fpta 40. identificación de agenes infecciosos en encefalitis de bovinos de … · agentes...

1Agentes infecciosos en encefalitis de bovinos

IDENTIFICACIÓN DE AGENTES INFECCIOSOSEN ENCEFALITIS DE BOVINOS

DE URUGUAY

Proyecto FPTA-274 Estudio retrospectivo para laidentificación de agentes infecciosos que provocan

encefalitis en bovinos

Editora del Proyecto: Cristina Easton, DMTV, MSc*

Equipo de trabajo: Cristina Easton DMTV, MSc*

Cecilia Paullier MV*

Marcela Preliasco DCV*

*Departamento de Patobiología, DILAVE "Miguel C. Rubino", MGAP.

2 Agentes infecciosos en encefalitis de bovinos

Título: IDENTIFICACIÓN DE AGENTES INFECCIOSOS EN ENCEFALITIS DE BOVINOS DEURUGUAY

Director de Proyecto: Cristina Easton

Equipo de trabajo: Cristina EastonCecilia PaullierMarcela Preliasco

Serie: FPTA N° 40

© 2012, INIA

Editado por la Unidad de Comunicación y Transferencia del Tecnología del INIA

Andes 1365, Piso 12. Montevideo - Uruguayhttp://www.inia.org.uy

Quedan reservados todos los derechos de la presente edición. Esta publicación no se podráreproducir total o parcialmente sin expreso consentimiento del INIA.


Instituto Nacional de Investigación Agropecuaria

Integración de la Junta Directiva

Ing. Agr., MSc., PhD. Álvaro Roel - Presidente

Ing. Agr., Dr. Mario García

Dr. Álvaro Bentancur

Dr. MSc. Pablo Zerbino

Ing. Agr. Joaquín Mangado

Ing. Agr. Pablo Gorriti


FONDO DE PROMOCIÓN DE TECNOLOGÍA AGROPECUARIA

El Fondo de Promoción de Tecnología Agropecuaria (FPTA) fue instituido por elartículo 18º de la ley 16.065 (ley de creación del INIA), con el destino de financiarproyectos especiales de investigación tecnológica relativos al sector agropecuario delUruguay, no previstos en los planes del Instituto.

El FPTA se integra con la afectación preceptiva del 10% de los recursos del INIAprovenientes del financiamiento básico (adicional del 4o/oo del Impuesto a la Enajena-ción de Bienes Agropecuarios y contrapartida del Estado), con aportes voluntarios queefectúen los productores u otras instituciones, y con los fondos provenientes definanciamiento externo con tal fin.

EL FPTA es un instrumento para financiar la ejecución de proyectos de investiga-ción en forma conjunta entre INIA y otras organizaciones nacionales o internacionales,y una herramienta para coordinar las políticas tecnológicas nacionales para el agro.

Los proyectos a ser financiados por el FPTA pueden surgir de propuestaspresentadas por:

a) los productores agropecuarios, beneficiarios finales de la investigación, o por susinstituciones.

b) por instituciones nacionales o internacionales ejecutoras de la investigación, deacuerdo a temas definidos por sí o en acuerdo con INIA.

c) por consultoras privadas, organizaciones no gubernamentales o cualquier otroorganismo con capacidad para ejecutar la investigación propuesta.

En todos los casos, la Junta Directiva del INIA decide la aplicación de recursos delFPTA para financiar proyectos, de acuerdo a su potencial contribución al desarrollo delsector agropecuario nacional y del acervo científico y tecnológico relativo a lainvestigación agropecuaria.

El INIA a través de su Junta Directiva y de sus técnicos especializados en lasdiferentes áreas de investigación, asesora y facilita la presentación de proyectos a lospotenciales interesados. Las políticas y procedimientos para la presentación deproyectos son fijados periódicamente y hechos públicos a través de una amplia gamade medios de comunicación.

El FPTA es un instrumento para profundizar las vinculaciones tecnológicas coninstituciones públicas y privadas, a los efectos de llevar a cabo proyectos conjuntos.De esta manera, se busca potenciar el uso de capacidades técnicas y de infraestruc-tura instalada, lo que resulta en un mejor aprovechamiento de los recursos nacionalespara resolver problemas tecnológicos del sector agropecuario.

El Fondo de Promoción de Tecnología Agropecuaria contribuye de esta manera ala consolidación de un sistema integrado de investigación agropecuaria para elUruguay.

A través del Fondo de Promoción de Tecnología Agropecuaria (FPTA), INIA hafinanciado numerosos proyectos de investigación agropecuaria a distintas institucio-nes nacionales e internacionales. Muchos de estos proyectos han producido resulta-dos que se integran a las recomendaciones tecnológicas que realiza la institución porsus medios habituales.

En esta serie de publicaciones, se han seleccionado los proyectos cuyos resulta-dos se considera contribuyen al desarrollo del sector agropecuario nacional. Surelevancia, el potencial impacto de sus conclusiones y recomendaciones, y su aporteal conocimiento científico y tecnológico nacional e internacional, hacen necesaria laamplia difusión de estos resultados, objetivo al cual se pretende contribuir con estapublicación.


Pág.

CONTENIDO

INTRODUCCIÓN ........................................................................................................ 9OBJETIVOS ............................................................................................................. 10

Objetivos Generales ............................................................................................ 10Objetivos Específicos .......................................................................................... 10

MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................................. 10Selección de casos ............................................................................................. 10Toma de muestras ............................................................................................... 11Procesamiento de tejidos ................................................................................... 11Estudio histopatológico....................................................................................... 11Puesta a punto y procesamiento de muestras por IHQ.................................. 11Puesta a punto y procesamiento de muestras por PCR ................................ 12

RESULTADOS ........................................................................................................ 12Diagnóstico de Rabia .......................................................................................... 12Estudio Histopatológico ...................................................................................... 13Diagnóstico de Rabia por Inmunohistoquímica ................................................ 14Diagnóstico de Encefalitis por Herpesvirus Bovino.......................................... 16Estudio Histopatológico ...................................................................................... 18Detección de BoHV por Inmunohistoquímica ................................................... 19Detección de BoHV por PCR ............................................................................. 21Diagnóstico de Listeriosis .................................................................................. 21Estudio Histopatológico ...................................................................................... 22Diagnóstico de Listeriosis por Inmunohistoquímica ........................................ 22Diagnóstico de Fiebre Catarral Maligna ............................................................ 22Estudio Histopatológico ...................................................................................... 24Diagnóstico de FCM por Inmunohistoquímica ................................................. 26Diagnóstico de FCM por PCR ............................................................................ 26

CONCLUSIONES .................................................................................................... 26AGRADECIMIENTOS ............................................................................................. 27BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA ............................................................................. 27DOCUMENTOS ANEXOS ...................................................................................... 29

Protocolo de Inmunohistoquímica para diagnóstico de rabia ......................... 29Protocolo de Inmunohistoquímica para detección de BoHV .......................... 29Protocolos de Inmunohistoquímica para detección de L. monocytogenes ... 29Protocolo 1 ........................................................................................................... 29Protocolo 2 ........................................................................................................... 29Protocolos de IHQ probados para detección de virus de la FCM .................. 31


Proyecto FPTA 274Período de Ejecución: Mar 2009 - Ago 2011

INTRODUCCIÓNLos disturbios caracterizados por sin-

tomatología nerviosa constituyen un im-portante grupo de enfermedades para losbovinos. Los mismos han tenido una im-portancia creciente desde la aparición dela Encefalopatía Espongiforme Bovina(EEB) a mediados de la década de 1980,y de su vinculación con la nueva variantede la enfermedad humana Creutzfeldt-Jakob en 1996 (1). A partir de esto, lospaíses exportadores de carne (como esel caso de Uruguay), han tenido querealizar esfuerzos para demostrar quesus rodeos son libres de EEB (1). Estoimplica necesariamente, poseer la capa-cidad de realizar el diagnóstico diferen-cial de las demás enfermedades queafectan al sistema nervioso de los bovi-nos, aún en ausencia de EEB (1).

