francesco piva istituto di biologia e genetica università politecnica delle marche introduzione...

Francesco PivaIstituto di Biologia e Genetica

Università Politecnica delle Marche

Introduzione alla bioinformatica

Novembre 2003

Obiettivi della bioinformatica

Banche dati: raccolta dati, ordinamento, correlare quelli che trattano i diversi aspetti di uno stesso tema, renderli fruibili in modo semplice, unificare le banche adti.

Ricerca dei geni in un genoma

Inferire la funzione delle proteine a partire dalla sequenza del gene, da qui la possibilità di creare nuove proteine con nuove funzioni

Prevedere lo splicing dell’mRNA a partire dalla sequenza del pre-mRNA, capire l’effetto delle mutazioni

Descrivere la rete genica di una cellula, chi attiva o reprime chi, da chi si fa attivare o reprimere. Prevedere al computer l’effetto di uno stimolo esogeno… sapere come compensarlo. Sapere che stimolo generare per produrre certi effetti

Capire l’evoluzione delle specie

Poter prevedere la ricombinazione nel DNA Francesco PivaIst Biologia e Genetica, Ancona

Metodi della bioinformatica

database

Risorse umane, formazione, mezzi

Teoria dell’informazione, studio dei linguaggi, ridondanza, entropia, correlazione…

Metodi statistici

Data mining

Reti neurali

Algoritmi matematici: FFT, Wavelet, ICA, PCA, teoria delle reti…

…Francesco PivaIst Biologia e Genetica, Ancona

cromosoma

mRNA

Cloni di cDNA

cDNA

Il trascrittoma: quanti e quali geni?

Quanti e quali geni sono contenuti in un genoma?

Quali geni sono espressi in un tessuto?

E in un tessuto patologico?

Cellule o tessuti

Sequenziamento…EST

Francesco PivaIst Biologia e Genetica, Ancona

TTTTTT

AAAAAA3’UTR5’UTR ESONE 1 ESONE 2

mRNA

TTTTTT

3’

GGGGGG

Rimozione dell’RNA e attacco di un poly (G) al cDNA

TTTTTTLe sequenze di cDNA ottenute dall’mRNA sono generalmentetronche

La costruzione del cDNA


AAAAAA 3’

TTTTTT 5’GGGGGG

CCCCCC

Produzione del cDNA complementare

Metilazione dei due cDNA per proteggere i siti di restrizione

CH3

AAAAAA

TTTTTTGGGGGG

CCCCCC

GAATTC

CTTAAG

GAATTC

CTTAAG

Aggiunta di siti di restrizione Eco RI


Digestione con Eco RI

AAAAAA

TTTTTTGGGGGG

CCCCCC

GAATTC

CTTAAG

GAATTC

CTTAAG

AAAAAA

TTTTTTGGGGGG

CCCCCC

AATTC

G

G

CTTAA

vector

Ligazione del cDNA nei plasmidi


La potenzialità di una libreria di cDNA è in relazione al numero di inserti di cDNA indipendenti che siamo riusciti a clonare.

Supponendo di prelevare un’aliquota di batteri trasformati, il titolo è dato dal numero di colonie per unità di volume di batteri ricombinanti


Come stimare la potenzialità di una libreria di cDNA?

Si potrebbe digerire il DNA plasmidico con enzimi di restrizione e analizzare i frammenti tagliati

3kb vettore

inserti

I cloni 7, 8, 9 e 13 non sono ricombinanti: quindi 4/16 = 25%

Esempio di una libreria:Titolo: 100 unità formanti colonia/microlitri% cloni non ricombinanti: 10%Volume totale di batteri trasformati: 1 mlPotenzialità: (100000 cloni totali – 10000 non ricombinanti) = 90000 inserti di cDNA

Calcolo delle probabilità applicato alle librerie di cDNA

Che probabilità abbiamo di trovare il clone A2B che ha frequenza dell’ 1% (f=0.01) in una libreria di 100 (N=100) cloni?

Dalla formula

Ricaviamo P = 63.4%)1ln(

)1ln(

f

PN

Quanti cloni devo sequenziare (N = ?) per essere abbastanza sicuro (99% P=0.99) di trovare il clone A2B che ha una frequenza dell’1% (f=0.01)?

Dalla stessa formula ricaviamo N = 458


Un caso reale

Quanti cloni devo sequenziare per avere il 99% delle probabilità di trovare un particolare clone di mio interesse?

