项目三血细胞化学染色

细胞学和化学相结合而形成的一门科学，是以细胞形态学为基础，结合运用化学反应的原理对血细胞内的各种特定的化学成分( 如酶类、酯类、铁、蛋白质、核酸等 ) ，作定性、定位、半定量分析的方法。

定义概述细胞化学染色

原粒原单原淋

POX染色+ 弱 + -

概述基本步骤

固定

显示

复染

概述

固

定物理法化学法

干燥固定

火焰固定

蒸汽固定

液体固定

概述偶氮偶联法

雪夫反应

联苯胺法

普鲁士蓝反应

金属沉淀法

显示

使各种细胞能显示出来以便于观察。

复染

概述

临床应用

概述辅助判断急性白血病的细胞类型

辅助血液系统等疾病的诊断和鉴别诊断观察疾病疗效和预后

探讨发病机制

酯酶染色（ SE 、 NSE ）苏丹黑染色（ SBB ）

细胞化学染色

糖原染色（过碘酸 - 雪夫反应）（ PAS ）中性粒细胞碱性磷酸酶染色（ NAP ）酸性磷酸酶染色（ ACP ）

铁染色

过氧化物酶染色（ POX ）

一、过氧化物酶（ POX ）染色【原理】

四甲基联苯胺法： H2O2

过氧化物酶新生态氧四甲基联苯胺联苯胺蓝亚硝基铁氢化钠稳定的蓝色颗粒（胞浆）

一、过氧化物酶（ POX ）染色【结果】胞浆中出现蓝色或蓝黑色颗粒为阳性。

1.中性成熟粒细胞，呈强阳性； 2.晚幼红细胞，呈阴性；3.单核细胞，呈弱阳性； 4.浆细胞，呈阴性

一、过氧化物酶（ POX ）染色【正常血细胞的染色反应】 1.粒细胞系统 •分化差的早期原始粒细胞为阴性，•分化好的晚期原始粒细胞至中性成熟粒细胞均呈阳性，中性分叶核粒细胞呈强阳性，衰老的粒细胞阳性程度减弱甚至呈阴性；•嗜酸性粒细胞反应呈强阳性，嗜碱性粒细胞为阴性。

一、过氧化物酶（ POX ）染色【正常血细胞的染色反应】 2.单核细胞系统 • 原始单核细胞呈阴性，• 幼稚及成熟单核细胞多呈弱阳性，其颗粒细少稀疏，分布不均。 3.其他细胞 • 淋巴细胞系统、红细胞系统及巨核细胞系统的细胞均呈阴性，浆细胞、组织细胞也呈阴性，•吞噬细胞有时呈阳性。

一、过氧化物酶（ POX ）染色

成熟中性粒细胞 POX活性的变化

临床意义

最重要的细胞化学染色；是辅助判断急性白血病细胞类型的首选

鉴别急性白血病的类型

一、过氧化物酶（ POX ）染色【临床意义】

1.鉴别急性白血病的类型（ 1 ）鉴别 ALL和 AML的重要指标。 • AML-M2、 M3、 M4——原始粒细胞可呈阳性。• AML-M4、 M5——原始、幼稚单核细胞多呈弱阳性或阴性。• ALL——原始和幼稚淋巴细胞均呈阴性。（ 2 ）鉴别 AML-M3与 M5

