GDO ANALİZLERİNDE VERİFİKASYON REHBERİ

GDO ANALİZLERİNDE VERİFİKASYON REHBERİ

Gıda ve Kontrol Genel Müdürlüğü

Nisan 2018

ÖNSÖZ

Son yıllarda gıda güvenliği ve güvenilirliği konusunda dünyanın en çok ilgilendiği konuların

başında biyoteknoloji ve biyoteknolojik yöntemlerle elde edilen genetik olarak değiştirilmiş

organizmaların (GDO) kullanımı gelmektedir. Tarım ürünlerinde modern biyoteknolojiyi

kullanarak ürün dayanıklılığını, verimini ve kalitesini arttırma gibi nedenlerle genetik

değişiklik yapılmaktadır.

GDO’lara ilişkin dünyadaki gelişmelerin yakından takip edilmesi, ülkemizin bu konudaki

politikalarının belirlenmesi açısından oldukça önemlidir.

Dünya üzerinde GDO’lu tarımsal ürün ekimi yapan birçok ülke bulunmaktadır. Ülkemizde

gıda amaçlı onay verilmiş bir gen bulunmamaktadır ve GDO’lu ürünlerin birincil üretimi

yasaktır. Bu sebeple Bakanlığımız tarafından ithalat kontrolleri ve yurt içi kontrollerde

laboratuvarlarımız tarafından yapılacak GDO analizleri ve analiz sonuçlarının güvenilirliğinin

sağlanması için metotların verifikasyonu büyük önem arz etmektedir. Bu kapsamda

Laboratuvarlarımızda GDO analizleri ile ilgili metot birliğinin sağlanması ve GDO

analizlerinde uygulanacak verifikasyon parametrelerinin belirlenmesi amacı ile Bakanlığımıza

bağlı Gıda Kontrol Laboratuvarlarından ve Bakanlığımız tarafından yetkilendirilen Özel Gıda

Kontrol Laboratuvarlarından konu uzmanlarının katılımıyla bir dizi toplantı düzenlenmiş ve

uzmanlarımızın özverili çalışmaları neticesinde “GDO Analizlerinde Verifikasyon Rehberi”

oluşturulmuştur. GDO analizi yapan Kamu ve Özel Laboratuvarların söz konusu Rehber’de

yer verilen verifikasyon çalışmalarını uygulaması suretiyle metot birliği sağlanacaktır.

Uzmanların katılımıyla belirli zamanlarda tekrar toplantılar yapılacak ve gerekli durumlarda

revize edilecek Rehber tekrar yayımlanacaktır.

“GDO Analizlerinde Verifikasyon Rehberi”nin hazırlanmasında yoğun çaba sarfeden konu

uzmanlarına, Genel Müdürlüğümüz personeline ve bu konuda emeği geçenlere teşekkür

ediyorum.

Muharrem SELÇUK

Gıda ve Kontrol Genel Müdürü

YÖNETİM KOMİTESİ

Dr. Neslihan ALPER Genel Müdür Yardımcısın V.

Dr. Gülsen SÖYLEMEZ Mühendis

Tevfik B. ALTUNKAYNAK GTH Uzmanı

GÖREV ALANLAR VE KATKIDA BULUNANLAR (*)

Nihal AKMAN

Ali ALMA

Tevfik Boğaçhan ALTUNKAYNAK (Tasarım)

Erdem ARTUVAN

Beyza BALABAN

Fatma AYDIN ERARSLAN

Aykut GÜLEREN

Dr. Ayşe GÜMÜŞ KARACA

Dr. Şafak BAŞIAÇIK KARAKOÇ,

Dr. Esra Alpözen MENGEN,

Dr. Eren NUMANOĞLU

Çiğdem ÖNER

S. Dilek ÖZCAN,

M. Kürşat ÖZTÜRK

Dr. Gülsen SÖYLEMEZ (Tasarım)

Ferruh TOMBUL,

Orhan TURAN,

H. Aytül TÜRKMENOĞLU

Doç. Dr. Aysun YILMAZ

* Soyadına göre alfabetik dizin

İçindekiler

1. AMAÇ VE KAPSAM ..................................................................................................... 5

2. VERİFİKASYON PARAMETRELERİ ......................................................................... 5

2.1. DNA Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması ........................................................................ 6

2.1.1. İnhibitör Kontrolü ................................................................................................. 6