In una cellula ho circa 500000 molecole di mRNA

quelli più abbondanti sono rappresentati in 10000 – 15000 copie per cellulaf=10000/500000 0.02

quelli mediamente abbondanti in 200 – 500 copie per cellulaf=500/500000 0.001

quelli rari in 1 – 15 per cellulaf=15/500000 0.000002

per gli abbondanti risulta… N=230 per i mediamente abbondanti… N=4600 per i rari… N=155000


Anziché mettersi a sequenziare in modo furioso, si può cercare di operare sulla libreria in modo di aumentare la probabilità di trovare il cDNA di interesse. Questo lo si può fare in vari metodi:

Metodo di arricchimento

Frazionamento in gel

Clonazione per sottrazione


Metodo di arricchimento

Per arricchire la libreria del cDNA di interesse si può

- selezionare in partenza le cellule o i tessuti più ricchi del trascritto- rimuovere dalla libreria le sequenze che non interessano- indurre o aumentare la trascrizione del particolare gene con stimoli specifici


Frazionamento in gel

Se si sa la lunghezza del cDNA che stiamo cercando, si possono selezionare su gel prima di legarli al vettore


Clonazione per sottrazione

Linea cellulare + Linea cellulare -

Sintesi del cDNA dall’mRNA

Eliminazione dell’mRNA

IbridazionemRNA non appaiaticDNA non

appaiati

Recupero del cDNA non appaiato tramite colonnine di idrossiapatite. Ottengo solo quello non comune alle due linee

mRNA


Tipo di cDNA

N°

di c

opie

Normalizzazione delle librerie di cDNA

Tipo di cDNAN

° di

cop

ie

Supponendo di avere il cDNA di 8 geni espressi con intensità diversa, mostriamo il grafico dell’abbondanza di copie di cDNA prima e dopo la normalizzazione della libreria

Si perdono le informazioni sul livello di espressione dei geni

Al fine di trovare con la stessa probabilità sia le sequenze abbondanti che quelle rare si attua una normalizzazione delle librerie di cDNA. Per far questo si sfrutta il fatto che i cDNA più abbondanti, si appaiano o ibridizzano più rapidamente e possono essere rimossi dall’insieme di cDNA di partenza. In questo modo l’insieme rimanente si svuota delle sequenze più abbondanti ovvero si arricchisce di quelle più rare.


Generazione delle sequenze EST: etichette di sequenza espressa

AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

cDNA clone

sequencing primers

3’ EST5’ EST


Scarsa qualità delle sequenze: errori dovuti ad un sequenziamento automatizzato, senza la supervisione di un operatore, sequenza a passaggio singolo. Quello che importa è determinare la presenza di un trascritto non la sua sequenza. In questo modo si perdono le informazioni sulle mutazioni.

>T27784 g609882 | T27784 CLONE_LIB: Human Endothelial cells. LEN: 337 b.p. FILE gbest3.seq 5-PRIME DEFN: EST16067 Homo sapiens cDNA 5' end AAGACCCCCGTCTCTTTAAAAATATATATATTTTAAATATACTTAAATATATATTTCTAATATCTTTAAATATATATATATATTTNAAAGACCAATTTATGGGAGANTTGCACACAGATGTGAAATGAATGTAATCTAATAGANGCCTAATCAGCCCACCATGTTCTCCACTGAAAAATCCTCTTTCTTTGGGGTTTTTCTTTCTTTCTTTTTTGATTTTGCACTGGACGGTGACGTCAGCCATGTACAGGATCCACAGGGGTGGTGTCAAATGCTATTGAAATTNTGTTGAATTGTATACTTTTTCACTTTTTGATAATTAACCATGTAAAAAATG


Problemi con gli EST

Le sequenze provenienti dallo stesso trascritto vanno raggruppate ‘clustering’Questa operazione non è banale perchè bisogna tener conto dei seguenti problemi:

