génotypage rhésus d fœtal à partir du sang maternel : apports et limites > j.m. costa...
TRANSCRIPT
Génotypage rhésus D fœtal à Génotypage rhésus D fœtal à partir du sang maternel : partir du sang maternel :
apports et limitesapports et limites
> J.M. COSTA Laboratoire PASTEUR CERBA
Paris le 7 novembre 2008
Génotypage rhésus D fœtal Génotypage rhésus D fœtal
Conflits d’intérêts déclarés JM Costa
• Laboratoire Pasteur Cerba (Privé): salarié
• Laboratoire LFB (Rhophylac®): aucun
• Institut Jacques Boy (Free DNA fetal kit®RhD): aucun
Diagnostic prénatal à partir du sang maternelDiagnostic prénatal à partir du sang maternel
L’ADN fœtal sérique ou plasmatique
(ADN fœtal libre circulant)
Cellules fœtales circulantes
Diagnostic prénatal à partir du sang maternelDiagnostic prénatal à partir du sang maternel
ADN fœtal libre: difficultés et limites d’analyse
• Ne représente que 3 à 6% de l’ADN
plasmatique
• Analyse restreinte aux séquences
« paternelles »
Analyse de l’ADN fœtal circulant: application au Analyse de l’ADN fœtal circulant: application au génotypage génotypage RHDRHD
Les bases moléculaires du phénotype RhD-négatif
Phénotype RhD-positif 85%
Phénotype RhD-négatif 15%
+
+
del
+
del
del 43%
42%
Génotypage Génotypage RHD RHD fœtal à partir du sang maternel: fœtal à partir du sang maternel: principeprincipe
Génome paternel RhD-positif
Sang maternel
Fœtus RhD-négatif
Génome maternel+
Génome foetal Fœtus RhD-positif
Détection par amplification génique (PCR en temps réel) de séquences nucléotidiques (d’origine paternelle) dérivées du gène RHD
Génome maternel+
Génome foetal
Ex5 Ex7 Ex10
Les bases moléculaires du système rhésus
Allèle RHD+
Allèle RHD Neg « classique »
Allèle RHD- « RHD»
Allèle RHD- « RHD-CE-Ds»
- + +
- - +
- - -
+ + +
Génotypage Génotypage RHD RHD fœtal à partir du sang maternel: fœtal à partir du sang maternel: principeprincipe
Ex5 Ex7 Ex10
<1%
<1%
18%99%
Afrique noireCaucase
15%
67%
3-5% 15-17%Fréquence du phénotype RhD-négatif:
Sensibilité + ++ +++
Génome paternel RhD-positif
Sang maternel
Les limites
Principe du génotypage Principe du génotypage RHD RHD fœtal à partir du sang fœtal à partir du sang maternelmaternel
Génome maternel+
Génome foetal Fœtus FAUX-Positif
Ex5 Ex7 Ex10
Principe du génotypage RHD fœtal à partir du sang Principe du génotypage RHD fœtal à partir du sang maternelmaternel
Génome paternel RhD-positif
Sang maternel
Fœtus ?« Unconclusive result »
Les limites
Génome maternel
+Génome foetal
Ex5 Ex7 Ex10
Génotypage Génotypage RHDRHD fœtal à partir du sang maternel fœtal à partir du sang maternel
Les limites: aucun test ne sera jamais parfait
• Les « unconclusive results »
variants du gène RHD chez la mère
• Les faux-positifs
variants du gène RHD chez le foetus
Procédure de laboratoire (contaminations)
Vanishing twin
• Les faux-négatifs
Procédure de laboratoire (défaut de sensibilité)
variants du gène RHD
Allo-immunisation 13%
Injection inutile anti-DRisque infectieux 0 (?)
Génotypage Génotypage RHDRHD fœtal à partir du sang maternel fœtal à partir du sang maternel
Expériences récentes en Europe
Sanquin IBGRL Pasteur-Cerba CNRHP
NL GB FR FR
Plasma 3ème Plasma 3ème Sérum 1ère Plasma 2ème
Patientes (n=) 2415 1869 2794 893
Terme (SA) 28 28 10-36 7-32
Fœtus RHD négatif 915 (38.4%) 670 (35.9%) 894 (31,9%) 193 (21,6%)
Faux-négatifs 7 (0,26%) 3 (0,16%) 0 (en cours) 4 (0,4%)
Faux-positifs 5 (0,20%) 14 (0,75%) >3 (0,10%) 5 (0,54%)
Unconclusive 2.1% 3.0% 3.3% 5.4%
Pourquoi faut-il proposer le génotypage Pourquoi faut-il proposer le génotypage RHDRHD fœtal ? fœtal ?
Recommandation du CNOGF 2005
Intérêts
• Cà marche !
