ヒト及びマウス人工染色体の医学・薬学応用 -...
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ヒト及びマウス人工染色体の医学・薬学応用!鳥取大学・染色体工学研究センター
教授 押村光雄 助教 香月康宏
平成26年度 山陰（鳥取・島根）発 新技術説明会 2014.7.4＠大阪商工会議所
染色体工学技術とは？ a.他のグループの一般的な染色体工学技術の例 b.鳥取大学が開発した染色体工学技術の例
相同組換えにより 部位特異的に2カ所
loxPサイトを導入
Cre発現により Mb単位の領域を
染色体レベルで削除
相同組換えにより 部位特異的に2カ所
loxPサイトを導入
Cre発現により Mb単位の領域を
染色体レベルで削除
10 kb 100 kb 1 Mb 10 Mb 100 Mb
Virus (̃150 kb)
YAC (̃1 Mb) Chromosome
HAC/MAC BAC/PAC (̃300 kb)
Plasmid (̃20 kb)
c. 遺伝子搭載サイズの限界
1. IgH=2Mb, Igκ=2Mb, Igλ=1Mb 2. CYP3A cluster=1Mb 3. HLA cluster=3Mb
4. DS critical region=5Mb 5. DMD gene=2.5Mb
d. Mbサイズの遺伝子例
(Trans-chromosomic mice ;Tc mice)
ヒト染色体を保持するマウスの作製法�
コルセミド処理�
マウスES細胞�
G418 selection�
ヒト染色体を保持する�マウスA9細胞クローン �
融合�遠心分離�
ヒト染色体を保持する�マウスES細胞�
キメラマウス�
微小核細胞�
子孫へ伝播 � 8細胞期胚へ移植�
サイトカラシンB処理�
仮親の子宮へ移植�
Neo耐性遺伝子�
�ヒト染色体（断片）のマウスにおける安定性と子孫伝達
ヒト染色体番号� 子孫伝達�染色体サイズ�遺伝子名� 安定性
21番 21番（断片）�
ダウン症 候補遺伝子群�
IgH cluster
35Mb 5Mb
× ○
○ ○
Igk cluster
14番 14番（断片） (SC20) 2番（断片） (W23)
CYP3A cluster 7番（断片）�
100Mb 25Mb 10Mb
× ○
100Mb × ×
○ ×
× ○
→ヒト21番染色体をもとにヒト人工染色体を作製�
課題：�・不要な遺伝子領域も導入されてしまう!����������・そのために、子孫伝達できない場合がある�
ヒト人工染色体ベクターの利点 (従来法との比較）
ヒト21番染色体 (約35Mb)
#21HAC (約3.2Mb)
人工染色体の 作製
loxP GFP
宿主染色体に挿入されず独立して維持される 一定のコピー数で安定に保持 宿主細胞の生理的発現制御を受ける 過剰発現／発現消失が起きない�
導入可能なDNAサイズに制約がない �（調節領域を含むゲノム遺伝子の導入）
HACベクター ＋ ゲノム遺伝子�
宿主遺伝子を破壊する可能性 コピー数がコントロールできない 外来プロモーターによる制御 過剰発現／発現消失
ウイルス／プラスミドベクター ＋ 外来プロモーター ＋ cDNA
DNAサイズに 制約���
【発明の名称】内在遺伝子を含まないヒト人工染色体ベクター（特開2007-295860）出願日2006.5.1・・・特許第4895100号（登録日2012/01/06）
new21HAC・・・鳥取大（香月、押村）・クロモセンター!
【課題】内在遺伝子を含まないヒト2 1 番染色体断片からなるヒト人工染色体ベクターを提供する。!
【解決手段】ヒト2 1 番染色体の長腕遠位がA P 0 0 1 6 5 7 において、また、短腕遠位がA L 1 6 3 2 0 1 において削除されたヒト2 1 番染色体断片からなり、好ましくは、該断片が1 つ以上のD N A 配列挿入部位とレポーター遺伝子およびネガティブ選別遺伝子とを含むことを特徴とするヒト人工染色体ベクター。!
