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GASTRIN
[125I] Radioimmunoassay Kit Page 1
Gastrin [125I]Radioimmunoassay Kit Seite 9
Kit pour Dosage Radio-Immunologique de laGastrine [125I] Page 17
Kit Radioimmunologico per il Dosaggio della Gastrina [125I] Pagina 26
Gastrin [125I]Kit de Radioimmunoensayo Página 34
100 Tube Kit Catalog No.06B255017200 Tube Kit Catalog No.06B255025
RIA HOT LINE U.S. ONLY: 1-800-437-1705
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GASTRIN [125I] Radioimmunoassay Kit
100 Tube Kit Catalog No. 06B255017200 Tube Kit Catalog No. 06B255025
For the Quantitative Determination of Immunoreactive Gastrins in Serum.
Summary and Explanation of the Test
Gastrin exists as at least four sulfated and non-sulfated polypeptide hormones producedand secreted by specific endocrine cells (G-cells) which are located in the mucosa ofthe gastric antrum and to a lesser extent, the proximal duodenum1-4. The mostabundant form of gastrin is composed of 34 amino acids and is known as big gastrinor G-34. Another form is the heptadecapeptide known as little gastrin or G-17. On amolar basis G-17 is a three to five fold more potent stimulant of gastric acid secretionthan G-345.
Measurement of the major forms of gastrin or immunoreactive gastrin in serum hasbecome the definitive test for the diagnosis of gastrinoma in patients with gastric acidhypersecretion1,6. Serum gastrin measurements may also be helpful in the evaluationof patients with suspected antral G-cell hyperplasia (hyperfunction), isolated retainedantrum or atrophic gastritis7-9. Elevated gastrin values may also be obtained in patientswith renal failure, although these patients do not usually secrete excessive amounts ofgastric acid10, and in pernicious anemia11.
Principle of the Test
In radioimmunoassay, the standard and the analyte which is present in the patient'ssample compete with labeled analyte for the limited number of available antibodybinding sites thereby reducing the amount of labeled analyte bound to antibody. Thelevel of radioactivity bound is, therefore, inversely related to the concentration ofanalyte in the sample or standard.
In the MP Biomedicals Gastrin [125I] Radioimmunoassay Kit, the antibody recognizes themajor circulating forms of gastrin. The tracer is monoiodinated [125I] gastrin preparedfree of unlabeled gastrin and diiodinated gastrin.
Reagents
For In Vitro Diagnostic Use
1. Gastrin [125I] Tracer Solution*, Catalog No. 06B255033, ready to125I TRACERuse formulation containing less than 3.5 µCi (130 kBq) gastrin [125I] per vial in0.02 M Tris buffer (pH 8.0) with rabbit globulins, human serum albumin andpreservatives; >10 mL per vial; 1 vial/100 tube kit, 2 vials/ 200 tube kit. Storage:Refrigerate at 2-8°C. Stability: Refer to expiration date on the vial.
2. Gastrin Antiserum*, Catalog No. 06B255041, ready to use rabbit anti-ANTIhuman gastrin containing human serum albumin in 0.02 M Tris buffer (pH 8.0)and preservatives; >10 mL per vial; 1 vial/100 tube kit, 2 vials/200 tube kit.Storage: Refrigerate at 2-8°C. Stability: Refer to expiration date on the vial.
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3. Gastrin Standards A-H*. One vial of each standard in a ready to use STD 1-8formulation containing synthetic human gastrin G-17-I in 0.02 Tris buffer (pH 8.0)with human serum albumin and preservatives. Storage: Refrigerate at 2-8°C.Stability: Refer to expiration date on the vials.
4. Precipitating Antiserum*, Catalog No. 06B254533, ready to useANTI PPTformulation containing goat anti-rabbit antiserum, with precipitation accelerator,human serum albumin and preservative. A bottle contains >100 mL; 1bottle/100 tube kit, 2 bottles/200 tube kit. The contents should be mixed wellprior to use, either by shaking or stirring on a magnetic stirrer. Storage:Refrigerate at 2-8°C. Stability: Refer to expiration date on the bottle.
Standard Catalog No.Volume/Vial (mL) Gastrin, pg/mL (ng/L)
ABCDEFGH
06B25505006B25506806B25507606B25508406B25511406B25512206B25513106B255149
6.02.52.52.52.52.52.52.5
0 15 25 50 100 200 5001000
*CAUTION: HANDLE AS IF CAPABLE OF TRANSMITTING INFECTION. Sourcematerial from which this product was derived was found nonreactive for HBsAg andnegative for HIV antibody when tested with licensed reagents. No known test methodcan offer assurance that products derived from human blood will not be infectious.Refer to CDC/NIH Biosafety in Microbiological and Bio-chemical Laboratories Publication(HHS Publication No. CDC 84-8395).
WARNING: CONTAINS RADIOACTIVE MATERIAL
This MP Biomedicals Gastrin [125I] tracer contains < 3.5 microcuries (130 kilobec-querels) of [125I] in the 100 tube kit, < 7 microcuries (260 kilobecquerels) for the 200tube kit.
This radioactive material may be received, acquired, possessed and used only by phy-sicians, clinical laboratories or hospitals and only for in vitro clinical or laboratory testsnot involving internal or external administration of the material, or the radiationtherefrom, to human beings or animals. Its receipt, acquisition, possession, use andtransfer are subject to the regulations and a general license of the U.S. NuclearRegulatory Commission or a State with which the Commission has entered into anagreement for the exercise of regulatory authority.
MP Biomedicals, LLC
Adherence to the basic rules of radiation safety should provide adequate protection.The user is referred to National Bureau of Standards Handbook No. 92, "Safe Handlingof Radioactive Materials", issued March 9, 1964, Superintendent of Documents, U.S.Government Printing Office, Washington, D.C. 20402. A summary follows:
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# Do not eat, drink, smoke or apply cosmetics where radioactive materials are used.# Do not pipet radioactive solutions by mouth. # Avoid direct contact with allradioactive materials by using protective articles such as lab coats and disposablegloves. # All radiological work should be done in a designated area away from traffic.# Radioactive materials should be stored in their original containers in a designatedarea. # A record book for logging receipt and disposal of all radioactive materialsshould be kept. # Laboratory equipment and glassware which are subject tocontamination should be segregated to prevent cross-contamination of differentradioisotopes. # Any radioactive spills should be taken care of immediately inaccordance with established procedures. # All radioactive materials must be disposedof in accordance with the prevailing regulations and guidelines of the agencies holdingjurisdiction over the laboratory. # Uncontaminated containers may be discarded in non-radioactive waste providing that labels and labeling are defaced.
Equipment and Reagents Required but not Provided:
1. Evacuated Glass Tubes 5 or 10 mL, or Serum Separation Tubes. 2. Any type disposable culture tube, such as Polystyrene 12 x 75 mm. 3. Test-tube racks, regular and for whole-rack decanting. 4. Syringe with Tip, 2 mL and Metal Holder. Disposable needle tubing adapter, 18
gauge. 5. Vortex mixer. 6. Centrifuge capable of achieving an RCF of at least 1500 x g. Ambient and
refrigerated centrifuges have been found acceptable. 7. Gamma counter for measuring [125I]. 8. Any pipettes with disposable tips, capable of accurately delivering 100 and 200
µL.Specimen Collection
For basal serum gastrin levels serum must be obtained after a period of fasting for 10hours or longer. Oxalate, heparin or EDTA plasmas may yield incorrect results andmust be avoided. LIPEMIC OR GROSSLY HEMOLYZED SAMPLES SHOULD NOT BEUSED.
Preparation of Specimen for Analysis: Collect the blood in a 5 or 10 mL EvacuatedGlass Tube or Serum Separation Tube. Allow the blood to clot at room temperaturefor 30-60 minutes. Centrifuge and collect the serum.
Serum should be separated within one hour after collection and assayed within 4 hoursor stored frozen at -20°C until assayed. REPEATED FREEZING AND THAWING MUSTBE AVOIDED.
Shipping of Specimens: Carefully packed serum must be shipped frozen and stored at-20°C until assayed.
Assay Procedure
Reagents and samples must be at room temperature (18-25°C) before use, andreturned to recommended storage conditions immediately after use. Do not usereagents other than those provided in this kit.
In the following protocol, assay of the standards in duplicate is recommended. Patientsamples must be assayed in duplicate and the preparation of the standard curve andthe clinical determinations must be run simultaneously. Control sera should be runconcurrently with patient samples.
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1. Label test tubes 1 to 20 for the standard curve. Starting with 21, label two tubesfor each clinical sample. Keep the tubes at room temperature.
2. Add 200 µL Gastrin Standards or patient samples according to the outline on page4. Pipette tips should be changed between samples to prevent carryover.
3. Add 100 µL Gastrin Tracer Solution to all tubes. Set aside tubes 1 and 2 untilStep 11.
4. Add 100 µL Gastrin Antiserum to tubes 5 to 20 and all patient samples andcontrols. Mix all tubes.
5. Incubate all tubes at room temperature (18-25°C) for 120 minutes. 6. Thoroughly mix the bottle of Precipitating Antiserum by shaking or stirring on a
magnetic stirrer. Add 1.0 mL Precipitating Antiserum to all tubes. Vortex eachtube.
7. Centrifuge all tubes at 1500 x g for 15 minutes. 8. Transfer the centrifuged tubes to a foam rack or other rack suitable for whole-rack
decanting. 9. Decant or aspirate all tubes except 1 and 2 without disturbing the pellets into a
waste container. Discard the supernatants according to accepted procedures fordiscarding radioactive waste.
10. Let the tubes drain upside down on absorbent paper for 5 minutes.11. Determine the radioactivity of the precipitate remaining in each tube by counting
in a gamma counter for a period of time not less than necessary to obtain 5000counts in the zero standard tubes. A longer counting time may be required for aninstrument with low efficiency. However, one minute is generally sufficient.Tubes 1 and 2 will give the Total Count.
Gastrin [125I] Radioimmunoassay
TubeStandard
(µL)Sample
(µL)
Gastrin[125I](µL)
GastrinAntiserum
(µL) Incubate
PrecipitatingAntiserum
(µL) Centrifuge
1, 2 3, 4 5, 6 7, 8 9,1011,1213,1415,1617,1819,20
PatientSamples
----200 A200 A200 B200 C200 D200 E200 F200 G200 H
----------------------------------------
200
100100100100100100100100100100
100
------
100100100100100100100100
100
----Mix alltubesand
incubateat roomtemp.
for 120minutes.
----100010001000100010001000100010001000
1000
VORTEX
----Centrifugeall tubesat 1500 xg for 15minutes
Calculation of Results
A. Logit-Log
1. Average the counts per minute (cpm) found in tubes 3 and 4, the "Blank" tubes.Note: Counting data need not be expressed as cpm. However, the unit of timemust be constant for all tubes counted.
2. Subtract the blank from all other counts to obtain the corrected counts per minute.Use only the corrected counts per minute in the calculations.
3. Average the corrected counts per minute for tubes 1 and 2 to give the correctedTotal Count per assay.
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4. Divide the average of the corrected counts per minute for tubes 5 and 6 by thecorrected Total Count to give the Trace Binding, Bo.
5. Divide the corrected counts for each tube by the average corrected counts fortubes 5 and 6 to give the % of Trace Binding for each tube.
6. A standard curve may be plotted as follows:Using logit-log paper, plot % of Trace Binding as the ordinate versus pg/mL ofgastrin on the log scale. Typical counting data and calculated % of Trace Bindingare shown in Table 1. Figure 1 shows a typical logit-log standard curve.
7. The concentration of gastrin in a patient's serum is determined by interpolationfrom the Standard Curve of % of Trace Binding versus pg/mL gastrin (Figure 1).
8. Example: (See Table 1)
Blank = counts tube 3 + counts tube 4 = 284 + 240 = 262 2 2
Corrected Total Count
= (counts tube 1 - Blank) + (counts tube 2 - Blank)2
= (17526 - 262) + (17024 - 262) = 17013 2
Bo = Trace Binding
= average corrected counts for tubes 5 and 6 x 100corrected Total Count
= 8356 x 100 = 49.1% 17013
% of Trace BindingCalculation for Tube 7 = (counts tube 7 - Blank) x 100
average corrected counts for tubes 5 and 6
= (7670 - 262) x 100 = 88.7% 8356
Sample Calculation for a Patient Specimen (Tube 21)
Counts (found) = 5823
Blank = 262
% of Trace Binding = 5823 - 262 = 66.6% 8356
The logit-log Standard Curve (Figure 1) shows that 66.6% corresponds to a gastrinconcentration of 58.9 pg/mL.
The average of this value and the value for the duplicate determination is reported asthe gastrin concentration in pg/mL for the patient sample (50.7 pg/mL) (54.8 pg/mL).