• Limiter l’exposition à des produits dérivés du sang
• Limiter l’utilisation des immunoglobulines (stocks limités)
• Augmente la pertinence de la prophylaxie (Jones et al, BJOG 2004;111:8982-902)
Pour éviter 1 cas d’allo-immunisation, il faut traiter:
– 278 femmes en l’absence de génotypage
– 166 femmes si le génotype fœtal RHD est connu positif
Génotypage Génotypage RHDRHD fœtal à partir du sang maternel fœtal à partir du sang maternel
Frein à sa généralisation
• Déficit d’information des patientes et des professionnels
• Laboratoires
– Activité de diagnostic prénatal (génétique moléculaire) Autorisation de diagnostic prénatal par l’ARH
Praticiens agréés par l’Agence de la Biomédecine
• Coût du test
– Remboursement (B700: 189€ par assimilation diagnostic prénatal) suspendu depuis janvier2008 (décision CNAM unilatérale)
– Sanquin-NL (149€), Pasteur-Cerba-FR (150€), IGBRL-UK (279€)
– Haute Autorité de Santé saisie début 2008
– Intérêt économique incertain
Intérêt économique du génotypage Intérêt économique du génotypage RHDRHD foetal foetal systématique?systématique?
Etude pilote:
A.Benachi, N Léticée N, JM Jouannic JM, Y Ville, JM Costa
Hôpital Necker-Paris, CHI Poissy, Hôpital Trousseau, Hôpital Américain de Paris
Suivi de 101 patientes RhD négatives (Caucase.93, Afr.Nord7, Antilles 1)– Génotypage fœtal non interventionnel au premier trimestre:
terme moyen 13SA– Pas de prophylaxie systématique à 28SA– Décompte: RAI, Test de Kleihauer, Groupe, Rhophylac, Soins infirmiers
Résultats– Génotypage RHD fœtal
– 2 résultats « unconclusive » (Caucase1,Antilles1)– 75 patientes à risque (fœtus RHD-positif)– 24 patientes avec fœtus RHD-négatif (25%)
– Prophylaxie ciblée: 23 patientes– 12 amniocentèses– 11 saignements et traumatismes
NNé RhD-Positif
Couple à risque
Patiente RhD-négative non immunisée
Conjoint RhD-positif
NNé RhD-négatif
Premier trimestre
Patiente:
Détermination du groupe rhésus
Recherche d’agglutinines irrégulières
Accouchement
Détermination du groupe rhésus NNé
De 12SA à accouchement
• Anti-D 200µg: prévention ciblée en cas de situation à risque +/- test de Kleihauer
• RAI: 6ème, 8ème mois
Anti-D 200µg
Test de Kleihauer
2 Prévention ciblée+systématique
NNé RhD-Positif
Couple à risque
Patiente RhD-négative non immunisée
Conjoint RhD-positif
NNé RhD-négatif
Premier trimestre
Patiente:
Détermination du groupe rhésus
Recherche d’agglutinines irrégulières
Accouchement
Détermination du groupe rhésus NNé
De 12SA à accouchement
• Anti-D 200µg: prévention ciblée en cas de situation à risque +/- test de Kleihauer
• RAI: 6ème, 8ème mois
Anti-D 200µg
Test de Kleihauer
1Prévention ciblée
27-29SA
Anti-D 300µg: prévention systématique
Conjoint (à documenter)
Détermination du groupe rhésus
Coût moyen par patiente:
331€ (+36.8%)
Coût moyen par patiente:
242€
Evaluation des coûts: impact de la prophylaxie Evaluation des coûts: impact de la prophylaxie systématiquesystématique
NNé RhD-Positif
Couple à risque
Patiente RhD-négative non immunisée
Conjoint RhD-positif
NNé RhD-négatif
Premier trimestre
Patiente:
Détermination du groupe rhésus
Recherche d’agglutinines irrégulières
Accouchement
Détermination du groupe rhésus NNé
De 12SA à accouchement
• Anti-D 200µg: prévention ciblée en cas de situation à risque +/- test de Kleihauer
• RAI: 6ème, 8ème mois
Anti-D 200µg
Test de Kleihauer
27-29SA
Anti-D 300µg: prévention systématique
Génotypage RHD foetal
X
Test commercial
RHD en duplicate 104€
2 Prévention ciblée+systématique
1Prévention ciblée
Coût moyen par patiente:
331€ (+36.8%)
Coût moyen par patiente:
242€
Quel objectif/quelle stratégie pour le génotypage?Quel objectif/quelle stratégie pour le génotypage?
Coût moyen par patiente:
331€ si génotypage 22€/test
464€ si génotypage 150€/test
599€ si génotypage 279€/testA titre de repère
Test de Kleihauer 19€
PCR Chlamydia UR 27€
PCR Toxo LAMN 169€
Quelle stratégie?Quelle stratégie?
