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GENÉTICA

MOLECULAR.

APUNTES DE TEORÍA. TODOS LOS GRADOS.

CARLOS FERNÁNDEZ RIVERA

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ÍNDICE. BLOC I. ESTRUCTURA I REPLICACIÓ DEL MATERIAL GENÈTIC TEMA 1. LA INFORMACIÓ GENÈTICA: NIVELLS D’ESTUDI I ORGANITZACIÓ - Introducció a la genètica.

• Genotip i fenotip • Àrees d’estudi

- Genètica Molecular - Genoma: Genomes de DNA, d’RNA, nuclears i d’orgànuls - Nivells d’organització i informació genètica: Virus/Cèl·lula procariota / eucariota - Haploïdia i diploïdia - Organismes models TEMA 2. ORGANITZACIÓ DEL DNA EN CROMATINA I EN CROMOSOMES - Model de la doble hèlix de Watson i Crick - Cèl·lula eucariota i nivells d’organització del DNA

• Nucleosomes, histones • Fibra d’11 nanòmetres • Fibres de 30 i 300 nanòmetres • Cromosoma metafàsic

- Telòmers, centròmers, braços i cromàtides d’un cromosoma - Cromosomes, cromàtides i cadenes de DNA en les fases del cicle cel·lular TEMA 3.LA REPLICACIÓ DEL DNA: INICIACIÓ I PROTEÏNES IMPLICADES - Orígens de replicació

• Orígens de replicació procariotes • Orígens de replicació eucariotes

- Inici de la replicació: el primosoma - Les DNA-polimerases procariotes i eucariotes TEMA 4. LA REPLICACIÓ DEL DNA: MECANISME D’ELONGACIÓ - El replisoma:

• La forqueta de replicació (en relació amb la bombolla) • L’elongació: cadenes líder i retardada • Els fragments d’Okazaki i el seu processament

BLOC II. MUTACIÓ I REPARACIÓ DEL DNA TEMA 5. MUTACIONS, LESIONS I AGENTS MUTAGÈNICS - Mutacions espontànies i induïdes - Tipus de mutacions puntuals

• SNP (transicions/transversions) • Indels (insercions/delecions) • Seqüències repetides en tàndem

- Efectes genètics de les mutacions puntuals - Agents mutagènics

• Físics (radiacions) • Químics (agents alquilants, oxidants, etc.)

TEMA 6. MECANISMES DE REPARACIÓ I - Reparació directa

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- Reparació d’aparellaments erronis (MMR) - Síntesi translesió i polimerases amb tendència a error - Malalties genètiques degudes a mutacions en gens MMR TEMA 7. MECANISMES DE REPARACIÓ II - Reparació per escissió de bases (BER) - Reparació per escissió de nucleòtids (NER)

• Reparació global del genoma (GGR) • Reparació preferent acoblada a la transcripció (TCR)

- Malalties genètiques degudes a mutacions en gens BER i NER BLOC III. RECOMBINACIÓ I TRANSPOSICIÓ TEMA 8. RECOMBINACIÓ HOMÒLOGA I MODELS - Recombinació homòloga - Model de Holliday

• Aspectes verificats • Aspectes erronis

- Creu de Holliday i formació d’heterodúplexs - Generació de cromosomes recombinants TEMA 9. MECANISME ENZIMÀTIC DE LA RECOMBINACIÓ - Inici de la recombinació

• Procariotes (RecBCD) • Eucariotes (Spo11)

- RecA, nucleofilament i invasió de cadenes - Progressió de la branca i resolució (RuvABC) - Model del trencament de doble cadena (DSB) TEMA 10. ELEMENTS GENÈTICS TRANSPONIBLES: TRANSPOSONS DE DNA. - Seqüències d’inserció (IS) - Transposons compostos - Mecanismes de transposició

• Replicatiu • No replicatiu

- Efectes genètics dels transposons sobre l’hoste - Regulació dels nivells de transposició TEMA 11. RETROTRANSPOSONS SEMBLANTS-A-RETROVIRUS. - Estructura dels retrotransposons semblants-a-retrovirus - El mecanisme de la seva transposició - Comparació dels cicles de retrovirus i retrotransposons semblants-a-retrovirus - Exemples en genomes animals i vegetals TEMA 12. RETROTRANSPOSONS NO-SEMBLANTS-A-RETROVIRUS. - Estructura dels retrotransposons no-semblants-a-retrovirus - El mecanisme de la seva transposició - Elements LINE i la seva importància en genomes de mamífers - Retrogens i Pseudogens processats - Retrogens de mRNAs i retrogens d’altres transcrits - Elements SINE en els genomes de mamífers

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- Conseqüències de la presència de transposons en els cromosomes d’eucariotes superiors BLOC IV : TRANSCRIPCIÓ I LA SEVA REGULACIÓ A PROCARIOTES TEMA 13. CONCEPTES GENERALS SOBRE L’EXPRESSIÓ GÈNICA. - El fluxe de la informació genètica des del genoma a les proteïnes - La síntesi del RNA

• Característiques i requisits. • Similituds i diferències amb la síntesi del DNA • Similituds i diferències del procés en cèl·lules procariotes i eucariotes

- Complexitat de l’expressió gènica en eucariotes TEMA 14. TRANSCRIPCIÓ A PROCARIOTES. - Iniciació de la transcripció a procariotes - Promotor procariota: regions -35 i -10 - Holoenzim de la RNA polimerasa procariota

• Subunitats α, β, β ’ i ω • La subunitat σ

- Elongació - Terminació: mecanisme intrínsec i mecanisme depenent de rho TEMA 15. REGULACIÓ DE L’EXPRESSIÓ GÈNICA A PROCARIOTES - Interruptors genètics

• Proteïnes activadores i repressores de la transcripció • Dominis d’unió al DNA i centre al·lostèric • Efectors al·lostèrics

- L’operó lac • Gens estructurals que codifiquen enzims per a la utilització de la lactosa • Components reguladors: el repressor, el promotor i l’operador • Activitat de l’operó en presència i absència de lactosa: control negatiu • Regulació per glucosa: control positiu • La proteïna CAP i l’AMPc

- Regulació de l’expressió gènica de λ • El cicle de λ • Els gens primerencs immediats N i Cro • El repressor cI • Control de l’expressió en lisogènia • Control de l’expressió en lisi • Esquema general de la regulació

BLOC V : TRANSCRIPCIÓ ALS EUCARIOTES TEMA 16. MAQUINÀRIA TRANSCRIPCIONAL ALS EUCARIOTES. - Multiplicitat de les RNA polimerases eucariotes

• Estructura i característiques de les RNA polimerases nuclears • RNA polimerases d’orgànuls

- Tipus de gens eucariotes: de classe I, II i III • Gens de classe I

o Estructura o Promotors o Factors de transcripció de la RNA pol I

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o Processament dels pre-rRNAs • Gens de classe II

o Estructura dels promotors o Nucli del promotor (core promoter) i promotor regulador o Concepte de promotor genèric o basal

• Gens de classe III o Tipus de promotors: promotors interns o Factors de transcripció de la RNA polimerasa III

TEMA 17. CARACTERÍSTIQUES I TRANSCRIPCIÓ DELS GENS EUCARIOTES DE CLASSE II. - Característiques generals dels gens de classe II

• Estructura dels promotors • Factors generals o basals de la RNA pol II (TFIIA, B, …)

- Procés de transcripció • Aparell de transcripció basal • Pas de l’iniciació del pre-mRNAs a l’allargament • Modificacions o processament del transcrit primari • Procés d’encaputxament(capping) en l’extrem 5’ • Mecanisme de tall i poliadenilació • Acabament de la transcripció en els gens de classe II

TEMA 18. PROCÉS D’SPLICING DE L’RNA PRECURSOR. - Mecanismes d’splicing - Processament dels t-RNAs - Processament dels introns del pre-mRNA

• Senyals d’splicing • Llocs donadors i acceptors d’splicing • Lloc o punt de ramificació • Reaccions implicades en l’splicing • Reconeixement de les seqüències conservades • Ribonucleoproteïnes nuclears petites (snRNPs, snurps). • Formació de l’spliceosoma • Centre catalític • Comparació amb els introns del grup II

TEMA 19. SPLICING ALTERNATIU. - Concepte de processament i d’splicing alternatiu - Mecanisme

• Intensificadors i silenciadors d’splicing • Proteïnes SR

- Exemples • El gen de la calcitonina • Determinació del sexe a Drosophila

BLOC VI: REGULACIÓ DE LA TRANSCRIPCIÓ A EUCARIOTES TEMA 20. PROMOTORS, ENHANCERS I FACTORS DE TRANSCRIPCIÓ - Estructura dels promotors eucariotes i altres regions reguladores:

• El nucli o core del promotor • El promor regulador • Elements intensificadors o enhancers.