急性粒细胞白血病（ M3b) 的 POX染色早幼粒细胞均呈阳性或强阳性

急性粒 - 单核细胞白血病（ M4a、 M4Eo）的 POX染色原始、幼稚粒细胞均呈阳性、嗜酸粒呈强阳性原始、幼稚单核细胞均呈弱阳性

急性单核细胞白血病的 POX染色1.中性成熟粒细胞，呈强阳性； 2.原始单核细胞，呈阳性；3.原始单核细胞，呈弱阳性；其他原幼单核细胞呈阴性

ALL 的 POX染色2 个中性成熟粒细胞，呈强阳性；其他原、幼淋巴细胞均呈阴性


（ 3 ）鉴别 M5 与组织细胞白血病、恶性组织细胞病• AML-M5 ——幼单核细胞和单核细胞呈弱阳性。 • 异常组织细胞的过氧化物酶呈阴性


2.成熟中性粒细胞过氧化物酶活性的变化活性增高：见于再生障碍性贫血、感染、 ALL、

CLL。活性减低：见于 AML、 CML、 AML-M5、 MDS、放射病及退化性中性粒细胞。

二、苏丹黑（ SBB ）染色【原理】

苏丹黑 B 是一种脂溶性重氮染料，能溶解于细胞内的含脂结构（如中性脂肪、磷脂、糖脂和类固醇）中，使脂类物质呈棕黑色或深黑色而显示出来。脂类物质在粒细胞中含量丰富，在单核细胞中也有少量。

二、苏丹黑（ SBB ）染色【正常血细胞的染色反应】

结果与 POX染色基本一致【临床意义】

与 POX 染色基本相同， POX 染色特异性高，但 SBB 比 POX 敏感。

M1-SBB(+)

M2-SBB(+)M5-SBB(弱+)

四、过碘酸 - 雪夫（ PAS）反应【原理】

含乙二醇基的多糖过碘酸双醛基 + 无色品红（ -CHOH-CHOH）（ -CHO-CHO） ( 雪夫试

剂 )

紫红色化合物（定位于胞浆中）称过碘酸 - 雪夫（ PAS）反应，以前又称为糖原染色

【正常血细胞的染色反应】

【正常血细胞的染色反应】1 、粒系：原粒（ - ），以后阶段（ + ）且越成熟阳性越强，阳性率达 67.2％，嗜酸（浆）、嗜碱（颗粒）（ + ）2 、淋巴系：原淋（ + ）或（ - ），成熟（ + ）阳性率 10-50％，多 20％；3 、红系：呈（ - ）；4 、巨核细胞：呈强（ + ）。5 、单核系：分化差原单（ - ），其他弱（ + ）。

四、过碘酸 - 雪夫（ PAS）反应

正常血细胞 PAS染色1.原始粒细胞（ - ） 2.早幼粒细胞（ + ）　 3.中性中幼粒细胞（ ++）　

4.中性晚幼粒细胞（ +++） 5.中性杆状核粒细胞（ ++++）　 6.中性分叶核粒细胞（ ++++） 7.嗜碱性粒细胞（ +++） 8.嗜酸性粒细胞（ +++）　 9.单核细胞（±）

10.淋巴细胞（ ++++）

【临床意义】

1 、红细胞系统疾病鉴别 M6 与巨幼细胞性贫血： M6 ：幼红细胞 PAS 强（ + ），积分率明显↑。巨幼贫、再障：幼红细胞（ - ）。


【临床意义】2 、白细胞系统疾病鉴别三种急性白血病急粒：（ - ）或弱 + 急淋：强（ + ）急单：（ + ），强弱不定3 、鉴别戈谢病和尼曼 - 匹克病戈谢细胞强（ + ），尼曼 - 匹克细胞呈（ - ～弱+ ）。


糖原染色（ PAS染色）A 、 AML-M6（ + ）； B 、 MA（ - ）

PAS 染色 A 、 CLL ； B 、 ALL原始、幼稚淋巴细胞均阳性，呈粗颗粒状阳性幼稚红细胞阴性

【原理】偶氮偶联法（ Kaplow法）碱性磷酸酶磷酸萘酚钠磷酸钠 + 萘酚 + 重氮盐 PH9.2-9.8

有色偶氮染料

五、中性粒细胞碱性磷酸酶（ NAP）染色

中性粒细胞碱性磷酸酶染色1.中性成熟粒细胞（ + ）； 2.中性成熟粒细胞（ ++）； 3.成熟中性粒细胞（ +++）；

4.成熟中性粒细胞（ ++++）； 5.淋巴细胞（ - ）


1.NAP主要存在于成熟中性粒细胞中，成熟中性粒细胞呈阳性反应，其他细胞基本呈阴性。


2. 坚牢蓝 RR 阳性为紫黑色颗粒，坚牢蓝 GBC 阳性为棕红色沉淀。

碱性磷酸酶（ NAP ）染色+ + - -

+++++++++ ++++

【参考范围】阳性率＜ 40％； NAP的积分值为 30～

130分。 ( 各单位应建立本实验室参考值 )


