GENETIĈKI

INŽENJERING

REKOMBINANTNA

DNK

TEHNOLOGIJA

Genetiĉki inženjering

Veštaĉko (manipulativno) prenošenje stranih

gena u postojeće genome ćelija.

Stvaraju se novi genotipovi ćelija , sposobni za

samostalnu reprodukciju.

Poĉetak 1973.godine

Kombinovanje raznih i sistematski vrlo

udaljenih organizama

– Geni ĉoveka → genom bakterije

Insulin

Hormoni rasta

Interferon

– Geni biljaka → genom bakterije

– Geni životinja → genom bakterije

– Geni bakterija → genom eukariota

1982. godine kompanija Eli Lilly

Odobrenje za prodaju insulina za ljudsku

upotrebu, dobijenog genetiĉkim inženjeringom

Zašto mikroorganizmi?

Jednostavni

Laki za manipulaciju

Brzo se razmnožavaju

Koriste jednostavne hranljive podloge

Primena

Mikrobiološke fermentacije: antibiotici, vitamin C

Vakcine: virus slinavke i šapa, hepatitis B, AIDS (?)

U poljoprivredi:

– genetski modifikovani organizmi (GMO)

– Rekombinantni mikroorganizmi

Zaštita voća od mraza – Pseudomonas syringae

Insekticid – Bacillus thuringiensis

– Transgene biljke – biljke sa uspešno ugraĊenim stranim

genom

Transgene biljke

Otpornost prema biljnim parazitima: bundeva

Otpornost prema štetnim insektima: krompir,

kukuruz, pamuk

Tolerantnost prema herbicidima: kukuruz, soja

Modifikacija u sastavu proteina, masnih

kiselina, ugljenih hidrata

Poboljšanje kvaliteta biljnih proizvoda

Transgene životinje

I dalja primena

Zaštita životne sredine

– Biodegradacija razliĉitih zagaĊivaĉa

– Toksiĉni otpad

– Otpadne vode

Regulacija gena i genetiĉka terapija

– Leĉenje genetskih oboljenja

Metode rekombinantne DNK tehnologije

Transfer DNK od jednog organizma u drugi

1. Klonirajući vektor i domaćin

2. Konstrukcija rekombinantnog plazmida

Karakteristike klonirajućih vektora

Moraju biti sposobni za nošenje dela DNK donora

Mora ih lako usvojiti klonirani domaćin

PLAZMIDI

– mali, dobro karakterisani,

– laki za manipulaciju i

– mogu biti prenešeni u odgovarajućeg domaćina transformacijom

BAKTERIOFAGI

– imaju prirodnu sposobnost da ubace svoju DNK u bakteriju domaćina transdukcijom

Osnovne procedure genetiĉkog inženjeringa

1. DNK koja sadrži odreĊen, specifiĉan gen

2. Plazmidna DNK

3. Tretiranje enzimom – restriktivna endonukleaza

4. Modifikovan plazmid – rekombinantni plazmid

5. Transformacija

6. Identifikacija kolonije bakterija sa modifikovanim plazmidom

7. Bakterije dobijene GI se umnožavaju u velikom broju, i proizvod kodiran prenešenim genom se izdvaja iz kulture i preĉišćava

1. DNK koja sadrži odreĊen specifiĉan gen

Dobija se iz organizma donora

Može biti sintetisana iz nukleotida

2. Izolacija plazmidne DNK

Služi kao nosaĉ odreĊenog gena

Odvajanje od ćelije i hromozomalne DNK

Centrifugiranje u razliĉitom gradijentu gustine

sa cezijum hloridom i etidijum bromidom

3. Tretiranje enzimom –

restriktivna endonukleaza

Prisutna u gotovo svim mikroorganizmima

Vrše identifikaciju i uništavanje “strane DNK”

Ćelija markira sopstvenu DNK metil (-CH3) grupom

Proces dodavanja metil grupe – DNK modifikacija

DNK donora i plazmidna DNK se tretiraju istim

enzimom

Seĉe DNK stvarajući komplementarne jednostruke

krajeve “lepljivi krajevi” (“sticky ends”)

4. Konstrukcija rekombinantnog plazmida

Lepljivi krajevi fragmenta DNK donora

spajaju se sa lepljivim krajevima plazmidne

DNK obrazujući rekombinantni, modifikovani

plazmid koji nosi fragment DNK donora.