2.2. Yanlış Pozitif Oranı % (Kalitatif) ................................................................................ 8

2.3. Yanlış Negatif Oranı %(Kalitatif) ................................................................................ 9

2.4. Tespit Limitinin Hesaplanması (LOD) (Kalitatif) ....................................................... 9

2.5. Kesinlik (Precision) (Kantitatif) ................................................................................ 10

2.5.1. Tekrarlanabilirlik ................................................................................................. 10

2.6. Ölçüm Limitinin Hesaplanması (LOQ) (Kantitatif) .................................................. 10

2.7. Doğruluk (Trueness) .................................................................................................. 11

2.8. Dinamik aralık, R2 katsayısı ve Amplifikasyon Verimliliği (Kantitatif) ............... 13

2.9. Sağlamlık (Robustness) ......................................................................................... 13

3. İÇ KALİTE KONTROLLERİ ...................................................................................... 15

4. İLAVE VERİFİKASYON ÇALIŞILMASI GEREKEN DURUMLAR ...................... 15

4.1. Personel Yetkilendirme .............................................................................................. 15

4.2. Yeni PCR Cihazı ........................................................................................................ 16

4.3 Yeni Kit Kullanımı ..................................................................................................... 16

4.4. Alan değişikliği .......................................................................................................... 16

5. KAYNAKLAR .............................................................................................................. 16

6. REVİZYON .................................................................................................................. 17

Tablo 1. GDO Analizleri için Yapılması Gereken Çalışmalar ................................................... 5

Tablo 2. Kabul Edilebilir DNA Kalitesi ..................................................................................... 7

Tablo 3. Kullanılan Metotlara Göre Laboratuvar için Önerilen Validasyon Derecesi ............ 14

Tablo 4. ISO 24276 GDO Analizlerinde Kullanılan Kontroller .............................................. 15

Şekil 1. Kabul Edilebilir DNA Kalitesi Kalibrasyon Eğrisi ....................................................... 8

5 / 17

1. AMAÇ VE KAPSAM

Bu doküman PCR temelli kalitatif ve kantitatif GDO analizlerinde verifikasyon çalışmalarını

kapsar.

2. VERİFİKASYON PARAMETRELERİ

GDO analizlerinde valide edilmiş metotların laboratuvarlar tarafından uygulanabilmesi için

bir takım doğrulama çalışmaları yapılmalıdır. Yapılacak çalışmalar Tablo1’ de verilmiştir.

Tablo 1. GDO Analizleri için Yapılması Gereken Çalışmalar

Parametre Kalitatif metotlar Kantitatif metotlar

DNA ekstraksiyonu ve

saflığı Evet Evet

DNA inhibisyon testi DNA Ekstraksiyon

Verifikasyonunda yapılır.

DNA Ekstraksiyon

Verifikasyonunda yapılır.

Dinamik aralık, R2 katsayısı

ve Amplifikasyon

verimliliği

Gerektiğinde yapılır. (DNA

ekstraksiyon inhibisyon

kontrolünde çalışılmamışsa R2

ve amplifikasyon verimliliği)

Dinamik aralık yok

Evet

Doğruluk (Trueness) Evet Evet

Kesinlik (Precision) Zorunlu değil Evet

Ölçüm limitinin

hesaplanması (LOQ) Yok Evet

Tespit limitinin

hesaplanması (LOD) Evet Zorunlu Değil

Yanlış Pozitif Oranı % Evet (GDO tarama ve

tiplendirme analizinde )

Gerektiğinde (valide

edilmemişse) yapılır.

Yanlış Negatif Oranı % Evet (GDO tarama ve

tiplendirme analizinde )

Gerektiğinde (valide

edilmemişse) yapılır.

Sağlamlık (Robustness) Gerektiğinde veya valide

metot değilse yapılır.

Gerektiğinde veya valide metot

değilse yapılır.

6 / 17

2.1. DNA Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması

Prosedür: Bu parametre kalitatif ve kantitatif tüm analizler için kullanılır. Metot daha

önceden valide edilmişse her DNA ekstraksiyonu en az 2 paralel ve her seferinde ayrı test

porsiyonu olacak şekilde ayrı günlerde ve mümkünse farklı analistlerle yapılmalıdır.