- presenza di polimorfismi, le mie EST potrebbero non allineare con la sequenza genomica poiché le EST sono del mio organismo, il genomico è di un organismo diverso da quello che sto studiando- un gene può avere anche centinaia di varianti di splicing- i geni paraloghi (fisicamente in posizioni cromosomiche diverse ma con trascritti quasi identici)- presenza negli EST di pezzi di vettore plasmidico- presenza di sequenze genomiche batteriche- presenza di sequenze ripetute come le Alu- artefatti dovuti al fatto che due inserti di cDNA entrano in tandem in un vettore plasmidico e io li leggo come un unico trascrittoIn generale questi problemi sono completamente superabili solo quando si conosce la sequenza genomica della specie che sto studiando


cDNA, EST e banche datidbEST (pronuncia ‘the best’)Divisione di GenBank che contiene tutte le sequenze EST, classificate per specie, tessuto, patologia…


dbEST release 103103 Summary by Organism - October 31, 2003

Number of public entries: 18,971,362

Homo sapiens (human) 5,427,521 Mus musculus + domesticus (mouse) 3,915,334 Rattus sp. (rat) 538,251 Triticum aestivum (wheat) 500,902 Ciona intestinalis 492,488 Gallus gallus (chicken) 451,565 Zea mays (maize) 383,759 Danio rerio (zebrafish) 362,445 Hordeum vulgare + subsp. vulgare (barley) 348,233 Xenopus laevis (African clawed frog) 344,747 Glycine max (soybean) 341,578 Bos taurus (cattle) 329,387 Drosophila melanogaster (fruit fly) 261,414 Oryza sativa (rice) 260,890 Saccharum officinarum 246,301 Caenorhabditis elegans (nematode) 215,200 Silurana tropicalis 209,240 Arabidopsis thaliana (thale cress) 190,732 Medicago truncatula (barrel medic) 187,763 Sus scrofa (pig) 171,920 Francesco Piva

Ist Biologia e Genetica, Ancona

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

1: BM055437 . ie94h04.y1 Melton...[gi:16813328] IDENTIFIERS

dbEST Id: 10156577 EST name: ie94h04.y1 GenBank Acc: BM055437 GenBank gi: 16813328

CLONE INFO Clone Id: IMAGE:5674615 (5') Source: University of Pennsylvania & Harvard University (HHMI) & Washington University (GSC) Other ESTs on clone:ie94h04.x1 DNA type: cDNA

PRIMERS PolyA Tail: Unknown

SEQUENCE GCCTCTTGGGAAGAACTGGATCAGGGAAGAGTACTTTGTTATCAGCTTTTTTGAGACTACTGAACACTGAAGGAGAAATCCAGATCGATGGTGTGTCTTGGGATTCAATA ACTTTGCAACAGTGGAGGAAAGCCTTTGGAGTGATACCACAGAAAGTATTTATTTTTTCTGGAACATTTAGAAAAAACTTGGATCCCTATGAACAGTGGAGTGATCAAGAA ATATGGAAAGTTGCAGATGAGGTTGGGCTCAGATCTGTGATAGAACAGTTTCCTGGGAAGCTTGACTTTGTCCTTGTGGATGGGGGCTGTGTCCTAAGCCATGGCCACA AGCAGTTGATGTGCTTGGCTAGATCTGTTCCAGTAAGGCGAAGATCTTGCTGCTTGATGAACCCAGTGCTCATTTGGATCCAGTAACATACCAAATAATTAGAAGAACTCT AAAACAAGCATTTGCTGATTGCACAGTAATTCTCTGTGAACACAGGATAGAAGCAATGCTGGAATGCCAACAATTTTTGGTCATAGAAGAGAACAAAGTGCGGCAGTACGATTCC Quality: High quality sequence stops at base: 429

Entry Created: Nov 8 2001 Last Updated: Mar 12 2002

COMMENTS Library was constructed by Dr. Douglas Melton DNA sequencing by: Washington University Genome Sequencing Center For information on obtaining a clone please contact: Juliana Brown ([email protected]) This sequence now available from the IMAGE consortium, for clone orders contact: [email protected]

PUTATIVE ID Assigned by submitter SW:CFTR_HUMAN P13569 CYSTIC FIBROSIS TRANSMEMBRANE CONDUCTANCE REGULATOR ;

LIBRARY Lib Name: Melton Normalized Human Islet 4 N4 - HIS 1 Organism: Homo sapiens Sex: Both Organ: Pancreas Tissue type: Islets of Langerhans Develop. stage: Adult Lab host: DH10B R. Site 1: Not 1 R. Site 2: Sal 1

Inserendo ‘homo sapiens’ e ‘CFTR’


Integrated Molecular Analysis of Genomes and their Expressions


Attenzione: la ricerca è ‘case sensitive’ quindi se digitate ‘cftr’ non trova nulla, si deve digitare ‘CFTR’ maiuscolo.