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• Aïlladors o insulators. - Factors de transcripció:

• Factors constitutius versus factors de regulació. • Activadors i coactivadors. • Estructura dels factors de transcripció: dominis d’unió al DNA i dominis • activador.

TEMA 21. REGULACIÓ DE LA TRANSCRIPCIÓ - Factors de transcripció/activadors induïbles

• Tipus de factors de transcripció • Mecanismes de control de l’activitat

- Regulació gènica en resposta al AMPc • Activació de la resposta a AMPc • Factors activadors CREM i CREB i repressors ICER • Elements de resposta al AMPc (CRE) en els gens cAI

- Regulació dels gens de resposta al xoc tèrmic • Activació de la resposta del xoc tèrmic • Factor del xoc tèrmic HSF • Activació del HSF

- Regulació gènica en resposta a esteroides • Estructura dels receptors d’esteroides • Elements de resposta a glucocorticoides (GRE) • Receptors de glucocorticoides i remodelatge de cromatina • Activació i repressió dels receptors de glucocorticoides per interacció amb altres

factors de transcripció TEMA 22. EPIGENÈTICA - Regulació de la transcripció per modificacions de la cromatina - Hipersensibilitat a la DNasa I - Modificació d’histones

• Metilació i acetilació • La modificació H3K4me3 com a exemple

- Remodelatge de la cromatina - Metilació del DNA

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I. ESTRUCTURA I REPLICACIÓ DEL MATERIAL GENÈTIC

TEMA 1. LA INFORMACIÓ GENÈTICA: NIVELLS D’ESTUDI I ORGANITZACIÓ

La genética estudia la variabilidad que se hereda. Se basa en el estudio del DNA como material hereditario. El DNA se encuentra en todos los seres vivos: bacterias, virus, plantas, animales… Los genes son secuencias en el DNA que se transcriben a RNA, y controlan los caracteres de un individuo. En muchos casos pero no en todos el RNA se traduce a proteína. Conceptos:

- Genoma: conjunto de genes del organismo (nucleares y mitocondriales y/o cloroplastídicos).

- Genotipo: genes que determinan un carácter. - Fenotipo: manifestación de un genotipo. Está influido por el ambiente. Los genes

pueden mutar (cambiar) y afectar de forma diferencial al genotipo.

Cada gen puede estar en distintas formas: alelos. Son secuencias de DNA con pequeñas diferencias entre ellas. Se originan por mutación. En general, los organismos más desarrollados tienen 2 alelos para cada gen (cada alelo está en un cromosoma homólogo). Los alelos pueden ser:

- Normales (salvajes = wildtype) ó mutantes. - Recesivos (debe haber 2 alelos iguales para que se manifieste un fenotipo) ó

dominantes (basta una copia para manifestar un fenotipo). Una de las causas que determina que un alelo sea dominante o recesivo es la afinidad de la RNA polimerasa por la secuencia de nucleótidos del promotor: si es alta será dominante; si es baja será recesivo.

Para los alelos de un gen, un individuo será:

- Homocigoto: dos alelos iguales (ambos dominantes o recesivos). - Heterocigoto: dos alelos diferentes para un gen.

Desde la publicación de los trabajos de Mendel (1865), la genética sigue desarrollándose. Áreas de la genética:

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TEMA 2. ORGANITZACIÓ DEL DNA EN CROMATINA I EN CROMOSOMES El DNA es ácido desoxiribonucleico. Está formado por desoxiribonucleótidos trifosfato (dNTP). Un dNTP está compuesto por:

- Una pentosa: desoxiribosa para el DNA. No tiene grupo –OH en el C2 (es más estable y menos reactiva). Si en lugr de desoxiribosa fuese ribosa, tendría un grupo –OH en el C2, y sería la pentosa de los ribonucleótidos del RNA.

- 3 grupos fosfato (trifosfato) orientados al exterior, lo que determina que tenga carga negativa en disolución, por lo que el DNA es ácido.

- Base nitrogenada: púrica (adenina-A ó guanina-G) ó pirimidínica (citosina-C ó timina-T). En el RNA hay uracilo-U en lugar de T. Siempre, la (A) se une a la (T) por un doble enlace de hidrógeno y la (G) a la (C) por un triple enlace.

(imagen)

Enlaces destacados en el DNA:

- Fosfodiéster: une los nucleótidos contiguamente (a lo largo), mediante este enlace entre los extremos 5’-P y 3’-OH de dos nt contiguos. Así se forma una cadena simple de DNA, con su extremo 5’-P y 3’OH en cada punta.

- Hidrógeno: una base nitrogenada se une a su complementaria por enlaces de H entre átomos concretos. Es un proceso espontáneo que no requiere actividad enzimática, sólo complementariedad. Estos enlaces pueden romperse con calor, lo que produciría la separación de las dos cadenas de DNA (desnaturalización).

- N-glicosídico: une la pentosa a la base nitrogenada.

(imagen) Una cadena de nucleótidos puede unirse (hibridarse) a otra cadana antiparalela mediante enlaces de H, siempre y cuando las bases nitrogenadas sean complementarias. Puede separarse de ella (desnaturalizar el DNA) si se rompen los enlaces de H entre las bases complementarias (2 cadenas complementarias unidas = 1 helice de DNA bicatenario). El diámetro de la doble hélice son 2nm, enrollados dextrógiramente (hacia la derecha). En cada vuelta completa, que mide 3’4nm, hay 10 pares de bases. Chargraff encontró una norma de proporcionalidad en las bases: dado que A se une siempre a T; y G se une siempre a C, resulta que a nivel de toda la doble hélice (en un dsDNA) el contenido de purinas es el mismo que el de pirimidinas:

(A+G) / (C+T) = 1 Aparte, existe el coeficiente de asimetría: calcula cómo de rica en (A-T) ó (C-G) es una cadena. Varía según la especie. Un valor elevado indica que hay pocas uniones GC y por tanto necesitaremos menos energía para separar las dos cadenas; valores pequeños indican lo contrario. Un valor = 1 indica que hay la misma proporción de dobles que de triples enlaces en la molécula.

(A+T) / (G+C) = C. asimetría.

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TEMA 3.LA REPLICACIÓ DEL DNA: INICIACIÓ I PROTEÏNES IMPLICADES Replicar el DNA es sintetizar una nueva molécula de DNA igual que la original. Características generales del proceso:

- La replicación es semiconservativa: a partir de una cadena vieja, se sintetiza la cadena nueva complementaria para formar la doble hélice (seminario).

- Está catalizada por un enzima llamado DNA Polimerasa. El sustrato del enzima es un extremo de DNA (primer o cebador), que debe ser sintetizado por otro enzima.

- La incorporación de nucleótidos (dNTP) a la nueva molécula de DNA se realiza siempre en sentido 5’ à 3’. Es universal, no existe excepción. Los nucleótidos (dNTP) que se incorporan han perdido 2 de los 3 fosfatos que llevan: sólo queda el primer fosfato del nucleótido (αP) cuando éste se une a la nueva cadena.

En Procatiotas, la replicación se da mediante un único replicón: toda la longitud de un DNA que se replica a partir de un único origen de replicación, por eso en Procariotas es una replicación simple.

(imagen) La principal diferencia en Eucariotas es que se replican por replicones múltiples: hay muchos inicios de replicación sobre un cromosoma, pero no todos se usan (algunos quedan como crípticos). Un origen de replicación nunca puede ocupar nada que tenga que ver con la transcripción: ni la región reguladora ni codificante. Por eso, los orígenes de replicación siempre están en lugares no codificantes.

- Un tamaño pequeño del genoma indica muchas secuencias codificantes, muy juntas y por tanto pocos orígenes, cuyos replicones serán grandes.

- Un genoma grande indica principalmente muchas secuencias no codificantes, por tanto hay más replicones que tendrán menor longitud.