计数 100个成熟中性粒细胞，按其反应强度分级，各级百分率与其级数乘积的总和，即为积分。例如： NAP 反应结果（ % ）（ - ）（ + ）（ ++ ）（ +++ ）（ ++++ ） 20 40 20 15 5 积分 = （ 1×40 ） + （ 2×20 ） + （ 3×15 ） + （ 4×5 ） =145

【积分方法】血片

【临床意义】 1 、生理性变化：新生儿、儿童 NAP活性较成人高；紧张、剧烈运动、经前期、妊娠期活性增高。


【临床意义】2 、疾病的鉴别（ 1 ）鉴别感染性疾病：病毒性感染：↓；细菌感染：↑（ 2 ）鉴别慢粒及类白：慢粒：↓↓；类白血病：↑↑（ 3 ）急性白血病类型的鉴别：急粒：↓；急单：正常或↓；急淋：↑。


（ 4 ）再障和 PNH的鉴别：再障时，酶活性 ↑ ； PNH时，酶活性 ↓ 。（ 5 ）恶性淋巴瘤与恶性组织细胞病的鉴别：恶性淋巴瘤常↑，恶性组织细胞病常↓。（ 6 ）恶组与反应性组织细胞增多症的鉴别：前者常↓，后者无变化。


（ 7 ）真红与继发性红细胞增多症鉴别：真红常↑，后者无变化。（ 8 ）原发性与继发性血小板增多症鉴别：前者常↑，后者无变化。注意：垂体、肾上腺皮质功能亢进及应用皮质激素时， NAP活性增强。


细菌性感染 NAP 染色成熟中性粒细胞（ ++ ）

CML NAP 染色成熟中性粒细胞（ - ）

ALL NAP 染色淋巴细胞（ - ）、中性粒细胞（ ++ ）

真性红细胞增多症 NAP 染色1.中性成熟粒细胞（ +++）； 2.中性成熟粒细胞（ ++）； 3.淋巴细胞（ - ）

【原理】

偶氮偶联法：血细胞内的酸性磷酸酶在酸性（ pH 5.0）条件下水解基质液中的磷酸萘酚 AS-BI，释放出萘酚 AS-BI，后者与基质液中的重氮盐（如：六偶氮付品红）偶联形成不溶性的有色沉淀（红色），定位于细胞质内酶所在的部位。

六、酸性磷酸酶（ ACP）染色

【原理】抗酒石酸酸性磷酸酶染色：用相同方法制备两份基质液，一份加入适量的 L-

酒石酸（左旋酒石酸） , 另一份不加酒石酸。取两张相同标本的涂片，分别用这两种不同的基质液做酸性磷酸酶染色。如果血细胞内的酸性磷酸酶耐 L-酒石酸，两张涂片均呈阳性；如不耐 L-酒石酸，不加 L-酒石酸的涂片呈阳性反应，而加 L-酒石酸呈阴性反应。



粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、巨核细胞、血小板、浆细胞、巨噬细胞均呈阳性。


【临床意义】1. 诊断多毛细胞白血病多毛细胞呈阳性（常呈强阳性），阳性反应不被 L-酒石酸抑制。 CLL的淋巴细胞和恶性淋巴瘤细胞 ACP染色也可呈阳性，但可被 L-酒石酸抑制。2. 鉴别戈谢细胞和尼曼 - 匹克细胞前者阳性，不被 L-酒石酸抑制；后者阴性。3. T淋巴细胞和 B 淋巴细胞的鉴别 T 淋巴细胞 ACP呈阳性反应； B 淋巴细胞 ACP呈阴性或弱阳性反应。


多毛细胞白血病酸性磷酸酶染色多毛细胞呈阳性反应

三、酯酶染色

根据酯酶特异性高低分为 :

特异性酯酶 ( 氯乙酸 AS-D萘酚酯酶 )

非特异性酯酶 pH值不同

酸性酯酶 ( 酸性 α- 醋酸萘酚酯酶 )

碱性酯酶 ( α-丁酸萘酚酯酶 )