La importancia del diagnóstico de lasenfermedades nerviosas se vio exacerba-da en Uruguay cuando en octubre de2007 se realizó por primera vez el diag-nóstico de rabia paralítica en el territorionacional (3). La misma constituye unaimportante zoonosis, siendo la enferme-dad nerviosa de etiología viral con mayorprevalencia en bovinos de Rio Grande doSul (1,10,19). El impacto que este hechotuvo sobre la opinión pública determinóque a partir del 2007 se incrementara demanera importante la remisión de mues-tras al Laboratorio DILAVE, imperando lanecesidad de poseer la capacidad derealizar el diagnóstico etiológico definiti-vo de dicha enfermedad y de aquellas quesignifican diferenciales.

Las principales enfermedades infec-ciosas que afectan el sistema nerviosocentral de bovinos de la región son Me-

ningoencefalitis por Herpesvirus bovinotipo 1 (BoHV-1) y Herpesvirus bovino tipo5 (BoHV-5), Fiebre Catarral Maligna(FCM), Rabia y Listeriosis (5,10,14,19).A su vez, se ha visto relacionado a BoHV-5 con la patogénesis de la Polioencefalo-malacia, enfermedad metabólico-caren-cial de amplia distribución en bovinos dela región (1,6,14,16,18,20). Estas enfer-medades requieren una vigilancia epide-miológica continua y por consiguiente,de un laboratorio con la capacidad paraidentificar los agentes etiológicos.

El diagnóstico patológico se funda-menta en el hallazgo de alteracionesmorfológicas de los tejidos animales, tan-to a nivel macroscópico como microscó-pico, que permiten relacionarlas con de-terminadas enfermedades. Sin embargo,realizar un diagnóstico etiológico definiti-vo requiere la incorporación de técnicasinmunológicas y moleculares que permi-tan la identificación del agente actuanteen el tejido del animal enfermo.

La técnica de Inmunohistoquímica(IHQ) combina técnicas histológicas, in-munológicas y bioquímicas, permitiendolocalizar agentes infecciosos definidos«in situ» mediante el empleo de anticuer-pos específicos y de moléculas marca-doras. En relación a otros métodos basa-dos en la inmunología, la IHQ se adaptamejor a los laboratorios de patología yaque requiere insumos y equipos comu-nes a los empleados rutinariamente en eldesarrollo de esta disciplina (8). Es con-siderada una técnica sensible que, apartir de tejidos fijados e incluidos enparafina, permite la realización de estu-dios retrospectivos, aumentando la posibi-lidad de confirmar la presencia del agenteinfeccioso en los materiales fijados (8).

Easton, C.Paullier, C.Preliasco, M.

Identificación deagentes infecciosos

en encefalitis debovinos de Uruguay


La técnica de Reacción en Cadena dela Polimerasa (PCR) se basa en la ampli-ficación exponencial de un determinadosegmento de material genético específi-co, característico y único de un agentedeterminado, partiendo de material fres-co o segmentos de tejidos fijados e in-cluidos en parafina (4,17).

El Laboratorio DILAVE «Miguel C.Rubino» es actualmente el laboratorio dediagnóstico nacional de referencia a don-de deben ser remitidos los casos desintomatología nerviosa que afectan a lasespecies domésticas (Resolución de laDirección General de los Servicios Gana-deros del 15 de enero de 1996). La Sec-ción Anatomía Patológica de laDILAVE desarrolla diversas tareas vincu-ladas al diagnóstico patológico de lasprincipales enfermedades que afectan alas especies productivas de nuestro país(bovinos, ovinos, suinos y aves). A su vezparticipa en el Programa de VigilanciaEpidemiológica de EEB desde el año1996 y en el Programa de Vigilancia derabia desde el año 2007. Esto ha permi-tido la génesis de un importante banco deinformación, a través de los registroshistóricos que lleva la sección, así comode muestras parafinadas de todos loscuadros que cursaron con sintomatologíanerviosa en bovinos. Todos estos constitu-yen importantes elementos que impulsa-ron la realización de este proyecto.

OBJETIVOS

Objetivos Generales

1. Incrementar la capacidad de diag-nóstico de las enfermedades nerviosasque afectan a los bovinos, poniendo es-pecial énfasis en aquellas que son zoo-nosis y tienen un impacto negativo en laproducción nacional.

2. Realizar la estandarización y apli-cación de técnicas inmunológicas y mo-leculares que permitan el diagnósticoetiológico de enfermedades nerviosas enbovinos.

Objetivos Específicos

1. Llevar a cabo un estudio retrospec-tivo para identificar los principales agen-tes infecciosos asociados a encefalitisen bovinos (Lyssavirus, Herpesvirus bo-vino tipo 1, Herpesvirus bovino tipo 5,Listeria monocytogenes, Herpesvirusovino tipo 2), remitidos a la DILAVE en elperiodo enero 1999 - junio 2011, em-pleando técnicas moleculares e inmuno-lógicas.

2. Generar información acerca de losagentes infecciosos vinculados a encefa-litis en bovinos en Uruguay.

3. Comunicación científica y difusiónde los resultados obtenidos.

MATERIALES Y MÉTODOS

Selección de casos

Para el estudio retrospectivo se utili-zaron materiales remitidos al LaboratorioDILAVE «Miguel C. Rubino» Montevideoy Laboratorio Regional DILAVE Tacuar-embó, desde enero de 1999 hasta juniode 2011. También se estudiaron algunoscasos remitidos a los Laboratorios Re-gionales DILAVE Paysandú y DILAVETreinta y Tres.

Se evaluaron los registros, se analizóinformación epidemiológica relevante yse seleccionaron aquellos casos que clí-nicamente presentaron síndrome neuro-lógico y lesiones de encefalitis, meningi-tis y/o mielitis al estudio histopatológico(HP), así como cualquier otra lesión quepudiera estar asociada a la acción de losagentes infecciosos en estudio. A su vezse tuvieron en cuenta los resultados deestudios bacteriológicos (aislamiento deListeria monocytogenes) y virológicos (In-munofluorescencia Directa e Inoculaciónintracerebral de ratones para diagnósticode rabia). En base a esto fueron seleccio-nados y clasificados 117 casos de bovi-nos con encefalitis (73 de rabia, 20 me-ningoencefalitis por BoHV, 12 listeriosisy 12 de FCM).


Con toda la información se creó unabase de datos que permitió relacionarla información preexistente de cadacaso con los datos que se generaroncomo resultado de la implementacióndel proyecto.

