Gene expression

מדידת ביטוי באמצעות מדידת •mRNAכמות

זהו השלב הראשון בתהליך בקרת •הביטוי

קל יותר לביצוע בקנה מידה גדול •לעומת מדידת כמות חלבונים

חסרון – לא תמיד מייצג באופן •ישיר את כמות התוצר הסופי

DNA Chips

Chipמבנה ה-•ביצוע הרבה ניסוי •

היברידיזציה במקבילמודד עוצמת ביטוי •

יחסיתבניית פרופיל ביטוי•גנום ידוע =< פרופיל •

ביטוי של כל הגניםמטריצת הביטוי ונרמול •

התוצאותהפחתת רקע–logטרנספורמצית –

Clustering

עיבוד המידע הרב דורש טכניקות חישוביות חדשות•

העקרון – קיבוץ גנים בעלי תבנית ביטוי דומה בצבר אחד.•

-מימדיnמתייחסים לכל גן כאל וקטור •

הגדרת פונקציית מרחק )"דימיון"( בין כל שני גנים, כגון:•מרחק אוקלידי–

מקדם המתאם–

•Hierarchical Clustering הצברים הקרובים ביותר2מצא את –

חבר אותם לצבר יחיד ע"י ענף חדש שאורכו תואם את רמת –הקרבה

חשב מחדש את הקרבה של כל הצברים הנותרים–

Clustering – The resultדימיון ברמה הויזואלית• מופיעים chipייצוגים חוזרים של אותו הגן על ה-•

בסמיכותגנים בעלי דימיון פונקציונלי ידוע מופיעים באותו •

הצבר, למשל:גליקוליזה–היסטונים–DNAהכפלת –

הביטוי תבניתרגישות רבה ל•אבחנה דקה בין תבניות ביטוי שונות–השפעת הרעש נמוכה יותר–

ביטוי דומה מרמז על בקרה דומה•

Clustering vs. Random data

Genomic Expression Programs in the Response of Yeast Cells to Environmental Changes

Audrey P. Gasch, Paul T. Spellman, Camilla M. Kao, Orna Carmel-Harel, Michael B. Eisen, Gisela Storz, David Botstein, and Patrick O. Brown

האורגניזם הנחקר – שמר האפייה•חד-תא, חייב לפתח מנגנוני תגובה –

מהירים לשינוי בתנאי הסביבה

גנים 6220בעל רצף גנומי ידוע, –ORFsו-

יש מידע רב שכבר ידוע על אורגניזם –זה, הרבה גנים שכבר מאופיינים

מטרות: •חקר התגובה והאדאפטציה של של התאים לתנאי עקה שונים–חקר הבקרה של התגובה התאית לתנאי עקה–

הניסויים שבוצעו

תנאי הניסוי:•עקות חום, מעברי טמפרטורות–שינוי ריכוזים בסביבת הגידול–עקת חמצון–התדלדלות מקור פחמן, חנקן–גידול על מקור פחמן שונה–פאזה סטציונארית–