【請求項1】!�ヒト21番染色体の長腕遠位がAP001657において、また、短腕遠位がAL163201において削除されたヒト21番染色体断片からなり、1つ以上のDNA配列挿入部位を含み、内在遺伝子を含まないことを特徴とするヒト人工染色体ベクターであって、ネガティブ選別遺伝子としてHSV－チミジンキナーゼ（TK）遺伝子が挿入されている、ヒト人工染色体ベクター。 �
1Kb � 10Kb � 100Kb � 1Mb � 10Mb � 100Mb �
Size limit of transgene �
Human�Chromosomes�(40-250Mb) �
ブルーレイディスク 50GB (x35,000)
(2007年）�
CD-R 700MB (x500)
(1996年頃）
フロッピーディスク1.4MB (x1)�
(1984年頃） DVD-R 4.7GB (x3,340)
(2000年頃）
プラスミドベクター10Kb (x1) �
BACベクター200Kb (x20) �
HACベクター�100Mbp (x10,000) �
1Mb � 10Mb � 100Mb � 1Gb � 10Gb � 100Gb �
新たに何ができるか！�
ジストロフィンとは�X染色体短腕に位置する、全長約2.5Mにも及ぶ巨大な遺伝子�
少なくとも7つのプロモーターがあり、選択的スプライシングにより多数のアイソフォームが産生される。複雑な発現制御 �
2.5Mbの巨大な遺伝子を運ぶベクターは存在しない→HACの利用�
DYS-HACを保持する患者由来iPS細胞で DMD患者の遺伝子欠損を修復できた
DMD患者由来線維芽細胞 （exon 4-43欠損）
Kazuki et al., Mol Ther. , 2010
DMD iPS(+DYS-HAC) �
exon45�exon48�
exon4
exon44�exon12 exon8 exon51�exon17 exon19
1 2 3 4
DMD-iPS細胞�(+DYS-HAC) �
ジストロフィン 遺伝子
自殺遺伝子
DYS-HAC
iPS誘導
mdxマウス由来�中胚葉系�血管芽細胞�（+DYS-HAC) �
筋芽細胞
分化誘導
移植後、6ヶ月における 24時間の移動距離
筋肉繊維において ジストロフィンが発現している
ジストロフィン抗体 による免疫染色
Tedesco et al., SciTranslMed.,2011
モデルマウスで６ヶ月間 細胞治療の効果が観察された
移植
筋ジストロフィー�モデルマウス(mdx) �
a. DMD患者由来iPS細胞における遺伝子修復 b. mdxマウス由来中胚葉系血管芽細胞による遺伝子・細胞治療
Tedesco et al., SciTranslMed.,2012
筋ジストロフィーの遺伝子治療の試み�
ヒト染色体ベクターの課題�1．ヒト染色体はマウス細胞から脱落する傾向がある!2．各組織での保持率が一定ではない!�����（特に造血系細胞において保持率が低い）!3．ホモ化の効率が悪い!
CYP3A-HAC
Red:HAC Yellow: DMD
DYS-HAC
CYP3A:700kb � DMD:2.5Mb �
セントロメア�テロメア�
テロメア�
GFP �loxP�
HAC �
ヒト細胞・・・・・・・・・・○�マウス細胞・・・・・・・△�
ハムスター細胞・・・△�
HACベクターの課題�安定性�
HACベクターはヒト細胞で安定であるので、ヒト細胞での解析やヒトの遺伝子治療へは有効であるが、齧歯類細胞・動物では安定性の面で問題があった �
ラット細胞・・・・・・・・△�
ヒトセントロメア・・・ヒト人工染色体(HAC) !→ヒト細胞で安定!