Geni noti in NCBI Reference Sequence

Geni non noti in NCBI Reference Sequence

In IMAGE si trovano due tipi di cluster di geni a seconda che corrispondano a geni già noti

Full:Cluster i cui cloni allineano pienamente con un gene noto

Predicted full:Cluster che contengono una ORF completa ma il cui gene è stato solo predetto sperimentalmente

Unknown:Cloni di cui non si sa se rappresentano l’intera ORF (perché è stato determinato un solo EST del clone)

Partial:Cloni che non rappresentano l’intera ORF (gli EST al 5’ e al 3’ non coprono l’intera regione del clone)

Empties:Cluster già noto ma di cui in questa libreria non ci sono cloni

Multi-member:Cluster contenente più cloni e il cui gene non è ne noto ne predetto

Singletons:Singolo clone che non si può raggruppare con altri già noti e contiene almeno 50 nucleotidi in cui non ci sono sequenze ripetute


descrizione del gene

Identificativo del cluster, attenzione perché può cambiare

Numero di cloni che coprono interamente la sequenza codificante, se ne esiste almeno uno allora abbiamo un ‘full cluster’

E’ possibile vedere gli allineamenti dei cloni che compongono il cluster

o quello delle singole sequenze EST


In questa schermata troviamo i dati sui cloni e sugli EST

Il bottone restituisce la descrizione del gene


clone

EST

Classificazione di un clone:predicted full, unknown, partial…

Provenienza del clone

Mammalian Gene Collection

Lunghezza del clone:dimensione determinata,se si conosce un solo EST si indica la lunghezza minima

chi ha verificato il clone

A volte è ambiguo stabilire a quale cluster appartiene un certo clone, il numero a fianco indica a quanti altri cluster (oltre a questo) appartiene questo clone

Bento SoaresColumbia UniversityLavora alla creazione di librerie di EST [email protected]


mailto:[email protected]

http://merops.sanger.ac.uk/


Si possono fare ricerche per identificativo dell librera, tassuto, stadio di sviluppo…


o per patologia…


Identificato un gene, mostra la descrizione della proteina

gli allineamenti…


Gli omologhi


UniGeneSviluppato da NCBI, contiene i cluster corrispondenti ai geniGli EST sono stati filtrati, verificati con MegaBlast, tutti i cluster sono confrontati con i nuovi EST e verificati settimanalmenteNota: non fare riferimento agli ID (identificativi) dei cluster poiché possono cambiare settimanalmente


Dalla schermata precedente c’è un collegamento a questo sito

Vengono fornite le sequenze di 10 basi (etichette) in ordine di occorrenza decrescente nel cluster per il gene di interesse

STACKSviluppato dal South African National Bioinformatics Institute, contiene i dati sui cluster, il criterio di allineamento è un po diverso da quello di UniGene perché inizialmente si verifica se due EST sono parzialmente sovrapposti controllando se hanno parti in comune


TIGR

In generale i dati di clustering differiscono da una banca dati all’altra a causa dei diversi criteri adottati Francesco Piva


ORF nelle tre fasi, nel filamento diretto e inverso

Zona e direzione in cui allineano gli EST

Per ciscun EST e possibile avere informazioni dal sito TIGR, da GenBank Nucleoride e da IMAGE Francesco Piva


Noi possiamo allineare i trascritti sul DNA genomico tramite programmi disponibili su siti internetQuesti programmi tengono conto che - il trascritto deve essere completamente contenuto nel DNA genomico- l’appaiamento potrebbe non essere perfetto- l’appaiamento può essere interrotto da introni


Predizione teorica dei geni in un genoma

metodi

Analisi discriminante lineare e quadratica

Modelli di Markov a variabili nascoste

Metodo del perceptron

Stima degli esameri codificanti

Metodo della matrice di pesi e del vettore di pesi

Decomposizione secondo le direzioni di massima dipendenza

Alberi di decisione

Reti neurali artificiali


Analisi discriminante lineare e quadratica

L’obiettivo di questo metodo è:

Identificare le variabili e le relazioni tra di esse che permettono di differenziare due o più gruppi di dati

Classificare nuovi casi nei gruppi ricavati (predittività)