DNA ektraksiyon verifikasyon çalışması için matriks grubu olarak işlenmemiş gıda, işlenmiş

gıda, yem ve tohum belirlenmiştir. Seçilen matrikslerin GDO içermesi zorunlu değildir. Bu

matriks gruplarından hangisi/hangileri laboratuvarın onaylı faaliyet listesinde yer

alıyorsa/alacaksa o grubu temsilen belirtilen matriksle ayrı günlerde (en az 3 farklı günde) 6

tekrar ekstraksiyon yapılarak sonuçların ortalama değeri, standart sapma ve RSD hesaplanır.

(Örneğin 3 gün x 6 tekrar x 1 matriks = 18 ) Bu çalışma (18 ekstraksiyon) analist sayısına

bölünerek yapılabilir. DNA miktarı yeterli olmazsa pratik LOD değeri etkileneceğinden bu

husus göz önünde bulundurulmalı ve ekstraksiyondan alınacak DNA verimliliği pratik

LOD/LOQ seviyesini karşılayacak miktarda olmalıdır.

100%

1

)(

1

2

x

sRSD

sSTSapman

xxn

i

i

2.1.1. İnhibitör Kontrolü

Prosedür: Herhangi bir matriksten elde edilen DNA’lardan inhibisyon riski en fazla olan

örnek (bebek maması, lesitin, DDGS, melas gibi aşırı işlem görmüş ürünler) tercih edilerek,

en az bir tanesi inhibisyon testine tabi tutulmalıdır. Bu amaçla DNA ekstraktı çalışma

konsantrasyonuna ayarlanır (ör: 40 ng/µl). Bu çalışma dilüsyonunda en az 4 noktalı dilüsyon

serisi (1:4, 1:16, 1:64, 1:256) oluşturulur. Her bir dilüsyondan en az 2 PCR tekrarı çalışılır. Bu

dört dilüsyondan kalibrasyon eğrisi oluşturulur (Tablo 2 ve Şekil 1).

7 / 17

Hesaplamanın yapılabilmesi için sırasıyla her bir dilüsyon faktörü için ölçülen Ct değerleri

yazılır. Bu değerlerin her bir çift için ortalaması alınır. ∆Ct, ardışık dilüsyonların Ct

ortalamalarının farkı ile bulunur. Dilüsyon faktörünün logaritmaları alınır ve Ct ortalamaları

ile logaritmik değerin eğrisi çizilir. Eğrinin eğimi ve varyasyon katsayısı hesaplanır. Bu

çalışma tarama kiti, bitki spesifik, takson spesifik PCR yöntemlerinden herhangi biri ile

yapılabilir.

Bu durumda her döngüde %100 verim ile teorik olarak -3,32 eğim oluşturan amplifikasyonun

oranıdır. Reaksiyonun verimi aşağıdaki şekilde hesaplanır;

Verim: 10 (-1/eğim)-1

Tablo 2. Kabul Edilebilir DNA Kalitesi

Ortalama

Ct(Ref)

Ortalama

Ct(Hed)ΔCt Logaritma

1 : 4 24

1 : 4 24

1 : 16 26

1 : 16 26

1 : 64 28

1 : 64 28

1 : 256 30

1 : 256 30

Ölçülen Ct Ortalama Ct Extrapolated Ct

Extrapolated Ct-

Mean Ct

22

22

0,00

0,00

0,00

0,00

-0,6021

Dilüsyon Faktör

Örnek Kodu:

OK

24

26

28

30

22Çalışma Dilüsyonu

-1,2041

-1,8062

-2,4082

0

8 / 17

Şekil 1. Kabul Edilebilir DNA Kalitesi Kalibrasyon Eğrisi

Kabul kriteri: Ortalama fark (∆Ct), ölçülen Ct değeri ile ekstrapole Ct değeri arasındaki fark

<0,5 olmalıdır. Kalibrasyon eğrisinin eğimi -3,6 ile -3,1 arasında olmalıdır. İşlenmiş ürünlerde

(rafine yağlar, lesitin, ileri işlenmiş gıda ve yemler) bu değer -4,1 ile -3,1 arasında olabilir.

R2 değeri ≥ 0.98 olmalıdır. Eğer ekstrakte edilen DNA inhibitör içeriyorsa DNA

saflaştırılmalı veya inhibisyonun ortadan kaldırıldığı noktaya kadar dilüsyon yapılmalıdır.