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B. Alternate methods of plotting a standard curve may be used. These include bothmanual and automated systems, such as counts versus pg/mL, percentage boundversus log concentration, reciprocal count, B/F, spline fit, and others.
Limitations of the Procedure
Gastrin will gradually be degraded by serum proteolytic activity. To minimize a loss inactivity, serum should be separated within one hour and assayed within four hours ofcollection. For longer storage, store frozen (-20°C). Repeated freezing and thawingof serum specimens must be avoided. After thawing at ambient temperature, serumshould be assayed within four hours. Do NOT use a 37°C bath to accelerate thawing.
IT IS OF EXTREME IMPORTANCE THAT THE PATIENT FAST FOR AT LEAST 10HOURS BEFORE THE DETERMINATION OF BASAL SERUM GASTRIN LEVEL.
The presence of radioactivity in a patient sample resulting from an in vivo scanningprocedure may interfere with the gastrin assay using this system. The effect may bechecked by carrying a patient blank tube without tracer through the assay.
A specimen assaying > 1000 pg/mL may be diluted with Standard A so that thediluted value falls on the standard curve. Multiply the calculated value by theappropriate dilution factor.
A syringe and metal holder with an 18-gauge disposable needle tubing adapter isrecommended for adding Precipitating Antiserum.
Expected Values
Each laboratory should define its own normal serum gastrin values from a group ofnormal subjects after an overnight fast.
The expected range for gastrin with the MP Biomedicals Gastrin Radioimmunoassay Kitwas determined for 135 healthy volunteers. This group was composed of 61 womenand 74 men ranging in age from 19 to 60 years. No volunteers had a history of pepticulcer or gastrointestinal disease and presented normal values for various analytes. Theobserved values for this population had a mean of 49.6 pg/mL and a range of 25-111 pg/mL. The values were normally distributed after log transformation.
Patients with duodenal ulcer who have not had ulcer surgery may have normal fastingserum gastrin values12. Following antrectomy or antrectomy plus vagotomy, the valuesremain in the normal range, while they may increase moderately after vagotomywithout antrectomy13,14. Patients with low rates of gastric acid secretion, includingmost patients with pernicious anemia and atrophic gastritis and many patients withgastric cancer and gastric ulcer, typically have increased gastrin levels.
Hypergastrinemia is found in patients taking the H2 receptor antagonist cimetidine,patients with antral distention secondary to pyloric obstruction, patients who havepreviously undergone vagotomy, and patients with retained antrum8,11,13-15. The twomost important causes of hyper gastrinemia are antral G-cell hyperplasia and Zollinger-Ellison syndrome16,17.
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Specific Performance Characteristics
PrecisionInter-Assay Precision
Sample Control 1 Control 2 Control 3
nmean, pg/mLS.D.% CV
22 56.0
5.91 10.6
22225
16.8 7.5
22474
37.2 7.8
Intra-Assay Precision
Sample Control 1 Control 2 Control 3 Serum
nmean, pg/mLS.D.% CV
20 56.7
2.59 4.6
20232
9.56 4.1
20 465
26.1 5.6
20 49.4
2.91 5.9
Parallelism
Two elevated gastrin samples were diluted with Standard A and assayed for linearity.
Sample 1 Sample 2
DilutionFactor
Foundpg/mL
Expectedpg/mL
% Found Foundpg/mL
Expectedpg/mL
% Found
0 1:21:41:8
1:16
425195101
44.1 23.7
---213107
53.5 26.8
---92948288
377173
79.8 39.6 21.1
---188
94.0 47.0 23.5
---92858490
8
Recovery
Serum was spiked with G17-I. Percent recovery was calculated as follows:
(pg/mL Gastrin found) - (endogenous) x 100 pg/mL Gastrin added
Spike (pg/mL) Found (pg/mL) Recovery %
0 50100200400
56.8106148258494
98 91101109
Specificity
Molar cross-reactivities with various forms of human gastrin and related peptides areshown below. Results are expressed as a ratio of the displacement of Gastrin 17-Idivided by cross reactant at 50% of trace binding.
Compound % Cross Reactivity Gastrin 17-I 100
Gastrin 17-II 77Gastrin 34-I 42Gastrin (5-17) 54CCK-PZ <0.1CCK-8 10.9
Sensitivity
As determined by the concentration at the mean minus 2 S.D. of 20 determinations ofthe zero standard, the assay sensitivity is 3.3 pg/mL.
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GASTRIN [125I] RADIOIMMUNOASSAY KIT
100 Röhrchen, Bestellnr. 06B255017200 Röhrchen, Bestellnr. 06B255025
Zur quantitativen Bestimmung von immunoreaktiven Gastrinen im Serum.
Zusammenfassung und Erläuterung des Tests
Gastrin ist ein Polypeptid-Hormon und wird von spezifischen endokrinen Zellenproduziert und ausgeschieden, die in der Schleimhaut des Magenantrums und ferner improximalen Abschnitt des Zwölffingerdarms liegen1-4. Die häufigste Form des Gastrinsist aus 34 Aminosäuren zusammengesetzt und ist unter der Bezeichnung 'großesGastrin' oder 'G-34' bekannt. Die zweite Form ist das Heptadekapeptid, das als'kleines Gastrin' oder 'G-17' bekannt ist. Auf molarer Basis stimuliert G-17 dieSekretion von Magensäure im Vergleich zu G-34 dreibis fünffach stärker5.
Die Messung von Gastrin im Serum ist zu dem entscheidenden Test bei der Diagnosevon Gastrinomen bei Patienten mit einer Überproduktion von Magensäure geworden1,6.Messungen von Gastrin im Serum können ebenfalls bei der Untersuchung von Patientenmit Verdacht auf antrale G-Zellen-Hyperplasie (Überfunktion), auf isoliertes gestautesAntrum und auf atrophische Gastritis nützlich sein7-9.
Erhöhte Gastrin-Werte können auch bei Patienten mit Nierenversagen gemessenwerden, obwohl diese Patienten normalerweise keine übergroße Sekretion vonMagensäure aufweisen10.
Testprinzip
Beim Radioimmunoassay sollte der verwendete Antikörper die gleiche Affinität für denStandard und das Antigen, das sich in der Patientenprobe befindet, haben. Dasunmarkierte Antigen konkurriert mit dem markierten Antigen um die begrenzte Anzahlverfügbarer Bindungsstellen an dem Antikörper und verringert somit die Menge des anden Antikörper gebundenen markierten Antigens. Der Anteil an gebundenerRadioaktivität ist somit umgekehrt proportional zur Konzentration des Antigens in derProbe oder im Standard.
Im MP Biomedicals Gastrin [125I] Radioimmunoassay Kit besitzt der Anti-körper einehohe Bindungskonstante und Reaktivitäten mit sulfatischen und nichtsulfatischenFormen von G-17 und G-34. Der Tracer besteht aus monojodiertem [125I] Gastrin undist frei von unmarkiertem Gastrin und dijodiertem Gastrin vorbereitet.
Reagenzien
Nur für In Vitro Diagnostik.
1. Gastrin [125I] Tracer-Lösung*, gebrauchsfertig, enthält weniger als125I TRACER130 kBq (3,5 µCi) Gastrin [125I] pro Fläschchen in 0,02 M Tris-Puffer (pH-Wert8,0) mit Kaninchen-Globulin, humanem Serumalbumin und Konservie-rungsstoffen;>10 ml pro Fläschchen, 1 Fläschchen für 100-Röhrchen-Kit, 2 Fläschchen 200-Röhrchen-Kit. Lagerung: gekühlt bei 2 bis 8°C aufbewahren. Haltbarkeit: sieheVerfallsdatum auf dem Fläschchen.
10
2. Gastrin Antiserum*, gebrauchsfertiges anti-humanes Kaninchen-Gastrin mitANTIhumanem Serum-albumin in 0,02 M Tris-Puffer (pH-Wert 8,0) undKonservierungs-stoffen; > 10 ml pro Fläschchen; 1 Fläschchen für 100-Röhrchen-Kit, 2 Fläschchen für 200-Röhrchen-Kit. Lagerung: gekühlt bei 2 bis 8°C aufbe-wahren. Haltbarkeit: siehe Verfallsdatum auf dem Fläschchen.
3. Gastrin Standard A-H*. Ein Fläschchen pro Standard, gebrauchsfertig STD 1-8mit synthetischem humanem Gastrin G-17-I in 0,02 mol gepufferter Tris (pH-Wert 8,0) mit humanem Serumalbumin und Konservierungsstoffen. Lagerung:gekühlt bei 2 bis 8°C aufbewahren. Haltbarkeit: siehe Verfallsdatum auf demFläschchen.
Standard Bestellnr.Volumen/
Fläschchen (ml)Gastrin, pg/ml (ng/l)
ABCDEFGH
06B25505006B25506806B25507606B25508406B25511406B25512206B25513106B255149
6,02,52,52,52,52,52,52,5
0 15 25 50 100 200 5001000
4. Präzipitierendes Antiserum*, gebrauchsfertig, mit Anti-KaninchenANTI PPT
Antiserum (Ziege), mit Präzipitations-beschleuniger, humanem Serum-albuminund Konservierungsstoffen. Eine Flasche enthält >100 ml; 1 Flasche für 100-Röhrchen-Kit, 2 Flaschen für 200-Röhrchen-Kit. Die Inhalte sollten vor demGebrauch gut gemischt werden, entweder durch Schütteln oder durch Rührenauf einem magnetischen Rührgerät. Lagerung: gekühlt bei 2 bis 8°Caufbewahren. Haltbarkeit: siehe Verfallsdatum auf der Flasche.
* ACHTUNG: DAS PRODUKT SO HANDHABEN, ALS KÖNNE ES INFEKTIONENÜBERTRAGEN: Das Ausgangsmaterial, aus dem dieses Produkt abgeleitet wurde,reagierte negativ auf HBsAg und auf HIV-Antikörper bei Versuchen mitgenehmigten Reagenzien. Keine bekannte Testmethode kann gewährleisten, daßStoffe, die aus Humanblut abgeleitet werden, nicht infektiös sind. Siehe dazuCDC/NIH Veröffentlichung über Biologische Sicherheit in mikrobiologischen undbiomedizinischen Laboratorien (HHS Veröffentlichung Nr. 84-8395.
WARNUNG: ENTHÄLT RADIOAKTIVES MATERIAL
Dieser MP Biomedicals Gastrin [125I] Tracer enthält <130 Kilobecquerel (3,5 Mikrocurie)an [125I] im 100-Röhrchen-Kit, <260 Kilo-becquerel (7 Mikrocurie) im 200-Röhrchen-Kit.
Das radioaktive Material von MP Biomedicals, darf nur durch Ärzte, klinische Labora-torien oder Krankenhäuser bezogen, gelagert oder verwendet werden. Es ist für kli-nische In-vitro-oder Laboratoriumstests bestimmt, die nicht mit inneren oder äußerenApplikationen des Materials oder seiner Strahlung an Mensch und Tier inZusammenhang stehen. Die Annahme, der Erwerb, der Besitz, die Verwendung und
11
der Transport dieses Materials unterliegen der Aufsicht und bedürfen einer Umgangs-genehmigung der zuständigen Behörden.
MP Biomedicals, LLC
Das Befolgen der grundsätzlichen Regeln des Strahlenschutzes bietet ausreichendeSicherheit. Der Benutzer wird dazu auf das Handbuch Nr. 92 des National Bureau ofStandards "Sichere Handhabung radioaktiven Materials" verwiesen, erschienen am9.3.1964, Superintendent of Documents, U.S. Government Printing Office,Washington, D.C. 20402.
Siehe dazu die folgende Zusammenfassung: # Wo mit radioaktivem Material gearbeitetwird, darf weder gegessen, getrunken, geraucht noch dürfen kosmetische Mittelbenutzt werden. # Radioaktives Material darf nicht mit dem Mund pipettiert werden.# Der direkte Kontakt zu jedem radioaktiven Material ist durch Verwendung von Sicher-heitsmaßnahmen wie Laborkleidung und Einmalhandschuhe zu verhindern. # MitRadioaktivität sollte nur in einem vom öffentlichen Zugang abgetrennten Raumgearbeitet werden. # Radioaktives Material sollte in den Originalbehältern in einemgekennzeichneten Raum aufbewahrt werden. # Ein Protokollheft über Erhalt undBeseitigung radioaktiven Materials sollte geführt werden. # Der Kontaminationausgesetzte Laboreinrichtungen und Glasgeräte sind voneinander zu trennen, um einemehrfache Kontamination mit verschiedenen Radioisotopen zu vermeiden. # JedesVerschütten von radioaktivem Material muß mit Vorsicht, dem festgelegten Verfahrenentsprechend, behandelt werden. # Jegliches radioaktive Material muß inÜbereinstimmung mit den geltenden Vorschriften und Richtlinien der für dasLaboratorium zuständigen Recht-sprechungsbehörden beseitigt werden. # Nichtkontaminierte Behälter können in nicht-radioaktivem Abfall beseitigt werden,vorausgesetzt, daß Aufschrift und Etiketten unkenntlich gemacht worden sind.