中性酯酶 α- 醋酸萘酚酯酶

醋酸 AS-D萘酚酯酶

中性粒细胞类

单核巨噬细胞类

【原理】

血细胞内的氯乙酸 AS-D萘酚酯酶水解基质液中的氯乙酸 AS-D萘酚，产生 AS-D萘酚，进而与基质液中的重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质内酶所在的部位。本试验常用的重氮盐为坚牢紫酱 GBC，形成的有色沉淀为红色。

（一）氯乙酸 AS-D 萘酚酯酶 (NAS-DCE)染色

（一）氯乙酸 AS-D 萘酚酯酶 (NAS-DCE)染色【正常血细胞的染色反应】1.粒细胞系统分化差的原始粒细胞呈阴性，分化好的呈阳性，自早幼粒细胞至成熟中性粒细胞均呈阳性。嗜酸性粒细胞呈阴性或弱阳性，嗜碱性粒细胞呈阳性。2.单核细胞系统绝大多数为阴性。3.其他细胞如淋巴细胞、浆细胞、巨核细胞、有核红细胞、血小板等均呈阴性；肥大细胞呈阳性。

【临床意义】1.急性粒细胞白血病原始粒细胞呈阳性或阴性。2.急性早幼粒细胞白血病早幼粒细胞呈强阳性。3.急性单核细胞白血病原始单核及幼稚单核细胞几乎呈阴性。4.急性粒 - 单核细胞白血病原始粒细胞及早幼粒细胞呈阳性，原始单核及幼稚单核细胞呈阴性。5.急性淋巴细胞白血病和急性巨核细胞白血病白血病细胞均呈阴性。

（一）氯乙酸 AS-D萘酚酯酶 (NAS-DCE)染色

急性粒细胞白血病（ M2a ）氯乙酸 AS-D萘酚酯酶染色1.原始粒细胞，呈弱阳性； 2.幼稚粒细胞，呈强阳性； 3.中性杆状核粒细胞，呈强阳性

【原理】

血细胞内的 α-醋酸萘酚酯酶在 pH中性的条件下，水解基质液中的 α-醋酸萘酚，释放出 α-萘酚，进而与基质液中的重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质内酶所在的部位。常用的重氮盐为坚牢蓝 B ，形成棕黑色或灰黑色沉淀。

（二） α-醋酸萘酚酯酶 (α-NAE)染色


1.单核细胞系统分化差的原始单核细胞呈阴性，分化好的原始单核细胞呈阳性，幼稚单核及单核细胞也呈阳性，阳性反应能被氟化钠抑制。2.粒细胞系统各期粒细胞多数呈阴性，少数呈弱阳性，阳性反应不能被氟化钠抑制。



3.淋巴细胞系统各期淋巴细胞多呈阴性，少数呈弱阳性，阳性反应不能被氟化钠抑制。4.其他细胞巨核细胞和血小板呈阳性，阳性反应不能被氟化钠抑制；少数有核红细胞呈弱阳性，阳性反应不能被氟化钠抑制；浆细胞呈阴性。


【临床意义】

1.急性单核细胞白血病单核系细胞多呈阳性，阳性反应能被氟化钠抑制。2.急性粒细胞白血病原始粒细胞呈阴性或弱阳性，阳性反应不能被氟化钠抑制。3.急性早幼粒细胞白血病早幼粒细胞呈强阳性，阳性反应不能被氟化钠抑制。


【临床意义】

4.急性淋巴细胞白血病原始淋巴细胞及幼稚淋巴细胞呈阴性或阳性，阳性反应不被氟化钠抑制。5.急性粒 - 单核细胞白血病原始粒细胞呈阴性至阳性，阳性反应不被氟化钠抑制；原始单核及幼稚单核细胞呈阳性，单核系阳性反应能被氟化钠抑制。


A 图：急性单核细胞白血病 α-NAE染色原始、幼稚单核细胞多呈强阳性

B 图：急性单核细胞白血病 α-NAE氟化钠抑制染色

原始、幼稚单核细胞阳性反应被氟化钠抑制（与 A 图为同一标本）

A

B

【原理】

血细胞内的 α-NBE在 pH碱性条件下，水解基质液中的 α-丁酸萘酚，释放出 α-萘酚，进而与基质液中的重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质内酶所在的部位。本试验常用的重氮盐为坚牢紫酱 GBC，形成的有色沉淀为红色。