マウスセントロメア・・・マウス人工染色体(MAC)! →マウスで安定？!
セントロメア�
マウス染色体�
遺伝子領域
テロメア�
テロメア�
不要な遺伝子領域を削除 セントロメア�テロメア�
テロメア�
GFP �loxP�
GFPおよびloxPを搭載
マウス人工染色体!(MAC)�
相同組み換え効率の高いDT40細胞を利用�
セントロメア テロメア
テロメア
GFP loxP
MAC
安定性
＜MACベクターの成果のまとめ＞
ヒト細胞、マウス細胞・個体、ハムスター細胞、ラット細胞・個体 において、長期培養後も90％以上の保持率で安定に維持される
ヒト細胞・・・・・・
マウス細胞・個体・・
ハムスター細胞・・・
ラット細胞・個体・・
MACへの遺伝子搭載方法�
1. Cre-loxPシステムによる単一ベクター挿入型!2. MIシステムによる複数ベクター導入型!3. Cre-loxPシステムによる染色体転座型�
目的に応じて搭載方法を選び、様々な遺伝子を導入することできる�
【発明の名称】マウス人工染色体ベクター（特願2010-001425）出願日2010.1.6!MAC・・・鳥取大（香月、押村）・クロモセンター!
【技術分野】!�本発明は、マウス体内で安定に保持され、かつ、子孫伝達可能なマウス人工染色体ベクターに関する。 ��本発明はまた、上記マウス人工染色体ベクターを保持する細胞に関する。 ��本発明はさらに、上記マウス人工染色体ベクターを保持する、マウスなどの非ヒト動物に関する。 !
【課題】マウス染色体断片由来のマウス人工染色体を提供する。!
【解決手段】マウス染色体由来の天然型セントロメア、セントロメア近傍のマウス染色体長腕の部位から長腕遠位を削除したマウス染色体由来の長腕断片、およびテロメア配列を含むこと、ならびに、齧歯類の細胞および個体組織において安定に保持されることを特徴とする、マウス人工染色体ベクター、ならびに、該ベクターを保持する細胞または非ヒト動物。 !
【請求項1】!�マウス染色体由来の天然型セントロメア、セントロメア近傍のマウス染色体長腕の部位から長腕遠位を削除したマウス染色体由来の長腕断片、およびテロメア配列を含むこと、ならびに、哺乳類の細胞および個体組織において安定に保持されることを特徴とする、マウス人工染色体ベクター。 �
PCT出願、各国審査中、日本において特許査定（2014.5月）�
代謝
催奇形性
毒性
がん原性
新薬開発上のスクリーニングに利用 ヒト型薬物代謝モデルマウス・ラット�
ヒトでの応答性を予測 薬効 薬・毒物・食品添加物・環境汚染物質・・・
ヒト薬物代謝�関連遺伝子搭載�MACベクター
ヒトに対する安全性予測の向上�医薬品開発のスピードアップと成功確率の向上�→新薬開発の低コスト化、国民医療負担減少�→国民の健康増進と経済活性化への貢献 �（ライフイノベーションの推進に貢献） �
成体特異的�3A4�
胎仔特異的� 3A7�
＜ヒトCYP3A導入マウスの作製に成功＞�
成体型CYP3A4は成体期に、 �胎仔型 CYP3A7は胎仔期に発現している�
3A4�
CYP3A4は肝臓と小腸に特異的に、 �CYP3A5は肝臓と小腸と肺に特異的に発現している�
肝臓�
3A5�
1. ヒトCYP3A クラスターのゲノムサイズは ̃700kb、CYP3A4, 5, 7, 43の分子種からなる�2. CYP3Aクラスターは重要な薬物代謝酵素のひとつ、市販の薬物の約50％を代謝する�3. CYP3A酵素には種差がある�
MACベクター�
CYP3A搭載�
CYP3A-MACベクター�ヒト化CYP3Aマウス�(CYP3A-MACマウス）�マウスに導入�
マウスCyp3a削除�
ヒトと同じ�遺伝子発現パターン �
ヒト化PXR/CYP3Aマウスの肝におけるリファンピシン投与の影響
0
1
2
3
4
5
6
oil PCN RIF
Relative CYP3A4 mRNA
levels
A B
1!