Toma de muestras

Las muestras de sistema nerviosocentral (SNC) fueron divididas en tresregiones: telencéfalo (y tálamo), cerebe-lo y tronco encefálico (Figura 1). A su vez,dichas estructuras fueron separadas endos partes iguales. Una de ellas fue fijadaen formol bufferado al 10% para HP e IHQ,mientras que la otra mitad se conservórefrigerada para estudios bacteriológicosy/o virológicos.

Procesamiento de tejidos

El material fijado fue examinado ma-croscópicamente. Posteriormente se rea-lizaron cortes representativos (2 a 3 mmde espesor) de las siguientes regionesanatómicas: corteza frontal, corteza pa-rietal, corteza occipital, corpus striatum,tálamo, hipocampo, mesencéfalo, puen-te, cerebelo, obex y médula (Figura 1).Cada corte fue identificado y colocado enun cassette histológico para luego serembebido en parafina (Figura 2). Se rea-lizaron bloques parafinados que luegofueron cortados en secciones de 4 μm deespesor, montados en láminas portaob-jetos y coloreados con Hematoxilina–Eosina (H.E.).

Estudio histopatológico

Se estudiaron muestras de las dife-rentes regiones anatómicas que confor-man el encéfalo. No se contó en todos loscasos con la totalidad de las áreas ante-riormente citadas debido a que no siem-pre fueron remitidas. Las lesiones obser-vadas fueron evaluadas según su magni-tud de acuerdo a la percepción subjetivaobtenida de la observación de dos patólo-gos. Se acordó su clasificación en cuatrogrupos: sin lesiones, encefalitis leve, en-cefalitis moderada y encefalitis severa.Además se cuantificaron los casos don-de se observaron corpúsculos de inclu-sión (intracitoplasmáticos en rabia e in-

Figura 2. Cortes de 2 a 3 mm de espesor de las diferentesregiones anatómicas del SNC, colocados encasettes histológicos identi f icados, para suposterior procesamiento.

tranucleares en meningoencefalitis porBoHV).

Puesta a punto y procesamientode muestras por IHQ

En los casos en que el resultado de lahistopatología sugiriera la presencia derabia, listeriosis, meningoencefalitis porBoHV-1 y BoHV-5 o FCM, se implemen-taron técnicas de IHQ para la confirma-ción del diagnóstico. Para ello se realiza-ron cortes histológicos de 3 a 4 μm deespesor, de las diferentes regiones deSNC utilizando láminas pre tratadas con

Figura 1. División anatómica de sistema nervioso central.


poly-L-lisina (10%) para mejorar su adhe-sión.

Para la detección del virus de rabia setrabajó con una adaptación del protocoloutilizado en el Laboratorio de PatologíaVeterinaria de la Universidad Federal deSanta María, Brasil, a cargo de la Dra.Glaucia Kommers (Documentos Anexos).Los controles positivos fueron validadospor inmunofluorescencia directa (IFD) einoculación intracerebral de ratones lac-tantes en el Departamento de Biotecnolo-gía de la DILAVE. Se estudiaron por IHQpara detección de virus de rabia todos loscasos con encefalitis no supurativa. Serealizaron un total de 465 determinacio-nes correspondientes a los 73 casospositivos a la HP y/o IFD; más 120 deter-minaciones sobre casos negativos a ra-bia por HP e IFD. Comparando los resul-tados de IFD e IHQ obtenidos se logródeterminar la sensibilidad y especifici-dad de ésta última.

Para la detección de BoHV-1 yBoHV-5 por IHQ se trabajó en conjuntocon la Dra.Cecilia Galossi (Facultad deVeterinaria de la Universidad Nacional deLa Plata, Argentina) y con el Dr. ClairtonMarcolongo-Pereira (Universidad Fede-ral de Pelotas, Brasil). Se logró adaptarun protocolo para la detección de dichosagentes (Documentos Anexos). Se trabajócon controles positivos de BoHV donadospor el Dr. M. Haritani, National Institute ofAnimal Health, (NAIH, Japón), y de la Dra.Cecilia Galossi. Se estudiaron un total de20 casos de bovinos con sospecha demeningoencefalitis por BoHV.

Para la detección de Lister iamonocytogenes por IHQ en muestras detejido nervioso se probaron tres anticuer-pos primarios diferentes: anticuerpo de-sarrollado en conejo «anti Listeria 1a +4b», NIAH, Tsukuba, Japón; anticuerpomonoclonal «mouse anti-Listeria mono-cytogenes p60», Millipore; anticuerpo mo-noclonal anti L. monocytogenes, Difco®.Inicialmente se trabajó con un protocolode IHQ para la detección de L. monocyto-genes desarrollado en el NIAH, Japón.En busca de mejorar los resultados obte-nidos por este método se empleó unaadaptación del protocolo de IHQ emplea-do en la Facultad de Veterinaria de PortoAlegre, Universidad Federal de Rio Gran-de do Sul. Dichos protocolos aparecendescriptos en Documentos Anexos. Los

controles positivos de listeriosis fueronvalidados por asilamiento bacteriológicoen el Departamento de Bacteriología dela DILAVE. Se estudiaron por IHQ untotal de 12 casos de bovinos con menin-goencefalitis supurativa para la detec-ción de este agente.

Se intentó la puesta a punto de unatécnica de IHQ para la detección del virusde la FCM. Para ello se probaron tresanticuerpos monoclonales de la marcaVMRD: N10-A (IgG2a), 36-A (IgG1) yN55-A (IgM) por diferentes protocolosque variaron los métodos de recupera-ción antigénica (Documentos Anexos).

Puesta a punto y procesamientode muestras por PCR

Se estudiaron por PCR muestras delos casos con sospecha de meningoen-cefalitis por BoHV y muestras de 12casos clasificados como FCM.

Para la detección de BoHV se realiza-ron cortes de 5 a 8 μm de espesor a losbloques parafinados que fueron acondi-cionados en recipientes individuales parasu envío al Departamento de Virología dela Facultad de Ciencias Veterinarias dela Universidad de La Plata en Argentina,donde fueron estudiados por PCR bajo ladirección de la Dra. Cecilia Galossi.

Para la detección de virus de la FCMse realizaron cortes de 10 μm de espesora bloques parafinados de muestras deSNC que se acondicionaron en recipien-tes individuales para su envío al Labora-torio de Biología Molecular de la Universi-dad Federal de Mato Grosso en Brasil,donde fueron analizados por PCR bajo ladirección del Dr. Luciano Nakazato (4).

RESULTADOS

Diagnóstico de Rabia

Se estudió la distribución anual ymensual de los casos de rabia en bovinosremitidos a la Sección Anatomía Patoló-gica del Laboratorio DILAVE «Miguel C.Rubino», correspondientes al brote 2007-2010. El año en que se detectó el mayornúmero de casos fue el 2009, con un totalde 28 casos diagnosticados, seguido porel año 2008 con un total de 26. Desde el


14

12

10

8

6

4

2

0ene feb mar abr may jun jul ago set oct nov dic

2007200820092010

N°

de fo

cos

Mes

mes de febrero del 2010 no se registraronnuevos focos.