NNé RhD-Positif
Couple à risque
Patiente RhD-négative non immunisée
Conjoint RhD-positif
NNé RhD-négatif
Premier trimestre
Patiente:
Détermination du groupe rhésus
Recherche d’agglutinines irrégulières
Accouchement
Détermination du groupe rhésus NNé
De 12SA à accouchement
• Anti-D 200µg: prévention ciblée en cas de situation à risque +/- test de Kleihauer
• RAI: 6ème, 8ème mois
Anti-D 200µg
Test de Kleihauer
27-29SA
Anti-D 300µg: prévention systématique
Génotypage RHD foetal
XCoût moyen par patiente:
331€ si génotypage 46€/test
440€ si génotypage 150€/test
574€ si génotypage 279€/test
2 Prévention ciblée+systématique
1Prévention ciblée
Coût moyen par patiente:
331€ (+36.8%)
Coût moyen par patiente:
242€
X
Coût moyen par patiente:
331€ si génotypage 22€/test
464€ si génotypage 150€/test
599€ si génotypage 279€/test
Quel objectif/quelle stratégie pour le génotypage?Quel objectif/quelle stratégie pour le génotypage?
NNé RhD-Positif
Couple à risque
Patiente RhD-négative non immunisée
Conjoint RhD-positif
NNé RhD-négatif
Premier trimestre
Patiente:
Détermination du groupe rhésus
Recherche d’agglutinines irrégulières
Accouchement
Détermination du groupe rhésus NNé
De 12SA à accouchement
• Anti-D 200µg: prévention ciblée en cas de situation à risque +/- test de Kleihauer
• RAI: 6ème, 8ème mois
Anti-D 200µg
Test de Kleihauer
27-29SA
Anti-D 300µg: prévention systématique
XX
Génotypage RHD foetal
X
2 Prévention ciblée+systématique
1Prévention ciblée
Coût moyen par patiente:
331€ (+36.8%)
Coût moyen par patiente:
242€
Coût moyen par patiente:
331€ si génotypage 87€/test
399€ si génotypage 150€/test
532€ si génotypage 279€/test
Coût moyen par patiente:
331€ si génotypage 22€/test
464€ si génotypage 150€/test
599€ si génotypage 279€/test
NNé RhD-Positif
Couple à risque
Patiente RhD-négative non immunisée
Conjoint RhD-positif
NNé RhD-négatif
Premier trimestre
Patiente:
Détermination du groupe rhésus
Recherche d’agglutinines irrégulières
Accouchement
Détermination du groupe rhésus NNé
De 12SA à accouchement
• Anti-D 200µg: prévention ciblée en cas de situation à risque +/- test de Kleihauer
• RAI: 6ème, 8ème mois
Anti-D 200µg
Test de Kleihauer
27-29SA
Anti-D 300µg: prévention systématique
XX
Génotypage RHD foetal
X
2 Prévention ciblée+systématique
1Prévention ciblée
Coût moyen par patiente:
331€ (+36.8%)
Coût moyen par patiente:
242€
Coût moyen par patiente:
331€ si génotypage 110€/test
370€ si génotypage 150€/test
501€ si génotypage 279€/test
Coût moyen par patiente:
331€ si génotypage 87€/test
399€ si génotypage 150€/test
532€ si génotypage 279€/test
Coût moyen par patiente:
331€ si génotypage 155€/test
319€ si génotypage 150€/test
453€ si génotypage 279€/test
33%
50%
25%
Taux de Fœtus RHD Neg
Quel objectif/quelle stratégie pour le génotypage?Quel objectif/quelle stratégie pour le génotypage?
Coût moyen par patiente:
331€ si génotypage 22€/test
464€ si génotypage 150€/test
599€ si génotypage 279€/test
Peut-on réduire la demande de génotypage?Peut-on réduire la demande de génotypage?
Phénotypage rhésus CDE du conjoint (B75:25€)
+ + +
del
Fœtus RhD-positif 50%
Fœtus RhD-positif 100%
Génotypage Génotypage RHDRHD fœtal à partir du sang maternel fœtal à partir du sang maternel
Questions à réponses variables
• ADN fœtal sérique ou plasmatique?
• Quel délai pour l’acheminement de l’échantillon au laboratoire?
• Quel test proposé:1ère, 2ème ou 3ème génération?
• Doit-on contrôler les résultats négatifs?
• Doit-on contrôler les résultats sur liquide amniotique si amniocentèse?
• A quel terme?
• A quelle patiente doit-on proposer le test?
– Patientes allo-immunisées
– Patientes devant avoir un geste invasif
– Toutes les patientes RhD négatives
Test de Kleihauer: contrôle de qualitéTest de Kleihauer: contrôle de qualité
Simmonet et al. Annales de Biologie Clinique 2001
échantillon C: 50 hématies fœtales/ 10.000
0
1
2
3
20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
Nbre d’injections anti-D
2 3 4 51