（三） α-丁酸萘酚酯酶（ α-NBE）染色

【正常血细胞的染色反应】1.粒细胞系统各阶段粒细胞呈阴性。2.单核细胞系统分化差的原始单核细胞呈阴性，分化好的原始单核细胞呈阳性，幼稚单核及单核细胞呈阳性，阳性反应能被氟化钠抑制。3.淋巴细胞系统 T 淋巴细胞、非 T 非 B 淋巴细胞可呈阳性， B 淋巴细胞呈阴性。4.其他细胞巨核细胞、有核红细胞、浆细胞呈阴性或弱阳性；组织细胞也可呈阳性，但不被氟化钠抑制。


【临床意义】与 α-NAE染色的临床意义相同。


【原理】

血细胞中的酸性 α-醋酸萘酚酯酶在 pH弱酸性(pH 5.8)条件下，可水解基质液中的 α-醋酸萘酚，产生 α-萘酚，进而与重氮盐六偶氮付品红形成不溶性红色沉淀，定位于细胞质内酶所在的部位。

（四）酸性 α-醋酸萘酚酯酶（ ANAE）染色


1.单核细胞系统单核系细胞常呈弥散型强阳性，阳性反应可被氟化钠抑制。2.淋巴细胞系统 T 淋巴细胞呈阳性，而 B 淋巴细胞多数呈阴性。3.其他细胞粒系细胞一般为阴性或弱阳性，但此反应不被氟化钠抑制；红系细胞、巨核系细胞含量较少。


【临床意义】

1.可粗略地鉴别 T 、 B 淋巴细胞： T 淋巴细胞呈点样颗粒或块状阳性； B 淋巴细胞多呈阴性。2.鉴别其它急性白血病细胞类型同 α-NAE染色。3.多发性骨髓瘤、多毛细胞白血病细胞多为阳性；恶性组织细胞病呈强阳性；霍奇金淋巴瘤网状高铁红细胞 (R-S细胞 ) 呈阳性。


【目的】

1 ．掌握骨髓铁染色的检测方法、结果分析及临床意义。 2 ．熟悉骨髓铁染色的原理及注意事项。

七、铁染色

【原理】

正常人骨髓中的贮存铁以铁蛋白和含铁血黄素的形式贮存，主要存在于骨髓小粒和幼红细胞中。骨髓中的铁在酸性环境下与亚铁氰化钾作用，形成普鲁士蓝色的亚铁氰化铁沉淀，定位于含铁的部位。

七、铁染色

【试剂器材】

1 ．器材新鲜骨髓片、显微镜、染色缸、水浴箱等。2 ．试剂（ 1 ）固定液： 95％乙醇。（ 2 ）酸性亚铁氰化钾溶液（临用前配制）。（ 3 ） 2g/L核固红 - 硫酸铝溶液。

七、铁染色

【操作】

1 ．固定选髓粒丰富的骨髓涂片用乙醇固定 10min，待干。2 ．显示浸入新配制的酸性亚铁氰化钾染液中，置 37℃培养箱染色 30min。蒸馏水冲洗。3 ．复染置核固红液染 3 ～ 5min。流水冲洗，干后镜检。

七、铁染色

含铁蛋白的幼红细胞：铁粒幼红细胞含铁蛋白 6 个以上，环核 2/3以上：环形铁粒幼红细胞含铁蛋白的红细胞：铁粒红细胞P83

• 贮存铁• 贮存部位：铁主要贮存在肝、脾和骨髓中。• 贮存形式：•（ 1 ）铁蛋白（细胞内铁）•（ 2 ）含铁血黄素存在于巨噬细胞等多种细胞中（细胞外铁）

外壳Fe2+ 中心腔（含铁丰富）

去铁蛋白


骨髓中的贮存铁分为细胞外铁和细胞内铁。细胞外铁主要存在于骨髓小粒的巨噬细胞中，细胞内铁是指存在于中幼红细胞、晚幼红细胞及红细胞中的铁（铁粒幼红细胞、铁粒红细胞）。