La distribución anual y mensual acu-mulada de casos diagnosticados en elperíodo 2007 – 2010 aparece representa-da en el Figura 3. Los meses de febreroy agosto fueron aquellos en los que serealizó el mayor número de diagnósticosde rabia para el período estudiado.

Todos los focos sucedieron en la re-gión norte del país (Figura 4), siendoRivera y Tacuarembó los departamentosdonde se registraron la mayor parte delos mismos (Cuadro 1).

Figura 3. Distribución mensual acumulada de casos de rabia (2007 a 2010).

Figura 4. Localización de focos de rabia del brote 2007- 2010.

Estudio Histopatológico

Se examinaron un total de 803 láminascorrespondientes a 73 casos de rabia. Laslesiones histopatológicas consistieron enmeningoencefalitis no supurativa caracte-rizada por infiltrado perivascular mononu-clear, gliosis y presencia de corpúsculosde inclusión intracitoplasmáticos eosinofí-licos (Figuras 5, 6 y 7). La evaluación dedichas lesiones reveló que el 40% de loscasos presentaron encefalitis severa, 33%encefalitis moderada, 18% encefalitis levey en 9% no se observaron lesiones. Fueron

Cuadro 1. Distribución espacial de fo-cos de rabia del brote2007-2010

Departamento Nº FocosRivera 40Tacuarembó 29Artigas 3Salto 1Total 73


Figuras 5 y 6. Infiltrado perivascular mononuclear (izquierda) y meningitis (derecha) Cerebelo, Bovino (H.E.,100X).

Figura 7. Corpúsculo de inclusión intracitoplasmático (flecha)Obex, Bovino (H.E., 1000X).

Figura 8. Frecuencia en la distribución delas lesiones histológicas decasos de rabia por regiónanatómica.

9080706050403020100

Frec

uenc

ia (

%)

CF CP CO CS T HC MES P CER O MCRegión anatómica

CF: Corteza frontal, CP: Corteza parietal, CO: Corteza occipital, CS:Corpus striatum, T: Tálamo, HC: Hipocampo, MES: MesencéfaloP: Puente, CER: Cerebelo, O: Obex, MC: Médula cervical.

33

49

66

80

72

8580

29

6059

27

encontrados cuerpos de inclusión intracito-plasmásticos (corpúsculos de Negri) en 48casos (66%).

Se constató que las lesiones de mayorintensidad se localizaron en las regionesbasales del encéfalo (mesencéfalo, puen-te, obex), cerebelo, y médula espinal cervi-cal. La frecuencia de la distribución de laslesiones por región anatómica del SNCaparece descrita en la Figura 8.

Diagnóstico de Rabia porInmunohistoquímica

De los 73 casos estudiados, 65 fueronpositivos a rabia por IHQ (Figuras 9, 10 y 11),mientras que en 8 no se observó marcación.

Todos los casos clasificados por histopa-tología como severos y moderados fueronpositivos a la prueba de IHQ.


La técnica de IFD es considerada dereferencia para el diagnóstico de rabiasegún el Manual de las Pruebas de Diag-nóstico y de las Vacunas para los Anima-les Terrestres de la Organización Inter-nacional de Sanidad Animal (OIE) (13).Para la comparación de los resultados delas pruebas IHQ e IFD se elaboró unatabla de doble entrada (Cuadro 2). En lamisma puede observarse que existió con-cordancia entre las técnicas IFD e IHQen la mayoría de los casos. Sin embargo3 casos negativos a la IFD resultaronclaramente positivos a la IHQ. Por otraparte, 7 casos positivos al la IFD nopresentaron señal a la IHQ.

En base a éstos resultados se calculóla sensibilidad, la especificidad, el valorpredictivo positivo y negativo que sonilustrados en el Cuadro 3.

Los resultados de Sensibilidad y Es-pecificidad así como los Valores Predic-tivos demuestran que la IHQ para detec-ción de virus de rabia es una herramientaútil y confiable, pudiendose utilizar parael diagnóstico de esta enfermedad en loscasos en que otros métodos no sonaplicables.

Figura 11. Marcación IHQ positiva de cuerpos de inclusión enneuronas de Purkinje. Cerebelo, Bovino (DAB, 400X).

Figuras 9 y 10. Marcación IHQ positiva de neuronas de Purkinje empleando distintos cromógenos: Izquierda=DAB; Derecha = Permanent Red. Cerebelo, Bovino (IHQ, 400X).

Cuadro 2. Resultados de las muestrasanalizadas por IHQ y por IFD

Cuadro 3. Valores de sensibil idad,especicidad, valor predictivopositivo y valor predicitivonegativo de IHQ comparadacon la IFD

VPP= Valor Predictivo Positivo; VPN= ValorPredictivo Negativo.

IFD + IFD - TotalIHQ + 56 3 59IHQ - 7 34 41Total 63 37 100

Sensibilidad 0.89Especificidad 0.92

VPP 0.95VPN 0.83


Se estudiaron muestras de sistemanervioso central de la totalidad de loscasos donde se observó encefalitis com-patible con una etiología infecciosa, in-cluyendo por lo tanto las muestras quetenían diagnóstico histopatológico de liste-riosis, encefalitis por BoHV-1 y BoHV-5, yfiebre catarral maligna. No se detectaroncasos positivos.

Este trabajo permitió concluir que nofueron remitidas al Laboratorio DILAVEmuestras positivas a rabia antes del primerdiagnóstico en octubre de 2007, cumpliendocon los objetivos del análisis retrospectivo.

Diagnóstico de Encefalitis porHerpesvirus Bovino

Se seleccionaron 20 casos de bovi-nos compatibles con encefalitis por

Herpesvirus bovino (BoHV) correspon-dientes a 15 focos ocurridos entre 1999 yjunio de 2011. Fueron seleccionados porpresentar lesiones de meningoencefalitisnecrotizante al estudio HP (Figuras 12 y13), y ser negativos al estudio IHQ paradetección de virus de rabia.

Los focos se presentaron esporádica-mente en el período estudiado, existien-do períodos en que no se detectó laenfermedad (2003 a 2005). Los años 2009y 2010 fueron los años en que se detec-taron el mayor número de brotes (Figura14).

La distribución mensual acumuladade los focos muestra que la mayoría sepresentaron en primavera, siendo setiem-bre el mes en que se presentaron elmayor número de brotes (Figura 15).

Figura 12. Meningitis mononuclear con presencia demacrófagos y células de Gitter. Cortezafrontal, Bovino (H.E., 200X).

Figura 13.Encefalit is con gliosis y manguitosperivasculares. Tálamo, Bovino (H.E.,200X).

Figura 14. Distribución anual de los focosde meningoencefalitis porBoHV registrados en elperíodo enero 1999 – junio2011.

N°

de fo

cos 3

2

1

0

1999

2000

2001

2002

2003

2004

2005

2006

2007

2008

2009

2010

2011

Año


La mayor parte de las muestras reci-bidas provinieron de la región sur y su-roeste del país (departamentos de Cane-

Figura 15. Distribución mensual acumulada de focos de meningoencefalitis porBoHV, en el período de estudio (1999 a junio 2011).

ene feb mar abr may jun jul ago set oct nov dicMes

6

5

4

3

2

1

0

N°

de fo

cos

lones, Soriano, San José, Colonia y Flo-res) (Cuadro 4), habiéndose también re-gistrado focos en las zonas norte y estedel país (Figura 16).