Enzim ligaza ponovo uspostavlja veze fosfat-

šećer koje su prekinute endonukleazama

Prvi rekombinantni plazmid – rezistentnost na

dva antibiotika (1973. god)

Teorijski: bilo koja dva molekula DNK,

razliĉitih vrsta, mogu da se spoje.

Gen iz južnoafriĉke žabe ubaĉen u plazmidnu

DNK bakterije.

Pitanje: iskazivanje (ekspresija) gena kod

bakterija

DNK eukariotskih ćelija: introni i egzoni

Bakterije ne vrše uklanjanje introna prilikom

transkripcije iRNK

Rešenje: Izolacija iRNK umesto DNK iz

eukariotske ćelije

iRNK se koristi kao matrica za sintezu

komplementarne DNK (kDNK) koja može biti

ubaĉena u plazmid

Enzim: reversna transkriptaza (RNK-directed

DNK-polimeraza)

5. Unošenje rekombinantnog plazmida u

bakteriju recipijenata

Transformacija

CaCl2 transformaciona procedura

– Tretiranje ćelija recipijenta sa CaCl2 na niskim

temperaturama (0-4C za E. coli)

– Dodavanje plazmidne DNK

– Zagrevanje ćelije recipijenta (do 42C za E. coli)

Elektroporacija – tretman kratkim

elektropulsevima

6. Identifikacija bakterija koje su primile

plazmid

Upotreba antibiotika

Umnožavanje rekombinantnog plazmida

Kada je rekombinantni plazmid uspešno

ubaĉen u bakterijsku ćeliju, ona može da stvara

veliku populaciju identiĉnih ćelija –

KLONOVA u kojima su novi geni prisutni u

svakoj ćeliji

Novi gen je ušao u nasleĊe – KLONIRANI

GEN

Identifikacija bakterija koje iskazuju novi gen

Koja bakterija sadrži pravilno konstruisan

rekombinantni plazmid sa kloniranim genom?

Bakterija koja stvara proizvod koji kodira gen

Problemi u kloniranju gena

1. Restriktivne endonukleaze mogu iseći i

uništiti gen koji treba klonirati. Više od

jednog gena povezano u ekspresiji odreĊene

karakteristike.

2. Gen donora nepravilno ubaĉen u plazmidni

vektor. Bakterija ne može da iskaže gen, ne

prepoznaje start i stop signale.

I dalje problemi

3. Protein – proizvod unutar ćelije u velikim,

nerastvorljivim agregatima. Izolacija proteina

neće dati odgovarajući proizvod.

4. Može se stvarati previše produkta – letalan

za bakterijsku ćeliju (primer: geni za sintezu

fenilalanina – aminokiselina koja se koristi u

stvaranju aspartama, veštaĉki zaslaĊivaĉ

Problemima nikad kraja

5. Proizvod može biti uništen nakon sinteze.

Bakterije imaju sisteme za otkrivanje i

uništavanje stranih proteina ukoliko se jave u

ćeliji

6. Nestabilnost plazmida. Ne nasleĊuje svaka

ćelija ćerka plazmidni vektor za vreme deobe

ćelija.

I sad KRAJ

7. Ekstrakcija i preĉišćavanje proizvoda

Gram (-) bakterije (E.coli) ne izdvajaju proteine u spoljašnju sredinu; neophodno da se unište bakterijske ćelije.

Gram (+) bakterije (Bacillus subtilis) izdvajaju proteine, ali stvaraju i proteolitiĉke enzime koji uništavaju proizvod

Kvaci nemaju spoljašnju membranu i obiĉno ne stvaraju protelitiĉke enzime (geni za bakterijsku celulazu klonirani u ćelijama kvasca)