バイオ医薬品の変革 糖鎖解析に奮闘する、すべての研究者へ

• グリコフォーム分析• 糖ペプチド解析• オリゴ糖分析• 単糖組成分析

Thermo Scientificバイオ医薬品の糖鎖解析

S O L U T I O N C A T A L O G U E S E R I E S

2

WHAT ?1

2

糖鎖の特性解析その困難な課題も克服できます

抗体医薬などのタンパク質性バイオ医薬品は、その有効性の高さにより、もっとも急成長している医薬品類です。このようなバイオ医薬品類は複雑な特性を持っており、品質、有効性、安全性を確保する上でさまざまな課題が医薬品開発者に投げかけられています。製薬業界では、バイオ医薬品の特性解析という課題を克服し、医薬品として承認を得るために、今まさに科学的な変革の時期を迎えています。

グリコフォームのパターンってどうなっているの？

グリコフォーム分析

WHERE ?糖鎖の結合部位ってどこだろう？

糖ペプチドのプロファイリング

3

43

WHICH ?どんな糖鎖が付いているの？濃度はどのくらいだろう？

糖鎖構造の確認

WHAT ?糖の組成ってどうなっているの？

単糖組成分析

バイオ医薬品を開発する上で、タンパク質に結合した糖鎖の特性解析は必須の試験項目ですが、より詳細な解析が求められており、困難が伴います。しかし、先端テクノロジープラットフォームを用いて四つのシンプルなワークフローに従うと、困難な課題も克服できます。

バイオ医薬品の活性、動態、安全性に重要な役割を果たす糖鎖

4

WHAT ?グリコフォームのパターンってどうなっているの？

グリコフォーム分析のワークフロー

インタクト糖タンパク質

まず、分析する前に精製した抗体および大きなタンパク質を還元します。

糖タンパク質の分離

最先端のイオン交換または疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムを用いれば、還元した抗体のフラグメントを完全に分離できます。

液体クロマトグラフィー

複雑な分子変化体を単純化するには、再現性の高いバイオコンパチブルクロマトグラフィーが効果的です。

糖タンパク質の質量の確認

分析には高い分解能と質量精度が求められます。また、スペクトルを解析するにはデコンボリューションソフトウェアも必要です。

糖鎖の不均一性を評価するには、グリコフォームのプロファイリングを行い、糖鎖のパターンと割合を確かめる必要があります。高分解能・精密質量分析計および高速液体クロマトグラフィーを用いれば、タンパク質や抗体におけるさまざまなグリコフォームの知見が得られ、もっとも効果的にグリコフォーム分析を行うことができます。

質量分析計（MS）による分析

精密質量により確認されたリツキシマブのグリコフォームのデコンボリューションスペクトル

リツキシマブのスペクトル（拡大図は種々のグリコフォームのピーク）

146925.606146619.406 148010.563162 Da 162 Da162 Da 162 Da162 Da

146619.406Man5/Man5

(G1F/G2F)SA1

(G1F/G2F)SA2

G1F/G2FSA2

G1F/G2FSA1

146541.406

146925.606

Man5/Man5(G2F/G2F)SA2

+2740.35+2673.54

+2513.07

(G2F/G2F)SA1

100

80

60

40

20

0

0

1

2

3

4

146600mass

mass

abun

danc

eab

unda

nce

146800 147000 147200 147400 147600 147800 148000 148200

146600

146698.328

146858.797

147075.969 147237.734 147399.516 147561.766 147721.813 147854.688

148010.563 148144.984148307.484

146800 147000 147200 147400 147600 147800 148000 148200

146698.328 146858.797

147075.969

147237.734147399.516

147561.766

147721.813147854.688 148144.984 148307.484

NL: 9.34E7

NL: 9.34E7

162 Da

または

質量

質量

存在量

存在量

相対存在量

拡大相対存在量

m/z

5

Thermo Scientifi c™ MAbPac™ カラムは、疎水性相互作用（HIC）、イオン交換（IEC）、サイズ排除（SEC）および逆相（RP）クロマトグラフィーで構成されており、モノクローナル抗体 （mAb）や関連する物質を分離するために設計されています。これらのカラム独自の化学的性質により、高い分離能、優れた生体物質への適合性および相補的な選択性が得られ、mAbや関連物質の広範なアッセイに適応します。