Cuadro 4. Distribución espacial defocos de BoHV de enero1999 a junio 2011

Figura 16. Localización de focos de BoHV registrados entre enerode 1999 y junio de 2011.

Departamento Nº FocosCanelones 4Soriano 2Tacuarembó 2Treinta y Tres 2Artigas 2Flores 1Colonia 1San José 1Total 15


La morbilidad osciló entre 0,33% a3,57%, siendo la letalidad media del 89%.

La mayor parte de los focos se pre-sentaron de forma esporádica, salvo unbrote epidémico registrado en el año 2011en el departamento de Treinta y tres en elcual enfermaron y murieron 5 animales(muestras remitidas a Laboratorio Regio-nal DILAVE Treinta y Tres).


Al evaluar las lesiones histopatológi-cas se observó que 4 casos presentaron

encefalitis leve, 9 encefalitis moderada y7 encefalitis severa. En 2 casos se detec-tó la presencia de corpúsculos de inclu-sión intranucleares eosinófilos en neuro-nas y astrocitos (Figura 17).

Se estudió la distribución de las lesio-nes en las diferentes regiones del encéfa-lo (Figura 18). Las lesiones se distribuye-ron difusamente en el SNC, presentándo-se con mayor frecuencia en las regionesde corteza frontal, mesencéfalo, puente ycorteza occipital.

Figura 17. Corpúsculo de inclusióneosinófilico intranuclear(f lecha). Hipocampo,Bovino (H.E., 1000X).

Figura 18. Frecuencia de la distribución por región anatómica de las lesioneshistológicas de casos de encefalitis por BoHV.

CF: Corteza frontal, CP: Corteza parietal, CO: Corteza occipital, CS: Corpus striatum,T: Tálamo, HC: Hipocampo, MES: Mesencéfalo P: Puente, CER: Cerebelo, O: Obex,MC: Médula cervical.

Frec

uenc

ia (

%)

CF CP CO CS T HC MES P CER O MCRegión anatómica

17

20

1614

19

8

19

10

1515

18


Detección de BoHV porInmunohistoquímica

Se estudiaron por IHQ para detecciónde BoHV la totalidad de los 20 casosseleccionados desde el año 1999 al 2011.Previamente los mismos fueron analiza-dos por IHQ para detección de virus derabia a modo de descartar esta enferme-dad.

·BoHV-5

Se obtuvo señal IHQ positiva en 4casos. Dicha señal se observó en elcitoplasma de neuronas de corteza, tála-mo y obex (Figuras 19 y 20), de modosimilar a como aparecen descriptas porChung y col. (1994) y Hübner y col.(2005).

Figura 20. Marcación IHQ positiva a BoHV-5 mesencéfalo, Bovino(IHQ, DAB, 400X).

Figura 19. Marcación IHQ positiva a BoHV-5 Corteza frontal,Bovino (IHQ, DAB, 200X).


·BoHV-1

Se observó marcación IHQ positiva aBoHV-1 en 6 de los 20 casos estudiados.

Se estudió un brote de bovinos meno-res de 2 años de edad, provenientes de unfeedlot en el departamento de Treinta y

Tres con signos neurológicos. Al estudiohistopatológico se diagnosticó meningo-encefalitis de probable etiología viral. Cin-co animales resultaron positivos a BoHV-1 (Figura 21) y negativos a BoHV-5 (Figu-ra 22). Se registró otro caso similar en eldepartamento de Soriano.

Figura 21. Marcación IHQ positiva a BoHV-1 Corteza frontal, Bovino(IHQ, DAB, 400X).

Figura 22. La misma muestra fue enfrentada a anticuerpo paradetección de BoHV-5. No se observa marcación enneuronas Corteza frontal, Bovino (IHQ, DAB, 400X).


En resumen, con IHQ se observó mar-cación positiva a BoHV-1 en 6 de los 20casos estudiados. Se detectó señal po-sitiva a BoHV-5 en otros 4 casos, corres-pondiendo 2 de ellos a los casos dondese observaron corpúsculos de inclusiónintranucleares a la histopatología. Noexistió reacción cruzada entre los anti-cuerpos empleados para estos dos tiposde BoHV.

Si bien existen estudios previos queconfirman la existencia del BoHV en Uru-guay (7,21), esta es la primera vez que sedetecta la presencia de este agente aso-ciada a meningoencefalitis en bovinos.

Detección de BoHV por PCR

Se analizaron las 20 muestras remiti-das a la Universidad de La Plata de BuenosAires. No se logró detección viral.

Diagnóstico de Listeriosis

Se estudiaron 12 casos de bovinoscon diagnóstico histopatológico presun-tivo de listeriosis registrados en la Sec-ción Anatomía Patológica del LaboratorioDILAVE Montevideo en el período 1999 –junio 2011. En sólo dos casos se logróaislamiento bacteriológico de Listeriamonocytogenes.

Los focos se presentaron de maneraesporádica a lo largo del período estudia-do, existiendo períodos en los que no sedetectaron focos (2002 – 2004), y añoscon uno o más registros, tal como apare-ce representado en la Figura 23.

La distribución mensual acumuladade los brotes muestra que la mayoría sepresentaron en los meses de invierno yprimavera, siendo agosto el mes conmayor número de focos (Figura 24).

N°

de fo

cos

2

1

0

1999

2000

2001

2002

2003

2004

2005

2006

2007

2008

2009

2010

2011

Año

Figura 24. Distribución mensual acumulada de focos de listeriosis(enero 1999 a junio 2011)

Figura 23. Distribución anual de focos de listeriosis en el período1999 – junio 2011.

ene feb mar abr may jun jul ago set oct nov dicMes

5

4

3

2

1

0

N°

de fo

cos


La mayor parte de las muestras remi-tidias provinieron de los departamentosde Florida y San José (Cuadro 5), regis-trándose focos también en Soriano, Co-lonia, Tacuarembó y Rivera (Figura 25).

El 92% (11/12) de los brotes corres-pondieron a casos individuales. La morbi-lidad y mortalidad oscilaron entre 0,006%y 2,7%, siendo la letalidad de 100% en latotalidad de los focos.


Al estudio histopatológico de los 12casos seleccionados se observaron 9

Figura 25. Localización de focos de listeriosis desde enero de1999 a junio de 2011.

Cuadro 5. Distribución espacial de focos delisteriosis (enero 1999 a junio2011)

con lesiones severas, 2 con encefalitismoderada y 1 con lesiones leves. Losmicroabscesos (Figura 26) se localiza-ron principalmente en las regiones detronco encefálico (mesencéfalo y puen-te), obex, médula cervical y cerebelo(Figura 27).

Diagnóstico de Listeriosis porInmunohistoquímica

En primera instancia se trabajó condos anticuerpos monoclonales para de-tección de L. monocytogenes: anticuerpodesarrollado en conejo «anti Listeria 1a +4b», NIAH, Tsukuba, Japón, y anticuerpomonoclonal «mouse anti-Listeria mono-cytogenes p60», Millipore. En estos ca-sos se logró marcación IHQ positiva en 7de los 12 casos estudiados.