También en Eucariotas existe relación entre el número de orígenes de replicación activos en un cromosoma, que varía según la necesidad de replicación más o menos rápida del DNA. Esto depende de la tasa de división celular, de for que si ésta es relativamente baja, muchos orígenes se mantienen crípticos. Todos los cromosomas de la célula Eucariota son lineales y están en el núcleo. Cada origen de replicación también es bidireccional. La replicación se prepara a lo largo de la vida de la célula (se preparan los enzimas de la replicación sobre el DNA) pero se mantienen basalmente reprimidos hasta que llega la señal que inicnia la replicación: se activan todos los replicones a la vez (excepto los crípticos) cuando se fosforilan las proteínas que estaban unidas al DNA bloqueando la replicación, inhibiéndolas. Así la síntesis de DNA es un proceso muy sincronizado. La síntesis de DNA siempre es semiconservativa catalizada por las DNA Polimerasas, que dependen de un molde de DNA que contiene la información original. Necesitan un extremo 3’OH libre a partir del cual empezar a elongar en 5’à3’. También necesita cationes divalentes y dNTP (cuando entran en el DNA, pierden el P en β-γ, quedando el P en α unido al DNA). El cromosoma bacteriano es circular de doble cadena, por lo que en una burbuja de replicación hay 2 horquillas, cada una de las cuales avanza en la dirección contraria a la otra (pero siempre en sentido 5’à3’).

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TEMA 4. LA REPLICACIÓ DEL DNA: MECANISME D’ELONGACIÓ La elongación: recordemos que 1 burbuja tiene 2 horquillas de replicación. La replicación es bidireccional, a partir de un único OriC. El DNA siempre se sintetiza en 5’à3’. Un fragmento de Okazaki (F.O.) tiene el primer de RNA + segmento de DNA elongado por la DNA Polimerasa III. Los primers son de unos 10-15nt, sin diana definida, pero suele empezar por 5’-AG. La cadena leading necesita un único primer, pero la cadena lagging necesita un primer por cada F.O. (por tanto tiene varios fragmentos de RNA hasta que son convertidos a DNA). En la lagging, DNA-G va entrando y saliendo de la burbuja ya que al sintetizar el primer salta enseguida porque es poco procesiva (añade pocos nt antes de separarse). Se activa al tocar a la helicasa (la helicasa toca a la DNA Polimerasa, la primasa no) y salta al acabar de sintetizar el primer: se produce un treadmilling (intercambio rotatorio). El 1er primer es el de la cadena leading. El de la lagging se hace cuando la horquilla de replicación se ha abierto un poco.

(imagen) El replisoma es el conjunto de todos los enzimas funcionando que intervienen en la replicación. Siempre se forma un loop en la cadena lagging para acompasar síntesis de DNA con la cadena leading. A la lagging (ssDNA) se une un gran número de monómeros (elevada [ ]) de SSBP. La DNA-G puede sintetizar un primer bastante más adelante del punto donde está replicando la DNA polimerasa, el cual queda a la espera de ser elongado. Realmente, es el DNA que se mueve dentro de la Polimerasa y la helicasa, no al revés. Son como dos cuerdas que se estira cada una por el lado opuesto. Para poder acompasar el ritmo, la cadena lagging va formando bucles. El primer de RNA es elongado por la DNA Polimerasa III, y a continuación entra la DNA Polimerasa I en el complejo para revisar la cadena recién sintetizada. Recordemos sus actividades:

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II. MUTACIÓ I REPARACIÓ DEL DNA.

TEMA 5. MUTACIONS, LESIONS I AGENTS MUTAGÈNICS

Las mutaciones son variaciones en la secuencia del DNA. Provocan un cambio en la información genética, pero no afectan a la estructura ni funcionamiento (replicación, transcripción…) del DNA a diferencia de las lesiones que sí afectan, por lo que comprometen la viabilidad celular. La célula tiene mecanismos de reparación para reconocer y corregir mutaciones espontáneas y lesiones.

- Tasa de mutación (µ): ritmo al cual aparecen mutaciones en el DNA. - Frecuencia de mutación: proporción de individuos de una población que poseen

una mutación. Tipos de mutaciones según nivel: puntual o grandes regiones. 1. Puntual: afectan a uno o muy pocos nt.

- Indel: se insertan o delecionan uno o pocos nt. En caso de que la indel afecte a la región codificadora, puede verse afectada la pauta de lectura (pero si cambian 3 (múltiplo) nt, podría no notarse el efecto). Vienen causados por errores en la replicación.

- SNP: Si cambian un nt por otro, es un polimorfismo de un solo nt. Puede darse en una región codificante o no. Si es codificante, según la posición del triplete que afecte la sustitución, puede notarse o no el efecto (la 3ª posición es tambaleante) en la proteína. Y si es no codificante, será un polimorfismo (se explica luego). Tipos:

o (Purina à purina) ó (pirimidina à pirimidina) es una transición. o (Purina ⇄ pirimidina) es una transversión.

Qué sucede antes y después de la replicación con una mutación puntual. Dependiendo de si es transición o transversión; del nt del triplete que se afecte; la cantidad de nt que se añadan o delecionen (y si esto afecta la pauta de lectura) puede darse un cambio en el aminoácido de la proteína. Tipos:

- Cambio sinónimo/silencioso: el nt que muta codifica para el mismo aminoácido - Cambio no sinónimo/substitución: el cambio en el nt afecta al aminoácido

codificado. o Conservativa: distintos aminoácidos pero con la misma carga. o No conservativa: nada que ver uno con otro.

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TEMA 6. MECANISMES DE REPARACIÓ I

Respuesta   Mecanismo   Qué  la  desencadena  

Reversión  del  daño   Reparación  enzimática  (directa)  por  la  fotoliasa,  metiltransferasa  (desalquilante),  etc  

DNA  lesionado  Tolerancia  del  daño  Reparación  por  recombinación  Reparación  por  síntesis  trans-­‐lesión  

Escisión  del  daño  

BER:  Reparación  por  escisión  de  bases    NER:  Reparación  por  escisión  de  nucleótidos    MMR:  Reparación  de  apareamientos  erroneos  producidos  al  replicar  el  DNA  

DNA  mutado  

En E.Coli, la subunidad α de la DNA Polimerasa III incorpora un nucleótido erróneo en frecuencia de 10-5 - 10-6. Si un gen mide 1000pb, esperaríamos encontrar 10-3 muts por gen y por generación. Demasiado alto. Gracias a la actividad proofreading, se reduce en tres órdenes de magnitud hasta 10-9. Además, gracias al resto de sistemas de reparación, la tasa real de mutación en Procariotas se reduce hasta 10-10 muts/gen/generación. Es un valor más tolerable. Reparación directa. Repara el DNA lesionado directamente mediante reacciones químicas. Por ejemplo los dímeros de pirimidinas por el mecanismo de fotoreactivación: 2 pirimidinas contiguas (CC ó TT), que se unen mediante 2 enlaces ciclobutilo, que son transversales a los enlaces de H normales e impiden avanzar a la DNA Polimerasa (por eso actúa antes de la replicación). Se forman debido a la luz UVA (260nm), un agente mutagénico. El enzima que repara éstos enlaces anómalos es la fotoliasa. Es exclusivo de Procariotas. La fotoliasa se activa por luz blanca. Esto se explica teniendo en cuenta que tiene 2 nucleótidos de flavina reducidos (FADH2). Cada uno de ellos, en presencia de luz blanca, cede 2e- (se oxida) a uno de los dos enlaces ciclobutilo, dejando al final a las dos pirimidinas sin ninguna anomalía. Es un mecanismo directo que no tiene homólogo en Eucariota (la fotoliasa es exclusiva de Procariotas). Se ha de unir al lugar con la anomalía, y aunque es un sistema sencillo, no es el principal para reparar bases dañadas. Otros enzimas, como las desalquilantes (metiltransferasas), reparan las bases alquiladas también directamente. Mecanismo MMR (missmatch repair) Procariota. Después de replicar el DNA, detecta y repara apareamientos erróneos de nt que la DNA Polimerasa III ha incorporado y no ha corregido. Es el principal para corregir nt erróneos, no dañados. Las bases no se han apareado bien porque no son complementarios, y se forma una estructura extrusionada en la dóble hélice de DNA. Ésta estructura que sobresale, es detectada por los enzimas reparadores del MMR. Son MutS, MutL y MutH.

- Mut-S: homodímero que contacta con el punto en el DNA que tiene el apareamiento erróneo (estructura extrusionada). Estructura: “manos en pregaria”.

- Mut-L: Homodímero reclutado por Mut-S. Se une a la cadena de DNA que está metilada (antigua), en GATC.

- Mut-H: Endonucleasa reclutada por Mut-S que corta por debajo de Mut-L, en la cadena no metilada.