2.2. Yanlış Pozitif Oranı % (Kalitatif)

Prosedür: Bu parametre her ne kadar validasyon parametresi olsa da laboratuvarlardaki

personelin konu hakkındaki yetkinliğinin arttırılması için GDO Tarama analizi

verifikasyonunda da istenmektedir. Bu oran, bilinen negatif bir numunenin kullanılan metotla

pozitif olarak tanımlanması olasılığıdır ve yüzdesel olarak ifade edilmektedir.

İstenilen güvenilirlik seviyesi, çalışmada kullanılan örneklerin sayısına bağlıdır. Onaylı

faaliyet listesinde yer alan/yer alacak ürün grubuna göre yem, tohum ve (işlenmiş ve

işlenmemiş) gıdalarda her bir ürün için 2 ekstraktta 5 tekrarlı çalışma yapılmalıdır (2

ekstraksiyon X 4 ürün X 5 tekrar). Bu aşamada toplam 40 çalışma tüm personele dağıtılır.

Çalışma güven aralığı %95 olmalıdır.

y = -3,3219x + 22

R2 = 1

20

22

24

26

28

30

32

-3,0 -2,5 -2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0

Ct

log(1/dilüsyon faktör)

9 / 17

% Yanlış Pozitif Sonuç = (Yanlış tanımlanmış bilinen negatif örnek sayısı / Bilinen tüm

negatif örneklerin sayısı) X 100

2.3. Yanlış Negatif Oranı %(Kalitatif)

Prosedür: Bu parametre her ne kadar validasyon parametresi olsa da laboratuvarlardaki

personelin konu hakkındaki yetkinliğinin arttırılması için GDO tarama analizi

verifikasyonunda istenmektedir. Bu oran, bilinen pozitif bir numunenin kullanılan metotla

negatif olarak tanımlanması olasılığıdır ve yüzdesel olarak ifade edilmektedir.

İstenilen güvenilirlik seviyesi çalışmada kullanılan örneklerin sayısına bağlıdır. Onaylı

faaliyet listesinde yer alan/yer alacak ürün grubuna göre yem, tohum ve (işlenmiş ve

işlenmemiş) gıdalarda her bir ürün için 2 ekstraktta 5 tekrarlı çalışma yapılmalıdır.

Verifikasyonu yapılan gen bölgelerini içerecek şekilde maksimum eşik değeri seviyesinde

(örneğin % 0,1 veya % 0,5 gibi düşük düzeyde) CRM/CRM’lerle spike yapılarak elde edilen

pozitif numune çalışılır (2 ekstraksiyon X 4 ürün X 5 tekrar). Bu aşamada toplam 40 çalışma

tüm personele dağıtılır. Çalışma güven aralığı %95 olmalıdır.

% Yanlış Negatif Sonuç =(Yanlış tanımlanmış bilinen pozitif örnek sayısı / Bilinen tüm

pozitif örneklerin sayısı) X 100

2.4. Tespit Limitinin Hesaplanması (LOD) (Kalitatif)

Prosedür: LOD rölatif (%) veya absolut (kopya sayısı) olarak hesaplanabilir.

Rölatif LOD (LODrel): Düşük GM seviyesindeki pozitif kontrol materyalinin 10 PCR tekrarı

ile ölçülmesi ve aynı yüzdeye sahip tüm tekrarların (aynı çalışmada) pozitif olduğu seviyenin

bulunmasıdır. Buradan LODrel pozitif kontrol seviyesine eşit veya daha altında anlamı

çıkarılır.

Absolut LOD (LODabs): %95 güven aralığında LODabs’un belirlenebilmesi için 60 PCR

paraleli gereklidir. Ancak pratikte 1 kopya zorunlu olmak üzere en az 3 farklı seviyede

10 / 17

(Beklenen LOD, Üstü ve Altı) 10 PCR tekrarı şeklinde çalışılır (ör; 20,10, 5 ve 1 kopya).

Yanlış negatif oranı %5 den az olmalıdır. Bu durumda tüm 10 tekrarın da pozitif olması

gerekir. LOD tüm 10 değerin de pozitif bulunduğu son dilüsyon olarak kabul edilir.

Yanlış negatif sonuç, analit miktarının LOD seviyesine yaklaştığı miktarlarda görülür.

Dilüsyon serileri seçilirken daha önceki bilgiler ışığında beklenen LODabs seviyenin üzerinde

ve altında konsantrasyonlar kullanılmalıdır.