En una segunda etapa se realizó IHQempleando anticuerpo monoclonal anti L.monocytogenes (Difco®) y el protocoloutilizado en el Laboratorio de Patologíade la Facultad de Veterinaria, Universi-dad Federal Rio Grande do Sul, Brasil. Selogró incrementar la sensibilidad de de-tección, logrando marcación IHQ positivaen 11 de los 12 casos estudiados. Dichamarcación consiste en la coloración debacterias asociadas a microabscesos yfocos de necrosis tal como se muestra enla Figura 28.

Diagnóstico de Fiebre CatarralMaligna

Se estudió la totalidad de los 12 casosen bovinos con diagnóstico histopatoló-gico presuntivo de Fiebre Catarral Malig-na registrados en la Sección AnatomíaPatológica de la DILAVE Montevideo enel período 1999 – junio 2011.

Los focos se presentaron de maneraesporádica a lo largo del período estudia-do tal como aparece representado en laFigura 29.

La distribución mensual acumuladade los focos muestra que 9 de los 12focos sucedieron en los meses de pri-mavera y verano, ocurriendo 2 brotesen el mes de abril y 1 en el mes de julio(Figura 30).

Departamento N° FocosFlorida 4San José 3Rivera 2Soriano 1Colonia 1Tacuarembó 1Total 12


Figura 26. Encefalitis supurativa: MicroabscesoObex, Bovino (H.E., 200x).

Figura 27. Frecuencia en la distribución por región anatómica de las lesioneshistológicas características (microabscesos) de casos de listeriosis.

Figura 28. Focos de necrosis con presencia deseñal IHQ positiva a L. monocytogenes.Puente, Bovino (IHQ, DAB, 200X).

Frec

uenc

ia (

%)

CF CP CO CS T HC MES P CER O MC

Región anatómica

0 017

8383

25

42

8 088

CF: Corteza frontal, CP: Corteza parietal, CO: Corteza occipital, CS: Corpus striatum,T: Tálamo, HC: Hipocampo, MES: Mesencéfalo P: Puente, CER: Cerebelo, O: Obex,MC: Médula cervical.


Figura 29. Distribución anual de focos de FCM (enero 1999 a junio 2011).

Figura 30. Distribución mensual acumulada de focos de FCM (enero 1999 a junio 2011).

Las muestras recibidas por el Labora-torio DILAVE «Miguel C. Rubino» Monte-video y Laboratorio Regional DILAVE Ta-cuarembó, de focos de FCM durante elperíodo estudiado provinieron principal-mente de los departamentos situados alnorte del país (Figura 31). El 67% (8/12)de las muestras fueron remitidas de losdepartamentos de Artigas, Salto, Paysan-dú, Rivera y Tacuarembó, tal como apa-rece represtado en el Cuadro 6.

Seis de los 12 focos correspondierona brotes colectivos mientras que 6 focosfueron casos individuales. La morbilidady mortalidad oscilaron entre el 2% y 5%,

siendo la letalidad del 100% en la totali-dad de los brotes.


Se consideraron características deFCM lesiones de encefalitis asociada avasculitis generalizada con infiltración ynecrosis de la capa media de arteriolas(Figuras 33 y 34). Dichas lesiones seobservaron también distribuidas fuera delSNC, en órganos pertenecientes a dife-rentes sistemas orgánicos (panvasculi-tis) como hígado, linfonódulos y riñón(Figura 32).

N°

de fo

cos

2

1

0

1999

2000

2001

2002

2003

2004

2005

2006

2007

2008

2009

2010

2011

Año

ene feb mar abr may jun jul ago set oct nov dic

Mes

3

2

1

0

N°

de fo

cos


Cuadro 6. Distribución espacial de focos.

Figura 31. Localización de focos de FCM desde enero de1999 a junio de 2011.

Figura 32. Vasculitis y perivasculitis mononulear.Hígado, Bovino (H.E., 200x).

Figura 33. Vasculitis mononuclear y congestiónTálamo, Bovino (H.E., 200X).

Figura 34. Infiltración mononuclear enpared de arteriola Tálamo,Bovino (H.E., 400X).

Departamento Nº FocosSalto 3Artigas 2Paysandú 1Rivera 1Tacuarembó 1Montevideo 1Lavalleja 1Florida 1Durazno 1Total 12


El estudio histopatológico de los ca-sos clasificados como FCM mostró que6 presentaron encefalitis severa, 5 mode-rada, y 1 caso lesiones leves. Las lesio-nes se distribuyeron de manera genera-lizada, abarcando todas las regiones delencéfalo.

Diagnóstico de FCM porInmunohistoquímica

Se probaron diferentes protocolos paralos tres anticuerpos primarios disponi-bles. Los mismos variaron los métodosde reactivación antigénica (DocumentosAnexos). En ningún caso se logró obte-ner marcación específica positiva.

La bibliografía consultada destaca laexistencia de dificultades para el aisla-miento del virus de la FCM y la detecciónde antígeno viral en las lesiones en ru-miantes domésticos (4,11,12,15,22).

Diagnóstico de FCM por PCR

Se logró detectar Herpesvirus Ovinotipo 2 por PCR en el Laboratorio deBiología Molecular de la Universidad Fe-deral de Mato Grosso.

Se obtuvo resultado positivo en 5 delas 12 casos estudiados. Los mismoscorrespondieron a focos registrados enlos años 2000, 2002, 2009, 2010 y 2011,en los departamentos de Salto, Montevi-deo, Artigas, Salto y Durazno respectiva-mente.

Las muestras positivas correspondie-ron a las regiones de corteza cerebral,corpus striatum, hipocampo, tálamo ymesencéfalo.

Esta constituye la primera confirma-ción de la presencia de este agente enUruguay.

CONCLUSIONESSe realizó el estudio retrospectivo de

los casos de encefalitis en bovinos delperíodo enero 1999 a junio 2011.

La distribución de las lesiones histo-lógicas permite resaltar la importanciade la remisión del sistema nervioso cen-tral en su totalidad junto con muestras deotros órganos a los laboratorios de diag-nóstico. Esto es particularmente impor-tante para el caso de listeriosis, enferme-dad en la cual las lesiones se distribuyenprincipalmente en la región de troncoencefálico, y fiebre catarral maligna lacual se caracteriza por panvasculitis,siendo necesario la remisión de tejidoscorrespondientes a varios sistemas orgá-nicos para solventar el diagnóstico pato-lógico.

Se lograron poner a punto y ejecutarcon éxito técnicas de IHQ para detecciónde virus de rabia, BoHV-1, BoHV-5 yListeria monocytogenes.

La IHQ para detección de virus derabia demostró ser una técnica que faci-lita la detección de corpúsculos de inclu-sión intracitoplasmáticos en tejidos pa-rafinados con elevada sensibilidad y es-pecificidad, resultando un ensayo com-plementario a la IFD e inoculación intra-cerebral de ratones. Se considera degran utilidad cuando sólo se dispone dematerial fijado o parafinado así como parala realización de estudios retrospectivos.No se encontraron casos positivos a ra-bia que no estuvieran comprendidos en elbrote 2007-2010.

Se realizó la primera comprobación dela presencia del BoHV-5 en casos espon-táneos de meningoencefalitis necrotizanteen bovinos de Uruguay. Se pudo diferen-ciar encefalitis producidas por BoHV-5 yBoHV-1 con el empleo de anticuerposmonoclonales específicos.