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TEMA 7. MECANISMES DE REPARACIÓ II Reparación por escisión de bases (base excision repair BER) en Procariotas. Otro sistema que reconoce lesiones (no cambios) en nt. Corta y resintetiza un fragmento de DNA. Actúan enzimas llamados n-glicosilasas ó DNA-glicosilasas. Repara bases dañadas, antes de replicar porque la DNA Polimerasa no puede avanzar ante bases dañadas. No actúa frente a dímeros de pirimidina, sino frente a un solo nt. Excepcionalmente, alguna también actúa frente a apareamientos erróneos (pero no es lo más común).

(imagen) Cortan el enlace n-glicosídico entre la pentosa y la base nitrogenada de un nucleótido. Eliminan la base, y dejan un lugar AP. La más conocida es la n-glicosilasa de Uracilo (aparece en el DNA por desaminación de C metilada). Hay varios tipos, aunque no existe una glicosilasa para cada lesión. A continuación actúa 5’-AP-endonucleasa que corta a 5’ del lugar AP, y luego una fosfodiesterasa (AP-liasa 3’) que elimina el azúcar cortando a 3’ del sitio AP. Se rompen así los dos enlaces fosfodiéster que flanqueaban al nt que tenía la anomalía. Finalmente, actúa la DNA Pol. I y pone el nt que falta. La ligasa une los nicks que puedan quedar. Reparación por escisión de nucleótidos (nucleoitide excision repair NER) en Procariotas. Es el principal mecanismo para reparar bases dañadas (no los cambios de nt). Corta y resintetiza un fragmento de DNA que incluye bases dañadas, antes de replicar para que no haya problemas. También actúa frente a dímeros de pirimidina.

(imagen) Lo realizan los enzimas Uvr-A, B, C y D. La zona con error de apareamiento forman una estructura extrusionada, que es reconocida por un heterotrímero (ααβ): dos monómeros de Uvr-A y un monómero de Uvr-B. ααβ necesita unirse a ATP para poder unirse al DNA. Están constitutivamente revisando el DNA. Una vez unido al DNA, Uvr-B deshace los puentes de H de la región con el error. Ahora saltan los dos monómeros de Uvr-A. Queda Uvr-B unido, que dobla al DNA formando un “codo”. Uvr-B recluta a Uvr-C, la única endonucleasa, que hace dos cortes (nicks) en la cadena con el error: un nick a 8nt en 5’ del error y otro a 4-5nt en 3’ del error. Siempre mantiene las distancias. Entra Uvr-D, que es una helicasa y separa los puentes de H del fragmento con los nicks (en total, 12-13nt que incluyen al error). Éste fragmento se separa, no hay ningún enlace que lo una. El gap que queda es de ssDNA y debe ser rellenado por la DNA Polimerasa que resistetiza el trozo que falta y la ligasa, une. Uvr-B se puede unir al DNA gracias a que detecta la estructura extrusionada que adquiere. Tiene unos AA con secuencias aromáticas laterales que le permiten intercalarse entre las bases del DNA que son erróneas. Así, Uvr-B queda intercalada dentro del DNA para separar los enlaces de H (algunos) estirando, ya que dobla al DNA formando el codo. Se puede incrustar en el DNA gracias a que el punto donde la base se debería unir a la complementaria no hay ningún enlace, porque es una base errónea y Uvr-B tiene sitio para unirse. El sistema NER es mucho más versátil y actúa frente a lesiones causadas por agentes físicos y químicos, por eso es el principal mecanismo. Para poner en marcha el sistema

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III. RECOMBINACIÓ, TRANSPOSICIÓ.

TEMA 8. RECOMBINACIÓ HOMÒLOGA I MODELS

Recombinar es reordenar genes ó marcadores génicos siempre como consecuencia de un intercambio físico. Funcionalmente, consiste en cortar un trozo de DNA y unirlo en un lugar diferente al original. Tipos:

- Artificial: la que provoca la Ingeniería Genética. Aprovecha las propiedades naturales del DNA.

- Natural: homóloga, de sitio específico y transposición. Dos regiones homólogas (que presentan homología) son aquellas que tienen “casi” la misma secuencia de nt, aunque no tienen porqué estar exactamente en la misma posición del genoma.

(imagen) La recombinación homóloga en Procariotas se resuelve mediante la cruz de Holliday, siguiendo el “modelo de Holliday” (1960). Estrictamente no es así, pero permite entender el que se cree que es el verdadero modelo (el de Meselson-Radding). Todos comparten que hay un intermediario común, llamado la cruz de Holliday (que sí existe). Sucede cuando en la bacteria entra DNA por transformación, conjudación, transducción… Consideremos 3 genes. Formación de la cruz de Holliday y resolución:

(imagen) Dos DNA homólogos, en este contexto, son aquellos que comparten la misma región física del genoma de 100nt o más, aunque no tienen el 100% de sus bases iguales. El entrecruzamiento ó recombinación física consiste en que diferentes cadenas de ssDNA se juntan y forman el heterodúplex, no se aparean perfectamente porque la que invade puede tener alelos diferentes (con nt diferentes). Éste problema se solventa con la conversión génica. Se detecta mediante los recombinantes genéticos (1/2 veces), usando genes marcadores. La conversión génica es consecuencia de la recombinación física (entrecruzamiento) que forma regiones heterodúplex. Inmediatamente se da la reparación de los nucleótidos desapareados tras la invasión. El modelo de la cruz de Holliday se puede aplicar a dsDNA circular también. De nuevo, las cadenas deben estar en la misma polaridad (se indica con + ó -). El cointegrante no es el final de la resolución N-S. Tiene secuencias diana de enzimas específicas que son reconocidas por nucleasas. Siempre, los intermediarios requieren una resolución. El cointegrante se resuelve generando dos dsDNA circulares que son recombinantes genéticos:

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TEMA 9. MECANISME ENZIMÀTIC DE LA RECOMBINACIÓ Proceso enzimático de la recombinación homóloga Procariota: sucede, o eso creemos, por el modelo de Meselson-Radding en el que se resuelve la cruz de Holliday que se forma durante el proceso. Las 3 grandes etapas son:

- Iniciación: Se rompe el dsDNA y se generan extremos de ssDNA. Lo hace RecBCD.

- Invasión: Se cambia de cadena, la cadena de ssDNA va a aparearse con la complementaria de la otra molécula de DNA. Lo hace RecA.

- Desplazamiento y Resolución: Migra el branchpoint, gira 180º y se corta. Lo hace RuvABC.

Iniciación. Catalizado por RecBCD. Es un heterotrímero formado por:

- B: tiene diversas actividades (helicasa lenta 3’à5’ y endonucleasa). - C: Función poco clara. ¿Reconoce secuencia χ? - D: helicasa rápida en 5’à3’ críptica.

Se comienza uniendo RecBCD a 1 de los extremos romos de uno de los 2 dsDNA.

(imagen) Actúa RecB como helicasa separando las cadenas y degradándolas hasta que RecC detecta la secuencia χ en la cadena de arriba (se lee en 3’à5’). Es un hot-spot de recombinación. Una vez leída la secuencia χ, se activa la helicasa 5’à3’ rápida de RecD. Se degrada un trocito más de la de abajo, para definir bien el fragmento de ssDNA protuberante con χ en el extremo. RecBCD no se separa aún. Ahora, se unen las SSBP y RecA al ssDNA. En principio, la afinidad de SSBP por el ssDNA es mayor que la de RecA. Cuando RecA se une al ssDNA y toca a RecBCD, su afinidad por el ssDNA se vuelve mucho mayor, y empieza a cargarse sobre el ssDNA en 5’à3’ desplazando a las SSBP. Sólo se carga RecA sobre el fragmento de ssDNA que tiene χ en el extremo, porque es en esa cadena a la que se había unido RecBCD. RecA se unirá siempre al que aporte el ssDNA, tenga el 3’ o el 5’ libre. Invasión. Catalizado por RecA, quien controla el intercambio de pareja. La proteína RecA (p.m. de 38 KDa):

- Se une al ssDNA con mucha afinidad y forma el extremo invasor. - El DNA invasor ha de aportar siempre un 3’OH libre, y “girará” en 3’à5’. - El receptor “girará”, por tanto, en 5’à3’. - Los DNA “giran” porque RecA hace tracción, es lo único que se mueve.