Kantitatif metotlar için LOD ayrıca ‘Guidance Document on Measurement Uncertanity for

GMO Testing Laboratories’ dokümanı üzerinden hesaplanabilir.

2.5. Kesinlik (Precision) (Kantitatif)

Kesinlik çalışması tekrarlanabilirlik ile hesaplanır.

2.5.1. Tekrarlanabilirlik

Prosedür: Gerçeklik ile aynı koşullarda yapılan çalışmalardır. Tekrarlanabilirlik koşulları

altında PCR tekrarları ile hesaplanmaktadır. Tekrarlanabilirlik test edilen tüm GM seviyeleri

için yapılmalıdır. Test koşulları rutin analiz şartları ile aynı olmalıdır. En az 16 PCR sonucu

elde edilmelidir.

Kabul kriteri: Dinamik aralık içerisinde rölatif tekrarlanabilirlik standart sapması ≤%25

olmalıdır.

2.6. Ölçüm Limitinin Hesaplanması (LOQ) (Kantitatif)

Prosedür: Metot kalitatif amaçla kullanılacaksa LOQ gerekli değildir. Kopya sayısının

RSD’sinin ≤%25’i sağladığı en düşük konsantrasyondur. LOQ rölatif (%) veya absolut

(kopya sayısı) olarak hesaplanabilir.

11 / 17

Rölatif LOQ (LOQrel): Pozitif kontrol materyali örneğin %0,1 konsantrasyonunda 10 PCR

tekrarı olacak şekilde analiz edilir. 10 tekrar hedef GM ve 10 tekrarda referans gen analiz

edilir. Gerçek LOQrel belirlenebilmesi için düşük GM yüzdesinde dilüsyonlar yapılmalıdır.

Absolut LOQ (LOQabs): Bilinen pozitif kontrolden (ör:%1) dilüsyon serileri oluşturulur ve

10 PCR tekrarı yapılır (ör; 80, 60, 40, 20, 10, 5 ve 1 kopya). LOQabs RSD’nin <%25 olduğu

son dilüsyon serisidir.

LOQ ayrıca ‘Guidance Document on Measurement Uncertanity for GMO Testing

Laboratories’ dokümanı üzerinden hesaplanabilir.

2.7. Doğruluk (Trueness)

Prosedür: Doğruluk, belirlenen eşik değerinde ya da metotta belirtilen veya LOQ değerine

yakın bir seviyede çalışılmalıdır. Eğer bu mevcut değilse miktarı bilinen bir sertifikalı

referans materyal ile spike yapılarak yapay referans materyal oluşturulabilir.

Eğer doğruluk, CRM ile belirlenememişse yeterlilik testlerine katılımla da hesaplanabilir. En

az 2 konsantrasyonda referans materyal ile çalışılmalıdır. Bu konsantrasyonlardan biri LOQ

seviyesine yakın olmalı (ör: % 0,1), diğeri de etiketleme seviyesinde olmalıdır. Üçüncü olarak

farklı bir konsantrasyon seviyesinde çalışma önerilir ve bu seviye yüksek konsantrasyonda

olmalıdır (ör; %5). Alternatif olarak yüksek seviyede CRM’den spike yapılarak referans

örnek oluşturulabilir. Bunun için GM pozitif ve negatif örneklerdeki referans gen miktarı aynı

kalibrasyon eğrisinde okunarak belirlenir ve aşağıdaki formülle dilüsyon faktörü hesaplanır.

X= Dilüsyon faktörü

A= GM pozitif DNA ekstraktındaki referans gen kopya sayısı

B= GM negatif DNA ekstraktındaki referans gen kopya sayısı

Y= Teorik dilüsyon faktörü (ör:%10GM’den % 0,1GM hazırlanırsa Y=100x)

12 / 17

Test koşulları rutin analiz şartları ile aynı olmalıdır. En az 16 PCR tekrarı ile elde edilmelidir.

Farklı deney modelleri bulunur.

Deney deseni 1: 2 DNA ekstraksiyonu her bir GM seviyesinde, 2 PCR paraleli her bir

ekstraksiyondan 4 plakada çalışıldığında 16 test sonucu ve 8 GM değerlendirmesi yapılır.