La técnica de IHQ para detección deListeria monocyotogenes demostró au-mentar las probabilidades de llegar aldiagnóstico etiológico de la enfermedaden comparación con el aislamiento bac-teriológico.

Se realizó la primera identificación delvirus de FCM en Uruguay mediante PCRa partir de muestras de sistema nerviosobovino fijado en incluido en parafina.

En suma, se demuestra un incremen-to en la capacidad de realizar el diagnós-tico etiológico de las enfermedades estu-


diadas, permitiendo la diferenciación delos principales agentes que causan en-cefalitis en bovinos de Uruguay.

AGRADECIMIENTOSAl Instituto Nacional de Investigación

Agropecuaria (INIA) por proporcionar losrecursos que posibilitaron la realizaciónde este estudio, y al personal del Institu-to por su profesional y siempre cordialatención.

A la Comisión Nacional de FomentoRural quienes realizaron la administra-ción del Proyecto permitiendo la concre-sión de las actividades según fueronplanificadas.

A los colegas veterinarios de profe-sión liberal por la remisión de las mues-tras que constituyeron la matriz de esteestudio.

A nuestros compañeros de la DILA-VE y Dirección de Sanidad Animal por suconstante apoyo a nuestra actividad.

A los Dres Miguel Franchi, RosarioBové y Fabiana López, (Laboratorio Re-gional DILAVE Tacuarembó), quienes nosremitieron gran parte del material proce-dente del brote de rabia.

Al Dr. Rodolfo Rivero (Laboratorio DI-LAVE Paysandú) quien actuó como con-sultor de la producción científica.

Al Dr. Fernando Dutra (LaboratorioDILAVE Treinta y Tres) quien colaboróen el aporte de casos detectados en elárea de influencia de dicho laboratorio.

A la Dra. Glaucia Kommers (Cátedrade Patología de la Facultad de Veterina-ria de Santa María, Brasil) y su equipo,quienes muy cordialmente nos recibie-ron en su laboratorio brindándonos todoel apoyo necesario para la puesta apunto de la técnica de IHQ para detec-ción de virus de rabia.

A la Dra. Cecilia Galossi (Facultad deVeterinaria, Universidad Nacional de LaPlata, Argentina) por su colaboración enesta investigación.

Al Dr. Clairton Marcolongo (Laborato-rio Regional de Diagnóstico de FacultadVeterinaria de Pelotas, Brasil) quien co-laboró en la puesta punto de técnicas deIHQ.

A Dr. David Driemeier y Dra. TatianeTerumi (Facultad de Veterinaria PortoAlegre, Universidad Federal Rio Grandedo Sul, Brasil) por abrir las puertas de sulaboratorio y brindar todo su apoyo.

Al Dr. Luciano Nakazato y sus cola-boraodres (Laboratorio de Biología Mole-cular, Facultad Veterinaria Mato Grosso,Brasil) por recibir y procesar las mues-tras de FCM por PCR.

Muy especialmente a nuestros com-pañeros, Sra. Daysi Piñeiro y Sr. MarioBentancor por su constante colabora-ción, cordialidad y profesionalismo en eldesarrollo diario de sus labores.

BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA1. BARROS, C.; DRIEMEIER, D.; DUTRA, I.,

LEMOS, R. 2006. Doenças do sistemanervoso de bovinos no Brasil. Ed.AGNS. 207p.

2. CHUNG, C.S.; PEARSON, L.D.; AYERS,V.K.; COLLINS, J.K. 1994. Monoclonalantibodies that distinguish betweenEncephalitogenic Bovine HerpesvirusType 1.3 and Respiratory BovineHerpesvirus Type 1.1. Clin. Diagn. Lab.Immunol. 1(1): 83-88.

3. CORREA MESSUTI, C.A. 2007. Informede notificación de ocurrencia de rabiaen Uruguay a la OIE. World AnimalHealth Information Database (WAHID)Interface. http://www.oie.int/wahis/public.php?page=single_report&pop=1&reportid=6404.

4. CRAWFORD, T.B.; LI, H.; O´TOOLE, D.1999. Diagnosis of malignant catharralfever by PCR using formalin-fixed,paraffin-embedded tissues. J. Vet.Diagn. Invest.11:111-116.

5. DILGER SANCHEZ, A.W.; LANGOHR,I.M.; LÜCKE STIGGER, A.; BARROS,C.S.L. 2000. Doenças do sistemanervoso central em bovinos no sul doBrasil. Pesq.Vet.Bras. 20(3):113-118.

6. ELIAS, F.; SCHILD, A.L.; RIET-COREA,F. 2004. Meningoencefal i te eencefalomalacia por Herpesvirusbovino 5: distribuição das lesões nosistema nervoso central de bovinosnaturalmente infectados. Pesq. Vet.Bras.24(3):123-131.

7. FURTADO, A.; CAMPOS, F.; LLAMBÍ, S.;MAISONNAVE, J.; ROEHE, P.; PUENTES,R. 2011. Detección de infecciones latentes


de Herpesvirus bovino 5 (BoHV-5) enganglios trigéminos de bovinos enviadosa faena en el Uruguay. XV CongresoLatinoamericano de Buiatría, Paysandú,Uruguay, 270-271.

8. GIMENO, E.J.; MASSSONE, A.R.;PORTIANSKY, E.L. 2000. Universidadde La Plata, Argentina, Departamentode Patología Manual de Introducciónde las Técnicas inmunohistoquímicasy aplicaciones en Patología Veterinaria.

9. HÜBNER, S.O.; PESCADOR, C.;COBERLLINI, L.G.; DRIEMEIER, D.;SPILKI, F.R.; ROEHE, P.M. 2005.Otimização da imuno-histoquímicapara detecção de Herpesvirus bovinotipo 5 (BHV-5) em tecidos dos sistemanervoso central f ixados comformaldeído. Arq. Bras. Med. Vet.Zootec. 57(1):1-6.

10. LANGOHR, I.M.; IRIGOYEN, L.F.; AMARALDE LEMOS, R.A.; BARROS, C.S.L. 2003.Aspectos epidemiológicos, clínicos edistribuição das lesões histológicasno encéfalo de bovinos com raiva.Ciencia Rural, Santa Maria 33(1):125-131.

11. LI, H.; SHEN, D.T.; DAVIS, W.C.;KNOWLES, D.P.; GORHAM, J.R.;CRAWFORD, T. 1995. Identification andcharacterization of the major proteinsof malignant catarrhal fever virus.J.gen.Virol. 76:123-129.

12. LIGGITT, H.D.; DE MARTINI, J.C. 1980.The pathomorphology of malignantcatarrhal fever. Vet. Pathol. 17:58-72.

13. MANUAL DE LAS PRUEBAS DEDIAGNÓSTICO Y DE LAS VACUNASPARA LOS ANIMALES TERRESTRES DELA ORGANIZACIÓN INTERNACIONAL DESANIDAD ANIMAL. 2008. Capítulo2.1.13. Rabia. Disponible en: http://www.o ie . in t / f i leadmin/Home/esp/H e a l t h _ s t a n d a r d s / t a h m /2.01.13.%20Rabia.pdf.

