事例について　表 2に食中毒事例の検査結果を示した．なお，事例No. 7 は集会施設において会合出席者等が自ら調理を行った事例であり，調理者も当該食を喫食している．

　いずれの事例も調理従事者からNV遺伝子が検出され，患者から検出されたNVの塩基配列とそれぞれ 100％一致することが確認された（事例No. 6 については患者検体の検査を実施した自治体よりシークエンスデータを入手した）．これらの検査結果と疫学情報から，9事例ともに，調理従事者を介した食品汚染を原因とするNVによる食中毒と断定された．このうち 3事例においては，食中毒発生前に胃腸炎を発症していた調理従事者からNV遺伝子が検出されており，胃腸炎発症者が調理に従事することの危険性について，未だ認識が不十分であることが伺われた．一方，6事例の調理従事者については事前発症者が確認されておらず，胃腸炎症状を呈していないNV感染者が食品汚染の原因になったと考えられた．各事例における調理従事者のNV陽性率は，事例No. 7 を除いた 8施設でそれぞれ 2/2（100％），1/2（50％），5/25（20％），5/12（42 ％），5/13（38 ％），3/8（38 ％），5/6（83 ％），4/11（36％）であった．8事例中 7事例の調理施設において複数の従事者からNV遺伝子が検出されており，NV陽性率は 5施設で約 4～ 5割，2施設で 8割以上と高い値を示した．このことから，調理施設にNVが持ち込まれた場合，従事者の間でNV感染が拡がりやすいことが示唆され，調理施設においては食中毒発生予防と施設内感染予防の両面におけるNV対策が必要であると考えられた．４．検出遺伝子型について　表 3に，2009/10 シーズンに検出されたNVの遺伝子型を発生施設別に示した．優勢遺伝子型はGII/4 であり，混合事例を含むと 72 事例中 43 事例（59. 7％）から検出された．GII/4 に次いで多く検出された遺伝子型は，GII/12（13. 9％），GII/2（8. 3％），GII/6（6. 9％），GI/4（8. 3％）であり（GII/12 及び GI/4 は混合検出事例分を加算），感染症事例において比較的検出頻度の高い遺伝子型が食中毒

表１　NVによる集団胃腸炎事例の内訳発生（原因）施設 事例数

 食中毒

事業所（飲食店） 1飲食店（飲食店） 2旅館（旅館） 3病院（給食施設） 1高齢者施設（給食施設） 1集会施設（集会施設厨房） 1合計 9

 感染症等

保育所・幼稚園 18小学校 5児童養護施設 1障害者更正施設 5病院 5高齢者施設 18宿泊施設 5集会施設 5イベント会場 1合計 63

図１　最近 5シーズンのNVによる集団胃腸炎事例数（道立衛研検査分）

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事例からも検出される傾向がみられた．これらの遺伝子型の検出時期をみると，シーズン初めの 9，10 月には，前シーズン後期に検出頻度の高かったGII/6 が検出された．その後，12 月から GII/4 と GII/12 が検出され始め，どちらもほぼ毎月確認された．GI/4 は 11 月～翌年 3月に，GII/2 は 2 月下旬～ 4月上旬に検出された．例年と同様，保育所，幼稚園，小学校においては多様な遺伝子型の感染が認められ，一方，障害者更正施設，病院，高齢者施設，集会施設の事例では，検出遺伝子型がGII/4 に大きく偏っていた．５．GII/4 株のクラスター分類　北海道では 2003/04 シーズン以降GII/4 の検出頻度の高い状態が続いていることから，その原因究明の一環として，GII/4 の新しいクラスタータイプ（系統樹解析により既知のGII/4 株とは異なるクラスターを形成する変異株）の出現とその後の流行状況について監視を行っている3–6）．そこで，2009/10 シーズンに検出されたGII/4 株について詳細な分類を行うため，GII/4 が検出された 43 事例から46 株を選出し，ポリメラーゼ領域とVP1 の P2 サブドメイン領域の塩基配列をもとに系統樹解析を行った．その結

表２　NVによる食中毒事例

No. 発生年月日

患者数／喫食者数（速報値）

発生場所 原因施設 原因食品RT–PCR結果　（陽性数／検査数）

検出NV遺伝子型患者

調理従事者食品 拭き取り

事前発症 事後発症 非発症1 2009. 12. 30 12 / 13 事業所 飲食店 生ちらし寿司 6 / 6 – – 2 / 2 0 / 6 0 /10 GII/62 2010. 01. 10 39 / 82 飲食店 飲食店 提供された食事 6 / 7 – – 1 / 2 NT 0 / 9 GI/43 2010. 01. 25 43 /106 旅館 旅館 提供された食事 7 / 7 – – 5 /25 0/16 NT GII/44 2010. 02. 13 21 / 69 病院 給食施設 提供された食事 4 / 4 1 / 1 2 / 2 2 / 9 NT NT GII/45 2010. 03. 13 22 /196 高齢者施設 給食施設 提供された食事 6 / 6 1 / 1 1 / 1 3 /11 NT NT GII/46 2010. 03. 21  9 / 15 旅館 旅館 提供された食事 NT – – 3 / 8 NT NT GII/27 2010. 05. 15 26 / 55 集会施設 集会施設 提供された食事 6 / 6 1 / 1 2 / 2 1 / 1 NT NT GII/48 2010. 05. 27 29 / 59 飲食店 飲食店 提供された食事 7 / 7 – – 5 / 6 NT NT GII/49 2010. 06. 07 11 / 13 旅館 旅館 提供された食事 6 / 7 – 1 / 1 3 /10 NT NT GII/6NT：not tested