1 GM seviyesi X 2 DNA ekstraksiyonu X 2 PCR paraleli X 4 Plaka = 16 test sonucu

Deney deseni 2: 2 DNA ekstraksiyonu her bir GM seviyesinde, 4 PCR paraleli her bir

ekstraksiyondan 2 plakada çalışıldığında 16 test sonucu ve 4 GM değerlendirmesi yapılır.

1 GM seviyesi X 2 DNA ekstraksiyonu X 4 PCR paraleli X 2 Plaka = 16 test sonucu

Analistler arasında karşılaştırma yapmak amacıyla laboratuvarda çalışılacak eventlerden

herhangi biri için analistlerin tümü aynı çalışmaları yapar. Her bir kişinin verileri kabul

kriterlerini karşılıyorsa diğer genlerin verifikasyonu tek bir analist tarafından yapılabilir.

Kabul kriteri: Gerçek referans değerden ±%25 sapma olabilir veya eğer yeterlilik testi

katılımı varsa z skoru 2 ile -2 aralığında olmalıdır.

EX

Y

é

ëê

ù

ûú »

x

y+

x

y3Var(y)

22

2

)()(

y

yVar

x

xVar

y

x

Y

XVar

sd X /Y[ ] = Var X /Y[ ]

GM = GM i / ji=1

j

å

sdGM = (ni -1)sdi

2 / ni - ki=1

j

åæ

èç

ö

ø÷

i=1

j

å

RSDr =sdGM

GM100

13 / 17

j: Kullanılan GM sayısı

n: Her bir ekstraksiyondaki tekrar sayısı

k: Birleştirilecek standart sapma sayısı

2.8. Dinamik aralık, R2 katsayısı ve Amplifikasyon Verimliliği (Kantitatif)

Prosedür: Dinamik aralık, R2 katsayısı ve amplifikasyon verimliliği standart eğri üzerinden

değerlendirilen gerçeklik ve kesinlik parametreleri sırasında doğrulanan bir parametredir. En

az iki standart eğrinin değerlerinin ortalaması alınmalıdır.

Deney deseni 1: 5 kalibrasyon noktasında her bir noktada en az 2 paralel 2 kalibrasyon eğrisi

oluşturulur. (Tavsiye Edilen)

Deney deseni 2: 5 kalibrasyon noktasında her bir noktada 2 paralel 4 kalibrasyon eğrisi

oluşturulur.

Deney deseni 3: 8 kalibrasyon noktasında (LOD ve LOQ’yu içeren) her bir noktada 5 paralel

2 kalibrasyon eğrisi oluşturulur.

Kabul Kriteri: Dinamik aralık için; dinamik aralık % GDO veya kopya sayısı olarak

kullanım için gerekli aralığı içermelidir. Amplifikasyon verimliliği için; kantitatif metotlarda

eğrinin eğimi -3,1≥Eğim≥-3,6 aralığında olmalıdır. Bu aralık %90-110 amplifikasyon

verimliliğine (-3,1 %110, -3,6 %90) karşılık gelir.

Verimlilik= (10(-1/eğim)-1)x100 formülü ile uygulamanın verimi ispatlanmalıdır.

R2 katsayısı için; Ortalama değer R2 için ≥0,98 olmalıdır.

2.9. Sağlamlık (Robustness)

Kullanılan metot valide metodun her şeyi ile aynı ise (ekipman, referans materyal, final

konsantrasyonları kimyasallar dahil) sağlamlığın yapılmasına gerek yoktur. Orjinal metottaki

final konsantrasyonları (Primer prob, master miks, DNA konsantrasyonu) ve termal profil

14 / 17

değiştirildiğinde sağlamlık çalışması yapılmalıdır. Sağlamlık çalışması orjinal metotla ve

değiştirilen metotla her bitki taksonunu (soya, kanola, mısır ve pamuk vb.) temsilen bir tipte 2

seviyede (örneğin %0,1 ve en fazla %1) ikişer çalışma 3 PCR tekrarı ile yapılır.

Çalışılan metodun reaksiyon hacminin (master miks+DNA hacmi) 20 µl’nin altına

indirilmemesi tavsiye edilir. Reaksiyon hacminin 20 µl’ nin altına indirilmesi durumunda

sağlamlık çalışması yapılır. İşletme içi metot (multiplex vb.) olduğunda tam validasyon

yapılmalıdır (Tablo 3).