抗体の分子変化体およびフラグメントの分離

Thermo Scientific Protein Deconvolution ソフトウェアを利用すると、高い生産性と信頼性を確保しながらインタクトタンパク質のスクリーニング、同定および特性解析を行えます。このソフトウェアは、1種類ではなく2種類のデコンボリューションアルゴリズムを使用します。一つ目のアルゴリズムは、Thermo Scientific

オービトラップシリーズの質量分析計によって得られる高品質、高分解能・精密質量のデータに生かされます。二つ目のアルゴリズムは、質量スペクトルピークが同位体分離されていない低分解能のスペクトルに活用されます。

タンパク質スペクトルのデコンボリューション

MAbPac RP カラムを用いた、セツキシマブの分子変化体の分離

0.0 1.3 2.5 3.8 5.0 6.3 7.5 8.8 10.0 12.0

Cetuximab - MAbPac RP

min

多くのバイオ医薬品および生物学的研究において、未変性（インタクト）の状態のタンパク質を分析することが求められます。Thermo Scientific Exactive™ Plus EMR 質量分析計は、比類ない高分解能・精密質量分析という特長と、広い測定範囲（EMR）という特長を兼ね備えており、未変性の状態に近い三次構造や四次構造のタンパク質の構造やトポロジーの研究に適した優れたツールです。モノクローナル抗体、抗体薬物複合体 （ADC）、PEG化タンパク質、オリゴマー化タンパク質ベースの医薬品およびグリコフォームの高性能スクリーニングに適しています。

インタクトタンパク質の分析

最高 m/z 20,000 の広い測定範囲（EMR）で高質量のイオンの検出も向上

セツキシマブ - MAbPac RP

分

6

WHERE ?糖鎖の結合部位ってどこだろう？

糖ペプチドのマッピングワークフロー

インタクト糖タンパク質

抗体または糖タンパク質を精製します。

糖ペプチドに消化

ハイスループットを可能にする消化キットを用いれば、1時間以内で再現性よく消化できます。

糖ペプチドの分離

最先端のUHPLCカラムを用いると糖ペプチドをより高速に分離できます。

分析およびマッピング

日常的なペプチドマッピングでは、糖ペプチドを含むタンパク質の配列情報を確認しますが、最先端のMSフラグメンテーションなら糖ペプチドの正確な位置情報も得られます。

オービトラップ質量分析計の Thermo Scientifi c Q

Exactive™ シリーズに、包括的なマッピングを行えるタンパク質性バイオ医薬品向け最新ソフトウェア（Thermo Scientifi c PepFinder™）を組み合わせることで、糖ペプチドを迅速かつ正確にマッピングすることが可能になります。

より高度に糖ペプチドの特性解析を行うためには、マルチフラグメンテーションが必要です。HCD高エネルギー衝突解離を利用すると、糖鎖組成に関する情報が得られます。一方、ETD（電子移動解離） ではペプチド主鎖上の広範なフラグメント情報が得られ、これを利用することにより、グリカン結合を維持しながら、グリコシル化部位を特定しつつ、ペプチドの配列解析を行うことができます。Thermo Scientifi c Orbitrap Fusion™

Lumos™ トライブリッド 質量分析計は、ETDも利用することができます。

分析およびマッピング

Thermo Scientific SMART Digest™ キットは、高い再現性、選択性および迅速な分析が求められるバイオ医薬品のアプリケーション用に設計されています。独自に最適化された熱安定性のある固定化トリプシン技術を使用しており、ハイスループットなワークフローに最適なキットです。SMART Digest はわずか