表３　検出されたNVの遺伝子型検出事例数

GI/4 GI/7 GI/8 GII/2 GII/3 GII/4 GII/6 GII/7 GII/12 GII/13 混合　食中毒事例 1 1 5 2

感染症事例等

保育所・幼稚園 1 4 1 4 2 4 2※1

小学校 1 1 1 1 1児童養護施設 1障害者更正施設 4 1病院 5高齢者施設 1 15 1 1※2

宿泊施設 3 1 1会食・集会施設 5イベント会場 1

合計 4 1 1 6 1 41 5 1 8 1 3（5. 6％）（1. 4％）（1. 4％） （8. 3％）（1. 4％）（56. 9％）（6. 9％）（1. 4％）（11. 1％）（1. 4％） （4. 2％）

※ 1：①GII/12検出事例において1名のみGII/4検出　  　②GI/4とGII/12の混合感染事例 （GI/4とGII/12検出が４名，GII/12のみ検出が１名）※ 2：GII/4検出事例において１名のみGI/4とGII/4検出

果，図 2のとおり，2009/10 シーズンに検出されたGII/4株は 3つのクラスタータイプに分類された．このうち 2つは既知のタイプであり，2006/07 シーズン以降の主流型である 2006b 型（cluster A，◎印）と，2008/09 シーズンに確認された 2008a 型6, 10）（cluster B，★印）であった．一方，cluster C に分類された株（●印）は 2009/10 シーズンに初めて確認されたクラスタータイプであった（以下，仮に 2009/10 new 型と示す）．これら 3タイプのGII/4 株の月別検出状況を図 3に示した．最も多く検出されたのは2006b 型であり，12 月以降ほぼ毎月検出された．2008a 型は，北海道では 2009 年 1 月に小学校の 1事例から検出されたのみであったが，2009/10 シーズンも高齢者施設 1事例からの検出に留まった．2009/10 new 型は，1月以降，主に高齢者施設を中心に検出されたが，検出は 2月をピークとして 4月に終息した．また，この 2009/10 new 型が検出された地域は太平洋側の 5保健所管内（ 2保健所管内で 4事例ずつ，3保健所管内で 1事例ずつ）に限局しており，全道に拡大する前に感染が終息したと考えられた．　北海道におけるGII/4 新クラスタータイプの最近の出現状況は，2006 年末に過去最大規模の流行をみせた 2006b

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図２　2009/10シーズンに検出されたGII/4株の系統樹

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型の後，2006a5），2008a，2008b6,10），2009/10 new 型が確認されたが，いずれも大きな流行を引き起こすことなく経過した．北海道では 2006b 型が 4シーズン続けてGII/4 の主流株となっているが，2006b 型の検出事例数は 2006/07から 2009/10 までの 4シーズンでそれぞれ 203，95，34，31 事例と年々減少している4–6）．これは免疫獲得による感受性者の減少が原因のひとつと考えられ，今後，既存のクラスタータイプとは抗原性の異なる新たなGII/4 変異株が 2006b 型に置き換わり，流行を引き起こす可能性が懸念される．GII/4 株が流行した場合，検出遺伝子型が例年GII/4 に大きく偏っている病院や高齢者施設などの介護系施設においてノロウイルス感染患者の多発が危惧されることから，引き続き新しいGII/4 変異株の出現に対する監視が必要である．　本稿を終えるにあたり，検体採取等にご協力頂きました

図３　各GII/4 クラスタータイプの月別検出状況

北海道保健福祉部健康安全局ならびに各保健所の関係者各位に深謝いたします．

文 献

 1）Green KY：Caliciviridae：The Noroviruses,  Fields Virology,  5th  ed.,  (ed. Knipe DM, Howley PM, Griffin DE,  Lamb RA, Martin MA,  Roizman  B  and  Straus SE) Lippincott Williams & Wilkins,  a Wolters Kluwer Business, Philadelphia, 2007, pp.949–979

 2）武田直和，名取克郎：食品衛生研究，48（7），65–75 （1998） 3）吉澄志磨，三好正浩，池田徹也，石田勢津子，奥井登代：道衛研所報，55，67–71 （2005）

 4）吉澄志磨，池田徹也，三好正浩，石田勢津子，奥井登代：道衛研所報，57，91–95 （2007）

 5）吉澄志磨，三好正浩，石田勢津子，奥井登代：道衛研所報，58，77–81 （2008）

 6）吉澄志磨，三好正浩，石田勢津子：道衛研所報，59，79–83 （2009）

 7）厚生労働省医薬食品局食品安全部監視安全課長通知食安監発第 1105001 号「ノロウイルスの検出法について」，平成15 年 11 月 5 日

 8）Kageyama T, Shinohara M, Uchida K, Fukushi S, Hoshino FB, Kojima S, Takai R, Oka T, Takeda N, Katayama K：J. Clin. Microbiol., 42（7）, 2988–2995 （2004）

 9）国立感染症研究所感染症情報センターホームページ：ノロウイルスの遺伝子型（http://idsc.nih.go.jp/ pathogen/refer/noro–kaisetu1.html）

10）Motomura K, Yokoyama M, Ode H, Nakamura H, Mori H, Kanda T, Oka T, Katayama K, Noda M, Tanaka T, Takeda N,  Sato H, Norovirus  Surveillance Group  of Japan：J. Virol., 84（16）, 8085–8097 （2010）