Erforderliches Zubehör und Reagenzien, die jedoch nicht mitgeliefert werden:
1. Evakuierte Glasröhrchen für 5 oder 10 ml oder Serumseparationsröhrchen.2. Jegliches Einwegröhrchen, wie zum Beispiel Polystyrol 12 x 75 mm.3. Dekantiergestell für Teströhrchen.4. Spritze mit Spitze, 2 ml und Metallhalter, Einweg-Nadel-Röhrchen-adapter.5. Vortex Mixer6. Zentrifuge mit einer RCF-Kapazität von mindestens 1500 Umdrehungen. Es kann
sowohl mit Kühlzentrifugen als auch bei Raumtempertatur gearbeitet werden.7. Absaugevorrichtung bei Bedarf.8. Gamma-Counter zur Messung von [125I].9. Mikroliterpipetten mit Einwegspitzen für 100 und 200 µl.
Probenentnahme
Das Serum sollte nach einer Fastendauer von mindestens 10 Stunden gewonnenwerden. Plasmen mit Oxalat, Heparin oder EDTA können zu falschen Ergebnissenführen und müssen ausgesondert werden. LIPÄMISCHE ODER STARKHÄMOLYTISCHE PROBEN SOLLTEN NICHT VERWENDET WERDEN.
Vorbereitung der Proben zur Analyse: Blutentnahme mit 5 oder 10 ml Serum-separationsröhrchen (SST). Lassen Sie das Blut 30 bis 60 Minuten lang bei Zimmer-temperatur gerinnen. Zentrifugieren und entnehmen Sie das Serum.
12
Das Serum sollte innerhalb einer Stunde nach der Entnahme getrennt und innerhalb von4 Stunden untersucht oder gefroren bei -20°C bis zur Untersuchung gelagert werden.
WIEDERHOLTES EINFRIEREN UND AUFTAUEN IST ZU VERMEIDEN.
Versand der Proben: sorgfältig verpacktes Serum muß in gefrorenem Zustand verschicktund bei -20°C bis zu Untersuchung gelagert werden.
Testansatz
Reagenzien und Proben müssen vor dem Gebrauch Zimmertemperatur (18-25°C)haben. Sie sollten jedoch, um eine Beeinträchtigung zu vermeiden, dieser Temperaturnicht länger als notwendig ausgesetzt werden. Verwenden Sie keine anderenReagenzien als die, welche in diesem Kit geliefert werden. Im folgenden Protokoll wirdein Ansatz der Standards in Doppelbestimmung emfohlen. Die Patientenproben müssendoppelt bestimmt werden. Der Ansatz der StandardKurve muß gleichzeitig mit dem derPatientenseren und der Kontrollseren erfolgen.
1. Markieren Sie die Teströhrchen von 1 bis 20 für die Standard-Kurve. Beginnendmit Nr. 21 markieren Sie zwei weitere Röhrchen für jede klinische Probe. HaltenSie die Röhrchen auf Zimmertemperatur.
2. Geben Sie 200 µl Gastrin Standards oder Patientenproben gemäß demAblaufschema auf S.13 hinzu. Die Pipettenspitzen sollten für jede Proben erneuertwerden, um eine Probenverschleppung zu vermeiden.
3. Geben Sie 100 µl Gastrin-Tracer-Lösung in alle Röhrchen. Lassen Sie Röhrchen1 und 2 beiseite, bis Sie zu Schritt 11 gelangen.
4. Fügen Sie 100 µl Gastrin Antiserum in die Röhrchen 5 bis 20 hinzu sowie in allePatientenproben und Kontrollen. Schütteln Sie alle Röhrchen.
5. Inkubieren Sie alle Röhrchen zwei Stunden lang bei Raumtemperatur.6. Mischen Sie den Inhalt der Flasche mit präzipitierendem Antiserum gründlich,
indem Sie schütteln oder auf einem magnetischen Rührgerät rühren. Geben Sie1,0 ml präzipitierendes Antiserum in alle Röhrchen. Jedes Röhrchen gut schütteln.
7. Zentrifugieren Sie alle Röhrchen 15 Min. bei 1500 x g.8. Setzen Sie die Röhrchen in ein Dekantiergestell.9. Dekantieren Sie alle Röhrchen außer 1 und 2 in ein Abfallgefäß. Entsorgen Sie die
Überstände gemäß dem genehmigten Verfahren zur Beseitigung radioaktivenAbfalls.
10. Lassen Sie die Röhrchen 5 Minuten lang auf saugfähigem Papier ablaufen. Odersaugen Sie die Überstände sorgfältig ab, ohne das Präzipitat zu beschädigen.
11. Bestimmen Sie die Radioaktivität des Präzipitates in jedem Röhrchen. Messen Siemit einem Gamma-Counter so lange, daß Sie wenigstens 5000 Impulse in denRöhrchen des Null-Standards messen. Eine längere Meßzeit kann bei einem Gerätmit geringerer Leistungsfähigkeit ratsam sein. Allerdings ist eine Minute imallgemeinen ausreichend. Die Röhrchen 1 und 2 ergeben die Totalaktivität.
13
Gastrin [125I] Radioimmunoassay
RöhrchenStandard
(µl)Probe(µl)
Gastrin[125I](µl)
GastrinAntiserum
(µl) Inkubieren
PräzipitierendesAntiserum
(µl)Zentri-
fugieren
1, 2 3, 4 5, 6 7, 8 9,1011,1213,1415,1617,1819,20
Patienten-proben
----200 A200 A200 B200 C200 D200 E200 F200 G200 H
----------------------------------------
200
100100100100100100100100100100
100
------
100100100100100100100100
100
----Alle
Röhrchenmischenund 2
Stundenbei Raum-temperaturinkubieren
----100010001000100010001000100010001000
1000
MISCHEN
----Alle
Röhrchen bei1500 x g 15
Minutenzentri-
fugieren
Berechnung der Ergebnisse
A. Logit-Log
1. Ermitteln Sie den Durchschnittswert der Impulse pro Minute (IpM) für die Röhrchen3 und 4, den sogenannten USB-Röhrchen. (Unspezifische Bindung). Anmerkung:Die Meßdaten müssen nicht in IpM ausgedrückt werden. Jedoch sollte dieZeiteinheit für alle gemessenen Röhrchen konstant sein.
2. Subtrahieren Sie die USB von allen anderen Meßwerten, um den berichtigten Wertder IpM zu erhalten. Verwenden Sie bei den Berechnungen lediglich denberichtigten IpM-Wert.
3. Bestimmen Sie den Durchschnitt der berichtigten IpM-Werte für die Röhrchen 1und 2, um die berichtigte Totalaktivität pro Assay zu ermitteln.
4. Dividieren Sie den Durchschnitt der berichtigten IpM-Werte für die Röhrchen 5 und6 durch die berichtigte Totalaktivität um die Bindung Bo anzugeben.
5. Dividieren Sie die berichtigten Meßwerte jedes Röhrchens durch den Durchschnittder berichtigten Werte für die Röhrchen 5 und 6, um die prozentuale Bindung fürjedes Röhrchen anzugeben.
6. Eine Standard-Kurve kann wie folgt gezeichnet werden:Bei Verwendung von Logit-Log-Papier tragen Sie die prozentuale Bindung alsOrdinate gegen pg/ml Gastrin auf der Log-Skala ein. Typische Meßdaten undberechnete prozentuale Bindungen sind in Tabelle 1 aufgeführt. Abbildung 1 zeigteine typische Logit-Log-Standardkurve.
7. Die Konzentration von Gastrin in einem Patientenserum wird durch Interpolationaus der Standard-Kurve für prozentuale Bindung gegen Gastrin in pg/ml bestimmt.(Abbildung 1)
8. Beispiel: (siehe Tabelle 1)
USB = Impulse Röhrchen 3 + Impulse Röhrchen 4 = 284 + 240 = 262 2 2
berichtigte Totalaktivität
= (Impulse Röhrchen 1 - USB) + (Impulse Röhrchen 2 - USB)2
14
= (17526 - 262) + (17024 - 262) = 17013 2
Bo = Bindung = Durchschnitt der berichtigten Impulswerte für die Röhrchen 5 und 6 x100
berichtigte Totalaktivität
= 8356 x 100 = 49,1% 17013
% Bindung für Röhrchen 7
= (Impulse Röhrchen 7 - USB) x 100 Durchschnitt der berichtigten IpM-Werte der Röhrchen 5 und 6
= (7670 - 262) x 100 = 88,7% 8356
Beispiel für eine Patientenprobe (Röhrchen 21)
Impulse (gemessen) = 5823 USB = 262 % Bindung = 5823 - 262 = 66,6% 8356
Die Logit-Log Standardkurve (Abbildung 1) zeigt an, daß 66,6% einerGastrinkonzentration von 58.9 pg/ml entsprechen.
Der Mittelwert aus diesem und dem 2. Wert der Doppelbestimmung wird in pg/ml alsGastrin-konzentration für die Patientenprobe angegeben (50,7 pg/mL) (54,8 pg/mL).
B. Es können auch andere Methoden zur Zeichnung einer Standardkurve verwendetwerden, wie zum Beispiel Impulse gegen pg/ml, prozentuale Bindung gegen LogKonzentration, reziproke Impulsrate, B/F, "spline-fit" und andere.
Grenzen des Verfahrens
Das Gastrin wird allmählich durch Proteolyse im Serum abgebaut. Um diesen Verlustauf ein Minimum herabzusetzen, sollte das Serum innerhalb einer Stunde abgetrenntund innerhalb von vier Stunden untersucht werden. Bei einer längeren Lagerung dasSerum gefroren aufbewahren. Wenn diese Vorsichtsmaßnahme getroffen wird, ist eineZugabe von Proteolysehemmstoffen nicht mehr erforderlich. Ein wiederholtes Einfrierenund Auftauen der Serumproben muß vermieden werden. Nach dem Auftauen beiRaumtemperatur muß das Serum innerhalb von vier Stunden untersucht werden.Verwenden Sie jedoch kein Wasserbad von 37°C, um den Auftauvorgang zubeschleunigen.
ES IST VON HÖCHSTER BEDEUTUNG, DAß DER PATIENT DIE NAHRUNGS-AUFNAHME MINDESTENS 10 STUNDEN VOR DER BESTIMMUNG DES BASALENGASTRINS IM SERUM EINSTELLT.
15
Radioaktivität aus einer In-vivo Scanning-Untersuchung in einer Patientenprobe kann dieGastrin-Bestimmung, die mit diesem Test durchgeführt wird, beeinträchtigen. DieseAuswirkung kann durch die Verwendung eines USB-Patienten-röhrchens ohne Tracerwährend des Testes überprüft werden.
Eine Probe, die >1000 pg/ml aufweist, kann mit Standard A verdünnt werden, so daßdie gemessenen Werte im Bereich der Standard-Kurve liegen. Multiplizieren Sie denerrechneten Wert mit dem entsprechenden Verdünnungsfaktor.
Zur Zugabe des präzipitierenden Antiserums wird eine Spritze mit entsprechendemZubehör empfohlen.
Erwartete Werte
Jedes Laboratorium sollte seine eigenen Normalbereiche für Serum-Gastrin auf der Basisvon gesunden Personen bestimmen, die über Nacht keine Nahrung aufgenommenhaben.
Dieser Wert beruht auf einer log Normalverteilung der Werte von 135. Diese Gruppesetzte sich aus 61 Frauen und 74 Männern im Alter zwischen 19 und 60 Jahrenzusammen. Keine der Versuchspersonen hatte je an einem peptischen Ulkus oder aneiner gastro-intestinalen Krankheit gelitten und alle wiesen bei einer Reihe andererAnalyten normale Werte auf. Der normal wert f̈ur diese Patientengruppe was 49.6pg/mL und der normalbereich lag von 25 bis 111 pg/mL.
Patienten mit einem Duodenalgeschwür, die nicht operiert worden sind, können imnüchternen Zustand normale Gastrinwerte im Serum aufweisen12. Nach einerAntrektomie oder nach Antrektomie mit Vagotomie bleiben die Werte im Normalbereich,während sie nach einer Vagotomie ohne Antrektomie leicht ansteigen können13,14.Patienten mit einer schwachen Sekretion von Magensäure, einschließlich der meistenPatienten mit perniziöser Anämie und atrophischer Gastritis und vieler Patienten mitMagenkrebs und Magengeschwür weisen typisch erhöhte Werte auf.