In-vivo, RecA se une al ssDNA formando un nucleofilamento = filamento presináptico. El ssDNA al que se une puede ser un fragmento tal cual de ssDNA, un gap en un dsDNA o un extremo protuberante del dsDNA. Debe haber una homología (con diferencias mínimas) al menos de unos 50nt entre el invasor que incluye el 3’ y el aceptor. Deben ser homólogas para poder unirse posteriormente por complementariedad. RecA se carga sobre el ssDNA, en el centro, polimerizando en 5’à3’ de manera helicoidal, para formar el nucleofilamento. Cada vuelta de RecA son 6 monómeros, y ello ocupa unas 19 bases. También se ha visto que se carga en 3’à5’, pero tan lenta que es

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TEMA 10. ELEMENTS GENÈTICS TRANSPONIBLES: TRANSPOSONS DE DNA.

Un transposón (Tn) es un fragmento de material genético que se mueve en el citoplasma de la célula, sin ningún tipo de restricción. Desde una región donadora del genoma, el fragmento salta de allí gracias a que es cortado por la transposasa (Tnp=Tra). Clases I (DNA) y II (RNA).

(imagen) Los transposones Procariota son siempre de DNA. Tipos:

- Secuencias de inserción (IS). Es lo más simple que transpone. Tiene lo esencial para ello: el gen Tra flanqueado por 2 secuencias repetidas e invertidas (IRS = IR). Flanqueando a un transposón, siempre hay secuencias en repetición directa (DRS = DR) pero no forman parte del propio transposón, sino del genoma del huésped.

(imagen)

- Transposones compuestos: Módulos IS y tipo TnA.

o Módulos IS: consisten en 2 elementos IS idénticos, cada uno de los cuales flanquea una región que tiene resistencia a un antibiótico u otras funciones no relacionadas con la transposición. Por supuesto, tiene flanqueándole las secuencias en DR del genoma del huésped. Ejemplos: Tn5 y Tn10.

o Tipo TnA: codifican para Tra y Res. También tiene las secuencias DR del huésped a los lados. Ejemplo: Tn3.

Cuando un transposón se mueve, genera una repetición de la secuencia diana al integrarse (la DR es del huésped, no del transposón). Esto sucede porque la transposición implica una pequeña síntesis de DNA. Proceso con un IS:

- El propio transposón codifica para la Tra, una endonucleasa heterodimérica formada por una subunidad de unión al DNA y una subunidad catalítica que corta (tanto en Procariotas como en Eucariotas). Corta a ambos lados del transposón (entre la IRS y la DR) y lo escinde de donde está. Ha dejado extremos romos.

(imagen)

- Después, corta al azar una secuencia (por ejemplo, TCGAT) en el genoma del huésped, dejando unos extremos protuberantes. Dentro se pone el transposón, unido únicamente por los “enlaces fosfodiéster” (se basan en ataques nucleofílicos) a esos extremos protuberantes del genoma. Así quedan “gaps” a ambos lados del transposón con ssDNA.

(imagen)

- Viene la DNA polimerasa Procariota y los rellena los dos en 5’à3’. Con ello, se duplica la diana del huésped.

Así se forman las secuencias en repetición directa que flanquean a todos los transposones. Esto corresponde a la transposición no-replicativa, una de las 3 maneras que tienen los transposones de transponer. La diana se duplica siempre, se mueva como se mueva.

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TEMA 11. RETROTRANSPOSONS SEMBLANTS-A-RETROVIRUS. Clase I: Transposones de DNA. En el maíz, lo descubrió Barbara McClintock en los años 50 y nadie se fijó en su trabajo. Causan mutación insercional y fenotipos alterados. Todos, cuando se integran, tienen la diana del huésped repetida en DR. “Als eucariotes hi ha transposons molt similars als elements IS procariòtics, com ara el mariner. I d’altres semblants, però la pauta de lectura presenta l’estructura típica dels gens eucariotes -dividida en exons-, com ara en l’element P de Drosophila o els elements Ac/Ds del blat de moro”. Transponen de forma conservativa (es rara). Clase II: Transposones de RNA. Los transposones que se mueven vía RNA son retrotransposón (=retroposón). Exclusivos de Eucariotas. Se retrotranscriben a DNA y se integra en el DNA del huésped. Tipos de retrotransposones:

- Retrovirus Like: tienen LTR. Son Ty en levadura y Copia en Drosophila. - non-Retrovirus Like: no tienen LTR. Son los LINE y SINE.

Retrovirus like: los retrotransposones son como un retrovirus que ha perdido la capacidad de pasar de una célula a otra, y ha de hacer el ciclo dentro del huésped. Su origen, por tanto, es desconcertante: ¿se trata de un retrovirus que por azar perdió la capacidad de infectar a otras células (env) o bien se trata de un retrotransposón ancestral que ganó la capacidad de infectar a otras células (env) y originó, así, a todos los retrovirus? (seminario). En levadura, los elementos Ty (transposon yeast): son los retrotransposones que primero se descubrieron. Tienen cajas δ en los extremos (~LTR), por lo que se les relaciona filogenéticamente con retrovirus. Elementos Ty integrados: Las cajas δ (~LTR) también se pueden encontrar solas en el genoma, flanqueadas por la DR del huésped. Ésto es debido a que se dan recombinaciones de sitio específico entre las cajas δ para eliminar exceso de Ty. La traducción del mRNA del Ty:

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TEMA 12. RETROTRANSPOSONS NO-SEMBLANTS-A-RETROVIRUS. Non retrovirus-like: no tienen las secuencias LTR en los extremos. Son LINES y SINES. LINE (Long Interspersed Nuclear Element): no se parecen a retrovirus por no tener LTR en los extremos. Se conocen bien en humanos. El primero en ser descubierto fue el LINE1. Hay muchas copias por nº haploide de cromosomas, de 50000 a 100000 copias. Todas ellas presentan diferente longitud:

- Cortas: muchas copias, cortas. Están truncados a 5’. - Largas: pocas copias, ocupan hasta 7kb. Se les considera completos. LINE1.

El extremo 3’ (secuencia de poliadenilación) se mantiene siempre. El LINE1 (completo) es:

(imagen) No hay acuerdo sobre cómo se transcriben los LINES truncados a 5’, ya que no deberían tener promotor. Tampoco está claro de dónde vienen. Se retrotranscriben por el mecanismo TPRT (Target Primed Reverse Transcription): codifica para una RT no homóloga a la de los retrovirus (diferente secuencia de AA, misma función). Componentes del LINE1:

- ORF1 codifica para una proteína llamada ORF1 (P40). Función poco clara. - ORF2 codifica para una proteína llamada ORF2 que tiene 2 dominios:

endonucleasa y RT. Se forma la partícula nucleoproteica en el citosol: ORF2+(2xP40)+mRNA del LINE. Se unen en 3’ del mRNA. Cuando entra en el núcleo, se pierden las dos ORF1. Gracias a ORF2, el mRNA toca al DNA del huésped, en una región rica en T (consideramos que es en la cadena de “abajo”). A ella, la ORF2 le acerca la cola de PolyA del mRNA. Ahora, ORF2 usa su dominio endonucleasa y hace un corte en el extremo izquierdo de la zona con TTTT, dejando un 3’ libre. ORF2 usa entonces su dominio RT aprovechando ese 3’OH libre para elongar el cDNA. El sustrato es el RNA enganchado con sus A a la zona de T. La RT sintetiza la primera cadena del cDNA en 5’à3’ aprovechando ese 3’ libre del nick. Usa la actividad RN’asaH para degradar el molde de RNA y sintetiza la segunda cadena del cDNA. Queda un dsDNA “colgando”, el cual se integra bien en el lugar donde está. Hay reparación de los posibles daños. En el momento de integrarse éste cDNA que “cuelga”, se produce un corte en el DNA del huésped que deja extremos protuberantes (pasa lo que indica el dibujo, ataque nucleofílico, entre los cuales se une el cDNA que “cuelga”. Por eso hay la DR que flanquea al LINE, como siempre, y siempre se repara. El TPRT es un mecanismo poco conocido.

(imagen) El retrotránscrito es un cDNA porque no tiene intrones (viene de mRNA procesado), no tiene promotor (el promotor nunca se transcribe) y tiene cola de polyA. Debido a que la RT es poco procesiva, añade pocos ribonucleótidos y se desengancha con facilidad del molde de RNA. Ello ocasiona que se separe antes de hora, y no llegue a

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IV. TRANSCRIPCIÓ I LA SEVA REGULACIÓ A PROCARIOTES.

TEMA 13. CONCEPTES GENERALS SOBRE L’EXPRESSIÓ GÈNICA.