:)תלוי בניסוי(ביקורות •השוואה לתנאים אופטימליים–השוואה לזמן תחילת ניסוי–

ESRתגובה גלובלית –

(, הציגו P ו-F צברים גדולים )2•תבניות ביטוי הפוכות בכיוונן אבל

זהות בעוצמתן

– ESRהוגדרו כ-גנים של •Environmental Stress Response

~ מהגנום14% גנים, 900סה“כ כ-•

גנים600ירידה בעוצמת ביטוי – כ-•גדילה, עיבוד ומטבוליזם רנ“א, ביוסינטזה של –

נוקליאוטידים, תהליכים מטבוליים שונים

גנים300עלייה בעצמת ביטוי – כ-•תיקון נזקי דנ“א, קיפול ופירוק חלבונים, –

דטוקסיפיקציה של תרכובות מחמצנות, תקשורת תוך תאית, מודיפיקציה של קרום התא

ESR upregulated

•A מטבוליזם של – פחמימות

•Cקיפול חלבונים – •Dפירוק חלבונים – •Fתקשורת תוך תאית –

ESRהתאמה מהירה לתנאים החדשים -

השינויים הגלובליים בכמות • היו לפרקי זמן mRNAה-

קצרים

שינוי גדול בהתחלה, אך יש • steadyהתאמה מהירה ל-

state החדש, עם הבדלים קטנים לעומת ההתחלה

התאמה בין עוצמת העקה •לעצמת התגובה

Aהפרש טמפרטורות גדול –

Bהפרש טמפרטורות קטן יותר –

הקו האדום – הערך הממוצע של גנים שביטויים עלה

הקו הירוק – הערך הממוצע של גנים שביטויים ירד

– ברמת הבקרהESRספציפיות של

:TRX2צבר •ESRרמת ביטוי עולה כחלק מ-–

רמת ביטוי גבוהה בהרבה יחסית – שונותחימצון בעקות ESRלשאר ה-

:TRX2בקרה של צבר •בעקת חימצון, מופעל ע“י אלמנט –

yap1הבקרה

בעקת חום, מופעל ע“י אלמנט –msn2msn4הבקרה

הרבה צברי גנים מתבטאים •, אך ברמת ביטוי גבוהה ESRב-

)למשל במיוחד בתנאים ספציפיים chaperons)

– העדפה בין איזוזימיםESRספציפיות של ה-

איזוזימים – צורות שונות •של אותו האנזים, בעל אותה הפונקציה באותו

הפרט.יש הבדל בעצמות הביטוי •

בין איזוזימים שוניםהבדלים בתכונות כגון •

ספיצפיות לסובסטרט, מיקום בתוך התא וכו'

?ESRמה מפעיל את ה-

בשל האופי הגלובלי של •התופעה, ההשערה הייתה

שינוי בתנאי סביבה כלשESRמפעיל את ה-

ביצעו שינויי תנאים הפוכים •וראו תוצאות הפוכות:

ESRעקה – הפעלת –

חזרה לתנאים מועדפים – –תגובה הפוכה, חזרה מהירה

steadyלרמת הביטוי של ה-stateהמועדף

ESRסיכום

מערכת גלובלית הרגישה להרעה בתנאי הגידול•מותאמת בעצמתה ובביטוי הגנים לעקה הספציפית•מרמזת על המערכות הפיזיולוגיות החיוניות לקיום, כגון:•

)דיכוי של מאות גנים הקשורים ברפליקציה וסינטזת חלבונים(שמירה על אנרגיה –

קיפול חלבונים תקין–הגנה מנזק חמצוני–תיקון דנ“א–

•Cross-Resistance – בתנאי עקה התא מתכונן לעקהכללית

Comprehensive Identification of Cell Cycle–regulated Genes of the Yeast Saccharomyces

cerevisiae by Microarray Hybridization

Paul T. Spellman, Gavin Sherlock, Michael Q. Zhang, Vishwanath R. Iyer, Kirk Anders, Michael B. Eisen, Patrick O. Brown, David Botstein, and Bruce Futcher

מטרות:לזהות ולאפיין גנים המבקרים –

את מחזור התא של השמר או הנמצאים תחת בקרה זו

בשמר ישנם גנים ידועים –רבים המשפיעים על מחזור התא או המבוקרים על ידו, מה שיאפשר קיום ביקורת

לתוצאות שיתקבלו

ביצוע הניסויברצוננו לעקוב אחר ביטוי הגנים בתאים בהתאם •

לשלב בו הם נמצאים במחזור. לשם כך יש צורך לבצע סינכרוניזציה בין תאי התרבית – זאת

נעשה ע"י עצירה זמנית של כל תאי התרבית בשלב מחזור מסוים.

כדי להימנע מתופעות לוואי שעלולות להשפיע • שיטות 3על ביטוי הגנים ננקטו במערך הניסוי

שונות לסינכרוניזציה של התאים. תוצאה נוספת "יובאה" מניסוי אחר שבוצע באותה השנה.

כקבוצת ביקורת בכל אחד משלבי בניסוי •שימשה תרבית שמרים שאינה מסונכרנת.

קבלת תוצאות

לאחר בדיקת דגימות מתאי התרביות בנקודות זמן •~ גנים 6,200 המכילים chipsשונות, בעזרת

, מתקבלות תוצאות במטריצה מתוכה אנו ORFו-רוצים לאתר את הגנים שמתבטאים באופן מחזורי.

לשם כך:• כך שהערך mRNAבוצע נירמול לרמת ההופעה של ה-–

יתאפס.)log)ratioהממוצע של נקבע מדד מיוחד המייצג את מידת המחזוריות שנמדדה –

לגן בהתאמה לזמן מחזור התא

קביעת רמת המחזוריות של גן

לצורך איתור הגנים המחזוריים מתוך כלל הגנום בשמר •כלל המדד:

שימוש בטרנספורם פורייה להערכת המחזוריות של פונקצית –הביטוי של כל גן.