1時間で完全に抗体を消化でき、溶液中での消化方法と比べて最大 23 時間も時間を短縮できます。

糖鎖分析は、ペプチドレベルでも行うことができ、ペプチド配列やグリコシル化部位の特定、糖鎖の構成も確認できます。

消化

バイオコンパチブルのThermo Scientifi c Vanquish™

UHPLC システムと、Thermo Scientifi c Accucore™

C18 または Acclaim™ 120 RS UHPLC カラムを併せて使用することで、高速性と高い分離能をもたらし、わずか数分で糖ペプチドを分離できます。

ペプチドの分離

7

シンプルかつ最先端のペプチドマッピングソフトウェアPepFinder ソフトウェアでは、質量分析データを用いてバイオ医薬品や他のタンパク質を正確に同定し、詳細な特性解析や相対定量も行えます。糖ペプチドの同定やジスルフィド結合マッピング、翻訳後修飾の定量などのワークフローの自動化にも対応します。さらに従来の時間のかかるマニュアルプロセスや複雑なデータ処理も自動化し、得られた結果を簡潔で有益なレポートにまとめます。

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rela

tive

Abun

danc

e

C6H

8NO

2C7

H8N

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Hex

Hex

NAc

-36

Hex

NAc

-18

Hex

NAc

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Neu

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b6++

Hex

NAc

Hex

y7++y3

b5 Pep+

Hex

NAc

4+

Hex

Neu

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Ac

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NAc

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y6Pep+

2Hex

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+2H

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Pep3+

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NAc

+3H

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Pep+

Hex

NAc

3+

Pep+

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NAc

+3H

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y7b9 Pep+

3Hex

NAc

+4H

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Pep+

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Pep+

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NAc

+Hex

3+

Pep+

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NAc

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Pep+

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NAc

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Pep+

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Pep+

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NAc

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Pep+

2Hex

NAc

+3H

ex2+

b16

G H G H R N G T G H G N S T H H G P E Y M RHCD

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000m/z

0

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20

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G H G H R N G T G H G N S T H H G P E Y M R

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200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000m/z

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Hex

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c5

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z4z10++ Hex

Hex

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Neu

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z15++c14++b14++

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c13++c12++

M+e

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M+2

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c14+++

z12+++z13+++z14+++

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M_5

+ - H

exN

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Hex

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c6z7c9 b10z8 z21+++_Iso1

c21+++_Iso1y7

G H G H R N G T G H G N S T H H G P E Y M REThcD

z17+++_Iso1

M+e

M+2

e

M+3

e

Orbitrap Fusion Lumos トライブリッド質量分析計は、もっとも高感度なオービトラップ質量分析計であり、探索を目的とした詳細な実験から複雑な翻訳後修飾の特性解析、さらに包括的な定性／定量分析まで、広範な分析ワークフローをサポートします。マルチフラグメンテーション技術 （CID、HCDおよびETD、またはHCDとETDを組み合わせたEThcD、 HCDプロダクトイオンに依存してETDを行うHCDpdETD）の利用が可能で、HCD と

ETD の二つのスペクトルを生成します。イオントラップもしくは Orbitrap

で、MSnフラグメントイオンをあらゆる段階で検出することができ、非常に困難なアプリケーションでも、新たなレベルの汎用性とパフォーマンスを実現します。糖ペプチドの同定や結合部位の特定はその具体的な例です。