El DNA se expresa mediante la síntesis de RNA. Cada molécula de RNA corresponde a una unidad discreta llamada gen. El proceso de síntesis de RNA a partir de DNA es la trascripción, y la lectura de algunos RNA a proteína se llama traducción. Con ello, se determina el dogma central de la biología molecular: La trascripción está realizada por un enzima llamado RNA Polimerasa (en Procariotas hay una, en Eucariotas hay hasta 4). Necesitan un molde de DNA, pero a diferencia de las DNA Polimerasas, no necesitan un primer. La RNA Polimerasa se une a una secuencia de nt en el DNA llamada promotor: es la región del DNA a partir de la cual se inicia la trascripción. Para un gen que se transcribe, la cadena que se lee es la molde = antisense; la que no se lee es la sense. Diferentes genes pueden ser leídos de diferente cadena molde (la de arriba o la de abajo), e incluso en una misma región del DNA, la cadena de arriba corresponde a un gen y la de abajo a otro gen, cada uno con su propio promotor.

(imagen)

El RNA es complementario a la cadena molde y es homólogo a cadena no molde. Siempre se sintetiza en sentido 5’à3’ de la nueva cadena. Además, la composición del RNA es distinta a la del DNA. El RNA está formado por ribonucleótidos (rNTP), los cuales:

- Tienen –OH en el C2 de la pentosa, por lo que el RNA es más reactivo y lábil que el DNA.

- Nunca tienen base nitrogenada de Timina, en su lugar hay Uracilo. Tanto en Procariotas como Eucariotas, la trascripción tiene 3 etapas:

- Iniciación: se reconoce el promotor por la RNA Polimerasa; se desenrolla la doble hélice y se comienza a polimerizar RNA.

- Elongación: se polimerizan rNTP complementarios a la cadena molde sin que la RNA Polimerasa se separe del molde.

- Terminación: se separa la RNA Polimerasa del DNA y del RNA por diferentes mecanismos.

Existen diferentes tipos de RNA. Algunos ejemplos (hay más):

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TEMA 14. TRANSCRIPCIÓ A PROCARIOTES. Para sintetizar RNA, se lee la cadena molde de DNA (cadena antisense porque tiene los nucleótidos complementarios al mRNA, es decir, los mismos nucleótidos que habrá en el anticodón del tRNA). Siempre se sintetiza en sentido 5’à3’ de la cadena nueva. Etapas: Iniciación. El promotor es la secuencia de bases a la cual se une la RNA polimerasa. Forma parte del gen, en la región “upstream” (no se trascribe, sino que regula, está a 5’ del gen). El “downstream” es desde el inicio de la trascripción (+1) hasta el final. La base “+1” en el DNA se asigna al primer nt que se encuentra en el RNA, es decir, el primer nt que se trascribe. La numeración de las bases del promotor será negativa. Tiene una secuencia de nt hacia la cual la RNA polimerasa tiene mayor o menor afinidad, pero siempre tendrá unas secuencias consenso (invariables):

(imagen)

Las distancias entre las cajas -35, TATAA box y caja CAT deben mantenerse en el número de bases indicado que las separe. Lo que se puede variar es la secuencia de bases que contienen. Si mutamos éstas bases podemos obtener mutaciones up si son bases hacia las cuales la RNA Polimerasa tiene alta afinidad: incrementa la tasa de trascripción (dominante, promotor fuerte); mientras que serán mutaciones down en caso contrario (recesivo, promotor débil). De éste modo, la RNA Polimerasa se une a la caja -35 y a la TATAA box, desenrolla desde la TATAA box, se mueve sobre el DNA sintetizando RNA complementario al DNA, en 5’à3’. Estrictamente, en la iniciación se sintetizan unos pequeños tránscritos abortivos (oligos de RNA no unido) desde antes de -10, pero el RNA definitivo siempre se sintetiza a partir de la base +1. Los promotores fuertes tienen una durada pequeña de la fase abortiva, al revés que los débiles. Así se forma el “complejo de trascripción cerrado” (dsDNA + RNA polimerasa). A partir del inicio de la trascripción se forma el “complejo ternario” (dsDNA + RNA polimerasa + RNA). Una vez hechas las trascripciones abortivas e iniciada la elongación, se pueden separar subunidades de la RNA polimerasa que ya no sean necesarias para elongar. La RNA polimerasa Procariota (sólo hay 1, trascribe todos los tipos de RNA) es un holoenzima codificado por los genes rpo y compuesto por:

- 2 subunidades α: ensamblan. Interaccionan con prots. reguladoras. Reconocen a las secuencias up element (accesorias en el promotor, no son enhncers, están de -40 a -60). Ambas subunidades son idénticas.

- Subunidad w: ensambla y regula expresión de genes. - Subunidades β y β’: son el verdadero centro catalítico. β forma enlaces fosfodiéster

y recluta rNTP; β’ mantiene el complejo unido al DNA. - Subunidad σ: atrae hacia el promotor. Reconoce a la caja -35 y la TATAA box con

sus dominios. Las subunidades σ son intercambiables, hay una diferente para cada grupo de genes (cada una de ellas se expresa cuando se quiere trascribir un conjunto concreto de genes). La forma más común es σ70.

Así, en la iniciación, se reconoce el promotor por la RNA Polimerasa. Se desenrollan las dos cadenas complementarias de DNA para formar el complejo abierto desde la TATAA box. Este “agujero” será la burbuja de replicación. Se sintetizan los enlaces fosfodiéster

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TEMA 15. REGULACIÓ DE L’EXPRESSIÓ GÈNICA A PROCARIOTES El sistema de control de la transcripción se realiza mediante los interruptores genéticos. Molecularmente, son proteínas que interaccionan entre sí y con regiones específicas del DNA. Las proteínas pueden ser:

- Activadoras: se unen en el DNA cerca de la región de unión de la RNA Polimerasa e interactúan con ella para activar (encender) la transcripción.

- Represoras: se unen a una región llamada operador, adyacente al promotor e impiden que la RNA Polimerasa avance porque crean un muro que la bloquea.

Así, generalmente se puede decir que sus dominios son:

- Centro alostérico: a él se unen pequeñas moléculas que determinan la función activadora o represora de la proteína reguladora.

- Unión al DNA: a través de este dominio, la proteína toca regiones concretas del DNA.

Un ejemplo de regulación de la expresión génica en Procariotas es el operón lactosa. Recordemos que en Procariotas los genes se organizan en operones (regiones en tándem que se expresan ordenadamente: policistrónicos) y el mRNA no se procesa porque no hay intrones, ni se añade CAP ni cola de PolyA. Molecularmente, el operón lactosa es así: De manera basal (constitutiva), las bacterias oxidan glucosa para obtener energía. Si no hay glucosa en el medio usan la lactosa, un poco más compleja de metabolizar. En este caso se pone en marcha el operón lactosa para sintetizar los enzimas que pueden degradar la lactosa para obtener energía. Por tanto, si hay glucosa la trascripción de los genes del operón lactosa está reprimida porque no tiene sentido que se expresen. El gen regulador. Se expresa siempre, es un gen constitutivo. Actúa en trans porque no forma parte del operón, pero sí forma parte de la región reguladora. Codifica para una proteína represora: es un elemento difusible con dos dominios:

- Unión al DNA: se une al operador del operón cuando no hay lactosa, creando un muro que impide avanzar a la RNA Polimerasa.

- Unión a lactosa: si hay lactosa en el medio, la proteína represora se inhibe porque sufre un cambio conformacional y no funciona. Si no hay lactosa, la proteína represora puede funcionar bien y bloquea la expresión del operón.

La expresión del operón lactosa se induce por lactosa. Es un control reprimible porque se inhibe al represor = se activa la transcripción.

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V. TRANSCRIPCIÓ ALS EUCARIOTES.

TEMA 16. MAQUINÀRIA TRANSCRIPCIONAL ALS EUCARIOTES.

En Eucariotas, la transcripción se da en el núcleo y la traducción en el citoplasma, es una separación espacial y también temporal. El mRNA Eucariota sufre una serie de modificaciones post-transcripcionales que nunca se dan en Procariotas: capping en el 5’, adición de una cola de poliadenina (PolyA) en 3’, Splicing y a veces edición del RNA. Así, la vida media del mRNA Eucariota es mayor que la vida media del mRNA Procariota y se permite regular su funcionamiento. Se da un control positivo de la trascripción: se necesitan a los factores de transcripción (TF) para poder activar a la RNA Polimerasa y posicionarla correctamente en el promotor. Tipos de TF:

- Basales/Generales (GTF): Son imprescindibles, están por todo. Ej: TF2D. - Constitutivos/Proximales: son ubicuos porque activan la transcripción siempre que

reconozcan una secuencia concreta sobre el promotor. Incrementan eficiencia en transcripción. Están activos constitutivamente, son propios de genes que necesitan expresión constante (housekeeping). Ej: SP1, CTF (=NF1)…

- Inducibles/de respuesta: necesitan activación porque basalmente están inactivos. Ej: HR.