השוואה בין הגנים לביטויים של חמישה גנים ידועים בעלי –הופעה מחזורית ברורה. כ"א מהגנים אופייני לשלב אחר.

במדד זה טמונה הנחה על-פיה גן מחזורי מגיע לשיא •ביטויו פעם בכל מחזור

( עבור כל אחד CDC scoreלאחר חישוב ערך המדד )•מהגנים יש צורך בקביעת הסף להכללה/אי הכללה של

הגן כמחזורי.

קביעת ערך הסףסיווג הגנים המחזוריים בוצע •

תוך כדי :צרוף כמה שיותר גנים –

104הידועים כמחזוריים. )בזמן הניסוי(

הרצון לצרך כמה שפחות גנים –שידועים כלא מחזוריים.

בסופו של דבר ישנה –שרירותיות מסוימת בקביעת זו.

ע"ס חישובים סטאטיסטיים •המתבססים על רנדוניזציות שונות של מטריצת הביטוי ,

3%-10%נצפה לאחוז של false positive.

גן מחזורי - דוגמא

הכללת מידע ממחקרים קודמים

מסודרים לפי זמן הביטוי המקסימאליcell cycle regulatedגנים שסווגו כ-

כתוצאה מאיתור •הגנים וסידורם

זה משויכים:1G ל-300•S ל-71•2G ל-121•M ל-195•G/M ל-113•

clustering לאחר cell cycle regulatedגנים המסווגים כ-

בעקבות מיון זה •נצפה כעת למצוא

קשר הדוק יותר המשקף את

פרופיל הביטוי של כל גן.

נדגים , ואכן•בהמשך כי שיטת

הזו clusteringה-שמה תחת אותו הצבר גנים בעלי

דמיון פונקציונאלי.

Regulation-DNA binding sites או cln3 מהגנים מראים תגובה משמעותית ל-70%כ-•

clb2 )ציקלינים( לקודון ההתחלה upstream הבסיסים 700בחיפוש ב- •

הגנים שאתרנו נמצא שלרוב הגנים ישנה 800של התאמה גבוהה לפקטורי שעתוק מוכרים בהתאמה

לזמן המופע המקסימאלי. בנוסף, נמצא כי עצם קיום הרצף לפני הגן ואף מיקומו •

יכולים להוות ניבוי טוב לקבוצה AUGיחסית לקודון אליה הוא משתייך.

שכיחויות אתרי קשירה לפי פאקטורי שעתוק מוכרים

גנים שידוע כי ביטויים אינו מחזוריC-279קבוצה • מייצג את מרחק האתר שנמצא מקודון ההתחלה.Xציר ה-••N ; בסיס כלשהו-Y-C/T ; W-A/T ; R-A/G ; M-A/C

רצף בקרה משולב

35 בן clusterבדוגמא לעיל , זיהו בעקבות התהוות ה-•הגנים. רצף קונצנסוס משוער שמשלב שני רצפים של

אלמנטי-בקרה שנחשבו, עד כה , נפרדים. •Cluster , 2 זהCLB כולל בעיקר גנים המעורבים ,

במיטוזה.

)דוגמאות(clusteringאפיון לצברים שנוצרו כתוצאה מה-

•1G–2СLN:

. 1G. שיא הביטוי באמצע DNA גנים, רבים מהם מעורבים בשכפול 76 בקבוצה •

)התאמה מושלמת ACGCGT מהם יש לפחות עותק אחד של הרצף 58%ב-• בקבוצת הביקורת(6% מול MBCלאלמנט

)רצף מנוון לאלמנט CRCGAA מהם יש לפחות עותק אחד של הרצף 52%ב-•SCB בקבוצת הביקורת(13% מול

נמצאו מוטיבים מוכרים נוספים ואותר אחד חדש.•

•S+M–Histones

גנים בעלי התאמה 9. מדובר בצבר קטן של Sבאים לביטוי בייחוד בשלב ה-•גבוהה במיוחד בין אופי ביטויים. הפער בין נק' המקסימום למינימום גבוה מאוד.