Concentrazione di A

Con

cent

raz i

o ne

di B

Es: distinguere gli individui sani e malati in base alla misura della concentrazione di due enzimi.Con il metodo dei minimi quadrati si minimizza l’errore di classificazione e si ottiene una relazione lineare tra le due variabili

Concentrazione di A

Con

cent

raz i

o ne

di B

Nel caso del riconoscimento degli esoni in una sequenza di pre-mRNA, come variabili si sceglie la frequenza di certe triplette nei siti di splicing in 5’ e in 3’.

linearequadratico


Modelli di Markov a variabili nascoste

Un sistema viene descritto da una successione di stati discreti e dalla probabilità di transizione da uno stato all’altro

AA

C C

G

T

G

T

0,32

0,31

0,31

0,18

0,36

0,37

0,35

0,26 0,20

0,15

0,20

0,17

0,16

0,18

0,15

0,36

AC GT A

Data una sequenza esonica:…catga…

Possiamo rappresentarla come la successione di stati di un sistema e ricavare un modello descrittivo che a partire da un certo stato indichi la probabilità di transizione verso un altro stato.La parola nascosti indica che uno stato non può essere osservato

Gli schemi di transizione sono caratteristici delle zone codificanti e non.


Date le cinque sequenze sotto, cerchiamo di ricavare un modello di Markov

Si ricava questo modello

E.g. P(ACACATC) = (0.8 * 1)*(0.8*1)*(0.8*0.6)*(0.4*0.6)*(1*1)*(0.8*1)*(0.8) A C A C A T C

(S = logP(sequenza) - lunghezza(sequenza)*log0.25 )

Inserzione di uno stato (regioni altamente variabili)

Stati principali


L’attuale modello di predizione di un gene

Stati principali

Inserzione di uno stato (regioni altamente variabili)

Stati particolari (es: n)

- si possono rappresentare regole semplici- non si considera la frequenza dei dinucleotidi- non si considera la dipendenza (correlazione) fra i nucleotidi- in realtà ci vorrebbe un modello di Markov per gli esoni, uno per gli introni, uno per le regioni non tradotte


Perceprton

w1

w2

w3

wn

x1

x2

x3

xn

b

biasweightsinputs

non linearfunction

)(1

bfyn

iii xw

assoni sinapsi

dendritiassone

corpo

E’ un algoritmo realizzato con una rete neurale artificiale che realizza l’analisi discriminante lineare, questo prova iterativamente vari piani di separazione cercando ad ogni passo di minimizzare l’errore di discriminazione.


Stima degli esameri

Le sequenze vengono trattate come successioni di parole. Ciascuna parola è un insieme di basi, ad esempio sei simboli formano un esameroLa distinzione tra sequenze codificanti e non, si basa sulla frequenza con cui si trovano certi esameri

Alcune parole sono caratteristiche delle sequenze codificantiEs: CAGCAGAltre sono caratteristiche di quelle non codificantiEs: TAATAADall’osservazione dei geni si ricava un punteggio che viene assegnato ad ogni esamero.Il punteggio può essere positivo o negativo a seconda che sia indizio di una sequenza codificante o meno.

In fase di analisi, data una sequenza che potrebbe rappresentare un potenziale gene, si estraggono tutti gli esameri e si ricava un punteggio totale.


Metodo della marice di pesi

Questo metodo è usato per assegnare un punteggio ad un sito di DNA o RNA per indicare quanto questo sia affine a legare una proteina o altro

Punto debole: non si tiene conto delle correlazioni tra basi in diversa posizioneEs:

Punteggio (gtcacgt) = -0.21 -0.5 +0.73 +1.32 +0.94 +0.99 +0.27 = 3,54

GTCACGT

GTCACTT

Questi siti di legame differiscono solo per la sesta posizione. Non è detto che il punteggio in posizione 4 (A) dipenda solo dal nucleotide che si trova in quella posizione: potrebbe dipendere da quali altri nucleotidi sono presenti nelle vicinanze. In altre parole, a volte non vale la semplice proprietà additiva per calcolare l’affinità di legame

Il metodo del vettore dim pesi associa un punteggio ad un’intera parola anziché ad una singola base

Decomposizione secondo la direzione di massima dipendenza


Reti neurali artificiali


francesco piva istituto di biologia e genetica università politecnica delle marche introduzione...

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