グリコシル化部位の正確な特定

最高分解能 500,000FWHMおよび 1 ppm を下回る優れた質量精度により、糖ペプチド同定に絶対的な信頼性を提供

マルチフラグメンテーション技術はグリコシル化部位を明確に特定することができます

相対存在量

相対存在量

相対存在量

m/z

m/z

m/z

8

WHICH ?どんな糖鎖が付いているの？濃度はどのくらいだろう？

遊離した糖鎖の分析ワークフロー

インタクト糖タンパク質

抗体または糖タンパク質を精製します。

糖鎖の遊離

グリコシダーゼの酵素反応により糖鎖を遊離します。

糖鎖のラベル化

fl uorophoreあるいはaminoxy TMT

を添加し、化学的に反応させます。

分離

HIC/WAXの二相を組み合わせた化学的性質を有するカラムを用いると、優れた糖鎖分離を実現できます。

特定の糖鎖をモニタリングする、または興味ある糖鎖類の相対量を把握することにより、バイオ医薬品の開発に重要な情報を得ることができます。糖鎖の構造は複雑であるため、タンパク質から糖鎖を遊離させてから、定量および同定を行います。N-結合型糖鎖は酵素処理で遊離できますが、O-結合型糖鎖には酵素が存在しないため、化学反応で遊離する必要があります。

糖鎖には発色団がないため、従来のLC-UVではほとんど検出できません。糖鎖は、蛍光タグで標識すればLC蛍光検出器で高感度に分析でき、2-アミノベンズアミド （2-AB）はもっとも一般的な標識です。また、質量分析計は、グリカンの構造を解明するもっとも強力なツールの一つです。ただし、ほとんどの糖鎖は効率的にイオン化できません。感度を向上させるために2-ABでラベ ル 化を行うこともありますが、Thermo

Scientifi c aminoxyTMT™（Tandem Mass Tag™）試薬をタンパク質や遊離した糖鎖のラベル化に使用すれば、質量分析法により複数サンプルの糖鎖を同時に定量できるマルチプレックス実験が可能になります。

9

分析と定量

非ラベルおよび蛍光ラベルの糖鎖を分離、検出します。

分析と定量

蛍光ラベルした糖鎖を分離、検出します。

Vanquish UHPLC システムは、生体分子の分離を新たなレベルに引き上げます。このシステムでは、これまでよりも良好かつ高速な分離が可能です。卓越したコントロールおよび安定性により、比類ない再現性を実現し、重要な知見を得ることができます。

• 最大化された分離能、フローおよびグラジエント精度を提供• 再現性の高いサーモスタットによる分離コントロールを実現• Vanquish チャージャーモジュールによる多検体分析も可能• Thermo Scientific Dionex™ Chromeleon™ CDS ソフトウェアの サポートによる規制準拠

変革をもたらすUHPLC

GlycanPac AXH-1 カラムおよび AXR-1 カラムThermo Scientific GlycanPac™ AXR-1 および GlycanPac AXH-1

カラムは高性能なシリカベースのHPLC カラムであり、糖鎖を高分離能で分離するために設計されています。糖鎖に対する独自の選択性によって、ラベル化の有無にかかわらず業界トップレベルの分離能を実現し、分離した糖鎖は蛍光検出器や質量分析計で検出できます。両カラムは、チャージおよびサイズで糖鎖を分離します。GlycanPac AXR-1 カラムは糖鎖の異性体の分離に優れています。GlycanPac AXH-1 カラムは、糖鎖のチャージをもとに高速、正確、シンプルに定量するために使用されます。

遊離した糖鎖の特性解析タンデム型質量分析計と SimGlycan® （PREMIER Biosoft）ソフトウェアを用いることで、遊離したラベル化・非ラベル化糖鎖の構造を予測することができます。このソフトウェアでは、包括的なデータベースと実験で得られた質量スペクトルを自動的に照合し、候補となる構造のスコアリストを生成します。