' 3אלמנטי בקרה שלילית, אלמנט באיזור ה- גנים אלו מבוקרים בכמה רמות:•, אלמנטי בקרה חיוביים.S למעט בשלב ה-mRNAשמפחית את יציבות ה-

M וה-Sצברים שזוהו כשייכים לשלבי ה-

•Aהיסטונים - •B - MET •C - 2CLB

מבט כללי בתבנית ביטוי הגנים בהתאם לתפקידם:

גנים רבים מגיעים לביטוים ממש לפני השלב בו הם •נדרשים. תופעה זו בולטת בייחוד בגנים הדרושים

.DNA, ותיקון replicationל-בגנים כדוגמת ההיסטונים, רואים שהביטוי •

המקסימאלי מתרחש בשלב עצמו.במקרים אחרים, כדוגמת תחילת השכפול, רק הטריגר •

הדרוש לתהליך מופיע בנק' הזמן המתאימה.

שיוך גנים לפי פונקציה ושלב ההופעה

שיוך גנים לפי פונקציה ושלב ההופעה

אמינות התוצאות

המאמר בו אנו עוסקים הוא אחד מהראשונים שעסקו • לגנים מחזוריים וככזה, נבחנה במיוחד clusteringב-

אמינות התוצאות שהתקבלו.זיהוי הגנים כמחזוריים נעשה, בסופו של דבר, ע"י •

קביעת סף שרירותית. ובבדיקה ביחס לגנים שהיו לא 104 מתוך 9ידועים מראש כמחזוריים נמצא כי

נכללו ברשימה. אחר שנערך ()1998( .Cho et alבהשוואה למחקר דומה )•

, microarraysבמקביל וכלל ג"כ תוצאות של קריאת נעשתה עבודת איתור הגנים המחזוריים באופן ידני. בהשוואת התוצאות של שני המחקרים נתגלה חוסר

חפיפה מסוים :

גנים מחזוריים )בהשוואה 421 זיהה choהמחקר של • 304 במחקר זה( ובהשוואה בין הקבוצות רק 800ל-

סומנו בשני המחקרים.כמה הסברים אפשריים לתוצאות אלו:•

.הגדרת גן מחזורי אינה הגדרה חד-משמעית–

–“noise” בחלק מהתוצאות יכול להסביר תוצאות שגויות (.false positive & negativeבשני הכיוונים )

נעשה שימוש במעכב אחד בעוד choבמחקר שנערך ע"י – מספר תוצאות spellmanשבפרוש רואים במחקר של

שנתגלו במעכב אחד אך לא באחר.

במציאת הגנים המחזוריים הונח מראש כי גן בעל בקרה –מחזורית מגיע לשיא ביטויו רק פעם במחזור- הנחה שאינה,

בהכרח, נכונה.

האלגוריתם שנבחר למציאת המחזוריות אינו האופטימלי. –

בבחינת רצפי הבקרה, הצליחו החוקרים לזהות , אלמנטי • גנים. 500בקרה המשוייכים לגנים מבוקרים מחזורית בכ-

גנים נוספים מבלי שזוהה האלמנט 300דבר המשאיר כ- המבקר אותם. מספר סיבות אפשריות לכך:

מספר אלמנטי בקרה שעדיין לא זוהו.–

~ גנים מאופיינת ברמת מחזוריות נמוכה 300קבוצה זו של –יחסית ליתר. ייתכן שאלמנטי הבקרה בקבוצה זו מנוונים.

ייתכן שבמקרים אלו הבקרה ברמה אחרת – לדוגמא יציבות –. mRNAה-

Cell Cycle Regulatedסיכום Genes

גנים המבוקרים בתיאום עם מחזור התא800נמצאו •

נמצאו צברים פונקציונלים של גנים המעורבים במחזור התא•היסטונים––CLN2–MET

צברים רבים נמצאו תחת השפעה של אלמנטי בקרה ידועים•

התקבל מידע על זמני ההפעלה הספציפיים של רצפי הבקרה•

נמצא רצף בקרה משולב חדש•

נקבע פרופיל הביטוי של קבוצות גנים רבים לאורך מחזור •התא

?clusteringאז מה ניתן ללמוד מ-השיטה מאפשרת•

עיבוד נתונים מהיר בקנה מידה נרחב–

הסקת מסקנות בעלות משמעות ביולוגית–

הצגת המסקנות בצורה ויזואלית נוחה–

מה סוג המסקנות שניתן להסיק?•פרופיל ביטוי דומה מרמז על נוכחות בקרה משותפת–

ניתן לאפיין גנים לא ידועים הנמצאים בצברים מאופיינים היטב–

ניתן ללמוד על ה"התנהגות" הפיסיולוגית הכללית של התא –מפרופילי הביטוי של קבוצות פונקציונליות ידועות

ניתן ללמוד על אופי ההשפעה או הנזק שנגרם לתא על סמך –צברי הגנים שהופעלו בו כתגובה