14. ODEÓN, A.C.; CAMPERO, C.M.;ODRIOZOLA, E.; SPÄTH, E.J.A. 2002.Patología de casos neurológicos enbovinos y su importancia en el monitoreode encefalopatías esporádicas. XIVReunión Anual de la AsociaciónArgentina de Veterinarios deLaboratorios de Diagnóstico; Villa Gral.Belgrano; Sierras de Córdoba.

15. PATEL, J.R.; EDINGTON, N. 1980. Thedetection of herpesvirus of malignantcatarrhal fever in rabbit lymphocytes invivo and in vitro. J. gen. Virol. 48:437-444.

16. PEDRAZA, F.J.; SCHILD, A.L.; ALESSI ,A.C.2008.Descripción inmunohistoquímicade la encefalitis en bovinos brasileñosnaturalmente infectados conHerpesvirus bovino tipo 5 (BoHV-5)Arch.Med.Vet. 40:69-75.

17. PELT-VERKUIL, E.; BELKUM, A.; HAYS,J.P. 2008. Principles and TechnicalAspects of PCR Amplification. 1a ed.Antilles, Ed. Springer Netherlands,325p.

18. PÉREZ,S.E.; VAGNOZZI, A.; SUR, J.H.;ODRIZOLA, E.; CAMPERO, C.M.;ODEON, A.C. 2003. Anál is isretrospectivo de casos con diagnósticode necrosis cerebrocort ical y surelación con Herpesvirus bovino tipo 5.Revista Argentina de Microbiología35:60-73, ISSN 0325-7541.

19. RIET-CORREA, F.; SCHILD, A.L.; GEVEHRFERNÁNDEZ, C. 1998. Enfermidadesdo sistema nervoso dos ruminantesno sul do Rio Grande do Sul. CienciaRural, Santa María, 28(2):341-348.

20. RIET-CORREA, G.; DUTRA DUARTE, M.;BARBOSA, J.D.; CHAVES OLIVEIRA,C.M.; DUARTE CERQUEIRA, V.; FARIASBRITO, M.; RIET-CORREA, F. 2006. Me-nigoencefalite e polioencefalomalaciacausada por Herpesvirus bovino 5 noEstado do Pará. Pesq.Vet.Bras.26(1):44-46.

21. RIVERO, R .; DEL CAMPO, R.; SAIZAR,J. ; GIL, J . ; GIANNECHINI , E . ;MENDARO, A.; WETTSTEIN, R. 1997.Meningoencefalitis por Herpesvirusen bov inos y su comprobac iónmed ian te e l p roced ime in to dehibr idac ión de ac idos nucle icos(Dot-Blot). Revista Veterinaria, vol 33N° 134 abril/junio, p 5-9.

22. SIMON, S.; LI, H.; O´TOOLE, D.;CRAWFORD, T.B.; OAKS, J.L. 2003. Thevascular lesions of a cow and bisonwith sheep-associated mal ignantcatharral fever contain ovineherpesvirus 2- infected CD8+ Tlymphocytes. J.gen.Virol . 84:2009-2013.


DOCUMENTOS ANEXOS

Protocolo deInmunohistoquímica para

diagnóstico de rabia(Adaptación del Protocolo del

Laboratorio de PatologíaVeterinaria de la Universidad

Federal de Santa María, Brasil)

1. Desparafinación y rehidratación de loscortes histológicos (xilol y alcohol).

2. Bloqueo de peroxidasa endógena conperóxido de hidrógeno.

3. Recuperación antigénica por calor(microondas, en buffer citrato pH 6,1).

4. Bloqueo de reacciones inespecíficascon caseína de la leche.

5. Marcación IHQ específica de virus rábicocon anticuerpo primario policlonal(Millipore (UK) Ltd), a una dilución de1:1000.

6. Sistema de detección Avidina –Streptavidina – Peroxidasa de rábanopicante (LSAB+System-HRP, de lamarca DAKO).

7. Revelado de la reacción con3´,3´diaminobencidina (DAB) comocromógeno.

8. Coloración de contraste conHematoxilina de Harris.

9. Deshidratación, clarificación y montaje.

Protocolo deInmunohistoquímica para

detección de BoHV



3. Recuperación antigénica por digestiónproteica con enzima proteinasa K al0.05%.

4. Bloqueo de reacciones inespecíficasempleando caseína de la leche.

5. Marcación IHQ específ ica conanticuerpo primario monoclonal deVMRD (BoHV-5: L6G / BoHV-1: F2) enuna dilución de 1:1000 para ambos.

6. Sistema de detección Mach 4 UniversalHRP-Polymer Kit (Biocare Medical, USA)

7. Revelado de la reacción con DAB comocromógeno.



Protocolos deInmunohistoquímica para

detección de L. monocytogenes

Protocolo 1 (NIAH, Japón)



3. Recuperación antigénica por digestiónproteica con actinasa al 0.1%.

4. Bloqueo de reacciones inespecíficascon caseína utilizando una solucióncomercial (Background sniper- BiocareMedical, USA).

5. Marcación IHQ específ ica conanticuerpo primario «anti Listeria 1a +4b» a una dilución de 1:5000.

6. Sistema de detección Mach 4 UniversalHRP-Polymer Kit (Biocare Medical,USA)




Protocolo 2(Adaptación del Protocolo de laFacultad de Veterinaria Porto Alegre,Universidad Federal de Rio Grande doSul, Brasil)

1. Desparafinación y rehidratación de loscortes histológicos (xilol, alcoholes aconcentraciones decrecientes, aguadestilada).

2. Bloqueo de peroxidasa endógena consolución peróxido de hidrógeno 10%en metanol por 15 minutos.

3. Bloqueo de reacciones inespecíficascon solución de leche descremada al5% en PBS o agua destilada por 20 a25 minutos.

4. Marcación IHQ específ ica conant icuerpo pr imario Lister iamonocytogenes (BD, Difcoâ) a una


dilución de 1/200, 1 hora en estufa(37ºC)

5. Sistema de detección Avidina –Streptavidina – Peroxidasa de rábanopicante (LSAB+System-HRP, de lamarca DAKO).





Anticuerpo Bloqueo de reacciones

inespecíficas

Recuperación

antigénica

Sistema de detección

Cromógeno

N10-A (VMRD) Peroxidazed®

Biocare- Leche en polvo 5%, 30´

Microondas máx. pot. 15´

Mach 4 Universal HRP-Polymer Kit

(Biocare) DAB

36-A (VMRD) Peroxidazed®




(Biocare) DAB





(Biocare) DAB





(Biocare) DAB





(Biocare) DAB





(Biocare) DAB





(Biocare) DAB





(Biocare) DAB





(Biocare) DAB



Proteinasa K 5´ Mach 4 Universal HRP-Polymer Kit

(Biocare) DAB




(Biocare) DAB




(Biocare) DAB



Proteinasa K 90 seg.

Mach 4 Universal HRP-Polymer Kit DAB





(Biocare) DAB





(Biocare) DAB

Protocolos de Inmunohistoquímica probados para detección de virus de la FCM


Impreso en Editorial Hemisferio Sur S.R.L.Buenos Aires 335Montevideo - Uruguay

Depósito Legal 259-871/12

fpta 40. identificación de agenes infecciosos en encefalitis de bovinos de … · agentes...

Documents