Los Eucariotas tienen varias RNA Polimerasas, cada una de las cuales transcribe para un grupo de genes concreto:

- RNA Polimerasa I à genes de clase I. Está en el nucléolo. Insensible a la α-amanitina. Es la RNA Polimerasa de más actividad.

- RNA Polimerasa II à genes de clase II. Está en el nucleoplasma. Sensible a la α-amanitina.

- RNA Polimerasa III à genes de la clase III. Está en el nucleoplasma. La sensibilidad a la α-amanitina es específica de cada especie.

- mtRNA Polimerasa y cpRNA Polimerasa: mitocondrial y cloroplastídica respectivamente, resistentes a la α-amanitina y similares a la Procariota.

Todas las RNA polimerasas Eucariotas tienen estructura similar, tomaremos como ejemplo la de la RNA Polimerasa II. Es un holoenzima con diversas subunidades:

- Subunidad de unión al DNA: Reconoce secuencias y recluta proteínas. - Sólo en la RNA Polimerasa II hay el dominio C’Terminal, que corresponde a la cola

CTD (Carboxi-Terminal Domain) y se activa cuando se fosforila. Recluta enzimas. El CTD tiene secuencia de AA repetida (YSPTSPS)n muy importante. Equivale a la β Procariota.

- Núcleo catalítico. Equivale a la β’ Procariota. - Subunidades que equivalen a las 2 α Procariotas.

Genes de Clase I.

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TEMA 17. CARACTERÍSTIQUES I TRANSCRIPCIÓ DELS GENS EUCARIOTES DE CLASSE II.

1. Qué transcriben: mRNA, las snRNA (excepto U6) y snoRNA. 2. Estructura: la más común, con promotor, intrones y exones. Puede haber enhancers/silencers.

3. Cómo se expresan: su promotor presenta variabilidad de secuencias consenso a 5’ del inicio de la transcripción. El promotor de los genes de clase II contiene:

- Promotor mínimo/Núcleo del promotor (core promotor CP): mínima secuencia sobre la cual se puede montar el aparato transcripcional basal e iniciar la transcripción. Va desde -40 hasta +30 aproximadamente e incluye:

o Caja BRE: situada a -35. Es rica en GC y se une a TF2B. Algunos autores no la consideran.

o Iniciation region (InR): contiene la región CAT con el nt +1 (en el 50-60% de los casos es una A).

o Secuencia posicionadora, que será sólo una de estas dos: § TATA box (caja Hogness): a -25pb, en los genes de mRNA. § Downstream promotor element (DPE): está ubicada downstream del

inicio de la transcripción (en el leader) y llega a +30. Se encuentra en los genes sin TATA box (TATA-less) de snRNP y en los mRNA de genes housekeeping (se expresan constantemente).

- Promotor regulador/proximal: contiene secuencias reguladoras cerca del CP, a 5’. Ninguno de estas secuencias es esencial para iniciar la transcripción pero permiten que sea de la intensidad adecuada (no son enhancers). Ejemplo: caja GC, CAAT box, etc. Reconocido por TF constitutivos y TF inducibles.

Para transcribir los mRNA y snRNA son necesarios los GTF propios de los genes de clase II (TF2x) y la RNA Pol II. Esto sería el aparato de transcripción basal. Formación:

- TF2D: reconoce y se une a la caja InR. Contiene entre otras, a la TBP (TATA binding protein). Aquí, la TBP se une a la TATA box para posicionar a la RNA Polimerasa II. Si eran promotores TATA-less, entonces el TF2D se une a InR pero

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TEMA 18. PROCÉS D’SPLICING DE L’RNA PRECURSOR. Es un proceso propio de los genes Eucariotas (genes de clase II y los tRNA) en el que se cortan los intrones y se empalman los exones de un RNA inmaduro (hnRNA) para volverlo maduro (mRNA). Se da en el nucleolo gracias a la cola de PolyA que interacciona con el splicesome antes de que el mRNA sea translocado al citoplasma. Existen varios grupos de intrones que sufren splicing:

- No autocatalíticos: requieren de proteínas o enzimas accesorias que catalizan la reacción. Son el tRNA, el mRNA y los del grupo AU-AC.

- Autocatalíticos (ribozimas): son aquellos que no precisan de snRNP (no requieren splicesome) para eliminarse, ellos solos pueden hacerlo. Tipo I ó II.

tRNA: viene codificado por genes de clase III. Se considera que los tRNA inmaduros tienen un único intrón (en levaduras, aunque hay algunos que no tienen intrón). Los enzimas que actúan son los siguientes:

- Endorribonucleasa que reconoce la estructura con hairpins y secuencias palindrómicas del tRNA inmaduro, corta el intrón y deja extremos 5’-OH y 2’-3’ P, no aptos para ligar.

- Fosfodiesterasa que deja 5’OH y 2’P-3’OH. - Quinasa que fosforila dejando un 5’P. - Ligasa que une el 5’P con el 3’OH.

mRNA: son la mayoría de los intrones. No depende de estructuras como el tRNA, sino de secuencias específicas conservadas el 100% de las veces dentro del intrón (GU-AG). Se pasa de un pre-mRNA inmaduro (hnRNA ó mensajero 1ª) a un mRNA maduro o secundario. El splicing de la mayoría de los intrones sigue la regla del GU-AG:

(imagen) Para eliminar los intrones se dan 2 transesterificaciones seguidas: son enlaces entre el 5’P de un nt y el 3’OH del nt no contiguo (lejano). La 1ª se da debido a que la A del branchpoint tiene un 2’OH que ataca nucleofílicamente al 5’P de la G del 5’ del intrón. Éste enlace 5’à2’ forma un lariat o lazo (1 lariat = 1 intrón). La 2ª transesterificación se produce cuando el 3’OH de la G del exón que ha quedado libre ataca nucleofílicamente al 5’P de la G del siguiente exón formando un enlace normal en 5’à3’. El lariat queda separado, se linealiza y es degradado por nucleasas. Estas dos transesterificaciones las realizan las proteínas snRNP (snurp). Las snRNP constituyen el splicesome (pseudoorgánulo que cataliza el splicing). Una snRNP= snRNA + proteínas diversas. Las snRNP se nombran según el snRNA que contienen. Las snRNP vienen de los genes de tipo II, por tanto tienen CAP en el extremo 5’ excepto snRNP-U6 que viene de un gen del tipo III y no tiene CAP. No hay cola de poliadenina. Estructura de la snRNP:

(imagen) Los snRNA de las snRNP son complementarios a regiones específicas del intrón del RNA. Considerar siempre la orientación de las cadenas del RNA (debajo de un 5’ siempre va un 3’, etc…).

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TEMA 19. SPLICING ALTERNATIU. El mRNA también puede ser procesado de forma diferencial en distintos tejidos o en distintos momentos del tiempo mediante splicing alternativo o diferencial, o también puede terminar su síntesis en distintos puntos usando lugares de poliadenilación crípticos. El splicing alternativo es un proceso en el que una única molécula de pre-mRNA puede dar diferentes tipos de mRNA que conducen a la síntesis de proteínas diferentes. Un 60% de los genes humanos sufren este tipo de splicing. Fenómenos que lo causan:

- Extensión de exones: un fragmento de intrón sobrevive al splicing y se empalma al exón. Si son 3 bases (o múltiplo de 3), no pasa nada. Si no, hay corrimiento de la pauta de lectura y dependiendo de lo avanzado en la traducción que esté el intrón añadido, puede hacer más o menos efecto.

- Eliminación de exones: se pierde algún exón con los intrones. - Inclusión de intrones: permanece un intrón entre dos exones. - Combinación de exones: dos exones que no deberían ser contiguos, se empalman

y forman una nueva secuencia codificante.

(imagen)

Molecularmente, este fenómeno se da debido a las proteínas activadoras/represoras del splicing (proteínas SR=SF2, ricas en serina y arginina) que actúan sobre regiones concretas del pre-mRNA. Las regiones son: Exón Intrón Intensificador (enhancer) de splicing.