Hypergastrinämie wird bei Patienten festgestellt, die den H2-Rezeptor-AntagonistenCimetidin einnehmen, bei Patienten mit antraler Distention infolge einesPylorusverschlusses, bei denen kürzlich eine Vagotomie durchgeführt wurde, undPatienten mit gestautem Antrum8,13,16. Die beiden wichtigsten Ursachen fürHypergastrinämie sind die antrale G-Zellen Hyperplasie und das Zollinger-EllisonSyndrom17,18.
Spezifische Leistungsmerkmale
Präzision:
Inter-Assay Präzision
Probe Kontrolle 1 Kontrolle 2 Kontrolle 3
nMittelwert pg/mlStandardabweichungCV in %
22 56,0
5,91 10,6
22225
16,8 7,5
22474
37,2 7,8
16
Intra-Assay Präzision
Probe Kontrolle 1 Kontrolle 2 Kontrolle 3 Serum
nMittelwert pg/mlStandardabweichungCV in %
20 56,7 2,59 4,6
20232
9,56 4,1
20 465
26,1 5,6
20 49.4 2.91 5.9
Linearität:
2 Serumproben wurde mit Standard A verdünnt und untersucht.
Probe 1 Probe 2
Verdünnungs-faktor
Gemessenpg/ml
Erwartetpg/ml
Gemessenin %
Gemessenpg/ml
Erwartetpg/ml
Gemessenin %
0 1:21:41:8
1:16
425195101
44,1 23,7
---213107
53,5 26,8
---92948288
377173
79,8 39,6 21,1
---188
94,0 47,0 23,5
---92858490
Wiederfindung:
Serum wurde mit unterschiedlichen Mengen von G17-I versetzt:
hinzugefügt (pg/mL) gefunden (pg/mL) Wiederfindung %
0 50100200400
56,8106148258494
98 91101109
Spezifität:
Kreuzreaktion mit verschiedenen Formen des humanen Gastrins und verwandtenPeptiden:
Verbindung % Kreuzreaktivität
Gastrin 17-I 100Gastrin 17-II 77Gastrin 34-I 42Gastrin (5-17) 54CCK-PZ <0,1CCK-Oktapeptid 10,9
Empfindlichkeit:
Die Empfindlichkeit, definiert als -2 Standard-Abweichung von 20 Nullstandard-Bestimmungen, liegt bei 3,3 pg/ml.
17
KIT POUR DOSAGE RADIO-IMMUNOLOGIQUEGASTRINE [125I]
Kit 100 tubes: N° de Référence: 06B255017Kit 200 tubes: N° de Référence: 06B255025
Destiné au dosage quantitatif des Gastrines immunoréactives dans le sérum.
Explication sommaire du test
La Gastrine est une hormone polypeptidique produite et sécrétée par des cellulesendocrines spécifiques (cellules G) qui se situent dans la muqueuse de l'antre gastrique,et, dans une moindre mesure, au niveau du duodénum proximal1-4. La forme degastrine la plus abondante est composée de 34 acides aminés, et elle est connue sousle nom de "big" gastrine, ou G-34. La gastrine existe aussi sous forme d'heptadéca-peptide, appelée "little" gastrine ou G-17. Du point de vue de la molarité, la G-17 esttrois à cinq fois plus active sur le plan de la stimulation de la sécrétion d'acide gastriqueque la G-345.
La mesure de la gastrine sérique est devenu le test définitif de diagnostic de lagastrinomie chez les patients souffrant d'hypersécrétion d'acide gastrique1,6. La mesuredu taux de gastrine sérique peut également s'avérer utile lors de l'examen de patientsavec suspicion d'hyperplasie des cellules G antrales (hyperfonctionnement), d'antreretenu isolé ou de gastrite atrophique7-9. On peut également rencontrer des taux degastrine élevés chez des malades souffrant d'insuffisance rénale bien que ces maladesne sécrètent pas, en général, des quantités excessives d'acide gastrique10.
Principe du test
Dans un dosage radio-immunologique, l'anticorps utilisé doit avoir une affinité égalepour l'étalon et pour l'analyte présent dans l'échantillon du patient. L'analyte nonmarqué entre en compétition avec l'analyte marqué sur le nombre limité de sitesdisponibles pour la fixation des anticorps, ce qui réduit la quantité d'analyte marqué fixésur l'anti-corps. Le taux de radioactivité fixé est, par conséquent, inversementproportionnel à la concentration de l'analyte dans l'échantillon ou dans l'étalon.
Dans le Kit de dosage radio-immunologique Gastrine-Iode 125, l'anticorps a uneconstante d'association et des réactivités avec les formes sulfatées et non-sulfatées dela G-17 et de la G-34 élevées. Le marqueur est de la gastrine-Iode 125 mono-iodurée,préparée de façon à ne contenir ni gastrine non marquée, ni gastrine di-iodurée.
Réactifs
Pour diagnostic in vitro
1. Solution de marquage Gastrine-Iode 125*, N° de Réf.:125I TRACER06B255033, prête à l'emploi; contient moins de 3,5 µCi (130 kBq) de Gastrine-Iode 125 par flacon dans un tampon Tris 0,02 M (pH 8,0), avec des globulinesde lapin, de la sérum-albumine humaine et des agents de conservation; chaqueflacon contient au minimum 10 ml de réactif; 1 flacon par coffret de 100 tubes;
18
2 flacons par coffret de 200 tubes. Stockage: conserver au réfrigérateur entre 2et 8°C. Stabilité: se reporter à la date de péremption indiquée sur les flacons.
2. Immunsérum contenant de la Gastrine*, N° de Réf.: 06B255041, gastrineANTIde lapin anti-humaine prête à l'emploi, contenant de la sérum-albumine humainedans un tampon Tris 0,02 M (pH 8,0) et des agents de conservation; chaqueflacon contient au moins 10 ml de réactif; 1 flacon par coffret de 100 tubes, 2flacons par coffret de 200 tubes. Stockage: conserver au réfrigérateur entre 2et 8°C. Stabilité: se reporter à la date de péremption indiquée sur le flacon.
3. Etalons A-H de gastrine*. Un flacon de chaque étalon dans une STD 1-8formule prête à l'emploi contient de la gastrine humaine synthétique G-17-Idans un tampon Tris 0,02 (pH 8,0) avec de la sérum-albumine humaine et desagents de conservation. Stockage: conserver au réfrigérateur entre 2 et 8°C.Stabilité: se reporter à la date de péremption indiquée sur les flacons.
EtalonN° de Réf. Volume/flacon
(ml)Gastrine, pg/ml (ng/l)
ABCDEFGH
06B25505006B25506806B25507606B25508406B25511406B25512206B25513106B255149
6,02,52,52,52,52,52,52,5
0 15 25 50 100 200 5001000
4. Immunsérum pour précipitation*, N° de Réf. 06B254533, formuleANTI PPTprête à l'emploi contenant de l'immun-sérum de chèvre anti-lapin, avecaccélérateur de précipitation, sérum-albumine humaine et agent de conservation.Chaque flacon contient au moins 100 ml de réactif; 1 flacon par coffret de 100tubes, 2 flacons par coffret de 200 tubes. Le contenu du flacon doit être mélangéde façon homogène avant utilisation, soit en secouant le flacon, soit en remuantle contenu à l'aide d'un agitateur magnétique. Conservation: au réfrigérateur,entre 2 et 8°C. Stabilité: Se reporter à la date de péremption indiquée sur leflacon.
* ATTENTION: A MANIPULER COMME AGENT POTENTIELLE-MENT INFECTIEUX:Les matières premières d'origine humaine utilisées pour la fabrication descomposants de cette trousse ont été analysées et révélées négatives en antigèneHBs, anticorps VIH 1/2 et anticorps VHC lors de tests réalisés avec des réactifshomologués. Toutefois, aucune méthode d'analyse connue ne pouvant garantirl'absence totale d'agents pathogènes dans des produits d'origine humaine, il fautles manipuler comme des agents potentiellement infectieux.
ATTENTION: COMPOSANT RADIOACTIF
Le marqueur de la Gastrine-Iode 125 de MP Biomedicals contient moins de 3,5 microc-uries (130 kilobecquerels) d'Iode 125 dans le coffret de 100 tubes, et moins de 7microcuries (260 kilobecquerels) dans le coffret de 200 tubes.
Ce produit radioactif ne peut être reçu, acquis, détenu et utilisé que par des médecins,des laboratoires cliniques ou des hôpitaux pour des analyses cliniques ou de laboratoirein vitro qui ne demandent pas l'administration interne ni externe du produit ou des
19
radiations émises par celui-ci à l'homme ou à l'animal. Sa réception, son acquisition,sa détention, son utilisation et sa transmission sont soumises aux règlementations dela législation française.
Pour information, nous indiquons ci-après un résumé des règlementations américaines:
# Ne pas manger, boire, fumer ni se maquiller dans le local où les produits radioactifssont utilisés. # Ne pas se servir de pipettes à aspiration par la bouche pour dessolutions radioactives. # Eviter tout contact direct avec tout produit radioactif: utiliserdes blouses de laboratoire et des gants à usage unique. # Tout travail radiologique doitêtre effectué dans un endroit spécial à l'écart de toute circulation. # Les produitsradioactifs doivent être stockés dans leur emballage d'origine en un lieu spécifique. #Tenir un journal dans lequel on indiquera l'entrée et la sortie de tout produit radioactif.# Le matériel de laboratoire et la verrerie qui sont soumis à contamination doivent êtretenus à l'écart pour éviter toute contamination croisée par les différents isotopesradioactifs. # S'il se produit un débordement de liquide radioactif, suivreimmédiatement les procédures de nettoyage en vigueur. # Tout produit radioactif doitêtre mis au rebut conformément aux règlementations légales. # Les récipients noncontaminés peuvent être jetés comme du matériel non radioactif, à condition que lesétiquettes et toutes autres marques d'identification soient retirées.
Matériel et accessoires nécessaires mais non fournis
1. Tube en verre sous vide 5 ou 10, ou Tubes avec Séparateur de Sérum.2. Tube de culture à usage unique, comme par exemple le Tube en polystyrène 12
x 75 mm.3. Portoirs de tubes, normaux et pour décantation.4. Seringue avec embout, 2 ml, et accessoire métallique. Adaptateur de tubulure à
aiguille à usage unique, calibre 18.5. Agitateur Vortex.6. Centrifugeuse pouvant tourner à au moins 1500 x g. Les centrifugeuses
réfrigérées et les centrifugeuses à température ambiante se sont avéréesacceptables.
7. Appareil d'aspiration pour aspiration (facultative), disponible, sur demande, auprèsde MP Biomedicals.
8. Compteur gamma permettant de mesurer l'Iode 125.9. Pipettes semi-automatiques à déplacement d'air, avec pointes à usage unique
capables de distribuer 100 et 200 µl.
Prélèvement de l'échantillon
Le sérum doit être obtenu après une période de jeûne de 10 heures ou plus. Lesplasmas oxalatés, héparinés ou avec EDTA peuvent donner des résultats faussés, etdoivent par conséquent être évités. NE PAS UTILISER D'ECHANTILLONS LIPEMIQUESOU FORTEMENT HEMOLYSES.
Préparation de l'échantillon pour analyse: Prélever le sang dans un tube en verre sousvide de 5 ou 10 ml ou dans un tube avec séparateur de sérum (SST). Laisser le sangformer un caillot à température ambiante pendant 30-60 mn. Centrifuger et préleverle sérum.
Le sérum doit être séparé dans l'heure qui suit le prélèvement et analysé dans les 4heures suivantes ou congelé à -20°C et conservé en l'état jusqu'au moment dudosage. EVITER DE PROCEDER A DES CONGELATIONS ET DECONGELATIONSREPETEES.
Transport des échantillons: Les échantillons, soigneusement emballés, doivent êtrecongelés et conservés à -20°C jusqu'au moment de l'analyse.
20
Procédure de dosage
Les réactifs et les échantillons doivent être amenés à température ambiante (18-25°C)avant utilisation, mais pour minimiser tout risque de détérioration, ne pas les laisser àcette température plus longtemps que nécessaire. Ne pas utiliser de réactifs autres queceux fournis dans le même kit.
Dans le protocole suivant, il est conseillé de procéder à un dosage en deux exemplairespour chaque étalon. Les échantillons des patients doivent également être dosés endouble, et la préparation de la courbe étalon ainsi que les dosages cliniques doivent êtreeffectués simultanément. Les sérums de contrôle doivent être dosés en même tempsque les échantillons des patients.
1. Numéroter des tubes de 1 à 20 pour la courbe étalon. A partir du numéro 21,numéroter deux tubes supplémentaires revêtus d'anticorps pour chaque échantillonclinique. Garder les tubes à température ambiante.
2. Ajouter 200 µl d'Etalons de gastrine ou d'échantillons cliniques conformément auxindications données dans le tableau ci-dessous. Changer les pointes de pipettesentre chaque échantillon pour éviter tout transport d'un échantillon à l'autre.