10!
100!
1000!
0! 2! 4! 6! 8!Time (hr)
Plasma triazolam conc. (nM) control
RIF ○
●
CYP3A4発現量（A）および活性（B）および血中濃度（C)に及ぼすリファンピシン (RIF) の影響
C
【発明の名称】!ヒトチトクロームP450遺伝子（クラスター）を含む哺乳動物人工染色体ベクター及びそれを保持する非ヒト哺乳動物（WO2009/063722）、優先日2007.11.14 特許第4997544号（登録日2012/05/25） �ヒト化CYP3Aマウス・・・キリン・鳥取大・クロモセンター!
【技術分野】!本発明は、ヒトチトクロームP450遺伝子を含むヒト7番染色体断片を保持しかつ子孫伝達可能な哺乳動物人工染色体ベクターに関する。 ��本発明はまた、上記ベクターを保持する非ヒト哺乳動物、例えばマウス、その細胞、器官又は組織に関する。 ��本発明はさらに、上記非ヒト哺乳動物、その細胞、器官又は組織を用いて、ヒトチトクロームP450を製造する方法、或いは薬物又は食品の薬理作用及び／又は代謝を試験する方法に関する。!
【請求項1】ヒトチトクロームP450遺伝子を含むヒト7番染色体断片を保持し、かつ、子孫伝達可能な哺乳動物人工染色体ベクターであって、該ヒト7番染色体断片が、染色体マーカーAC004922とAC073842との間に存在する少なくともヒトCYP3A遺伝子クラスターを含む約1Mb±500Kbサイズの領域を保持することを特徴とする、上記哺乳動物人工染色体ベクター。 !【請求項2】ヒト人工染色体ベクターである、請求項1に記載の哺乳動物人工染色体ベクター。 �【請求項3】前記ヒト人工染色体ベクターが、前記ヒト7番染色体断片を、ヒト14番染色体由来のSC20ベクター(FERM BP-7583)に転座して得られたベクターである、請求項2に記載の哺乳動物人工染色体ベクター。 �
鳥取県経済再生成長戦略による継続的な施策推進 【戦略推進分野】 バイオ・食品産業 ＋ 【新戦略】 医療イノベーション（創薬）
H25地域イノベーション戦略支援 プログラムによる事業推進
最先端設備の共用化�
バイオ人材育成�
知のネットワーク構築�地域内外の企業等から 研究者を招へい�
技術支援スタッフを充実し、 遺伝子改変・イメージング 機器等の利用促進 �
バイオビジネスに精通する 地域連携コーディネーター を配置
起業化精神の養成 実験動物高度技術者
バイオ産業集積に向けた各種施策 ・とっとりバイオフロンティアの管理運営 ��バイオ専門スタッフによる入居者支援
・ベンチャー支援制度 �低金利融資制度による円滑な資金調達 �創業支援制度による起業促進
・企業立地促進制度 �全国トップクラスの企業立地助成制度による バイオ関連企業の立地促進
・（地独）鳥取県産業技術センターによる 食品開発支援の強化 � 様々な試作加工機能、健康・美容関連分析 支援の充実強化
国内外のバイオ関連企業の誘致、新産業の創出!
（国の施策）!バイオベンチャー事業拡大、 健康食品企業等の集積!
�（県の施策）!
＋�
＜鳥取県産業振興機構＞�・創業支援センター・新事業創出部!・企業支援部���
＜鳥取大学＞�・産学・地域連携推進機構!・医学部!・工学部!・農学部!・その他関連学部等�
＜鳥取県産業技術センター＞�・食品開発研究所! ＜鳥取県商工会議所連合会＞!