2 Minutes

Fluo

resc

ence

Cou

nts

3010 20

1 2

3

7

4

5

6

8

9

10

11

12 1415

16

neutral

monosialylated

13 170

8.5E5

GlycanPac AXH-1 カラムを用いた、ヒトIgGのラベル化N型糖鎖の分離

蛍光カウント

中性

モノシアリル化

Time（min）

LC による分析

LC-MS による分析

10

WHICH ?複雑な糖鎖ってどんなタイプだろう？

非ラベル化糖鎖の分析ワークフロー

インタクト糖タンパク質抗体または糖タンパク質を精製します。

グリカンの遊離

グリコシダーゼによる酵素反応により糖鎖を遊離します。

イオンクロマトグラフィーによる分析

イオンクロマトグラフィーにより、シンプルかつ高感度に非ラベルグリカンを分析できます。

陰イオン交換-パルスドアンペロメトリー検出法（HPAE-PAD法）

HPAE-PAD法は、遊離した糖鎖の構造解析を行うために確立された分析法です。この方法による分離は糖に対する選択性に優れ、電荷、サイズ、組成、異性体、結合によって糖を分離することができます。さらに、シアル酸結合に基づいて糖鎖を分離することも可能なため、糖の配列ばかりでなく、疾患状態を示しうるようなわずかな結合の違いなど、貴重な情報を得ることもできます。

優れた分離能を有する陰イオン交換カラムThermo Scientifi c Dionex CarboPacTMカラムは、イオン交換基を有するThermo Scientifi c Dionex Micro

BeadTMで表面を修飾したペリキュラー型陰イオン交換樹脂（左図）が充填されています。樹脂表層に交換基を持つことで、分析種の拡散保持と移動速度が速くなり、高い分離能を示します。

モノクローナル抗体調製液から遊離した非ラベル化N-結合型オリゴ糖

クロマトグラム:

A: ヒトポリクローナル IgG の

PNGase F 消化物B: ヒト化 MAB M115のPNGase F消化物

25

150

nA A

Minutes

0 10 20 30 40 50

25

300

nA B

コア

陰イオン交換部

0 5 10

90

nC

–5

1

2

3

45

6

A Without Dionex BorateTrap Column

100

nC

–50 5 10

Minutes

1

2

3

4 5

6

B With Dionex BorateTrap Column

A Dionex BorateTrap カラム無し

B Dionex BorateTrap カラム有り

Time（min）

Time（min）

ペリキュラー型イオン交換樹脂

11

WHAT ?糖の組成って

どうなっているの？

単糖組成分析のワークフロー

インタクト糖タンパク質

抗体または糖タンパク質を精製します。

糖鎖の遊離

グリコシダーゼによる酵素反応により糖鎖を遊離します。

単糖類の遊離

遊離した糖鎖を酸で加水分解し、単糖類を得ます。

イオンクロマトグラフィーによる分析

イオンクロマトグラフィーにより、単糖およびシアル酸を超高感度に分析できます。

Thermo Scientific Dionex ICS-5000+ は単糖、二糖、多糖類およびシアル酸を簡単にすばやく分析できるHPAE-PADイオンクロマトグラフィーシステムです。完全なメタルフリーシステムのため、試料の吸着や金属汚染などの心配がありません。 またイオン交換水からインラインで溶離液を調製できる溶離液ジェネレーターを備えたReagent-FreeTM Ion Chromatography（RFICTM）システムを用いて分析することも可能です。

HPAE-PADは、金電極に印加した電圧で酸化される官能基を有する化合物を検出します。電気化学活性種以外の多くの化合物は検出されません。Dionex

ICS-5000+は高い分離能を有する陰イオン交換カラムとHPAE-PAD検出器を組み合わせた選択性の高い装置です。

HPAE-PAD、高圧高速イオンクロマトグラフDionex ICS-5000+

糖鎖構造やその異性体はバイオ医薬品などの有効性に影響を及ぼす可能性があり、タンパク質に結合する糖鎖を評価するために、フコース、ガラクトサミン、グルコサミン、ガラクトース、グルコースおよびマンノースといった単糖の測定が必要です。単糖類は高塩基性条件下で陰イオン交換カラムを用いて分離することができます。糖タンパク質から糖鎖を切り出し、酸加水分解して単糖を遊離して、CarboPacカラムで分離した後にPADで検出します。

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