3. Ajouter 100 µl de solution de marquage de la gastrine dans chaque tube. Mettreles tubes 1 et 2 de côté jusqu'à l'étape 11.
4. Ajouter 100 µl d'Immunsérum de Gastrine dans les tubes 5 à 20 et à tous leséchantillons cliniques ainsi qu'aux sérums de contrôle. Agiter tous les tubes.
5. Incuber tous les tubes à température ambiante (18-25°C) pendant 120 minutes. 6. Secouer le flacon d'Immunsérum pour précipitation ou agiter son contenu avec un
agitateur magnétique pour obtenir un mélange homogène du réactif. Ajouter 1,0ml d'Immunsérum pour précipitation à tous les tubes. Agiter chaque tube auVortex.
7. Centrifuger tous les tubes à 1500 x g pendant 15 minutes. 8. Placer les tubes centrifugés dans un portoir en mousse ou tout autre portoir prévu
pour décantation. 9. Décanter tous les tubes sauf les tubes 1 et 2 dans un bac d'évacuation. Jeter le
surnageant conformément aux procédures en vigueur pour le rejet des résidusradioactifs.
10. Faire égoutter les tubes en les renversant sur du papier absorbant pendant 5minutes, ou aspirer soigneusement le surnageant sans toucher au culot, à l'aided'un appareil d'aspiration adéquat.
11. Calculer la radioactivité du précipité restant dans chaque tube en la comptant dansun compteur gamma pendant un laps de temps suffisamment long pour obtenir5000 coups dans les tubes à Etalon zéro. Il peut s'avérer nécessaire d'augmenterle temps de comptage pour un appareil à efficacité faible. Toutefois, en général,une minute suffit. Les tubes 1 et 2 donneront le nombre de coups total.
21
Dosage radio-immunologique de la gastrine par Iode 125
TubesEtalons
(µl)Echantil
.(µl)
GastrineIode 125
(µl)
ImmunsérumGastrine
(µl) Incubation
Immunsérumprécipit.
(µl) Centrifugation
1, 2 3, 4 5, 6 7, 8 9,1011,1213,1415,1617,1819,20
Ech. despatients
----200 A200 A200 B200 C200 D200 E200 F200 G200 H
----------------------------------------
200
100100100100100100100100100100
100
------
100100100100100100100100
100
----Mélangertous lestubes etincuber àtempér.
ambiantependant120 mn
----100010001000100010001000100010001000
1000
VORTEX
----Centrifuger
tous les tubespendant
15 mn à1500 x g
Calcul des résultats
A. Logit-log
1. Faire la moyenne des nombres de coups par minute (cpm) trouvés dans lestubes 3 et 4, qui sont les tubes "Blancs".
Remarque: Il n'est pas indispensable que les résultats soient exprimés ennombre de coups par minute (cpm). Cependant, il faut toujours utiliser lamême unité de temps pour tous les tubes analysés.
2. Soustraire le blanc de tous les autres nombres de coups pour obtenir le nombrede coups/mn corrigé. Utiliser uniquement les cpm corrigés pour les calculs.
3. Faire la moyenne des coups/mn corrigés des tubes 1 et 2 pour donner leNombre de coups Total corrigé par dosage.
4. Diviser la moyenne du nombre de coups/mn corrigé des tubes 5 et 6 par leNombre de coups total corrigé pour obtenir le Niveau de marquage Bo.
5. Diviser le nombre de coups corrigé de chaque tube par la moyenne desnombres de coups corrigés des tubes 5 et 6 pour obtenir le pourcentage deniveau de marquage de chaque tube.
6. On peut tracer une courbe étalon comme suit:Utiliser du papier logit-log noter le pourcentage de niveau de marquage enordonnée et les valeurs en pg/ml de gastrine sur l'échelle logarithmique. Ontrouvera dans le Tableau 1 des valeurs types de nombres de coups et despourcentages obtenus par calcul. Une courbe étalon type logit-log est indiquéeen Figure 1.
7. La concentration de gastrine dans le sérum d'un patient est déterminée parinterpolation à partir de la courbe étalon donnant le pourcentage de niveau demarquage par rapport à la valeur de gastrine exprimée en pg/ml (Figure 1).
8. Exemple: (Voir Tableau 1) Blanc = cpm tube 3 + cpm tube 4 = 284 + 240 = 262
2 2
Nb cpmtotal corrigé = (cpm tube 1 - blanc) + (cpm tube 2 - blanc)
2
22
= (17526 - 262) + (17024 - 262) = 17 6132
Bo = Niveau demarquage = cpm moyen corrigé tubes 5 et 6 x 100
cpm total corrigé
= 8356 x 100 = 49,1% 17013
Calcul du % niveau marquage tube 7 = cpm tube 7 - blanc x 100
cpm moyen corrigé des tubes 5 et 6
= (7670 - 262) x 100 = 88,7%8356
Exemple de calcul pour un échantillon clinque (Tube 21)
cpm (trouvé) = 5823
Blanc = 262
% niveau marquage = 5823 - 262 = 66,6% 8356
La Courbe Etalon logit-log (Figure 1) indique que 66,6% correspond à uneconcentration de gastrine de 58,9 pg/ml.
La moyenne de cette valeur et de la valeur du dosage du deuxième élément de lapaire correspond à la concentration en gastrine exprimée en pg/ml pour l'échantillondu patient (50,7 pg/ml) (54,8 pg/ml).
B. On peut utiliser d'autres méthodes pour tracer une courbe étalon, comme parexemple les coups par minute par rapport à la concentration en pg/ml, lepourcentage fixé par rapport à la concentration en log, le nombre de coupsréciproque, "B/F", et d'autres.
Limites de la procédure
La gastrine se dégrade progressivement à cause de l'activité protéolytique du sérum.Pour minimiser les pertes d'activité, le sérum doit être séparé dans l'heure qui suit leprélèvement et analysé dans les quatre heures suivant ce prélèvement. Si le sérumdoit être conservé plus longtemps, congeler l'échantillon. Si cette précaution estprise, il n'est pas nécessaire d'ajouter les inhibiteurs de l'activité protéolytique. Ilfaut éviter de décongeler puis de recongeler l'échantillon plusieurs fois. Aprèsdécongélation à température ambiante, le sérum doit être analysé dans les quatreheures. Ne pas utiliser de bainmarie à 37°C pour accélérer la décongélation.
IL EST EXTREMEMENT IMPORTANT QUE LE PATIENT SOIT A JEUN DEPUIS AUMOINS 10 HEURES AVANT LE DOSAGE DU TAUX DE GASTRINE SERIQUEBASAL.
23
La présence de radioactivité dans un échantillon clinique résultant d'une procédured'exploration in vivo peut avoir une influence sur le résultat du dosage de la gastrineobtenu avec ce système. On peut vérifier cet effet en procédant au dosage d'untube "blanc" avec prélèvement du patient sans marqueur.
On peut diluer un échantillon dont le dosage est supérieur à 1 000 pg/ml, avec del'étalon A de façon à ce que le valeur tombe sur la courbe étalon. Multiplier lavaleur calculée par le facteur de dilution approprié.
Il est conseillé d'utiliser une serinque avec accessoire en métal et un adaptateur detubulure à aiguille à usage unique, calibre 18, pour ajouter l'Immunsérum pourprécipitation.
Valeurs attendues
Chaque laboratoire doit définir lui-même ses propres valeurs normales de gastrinesérique à partir d'un groupe d'individus normaux ayant jeûné toute la nuit.
La zone de normalité attendue pour la gastrine avec le Kit de dosage radio-immunologique Gastrine de MP Biomedicals, est comprise entre 25 et 111 pg/ml;cette valeur a été obtenue en se basant sur la distribution normale logarithmique desrésultats de 135 volontaires sains. Ce groupe était composé de 61 femmes et de74 hommes âgés de 19 à 60 ans. Aucun des volontaires n'avait d'anté-cédentd'ulcère de l'estomac ou de maladie gastro-intestinale et ils présentaient des valeursnormales pour différents analytes.
Les patients souffrant d'ulcère duodénal et n'ayant pas été opérés de cet ulcèrepeuvent avoir des taux de gastrine sérique à jeûn normaux12. Après antrectomie ouantrectomie plus vagotomie, les valeurs restent à l'intérieur de la zone de normalité,alors qu'elles peuvent augmenter modérément après vagotomie sansantrectomie13,14. Les patients à taux faibles de sécrétion d'acide gastrique, y comprisla plupart des patients souffrant d'anémie pernicieuse et de gastrite atrophique, ainsique de nombreux malades souffrant de cancer gastrique et d'ulcère gastrique, ont,de façon typique, des taux de gastrine augmentés.
On trouve une hypergastrinémie chez les patients qui prennent de la cimetidine,antagoniste des récepteurs H2, chez les patients souffrant de distention antraleconsécutive à une obstruction du pylore, chez les patients qui ont subiantérieurement une vagotomie, et chez les patients à antre retenu8,13-16. Les deuxcauses les plus importantes de l'hypergastrinémie sont l'hyperplasie des cellules Gantrales et le syndrôme de Zollinger-Ellison17,18.
24
Caractéristiques des performances spécifiques
Précision: Précision inter-dosages
Echantillon Contrôle 1 Contrôle 2 Contrôle 3
nmoyenne,pg/mlEcart-type% CV
22 56,0
5,91 10,6
22225
16,8 7,5
22474
37,2 7,8
Précision intra-dosage
Echantillon Contrôle 1 Contrôle 2 Contrôle 3 Sérum
nmoyenne, pg/mlEcart-type% CV
20 56,7
2,59 4,6
20232
9,56 4,1
20 465
26,1 5,6
20 49.4
2.91 5.9
Parallélisme:
Deux études de parallélisme a été menée en utilisant l'Etalon A comme diluant.
Echantillon 1 Echantillon 2
Facteurde
dilution
Trouvépg/ml
Attendupg/ml % trouvé
Trouvépg/ml
Attendupg/ml % trouvé
0 1:21:41:8
1:16
425195101
44,1 23,7
---213107
53,5 26,8
---92948288
377173
79,8 39,6 21,1
---188
94,0 47,0 23,5
---92858490
25
Exactitude
Trois échantillons de sérum ont été supplémentés avec de la G17-I. Le pourcentagede récupération a été calculé comme suit:
(pg/ml de gastrine trouvés) - (endogène) x 100 pg/ml de gastrine ajoutés
Ajout (pg/ml) Trouvé (pg/ml) Récupération %
0 50100200400
56.8106148258494
98 91101109
Spécificité
Les réactivités croisées molaires avec différentes formes de gastrine humaine et depeptides proches:
% de réaction croisée
Gastrine 17-I 100 Gastrine 17-II 77Gastrine 34-I 42Gastrine (5-17) 54CCK-PZ <0,1CCK octapeptide 10,9
Sensibilité
Déterminée par la concentration moyenne de 20 déterminations du zérostandard -2 S.D. la sensibilité du test est égale à 3,3 pg/ml.
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KIT RADIOIMMUNOLOGICO PER IL DOSAGGIODELLA GASTRINA [125I]
Kit da 100 provette, Catalogo n° 06B255017Kit da 200 provette, Catalogo n° 06B255025
Per la determinazione quantitativa delle gastrine immunorative nel siero.
Generalita' E Metodologia di Dosaggio
La gastrina è un ormone polipeptidico prodotto e secreto da specifiche celluleendocrine (cellule G) che sono localizzate nella mucosa dell'antro gastrico e, inminor misura, nel duodeno prossimale1-4. La forma più abbondante di gastrina ècomposta da 34 aminoacidi ed è nota come "big gastrin" o G-34. L'altra forma èl'eptadecapeptide noto come "little gastrin" o G-17. Su base molare, la G-17 è unostimolatore della secrezione acida gastrica da tre a cinque volte più potente della G-345.
La determinazione della gastrina serica è divenuta il test definitivo per la diagnosi digastrinoma in pazienti con ipersecrezione acida gastrica1,6. La determinazione dellagastrina serica può anche essere utile per la diagnosi in pazienti con sospettaiperplasia (iperfunzione) delle cellule G antrali, isolato antro ritenuto o gastriteatrofica7-9. Valori elevati di gastrina possono anche essere osservati in pazienti condanno renale sebbene questi pazienti solitamente non secernono eccessive quantitàdi acido gastrico10.
Principio di Dosaggio
In radioimmunologia, l'antisiero impiegato dovrebbe presentare uguale affinità per laforma standard e per l'analita presente nel siero. L'analita non marcato competecon il tracciante per i siti anticorpali in difetto, inducendo pertanto una riduzionedella quota di tracciante legato all'anticorpo. Il livello di radioattività associata agliimmunocomplessi risulterà pertanto inversamente correlato alla concen-trazione dianalita del campione o dello standard.