＜鳥取県商工会連合会＞!＜鳥取県中小企業団体中央会＞�
＜鳥取銀行＞＜山陰合同銀行＞＜鳥取信用金庫＞!＜米子信用金庫＞<日本政策金融公庫鳥取支店>�
＜米子市＞!＜境港市＞�
関連機関�
研究者の集積�
事業化に向けた共同推進 �
平成25年度 文部科学省 地域イノベーション戦略支援プログラム事業�
テー
マ①�
国際標準化染色体!工学技術の事業化�
chromocenter �
発光レポーターシステムを用いたマウス等in vivoシステ ム に よ る 創 薬 支!援ツールの事業化!
テー
マ�③�
ジーピーシー!研究所�
iPS細胞等を用いた再生医療・動物モデル作製のための国際標準化染色体解析技術の事業化�
テー
マ�⑤�
chromocenter �
治療薬開発のための疾患モ デ ル 細 胞 ・ 動 物!の開発と事業化�
テーマ
⑦�
鳥取大学発!ベンチャー�
ヒト薬物代謝モデル細胞・動物による創薬支援ツール の 事 業 化!
chromocenter �テー
マ
②�
発光レポーターシステムを用いたiPS細胞等in vitroシステムによ る 創 薬 支 援 ツ ー ル!の事業化!
鳥取大学発!ベンチャー�
テー
マ�④�
iPS細胞等を用いた遺伝子・再 生 医 療 用 細 胞 の 開!発と事業化�
鳥取大学発!ベンチャー�
テー
マ�⑥�
抗体医薬品等機能性タンパ ク 質 発 現 シ ス テ!ム開発と事業化�
ｼﾞｰﾋﾟｰｼｰ研究所�/chromocenter!
テー
マ�⑧�
企業への期待・要望�
• 細胞融合・遺伝子導入の技術を持つ、企業との共同研究を希望。 �
• 複数遺伝子・巨大遺伝子の安定発現株を利用されたい企業からの問合せを希望。 �
• ゲノム編集技術を開発中の企業、医薬品開発ツール開発への展開を考えている企業との共同研究を希望。
• とっとりバイオフロンティアを利用されたい企業、鳥取県成長戦略を利用した企業における実用化を希望。 �
本技術に関する主な知的財産権�• 発明の名称 �：ヒトチトクロームP450遺伝子を含む哺乳動物人工染色体ベクター及びそれを保持する非ヒト哺乳動物�
• 特許番号 �：特許第4997544号（2012/05/25） • 出願人 �：鳥取大学、株式会社chromocenter �• 発明者 �：押村光雄、香月康宏、松岡�隆之、富塚一磨、大島毅
• 発明の名称 �：内在遺伝子を含まないヒト人工染色体ベクター�• 特許番号 �：特許第4895100号（2012/01/06） • 出願人 �：鳥取大学、株式会社chromocenter �• 発明者 �：押村光雄、香月康宏、松岡隆之
• 発明の名称 �：マウス人工染色体ベクター�• 公開番号 �： WO2011/083870�A1（2011/07/14） • 出願人 �：鳥取大学、株式会社chromocenter �• 発明者 �：押村光雄、香月康宏、滝口正人、松岡隆之
お問い合わせ先�
鳥取大学 産学・地域連携推進機構
知的財産管理運用部門長・教授 三須 幸一郎
ＴＥＬ ：０８５７‐３１‐６０００
ＦＡＸ ：０８５７‐３１‐５４７４
e-mail ： chizai＠adm.tottori-u.ac.jp
鳥取大学 染色体工学研究センター
バイオモデル動物開発部門・助教 香月 康宏
ＴＥＬ ：０８５９‐３８‐６２１９
ＦＡＸ ：０８５７‐３８‐６２１０
e-mail ：[email protected]