七、铁染色


1.细胞外铁观察骨髓小粒中的铁，阳性结果呈弥散性、颗粒状、小珠状或块状蓝色。根据骨髓小粒中铁的存在方式及量，将细胞外铁分为（ - ）、（ + ）、（ ++）、（ +++）、（ ++++）。

七、铁染色

A骨髓细胞外铁染色 A 图：细胞外铁 + ； B 图：细胞外铁 ++

B

骨髓细胞外铁染色 C 图：细胞外铁 +++ ； D 图：细胞外铁 ++++

C D


2.细胞内铁观察 100个中幼红细胞和晚幼红细胞，计算出铁粒幼红细胞的百分比。铁粒幼红细胞：指胞质中出现蓝色铁颗粒的幼红细胞，根据蓝色铁颗粒的多少及粗细，分为： Ⅰ 型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型及环形铁粒幼红细胞。环形铁粒幼红细胞：指幼红细胞胞质内含铁粒 6 颗以上，并环绕细胞核排列超过核周径 2/3以上者。铁粒红细胞：指成熟红细胞中出现铁颗粒。

七、铁染色

骨髓细胞内铁染色1.环形铁粒幼红细胞； 2.铁粒幼红细胞

【参考范围】1.细胞外铁（ + ）～（ ++）。2.细胞内铁铁粒幼红细胞阳性率在 12％～ 44％。以 Ⅰ型为主，少数为Ⅱ型。无环形铁粒幼红细胞及铁粒红细胞。不同的实验室其细胞内铁的参考范围相差较大，所以要建立自己实验室的参考范围。

七、铁染色

【临床意义】

主要用于缺铁性贫血和环形铁粒幼红细胞增多性贫血的诊断和鉴别诊断。1.缺铁性贫血其细胞外铁明显减少甚至阴性，细胞内铁阳性率减低或为零。经铁剂治疗有效后，其细胞内铁、外铁增多。因此铁染色可作为诊断缺铁性贫血及指导铁剂治疗的重要方法。

七、铁染色

骨髓铁染色• 细胞外铁－阴性，• 细胞内铁－减少

－诊断 IDA 直接可靠的方法

外铁：阴性，骨髓细胞外基质中无铁颗粒。

内铁：减少，幼红细胞内未见铁颗粒。

【临床意义】

2.铁粒幼细胞贫血铁粒幼红细胞增多，其中的环形铁粒幼红细胞增多，有时可见到铁粒红细胞，细胞外铁也明显增多。因此铁染色可作为诊断本病的重要方法。

七、铁染色

铁粒幼细胞贫血（ SA ）细胞外铁及细胞内铁均增多

环形铁粒幼红细胞

【临床意义】

3.骨髓增生异常综合征伴环形铁粒幼红细胞增多的难治性贫血，其环形铁粒幼红细胞大于 15％，细胞外铁也常增加。

七、铁染色

【临床意义】

4.非缺铁性贫血溶血性贫血、巨幼细胞性贫血、再生障碍性贫血、多次输血后和白血病等，细胞外铁和内铁正常或增加；感染、肝硬化、慢性肾炎、尿毒症、血色病等，细胞外铁明显增加而铁粒幼红细胞可减少。

七、铁染色

细胞化学染色

小结

M3 M1 、 M2a M5 ALL

POX染色强阳性阳性或阴性阴性或弱阳性阴性SB染色强阳性阳性或阴性阴性或弱阳性阴性NAS-DCE染色强阳性阳性或阴性阴性或弱阳性阴性α-NAE染色强阳性阴性或阳性阳性或强阳性阴性或阳性α-NAE+NaF 不抑制不抑制抑制不抑制α-NBE染色阴性阴性阳性阴性α-NBE染色 + NaF

/ / 抑制 /

PAS染色阳性（弥散状）阳性（弥散状）阳性（细颗粒状）阳性（粗颗粒状）

四种常见类型急性白血病的染色结果

常用细胞化学染色与急性白血病亚型诊断思路

项目三 血细胞化学染色

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项目三血细胞化学染色