Nel kit MP Biomedicals, per il dosaggio radioimmunologico della gastrina [125I]l'anticorpo presenta una alta costante di associazione e reattività con le formesolfate e non solfate di G-17 e G-34. Il tracciante è costituito da gastrina mono-iodata [125I] depurata dalla gastrina non marcata e dalla diiodata.
Reagenti
Per uso diagnostico in vitro
1. Soluzione tracciante Gastrina [125I]*, Catalogo n° 06B255033,125I TRACERpronta per l'uso, contenente meno di 3,5 µCi (130 kBq) di Gastrina [125I] perflacone in tampone tris 0,02 M (pH 8,0) con globuline di coniglio, sieroalbumina umana e conservanti; >10 ml per flacone; un flacone per kit da 100provette, due flaconi per kit da 200 provette. Conserva-zione: refrigerare a 2-8°C. Stabilità: vedi la data di scadenza sul flacone.
2. Antisiero anti-gastrina*, Catalogo n° 06B255041, soluzione pronta perANTIl'uso di antisiero anti-gastrina (coniglio) contenente siero albumina umana in
27
tampone tris 0,02 M (pH 8,0) e conservanti; >10 ml per flacone; un flaconeper kit 100 provette, due flaconi per kit da 200 provette. Conservazione:refrigerare a 2-8°C. Stabilità: vedi la data di scadenza sul flacone.
3. Gastrina standard A-H*. Un flacone di ogni standard in soluzione STD 1-8pronta per l'uso contenente gastrina umana sintetica G-17-I in tampone tris0,02M (pH 8,0) con siero albumina umana e conservanti. Conservazione:refrigerare a 2-8°C. Stabilità: vedi la data di scadenza sul flacone.
Standard Catalogo n°Volume/flacone
(ml)Gastrina, pg/ml (ng/l)
ABCDEFGH
06B25505006B25506806B25507606B25508406B25511406B25512206B25513106B255149
6,02,52,52,52,52,52,52,5
0 15 25 50 100 200 5001000
4. Antisiero precipitante*, Catalogo n° 06B254533, soluzioneANTI PPTpronta per l'uso contenente antisiero di capra anti-coniglio con acceleratoredella precipitazione, siero albumina umana e conservante. Un flacone contiene>100 ml; un flacone per kit da 100 provette, due flaconi per kit da 200provette. il contenuto dovrebbe essere mescolato bene prima dell'uso, perscuotimento o per agitazione elettromagnetica. Conservazione: refrigerare a 2-8°C. Stabilità: vedi la data di scadenza sul flacone.
* ATTENZIONE: MANEGGIARE COME SE FOSSE CAPACE DI TRASMETTEREINFEZIONE. Il materiale da cui é derivato questo prodotto é stato trovato nonreattivo per HBsAg e negativo per l'anticorpo Anti-HIV quando testato conreagenti autorizzati. Nessun test puó offrire garanzia che i prodotti derivati dasangue umano non siano infettivi. Far riferimento allo Biosicurezza CDC/NIHNei Laboratori di Microbiologia di Biomedica (Pubblicazione NHS n° 84-8395).
IMPIEGO DI MATERIALE RADIOATTIVO: AVVERTENZE
L'acquisto, la ricezione, la detenzione, l'uso, il trasferimento e lo smaltimento dimateriale radioattivo, sono soggetti ai regolamenti ed ai permessi previsti dalleautorità legislative. Nella manipolazione di sostanze radioattive devono essereosservate le seguenti precauzioni: # Il materiale radioattivo deve essere conservato emanipolato in un'area del laboratorio specificatamente designata a tale uso. #L'ambiente di lavoro deve essere ben illuminato e arieggiato. # Le superfici di lavorodevono essere non porose in modo da ridurre al minimo la contaminazione dovutaallo spargimento di liquidi radioattivi. # Considerata la piccola radioattività contenutanel flacone del tracciante (circa 3,5 µCi), l'uso del kit non pone alcun problema dipericolo di radiazioni. # Tuttavia per evitare inalazione o ingestione di materialeradioattivo è necessario rispettare le buone norme generali di laboratorio. # Inparticolare si raccomanda di: non pipettare con la bocca soluzioni radioattive; nonmangiare, bere, fumare o usare cosmetici nell'area di lavoro designata; pulire lesuperfici di lavoro dei materiali radioattivi eventualmente versati; raccogliere ilmateriale contaminato solido e liquido in appositi contenitori ed effettuarne losmaltimento secondo le procedure previste; lavarsi accuratamente le mani dopo l'usodi materiale radioattivo.
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Attrezzature richieste ma non fornite
1. Provette per raccolta ematica tipo da 5 o 10 ml.2. Qualsiasi tipo di provetta, (esempio: provette in polistirene 12x75 mm).3. Portaprovette sia normale che atto alla decantazione dell'intero gruppo di
provette.4. Agitatore tipo Vortex.5. Centrifuga in grado di operare ad almeno 1500 x g. La centrifugazione può
avvenire indifferentemente a temperatura ambiente o in refrigerazione.6. Dispositivo per aspirazione.7. Contatore gamma per la rilevazione delle radiazioni [125I].8. Pipette semiautomatiche con puntali a perdere in grado di dispensare 100 e
200 µl.
Raccolta dei Campioni
Il campione ematico dovrebbe essere prelevato dopo un periodo di digiuno di almeno10 ore. Il plasma raccolto con ossalato, eparina o EDTA può ingenerare risultatierrati e deve essere evitato. NON SOTTOPORRE AD ANALISI CAMPIONIEMOLIZZATI O FORTEMENTE LIPEMICI.
Preparazione del campione per l'analisi: raccogliere il sangue in una siringa da 5 o10 ml. Attendere la coagulazione a temperatura ambiente per 30-60 minuti.Centrifugare e raccogliere il siero. Il siero dovrebbe essere separato entro un'oradalla raccolta e dosato entro 4 ore o congelato a -20°C fino al momento deldosaggio. EVITARE CONGELAMENTI E SCONGELAMENTI RIPETUTI.
Spedizione dei campioni: il siero dovrebbe essere spedito congelato e conservato a -20°C fino al momento del dosaggio.
Procedimento di dosaggio
Portare i reagenti e i campioni a temperatura ambiente (18-25°C) prima dell'uso. Alfine comunque di ridurre il deterioramento, evitare di mantenerli non refrigerati senon per il tempo necessario al loro uso. Non usare reagenti diversi da quelli fornitinel kit.
Si consiglia di eseguire le analisi in duplicato. L'allestimento delle provette deicampioni e degli standard, così come dei controlli, deve essere effettautosimultaneamente.
1. Numerare 20 provette per la curva standard. A partire dal numero 21,numerare due provette per ogni campione. Mantenere le provette atemperature ambiente.
2. Pipettare 200 µl di gastrina standard e campioni secondo lo schema che segue.Il puntale della pipetta dovrebbe essere cambiato per ogni campione così daevitare le contaminazioni.
3. Aggiungere 100 µl di tracciante gastrina [125I] ad ogni provetta. Tenere daparte le provette 1 e 2 sino al passaggio 12.
4. Aggiungere 100 µl di antisiero anti-gastrina alle provette 5-20 e a tutte leprovette dei campioni e dei controlli. Mescolare tutte le provette.
5. Incubare tutte le provette a temperature ambiente (18-25°C) per 120 minuti. 6. Mescolare il flacone di antisiero precipitante per scuotimento o per agitazione
elettromagnetica. Aggiungere 1 ml di antisiero precipitante a tutte le provette.Mescolare ogni provetta.
7. Centrifugare tutte le provette a 1500 x g per 15 minuti.
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8. Transferire le provette centrifugate su di un portaprovette in espanso o altroportaprovette atto alla decantazione dell'intero gruppo di provette.
9. Decantare tutte le provette, escluse 1 e 2, in un contenitore per rifiuti. Scartarei surnatanti secondo il procedimento adottato per lo scarico dei rifiuti radioattivi.
10. Lasciare le provette capovolte su carta assorbente per 5 minuti o aspirare concura il surnatante evitando di intaccare il precipitato usando un idoneo mezzo diaspirazione.
11. Determinare la radioattività dei precipitati rimanenti in ogni provetta contando inun contatore gamma per un tempo non inferiore al tempo necessario perottenere 5000 colpi nelle provette dello standard zero. Un tempo più lungo diconteggio può essere richiesto per uno strumento a bassa efficienza. Ingenerale è comunque sufficiente un minuto. Le provette 1 e 2 sonoespressione dell'Attività Totale.
DOSAGGIO RADIOIMMUNOLOGICO DELLA GASTRINA [125I]
ProvettaStandard
(µl)Campione
(µl)
Gastrina
I 125(µl)
Antisieroanti-
gastrina(µl)
Incubazione
Antisieroprecipitante
(µl) Centrifuga-zione
1, 2 3, 4 5, 6 7, 8 9,1011,1213,1415,1617,1819,20
Campione
----200 A200 A200 B200 C200 D200 E200 F200 G200 H
----------------------------------------
200
100100100100100100100100100100
100
------
100100100100100100100100
100
----Mescolaretutte le
provette eincubare atemp. amb.
per 120min.
----100010001000100010001000100010001000
1000
VORTEX
----Centrifugare
tutte leprovette a
1500 x g per15 minuti.
Calcolo dei Risultati
A. Logit-log
1. Calcolare la media dei conteggi per minuto (cpm) delle provette 3 e 4, provettedel "bianco".
Nota: I dati di conteggio non devono necessariamente essere espressi in cpm.L'unità di tempo comunque deve essere costante per tutte le provette.
2. Sottrarre il bianco da tutti gli altri conteggi ottenendo i conteggi corretti perminuto. Usare solo i conteggi corretti nei calcoli.
3. Calcolare la media dei conteggi corretti per minuto delle provette 1 e 2 otte-nendo l'Attività Totale Corretta del dosaggio.
4. Dividere la media dei conteggi corretti per minuto delle provette 5 e 6 perl'Attività Totale corretta ottenendo la Capacità Legante Bo.
5. Dividere i conteggi corretti di ogni provetta (B) per la media dei conteggi correttidelle provette 5 e 6 ottenendo la percentuale di legato (B/Bo) di ogni provetta.
6. La curva standard può essere riportata su grafico come segue: Usando ungrafico logit-log riportare i valori di B/Bo in ordinate in funzione delleconcentrazioni di gastrina in pg/ml sulla scala loga-ritmica. Dati tipici diconteggio e calcolo sono riportati in Tabella 1. La fig. 1 mostra una curvastandard in coordinate logit-log.
30
7. La concentrazione di gastrina in un campione è determinata per interpolazionesulla curva standard di fig. 1.
8. Esempio (vedi Tabella 1).
Bianco = (conteggio provetta 3 + conteggio provetta 4) 2
= 284 + 240 = 2622
Attività Totalecorretta = (cont.prov.1 - Bianco) + (cont.prov.2 - Bianco)
2
= (17526 - 262) + (17024 - 262) = 170132
Bo = capacità legante = media conteggi corretti provette 5 e 6 x 100
attività totale corretta
= 8356 x 100 = 49,1% 17013
(Bo) x 100(calcolo per la provetta 7) = conteggio prov. 7 - Bianco x 100
media conteggi corretti per le prov. 5 e 6
= (7670 - 262) x 100 = 88,7% 8356
Calcolo per un campione (provetta n° 21)
conteggio (trovato)= 5823Bianco = 262
(B/Bo) x 100 = 5823 - 262 = 66,6% 8356
La curva standard in coordinate logit-log (fig. 1) mostra che il 66,6% corrisponde aduna concentrazione di gastrina di 58,9 pg/ml.
La media fra questo valore ed il valore del duplicato è riportata in termini diconcentrazione di gastrina per il campione (50,7 pg/ml) (54,8 pg/ml).
B. Possono essere usati metodi alternativi per riportare la curva standard sugrafico, come conteggi in funzione di pg/ml, percentuale di legato in funzionedel logaritmo della concentrazione, conteggi reciproci, B/F, funzione "spline" ealtri.
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Considerazioni Procedurali
La gastrina è gradualmente degradata dagli enzimi proteolitici. Al fine di contenerele perdite di attività, il siero dovrebbe essere separato entro un'ora e dosato entroquattro ore dal prelievo. Per conservazioni prolungate, si consiglia di congelare. Avendo queste precauzioni, l'aggiunta di inibitori della attività proteolitica non énecessaria. Si devono evitare i congelamenti e scon-gelamenti ripetuti. Dopo losgelamento a temperatura ambiente, il siero dovrebbe essere dosato entro quattroore. Non usare il bagno termostatico a 37°C per accelerare lo sgelamento.
E' D'ESTREMA IMPORTANZA CHE IL PAZIENTE OSSERVI IL DIGIUNO PERALMENO 10 ORE PRIMA DEL PRELIEVO PER LA DETERMINAZIONE BASALE DIGASTRINA.