Tablo 3. Kullanılan Metotlara Göre Laboratuvar için Önerilen Validasyon Derecesi

Kullanılan Metotlar Önerilen Validasyon

Derecesi

Ulusal/Uluslararası kuruluşlarca onaylanmış, valide edilmiş

standart metotlar Verifikasyon

Ulusal/Uluslararası kuruluşlarca onaylanmış, valide edilmiş

standart metotlarda final konsantrasyonları (Primer prob,

master miks, DNA konsantrasyonu) ve termal profil

değiştirildiğinde, reaksiyon toplam hacmi 20 µl’ nin altına

indirildiğinde

Verifikasyon ve Sağlamlık

Laboratuvar içi geliştirilmiş metot (multiplex vb.) ve Majör

değişiklik yapılmış metotlar Tam Validasyon

15 / 17

3. İÇ KALİTE KONTROLLERİ

İç kalite kontrolleri Tablo 4’deki ISO 24276’ya göre her çalışmada yapılmalıdır.

Tablo 4. ISO 24276 GDO Analizlerinde Kullanılan Kontroller

4. İLAVE VERİFİKASYON ÇALIŞILMASI GEREKEN DURUMLAR

4.1. Personel Yetkilendirme

Kalitatif analizlerde verifikasyona katılmamış ve yeni personel için LOD çalışması yapılır

(Çalışmalar ekstraksiyon verifikasyonundan başlamalıdır). Kantitatif analizlerde personelin

yetkilendirilmesi yapılırken mevcut yetkilendirilmiş bir personel ile bir GD tip/event karşılıklı

çalışılır. Her tipin verifikasyonunun en az bir personel tarafından yapılmış olması gerekir.

Verifikasyon tek personel tarafından yapılmış ise o personelin ayrılması durumunda o GD

16 / 17

tiplerin/eventlerin verifikasyonu yenilenir (Örneğin 1. Kişi (1-2-3 nolu eventi), 2.kişi (4-5-6

nolu eventi), her ikisi 7 nolu eventi çalışmışsa 1. Kişi laboratuvardan ayrılırsa 1-2-3 nolu

eventlerin verifikasyonu yenilenir).

4.2. Yeni PCR Cihazı

Yeni cihaz kullanıma alınmadan önce her analiz grubu (tarama, tip belirleme ve miktar vb.)

için seçilen bir tipte daha önce çalışılan seviyede, kalitatif analizlerde LOD, kantitatif

analizlerde LOQ çalışması yapılır. Eski cihaz LOD/LOQ değerlerini karşılıyorsa cihaz

kullanıma alınır, karşılamıyorsa verifikasyon raporu yenilenir.

4.3 Yeni Kit Kullanımı

DNA ekstraksiyon ve PCR kiti kullanıma alınmadan önce yeni kitle verifikasyon yapılır.

4.4. Alan değişikliği

İç kontrol parametreleri kontrol edilir. Parametrelerde bir değişiklik olursa düzeltici faaliyet

başlatılır. Faaliyetin değerlendirilmesine göre verifikasyon veya parametre yenilenir.

Taşınmadan dolayı performansı etkilenebilecek cihazların kalibrasyonları ve performans

kontrolleri yaptırılır veya yapılır.

5. KAYNAKLAR

JRC Verification of analytical methods for GMO testing when implementing interlaboratory

validated methods EUR 24790 EN-2011.

JRC Technical Report, Definition of Minimum Performance Requirements for Analytical

Methods of GMO Testing, 2015.

CAC/GL 74-2010.Guidelines on performance criteria and validation of methods for detection,

identifcation, and quantification of specific DNA sequences and specific proteins in

foods.

Zel J.,Milavec M., Morisset D., Plan D., Eede GV., Gruden K. How to reliably test for

GMOs. Springer 2012.

17 / 17

PD CEN/ TS 16707 Foodstuffs-Methods Of Analysis For The Detection Of GMO And

Derived Products PCR Based Screening Strategies.

ISO 24276 Foodstuffs -Methods of analysis for the detection of genetically modified

organisms and derived products – General requirements and definitions.

JRC Training Course, The Analysis of Food and Feed Samples for the Presence of GMOs,

TÜBİTAK, MAM Gıda Enstitüsü Nisan 2010.

JRC Technical Report, Guidance Document on Measurement Uncertainty for GMO Testing

Laboratories, EUR 22756 EN/ 2 – 2009.

6. REVİZYON

Revizyon No Tarih Revizyon Yapılan Madde Revizyon Nedeni