ESE (exonic splicing enhancer)

ISE (intronic splicing enhancer)

Silenciador (silencer) de splicing. ESS (exonic splicing silencer) ISS (intronic splicing silencer) Las proteínas SR participan tanto en el splicing alternativo como en el constitutivo. Son las responsables de que durante el splicing no se pierdan exones (constitutivo), o bien que se utilicen los lugares crípticos de splicing (que normalmente no se usan) para darse el splicing alternativo.

- ESE - ISE: estimulan splicing en lugares crípticos (ocultos). Se unen a SR y atraen a U1 y U2AF35 y las estabilizan.

- ESS - ISS: bloquean splicing en lugares normales que normalmente se usan. Atraen a sus SR, desestabilizan a las snRNP o compiten con ellas por su afinidad al RNA, todo para silenciar el splicing y que no se dé en las regiones a donde se han unido.

(imagen) Casos frecuentes:

- En un intrón haya un final de traducción de una proteína: debido a secuencias flanqueantes ISS dentro del intrón, no se corte el intrón y al traducirse, produzca una proteína mas corta porque al leerse el RNA se topa con el STOP del intrón que normalmente no está.

- Las ISS hacen que el splicesome se vaya a cortar a un lugar críptico, que se usa porque los otros están bloqueados.

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VI. REGULACIÓ DE LA TRANSCRIPCIÓ A EUCARIOTES.

TEMA 20. PROMOTORS, ENHANCERS I FACTORS DE TRANSCRIPCIÓ

Las regiones reguladoras de los genes Eucariotas son modulares, es decir, tienen varias secuencias cortas (cis) diana de diferentes TF (trans). En general son activadores de la transcripción pero existen casos en que no es así.

Factor cis Factor trans (TF) Promotor basal/core Basales (GTF) Promotor regulador/proximal Constitutivos Enhancer/Silencer Inducibles

Los enhancers/silencers son secuencias cis situadas muy lejos del gen, tanto a 5’ como a 3’, no forman parte del promotor y sirven para incrementar o disminuir respectivamente la tasa de transcripción, siendo específicos de cada promotor. Cada uno es específico de promotor. Ni los promotores reguladores ni los enhancers/silencers son esenciales para la expresión de un gen pero permiten que se transcriba al nivel adecuado. Los TF inducibles que se unen a enhancers y silencers, aparecen específicamente en tejidos concretos y se activan sólo frente a estímulos concretos: regulación espacio-temporal de la expresión génica. Molecularmente, el funcionamiento es complejo e implica interacciones entre distintas proteínas. Los TF activadores pueden interactuar con los GTF:

- Directamente: raro. - Indirectamente: a través de mediadores (coactivadores). El DNA “se dobla”.

(imagen)

Ejemplos de elementos reguladores cis modulares y los factores trans que se unen: El sistema Gal en levaduras es ilustrativo de la regulación inducible en Eucariotas (seminario). Si hay varios genes distintos que deben ser expresados de forma coordinada, comparten elementos reguladores y potenciadores similares. Las secuencias UAS que lo forman son un tipo de elementos de respuesta que forman parte del promotor regulador.

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TEMA 21. REGULACIÓ DE LA TRANSCRIPCIÓ EUCARIOTA. Regulación por TF inducibles. En general, la regulación de la transcripción Eucariota es positiva porque implica proteínas activadoras que ponen en marcha la maquinaria transcripcional, aunque también existen casos de regulación negativa de la transcripción. Los TF inducibles activadores funcionan transcribiendo genes específicos en tejidos y momentos concretos (expresión espacial y temporal). Activación:

- Sintesis de TF: lento. - Fosforilación (HSF) ó desfosforilación. - Unión a ligando: HR. - Corte Hidrolítico. - Separación de proteína inhibidora que lo secuestraba: NF-kD. - Change of friend: En un heterodímero, cambiamos un miembro por otro que tenga

más afinidad por DNA.

(imagen) CREM (o CREB). Basalmente inactiva, se activa con AMPc (poca glucosa = mucho APMc). Se sintetiza constitutivamente. La diana de CREM activado es la caja CRE (Ciclic-AMP Response Element) en el DNA. Las isoformas de CREM formadas por splicing alternativo son CREMa (predominante, es activador, con dominio de unión al DNA y dominio activador de la transcripción) y CREMi (represor, sólo tiene dominio de unión al DNA). El dominio de unión al DNA tiene cremalleras de leucina, por tanto, dimeriza. Se regula: la poca glucosa regula al AMPc, que activa a ciertas quinasas que tienen como diana a CREM. Una vez activado (por fosforilación), CREM-P se une a la caja CRE en el DNA. La caja CRE está, por ejemplo, en el gen de la cadena α de las gonadotrofinas. Una de las cajas CRE está al lado del promotor de ICER, que se estimula y transcribe para ICER. ICER tiene como objetivo bloquear a CRE para que separar CREM y que no se una más. Además se para la transcripción de CREM porque el promotor de ICER (al lado de caja CRE, diana de CREM fosforilado)está a 3’ del promotor de CREM. Y también se deja de transcribir ICER. La afinidad de ICER por CRE es mayor que la de CREM fosforilado por CRE. Así se queda CRE bloqueado. Por tanto, la respuesta de CREM es rápida y transitoria.

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TEMA 22. EPIGENÈTICA Son un conjunto de mecanismos moleculares reversibles que actúan sobre el DNA sin modificarlo y determinan el desarrollo del individuo. Es una regulación que se hereda de padres a hijos sin cambiar ninguna secuencia del DNA. Puede ser consecuencia de la interacción gen-ambiente o respuestas que se activan frente a determinados estímulos. Por ejemplo, un factor ambiental puede activar una vía de señalización que termine silenciando la expresión de un gen debido a metilación de una región del cromosoma. Este cambio se puede mantener durante varias generaciones, aunque hay casos que en pocas generaciones se pierde porque es reversible. No se conocen todos los detalles del proceso. Muchos de los procesos que desembocan en respuestas epigenéticas ya los hemos presentado. Todos los procesos epigenéticos son reversibles. Metilación del DNA: reclutar enzimas que metilan bases del DNA porque así repelen a la RNA Polimerasa reduciendo la tasa de transcripción. Se da preferencialmente en islas CpG (regiones de 300-3000pb con alto contenido en Citosina-Guanina contiguas). En ellas se metila la C (5-metilcitosina) con enzimas llamados DNA metil-transferasas (DNMT) usando como cofactor S-Adenosilmetionina. La C metilada puede pasar a T por desaminación durante la replicación, con lo que es fuente de mutaciones. Las islas CpG suelen estar en el promotor de genes constitutivos e inducibles. Juegan un papel importante en la inactivación permanente de uno de los dos cromosomas X en la mujer, pero principalmente su función es silenciar el gen adyacente metilando las C de forma reversible. La metilación se mantiene por DNMT1 y se realiza de novo sobre DNA recién sintetizado con DNMT3A-3B. Una vez metilado, se recluta HDAC (desacetila histonas) que estabiliza nucleosomas y reprime la transcripción. Al desmetilar el DNA se facilita la entrada de HAT (acetila histonas) con lo que se desempaquetan nucleosomas y se inicia la transcripción. Ojo: la metilasa DAM metilaba la A de regiones GATC en la replicación, no confundir con metilación de islas CpG para regular transcripción. Modificación de histonas. Las histonas tienen un dominio globular para interaccionar entre ellas y una cola con cargas positivas (extremo N’terminal) con la que interacciona con el DNA mediante puentes de H. Es en la cola de las histonas donde se realizan las modificaciones químicas (código de histonas) que cambian su afinidad por el DNA: si se unen al DNA dificultan la transcripción porque bloquean la entrada de la maquinaria transcripcional; mientas que si se separan de él facilitan la expresión de genes.

- Metilación: según el aminoácido de la cola que se metila, puede activar o reprimir la transcripción de genes. Una metilación común es la H3K4me3: adición de 3 metiles a la lisina 4 de la histona 3 (esta metilación en concreto activa la transcripción, pero si se hace en la lisina 27 se reprime). Esta histonas se suele encontrar cerca de los inicios de la transcripción. La proteína NURF (nucleosome remodeling factor) reconoce específicamente la H3K4me3 y altera el empaquetamiento de la cromatina desplazando los nucleosomas.

- Acetilación: es un mecanismo que generalmente activa la transcripción. Por ejemplo, acetilar H4K16Ac evita que se forme la fibra de 30nm: DNA descondensado que se puede transcribir. Enzimas implicados:

o Histone acetil transferase (HAT) acetila: activa la transcripción porque separa histonas de DNA).

o Histone deacetilation complex (HDAC) desacetila: reprime la transcripción …