La presenza di radioattività nel campione, risultante da procedimenti scintigrafici invivo, può interferire sul dosaggio della gastrina. L'effetto può essere controllatoallestendo in parallelo una provetta del campione senza il tracciante.
I campioni a concentrazione >1000 pg/ml, possono essere diluiti con Standard Acosicchè il valore diluito rientri nella curva standard. Moltiplicare quindi per il fattoredi diluizione appropriato.
Valori Attesi
Ogni laboratorio dovrebbe definire i propri valori normali gastrinemici su di ungruppo di soggetti normali a digiuno da tutta le notte.
L'intervallo di normalità per la gastrina con il kit MP Biomedicals, per il dosaggioradioimmunologico della gastrina è di 25-111 pg/ml (media 49,6 pg/ml) fino a 100pg/ml, calcolato sulla base della distribuzione log-normale dei risultati ottenuti su135 volontari sani. Questo gruppo era composto da 61 donne e 74 uomini di etàcompresa fa 19 e 60 anni. Tutti i volontari non avevano precedenti di ulcerapeptica o malattie gastrointestinali e presentavano valori normali per i vari analiti.
I pazienti con ulcera duodenale che non abbiano subito interventi chirurgici perulcera possono presentare normali valori gastrinemici a digiuno12. A seguito diantrectomia o antrectomia e vagotonia, i valori permangono nell'intervallo normale,mentre essi possono crescere moderatamente dopo vagotomia senzaantrectomia13,14. I pazienti con ridotta velocità di secrezione gastrica, così comeparecchi pazienti con anemia perniciosa e gastrite atrofica e molti pazienti concancro gastrico e ulcera gastrica, presentano tipicamente aumentati livelli di gastrina.
Ipergastrinemia si riscontrava nei pazienti sottoposti a trattamento con l'antagonistadei recettori H2 cimetidina, nei pazienti con distensione antrale secondaria adostruzione pilorica, nei pazienti stati sottoposti a vagotomia e nei pazienti con antroritenuto8,13-16. Le due più importanti cause di ipergastrinemia sono l'iperplasia dellecellule G antrali e la sindrome di Zollinger-Ellison17,18.
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Caratteristiche Tecnologiche
Precisione:
Precisione "fra i saggi"
Campione Controllo 1 Controllo 2 Controllo 3
nmedia, pg/mlD.S.% CV
22 56,0
5,91 10,6
22225
16,8 7,5
22474
37,2 7,8
Precisione "nel saggio"
Campione Controllo 1 Controllo 2 Controllo 3 Siero
nmedia, pg/mlD.S.% CV
20 56,7
2,59 4,6
20232
9,56 4,1
20 465
26,1 5,6
20 49.4
2.91 5.9
Parallelismo:
Due campioni di siero sono stati diluiti con Standard A e dosati.
Campione 1 Campione 2
Fattore didiluizione
Trovatopg/ml
Attesopg/ml
% Trovato Trovatopg/ml
Attesopg/ml
%Trovato
0 1:21:41:8
1:16
425195101
44,1 23,7
---213107
53,5 26,8
---92948288
377173
79,8 39,6 21,1
---188
94,0 47,0 23,5
---92858490
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Recupero:
Un siero umano é stato arricchito con varie quantità di G17-I. La percentuale direcupero é stata calcolata come segue:
(pg/ml Gastrina trovata) - (endogena) x 100 pg/ml Gastrina aggiunta
Aggiunta (pg/ml) Trovata (pg/ml) Recupero %
0 50100200400
56,8106148258494
98 91101109
Specificità
Le reazioni crociate in termini molari con varie forme di gastrina umana e relativipeptidi sono qui di seguito rappresentate:
Componente % Reazione crociata
Gastrina 17-I 100Gastrina 17-II 77Gastrina 34-I 42Gastrina (5-17) 54CCK-PZ <0,1CCK octapeptide 10,9
Sensibilità:
La sensibilità definita come media - 2 DS di 20 determinazioni dello standard zero, édi 3,3 pg/ml.
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GASTRIN [125I] Kit de Radioinmunoensayo
Kit con 100 tubos, N° de catálogo 06B255017Kit con 200 tubos, N° de catálogo 06B255025
Para la determinación cuantitativa de gastrinas inmunorreactivas en suero.
Resumen y explicación de la prueba
La gastrina es una hormona polipeptídica producida y segregada por célulasendocrinas específicas (células G) que se encuentran en la mucosa del antro gástricoy, en menor medida, en el duodeno proximal1-4. El tipo de gastrina que más abundase compone de 34 aminoácidos y se denomina gastrina grande o G-34. El otro tipoes el heptadecapéptido llamado pequeña gastrina, o G-17. En proporcionesmolares, la G-17 es un estimulante de la secreción de ácido gástrico de tres a cincoveces más potente que la G-345.
La medición de la gastrina en suero ha llegado a ser la prueba definitiva para eldiagnóstico de gastrinoma en pacientes con hipersecreción de ácido gástrico1,6. Lamedición de la gastrina en suero puede ser útil también en la evaluación depacientes en quienes se sospecha la presencia de hiperplasia (hiperfunción) decélulas G en el antro gástrico, retención aislada del antro o gastritis atrófica7-9.Pueden darse asimismo valores elevados de gastrina en pacientes con fallo renal, sibien en este tipo de pacientes no suele producirse la secreción excesiva de ácidogástrico10.
Principio de la prueba
En el radioinmunoensayo, el anticuerpo que se utiliza debe tener la misma afinidadhacia la sustancia de control y hacia la sustancia analizada que se encuentra en lamuestra tomada del paciente. La sustancia analizada no marcada y la sustanciaanalizada marcada compiten por el número limitado de emplazamientos disponiblespara el ligado de anticuerpos, reduciéndose así la cantidad de sustancia analizadamarcada que se liga al anti-cuerpo. El nivel de radioactividad ligada guarda, por lotanto, una relación inversa a la concentración de sustancia analizada que seencuentra en la muestra del paciente o en el control.
En el kit de radioinmunoensayo de gastrina [125I] de MP Biomedicals, la constante deasociación y la reactividad del anticuerpo con las formas sulfatadas y no sulfatadasde G-17 y G-34 son altas. El indicador radioactivo es gastrina impregnada con yodo[125I], preparada sin gastrina no marcada y sin gastrina diyodinada.
Reactivos
Exclusivamente para diagnóstico in vitro
1. Solución radioactiva indicadora de gastrina [125I]*, N° de125I TRACERcatálogo 06B255033, en una formulación lista para usar que contiene menosde 3,5 µCi (130 kBq) de gastrina por frasco en tampón Tris 0.02M (pH 8,0)con globulinas de conejo, albúmina de suero humano y con-servantes; >10 mlpor frasco; 1 frasco por kit de 100 tubos , 2 frascos por kit de 200 tubos.Conservación: Refrigerar a 2-8°C. Estabilidad: Ver la fecha de caducidadindicada en el frasco.
35
2. Antisuero de gastrina*, N° de catálogo 06B255041, gastrina anti-ANTIhumana de conejo lista para usar, que contiene albúmina de suero humano entampón Tris 0,02M (pH 8,0) y conservantes; >10 ml por frasco; 1 frasco porkit de 100 tubos, 2 frascos por kit de 200 tubos. Conservación: Refrigerar a2-8°C. Estabilidad: Ver la fecha de caducidad en el frasco.
3. Controles de gastrina A-H*: Un frasco de cada control, en una STD 1-8formulación lista para usar que contiene gastrina humana sintética G-17-I entampón Tris 0,02M (pH 8,0) con albúmina de suero humano y conservantes.Conservación: Refrigerar a 2-8°C. Estabilidad: Ver la fecha de caducidadindicada en los frascos.
ControlN° de
catálogoVolumen/frasco
(ml)Gastrina, pg/ml (ng/l)
ABCDEFGH
06B25505006B25506806B25507606B25508406B25511406B25512206B25513106B255149
6,02,52,52,52,52,52,52,5
0 15 25 50 100 200 5001000
4. Antisuero precipitante*, N° de catálogo 06B254533, en unaANTI PPTformulación lista para usar que contiene antisuero anticonejo de cabra, conacelerador de precipitación, albúmina de suero humano y conservante. Unabotella contiene > 100 ml; 1 botella por kit de 100 tubos, 2 botellas por kit de200 tubos. Debe mezclarse bien el contenido antes de utilizarlo, bienagitándolo o bien removiéndolo con un agitador magnético. Conservación:Refrigerar a 2-8°C. Estabilidad: Ver la fecha de caducidad en la botella.
* PRECAUCION: MANIPULAR COMO POSIBLE TRANSMISOR DE INFECCIONES:El material original del que se ha obtenido este producto no reaccionaba frentea HBsAg y era negativo en anti-cuerpos anti-HIV cuando se analizó conreactivos autorizados. No se conoce ningún método que asegure que losproductos derivados de sangre humana no sean infecciosos. ConsultarCDC/NIH, Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (PublicaciónHHS N° CDC 84-8395).
ADVERTENCIA: CONTIENE MATERIAL RADIACTIVO
Este Kit de MP Biomedicals de Radioinmunoensayo contiene <3,5 microcurios (130kBq) de [125I] por botella de trazador. Este material radiactivo sólo pueden recibirlo,poseerlo y utilizarlo médicos, veterinarios en la practica de la medicina veterinaria,laboratorios clínicos u hospitales, y solamente para pruebas clínicas in vitro o delaboratorio, que no impliquen la administración interna o externa del producto, o desus radiaciones, a los seres humanos o animales. Su recepción, adquisiciónutilización y transferencia, están sometidas a las normas y regulaciones de lalegislación española.
MP Biomedicals, LLC
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El cumplimiento de las normas básicas para seguridad de las radiaciones asegurarauna protección adecuada. Dichas normas pueden obtenerse de la Junta deSeguridad Nuclear, Madrid. A continuación recogemos un resumen del mismo:
# No comer, beber, fumar o aplicar cosméticos donde se utilicen materiales radiacti-vos. # No pipetear soluciones radiactivas oralmente. # Evitar el contacto directo contodo material radiactivo, utilizando artículos protectores tales como batas delaboratorio y guantes desechables. # Todo trabajo radiológico se realizará en zonasespeciales, que no sean de paso. # Los materiales radiactivos deben seralmacenados en sus envases originales en una zona especial. # Debe llevarse unlibro de registro con la entrada y salida de material radiactivo. # El equipo delaboratorio y material de vidrio, sometido a contaminación debe estar separado deforma que se evite la contaminación cruzada de diferentes radioisótopos. #Cualquier posible contaminación con material radiactivo se tratará inmediatamentesegún los métodos establecidos. # El material radiactivo será eliminado de acuerdocon las normas y regulaciones de las agencias que tengan jurisdicción sobre ellaboratorio. # Los envases no contaminados se desecharán junto con el material noradiactivo, después de destruir sus etiquetas.
Equipos y reactivos necesarios que no se incluyen en el kit:
1. Tubos de cristal con vacío de 5 ó 10 ml, o tubos para la separación de suero. 2. Cualquier tipo de tubo de cultivo desechable, como por ejemplo el de
poliestireno de 12 x 75 mm. 3. Soportes para tubos de ensayo, normales y para la decantación de todos los
tubos. 4. Jeringa de 2 ml con punta y cono metálico. Adaptador desechable para agujas
y tubos, calibre 18. 5. Agitador Vortex. 6. Centrifugas capaz de alcanzar un RCF de por lo menos 1500 x g. Han
demostrado ser aceptables tanto las centrifugadoras que funcionan atemperatura ambiente como las refrigeradas.
7. Dispositivo de aspiración, para la aspiración optativa. 8. Contador de radiaciones gamma para medir [125I]. 9. Cualquier tipo de pipetas con punta desechable, con una capacidad real de 100
y de 200 µL.
Extracción de muestras
Para la determinación de los niveles basales de gastrina en suero, el suero debeobtenerse al cabo de un período de ayunas de 10 horas o más. Si el plasmacontiene oxalatos, heparina o EDTA, pueden darse resultados incorrectos y deben,por lo tanto, evitarse. NO SE UTILIZARAN MUESTRAS LIPEMICAS O MUYHEMOLIZADAS.
Preparación de la muestra para análisis: Recoger la sangre en un tubo de cristalconvacío de 5 ó 10 ml, o en un tubo para la separación de suero. Dejar que la sangrecoagule a temperatura ambiente durante 30 a 60 minutos. Centrifugar, y recoger elsuero.
El suero debe separase en el plazo máximo de una hora después de su extracción ydebe analizarse en el plazo de 4 horas o guardarse congelado a -20°C hasta quese analice. SE EVITARA LA REPETIDA CONGELACION Y DESCONGELACION.
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Transporte de muestras: El suero debe embalarse con cuidado, transportarsecongelado y conservarse a -20°C hasta que se analice.
Procedimiento del ensayo
Los reactivos y las muestras tienen que estar a temperatura ambiente (18-25°C)antes de usarlos, y se volverán a almacenar bajo las condiciones recomendadasinmediatamente después de su uso. Se utilizarán exclusivamente los reactivossuministrados con el kit.
En el protocolo detallado a continuación, se recomienda el ensayo de los controlespor duplicado. Las muestras de los pacientes deben ensayarse por duplicado, y lapreparación de la curva estándar y las determinaciones clínicas deben efectuarse demanera simultánea. Los sueros de control y las muestras de los pacientes debenanalizarse de manera concurrente.
1. Etiquetar los tubos de ensayo 1 a 20 para la curva estándar. Comenzando conel 21, etiquetar dos tubos para cada muestra clínica. Mantener los tubos atemperatura ambiente.
2. Añadir 200 µL de los controles de gastrina o muestras de pacientes, conformeal esquema que figura en la página 34. Las puntas de las pipetas se cambiaránentre muestras con el fin de evitar la contaminación por arrastre.
3. Añadir 100 µL de solución radioactiva indicadora de gastrina a todos los tubos.Apartar los tubos 1 y 2 hasta llegar al Paso 11.
4. Añadir 100 µL de antisuero de gastrina a los tubos 5 a 20 y a todas lasmuestras de pacientes y todos los controles. Mezclar todos los tubos.
5. Incubar todos los tubos a temperatura ambiente (18-25°C) durante 120minutos.
6. Mezclar bien la botella de antisuero precipitante, agitándolo o removiendo conun agitador magnético. Añadir 1,0 ml de antisuero precipitante a todos lostubos. Mezclar todos en el mezclador de torbellino.
7. Centrifugar todos los tubos a 1500 x g durante 15 minutos. 8. Pasar los tubos centrifugados a un soporte de goma espuma u otro soporte
adecuado para la decantación de todos los tubos en el soporte. 9. Sin remover los gránulos, decantar o aspirar todos los tubos salvo el 1 y el 2,
vertiendo los líquidos sobrenadantes a un recipiente para desechos delaboratorio conforme a los procedimientos establecidos para desechosradioactivos.
10. Dejar que los tubos escurran boca abajo sobre papel absorbente durante 5minutos.
11. Determinar la radioactividad del precipitado que queda en cada tubo, utilizandoun contador de radiaciones gamma durante un período de tiempo que no serámenor al necesario para obtener un recuento de 5000 en los tubos de controlcero. Es posible que el tiempo de recuento sea mayor si el instrumento utilizadoes de baja eficiencia. No obstante, un minuto será, por regla general,suficiente. Los tubos 1 y 2 darán el recuento total.
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Inmunoensayo de gastrina[125I]
TuboControl
(µl)Muestra
(µl)
Gastrina[125I](µl)
Antisuerode
gastrina(µl)
Incubar
Antisueroprecipitante
(µl) Centrifugar
1, 2 3, 4 5, 6 7, 8 9,1011,1213,1415,1617,1819,20
Muestrasde
pacientes
----200 A200 A200 B200 C200 D200 E200 F200 G200 H
----------------------------------------
200
100100100100100100100100100100
100
------
100100100100100100100100
100
----Mezclar
todos lostubos e
incubar atemperatura ambiente
durante120
minutos.
----100010001000100010001000100010001000
1000
TORBELLINO
----Centrifugartodos lostubos a
1500 x gdurante 15
minutos
Cálculo de resultados
A. Logit-Log
1. Calcular el recuento medio por minuto (cpm) de los tubos 3 y 4, es decir, lostubos "en blanco".
Nota: No es necesario expresar los datos del recuento en términos de cpm, sibien la unidad de tiempo debe ser constante para todos los tubos medidos.
2. Restar el recuento de los tubos en blanco de todos los demás recuentos paraobtener los recuentos por minuto corregidos. Para efectuar los cálculos seusarán exclusivamente los recuentos por minuto corregidos.
3. Calcular la media de los recuentos por minuto corregidos para los tubos 1 y 2,con el fin de obtener el recuento total corregido por ensayo.
4. Dividir la media de los recuentos por minuto corregidos para los tubos 5 y 6por el recuento total corregido, con el fin de determinar el factor de ligadodel indicador radioactivo, Bo.
5. Dividir los recuentos corregidos de cada tubo por los recuentos medioscorregidos de los tubos 5 y 6, con el fin de determinar el % de ligado delindicador radioactivo de cada tubo.
6. Se puede trazar una curva estándar como sigue:Usando papel logit-log, trazar el % de ligado del indicador radioactivo como laordenada, contra pg/ml de gastrina en la escala logarítmica. El cuadro 1 recogeejemplos típicos de datos de recuento y los porcentajes de ligado que se hancalculado. En la figura 1 se aprecia una curva estándar típica de logit-log.
7. La concentración de gastrina en el suero de un paciente se determina mediantela interpolación basada en la curva estándar de porcentaje de ligado delindicador radioactivo, contra pg/ml de gastrina (Figura 1).
8. Ejemplo: (Ver Cuadro 1)
Blanco = recuento tubo 3 + recuento tubo 4 = 284 + 240 = 2622 2
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Recuento total corregido
= (recuento tubo 1 - blanco) + (recuento tubo 2 - blanco)2
= (17526 - 262) + (17024 - 262) = 17013 2
Bo = Ligado de indicador radioactivo
= recuentos medios corregidos para tubos 5 y 6 x 100recuento total corregido
= 8356 x 100 = 49,1%17013
% de ligado del indicador radioactivoCálculo para el tubo 7
= (recuento tubo 7 - blanco) x 100 recuentos medios corregidos para los tubos 5 y 6
= (7620 - 262) x 100 = 88,7% 8356
Ejemplo de cálculo para una muestra tomada de un paciente (tubo 21).
Recuento (encontrado) = 5823
Blanco = 262
% de ligado del indicador radiactivo = 5823 - 262 = 66,6% 8356
La curva estándar de logit-log (Figura 1) indica que el 66,6% corresponde a unaconcentración de gastrina de 58,9 pg/ml.
La media entre este valor y el valor de la determinación por duplicado se considera laconcentración de gastrina, en pg/ml, para la muestra del paciente (50,7 pg/ml)(54,8 pg/ml).
B. Pueden utilizarse otros métodos para trazar una curva estándar, tales comorecuentos versus pg/ml, el porcentaje de ligado en compar-ación con laconcentración logar-ítmica, recuento recíproco, B/F, coincidencia con la reglapara trazar líneas curvas, y otros.
Limitaciones del procedimiento
Gradualmente, la actividad proteolítica del suero irá degradando la gastrina. Con elfin de reducir al mínimo la pérdida de actividad, el suero debe separarse en el plazomáximo de una hora y analizarse en el plazo de cuatro horas después de laextracción de la muestra. Si la muestra va a guardarse durante más tiempo, seconservará congelada (-20°C). Esta medida de precaución, de tomarse, elimina lanecesidad de agregar inhibidores de la actividad proteolítica. Debe evitarse larepetida congelación y descongelación de las muestras de suero. Una vez
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descongelado a temperatura ambiente, el suero debe analizarse en el plazo máximode cuatro horas. NO debe usarse un baño a 37°C para acelerar la descongelación.
ES EXTREMADAMENTE IMPORTANTE QUE EL PACIENTE ESTE EN AYUNASDURANTE POR LO MENOS 10 HORAS ANTES DE PROCEDER A LA DETER-MINACION DEL NIVEL BASAL DE GASTRINA EN SUERO.
La muestras tomadas de pacientes que se han sometido a procedimientos de barrido(scanning) in vivo pueden presentar niveles de radioactividad que, posiblemente,interfieran con los análisis de gastrina realizados con este kit de radioinmunoensayo.Este efecto puede comprobarse analizando un tubo en blanco con una muestratomada del paciente, sin indicador radioactivo.
Una muestra que de un resultado de >1000 pg/ml puede diluirse con el Control A,con el fin de que el valor diluido coincida con algún punto de la curva estándar.Multiplicar el valor calculado por el correspondiente factor de dilución.
Para agregar el antisuero precipitante, se recomienda el empleo de una jeringa concono metálico y un adaptador desechable para tubos y agujas, del calibre 18,marca.
Valores esperados
Cada laboratorio individual debe definir sus propios valores normales de gastrina ensuero, en base a un grupo de personas normales que han estado en ayunas durantetoda la noche.
El kit de radioinmunoensayo de gastrina de MP Biomedicals, fue utilizado paradeterminar la banda de gastrina esperada en un grupo de 135 voluntarios sanos. Elgrupo se componía de 61 mujeres y 74 hombres de edades comprendidas entre los19 y los 60 años. Ninguno de los voluntarios tenía historial de úlcera péptica u otraenfermedad gastrointestinal, y todos presentaban valores normales de las diferentessustancias analizadas. Todos los valores observados en ésta población tenián unamedia de 49.6 pg/mL y un rango de 25 - 111 pg/mL. Los valores se distribuyeronnormalmente después de la transformación logar-ítmica.
Los pacientes con úlcera de duodeno no intervenida quirúrgicamente puedenpresentar valores normales de gastrina en suero en ayunas12. Con posterioridad auna antrectomía o una antrectomía con vagotomía, los valores permanecen dentrode la banda normal, si bien pueden incrementarse moderadamente tras unavagotomía sin antrectomía13,14. Es típico encontrar niveles elevados de gastrina enenfermos con un índice bajo de secreción de ácido gástrico, incluyendo la mayoríade los enfermos de anemia perniciosa o gastritis atrófica, así como muchos de losafectados por cáncer gástrico o úlcera gástrica.
La hipergastrinemia se encuentra en pacientes que toman cimetidina, antagonista delos receptores de H2, y, asimismo, en los que presentan distensión del antroabdominal secundaria a la obstrucción pilórica, en los que han sufrido unavagotomía anterior, y los afectados por retención antral8,13-16. Las dos causas másimportantes de hipergastrinemia son la hiperplasia de células G del antro y elsíndrome de Zollinger-Ellison17,18.
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Características de rendimiento específicas
Precisión
Precisión inter-ensayo
Muestra Control 1 Control 2 Control 3
nMedia, pg/mlS.D.% CV
22 56,0
5,91 10,6
22225
16,8 7,5
22474
37,2 7,8
Precisión intra-ensayo
Muestra Control 1 Control 2 Control 3 Suero
nMedia, pg/mlS.D.% CV
20 56,7
2,59 4,6
20232
9,56 4,1
20 465
26,1 5,6
20 49.4
2.91 5.9
Paralelismo
2 muestras con un elevado contenido en gastrina fueron diluidas con el Control A yanalizadas con el fin de determinar la linealidad.
Muestra 1 Muestra 2
Factor dedilución
pg/mlencontrado
pg/mlesperado
%encontrado
pg/mlencontrado
pg/mlesperado
%encontrado
0 1:21:41:8
1:16
425195101
44,1 23,7
---213107
53,5 26,8
---92948288
377173
79,8 39,6 21,1
---188
94,0 47,0 23,5
---92858490
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Recuperación
El suero fue mezclado con G17-I. El porcentage de recuperación fue calculadocomo sigue:
(pg/ml Gastrina encontrada) - (Endogena) x 100 pg/ml Gastrina añadida
Pico (pg/ml) Encontrada (pg/ml) Recuperación %
0 50100200400
56,8106148258494
98 91101109
Especificidad
Se muestran a continuación las reactividades molares cruzadas con diferentesformas de gastrina humana y péptidos relacionados. Los resultados se expresancomo un índice de desplazamiento de Gastrina 17-I, dividido por el reactantecruzado, con un factor de ligado del indicador radioactivo del 50%.
Componente % Reactividad cruzada
Gastrina 17-I 100Gastrina 17-II 77Gastrina 34-I 42Gastrina (5-17) 54CCK-PZ <0,1CCK octapéptido 10,9
Sensibilidad
Determinado por la concentración de la media menos 2 desviaciones estandar de 20determinaciones del cero estandar, la sensibilidad del ensayos es 3,3 pg/ml.
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TABLE 1GASTRIN [125I] RADIOIMMUNOASSAY
Tabulated Data
Tube No. Countsper
minute
CorrectedCounts
AverageCounts
%Bound
% of TraceBinding
pg/mL(ng/L)
Total 1Counts 2Blank 3
4Trace 5Binding 6
789
1011121314151617181920
Sample 21Sample 22
1752617024 284 240 8650 8586 7670 7645 6967 7100 6090 5978 4753 4889 3439 3316 1876 2002 1114 1209 5823 6100
1726416762
83888324740873836705683858285716449146273177305416141740 882 94755615838
17013
262
8356 49.188.788.480.281.869.768.453.755.438.036.519.320.810.611.366.660.4
15
25
50
100
200
500
1000 58.9 50.7
44
FIGURE 1TYPICAL STANDARD CURVEWITH LOGIT LOG TRANSFORMATION
45
References
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