Anticuerpos monoclonales contra protefnas de lanucleocapslde del virus IBR y su evaluaci6n por ELISA

Monoclonal antibodies against proteins of the IBR virusnucleocapside and their assessing by ELISA

Jeannette Navarrete 0.', Victor J. Vera", Gloria Remtrez'", Luis Carlos vtttemit""

RESUMEN

A partir de un aislamiento de una cepa de campo del virus de IBR, se produjeron clonos productores deanticuerpos monoclonales (AcMo)contra componentes de su nucleocapside, para 10 cuallos in6culos para serdescargados en los ratones Balb/cfueron obtenidos del cultivo de la linea celular (MOBK),los cuales se purifica-ron y concentraron por centrifugaci6n en gradiente continuo de sacarosa al 30% y posterior precipitaci6n pormetodos quimicos. Las nucleocapsides obtenidas fueron sometidas a SOS-PAGEpreparativas allO%. Se emple6la tecnica de ELISAdirecta como prueba de tamizaje para los sobrenadantes de los hibridomas positivos para laproducci6n de los AcMo. Se obtuvieron ocho hibridomas positivos al virus de IBR por ELISA;cinco fueronpositivos por prueba de seroneutralizaci6n y por inmunodot; realizada la selecci6n clonal por medio del procesode diluci6n limite, se obtuvieron 56 clones positivos al virus de IBR, que reconocen la protefna de 39.8kOa; sussobrenadantes fueron confirmados por las pruebas de ELISA,Dot y Western Blot. Con los AcMo, se normaliz6una tecnica de ELISAde captura, que permite detectar tanto la cepa de campo como la cepa de referencia Iowa.

Palabras clave: herpesvirus bovino-I, protefnas virales, inmunologia, glicoprotefnas, nucleocapside.

ABSTRACT

Monoclonal antibodies were produced against the nucleocapside of a field IBRvirus strain. The virus was growthin MOBK cell line. Viral components were purified and concentrated in a continuous 30% sacarose gradientfollowed by chemical precipitation. Nucleocapsides were run in a 10% SOS-PAGEgel. Positive hybridomes weretested using a direct ELISAdeveloped in our laboratory. As a result eigth ELISApositive clones were obtained,from these five were also positive to seronetralization and immunodot. The clones recognize a 39.8Kda protein.Aditionally, a capture-ELISA was developed using the monoclonal antobodies from this research. This ELISAisuseful to detect a reference as a field nm virus strain.

Key words: bovine herpesvirus-I, viral proteins, immunology, glycoproteins, nucleocapside.

INTRODUCCION

La rinotraqueitis bovina infecciosa (IBR) es unainfecci6n de origen viral del grupo de los herpesvirus que afecta a los bovinos; su presentaci6n ycurso estan influidos por factores ambientales. Los6rganos que elige el virus principalmente para sumanifestaci6n son las mucosas de los aparatosgenital y respiratorio. Los germenes provocan

cuadros tfpicos patol6gicos como vulvovaginitis,aborto, rinotraqueitis, trastornos nerviosos cen-trales consecuentes a meningoencefalitis, as!como afecciones de los 6rganos digestivos y glan-dula mamaria (Gibbs et al., 1997; Kahrs, 1977).Los miembras del genera Herpes son reconoci-dos por la arquitectura del viri6n, los cuales con-

* Bacteri6loga, M.Sc. Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca, Universidad Nacional de Colombia.e-mail: jeanavilla@yahoo.com** M.V. M.Sc. Ph.D. Universidad Nacional de Colombia. e-mail: instituto_genetica@yahoo.com*** MV M.Sc. Universidad Nacional de Colombia. e-mail: dgcramire@veterinaria.unal.edu.co**** M.V. M.Sc. Ph.D. Universidad Nacional de Colombia. e-mail: Icvillaj@bacata.usc.unal.edu.co

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ANTICUERPOS MONOCLONALES CONTRA PROTEINAS DE LA NUCLEOcApSIDE DEL VIRUS IBR

forman un gran grupo de virus ADN de 150-170 nm dediarnetro. Poseen una capside icosahedrica compues-ta por 162 capsorneros formados por 12 pentamerosy 150 hexameros, los cuales estan unidos porlipopolisacaridos. Por tinciones negativas el virus hademostrado tener dos capsides designadas comomedia e interna (Fenner et al., 1974; Fenner et al.,1997; Virol Div., 1998). En los virus Herpes bovino tipo1 y 2 se han caracterizado 33 popipeptidos estructu-rales, de los cuales 11 son de caracter glicoproteico,con pesos moleculares que oscilan entre 12-330 kDa.(Marshal et al., 1986; Misra et al., 1981; Van Drunen etal., 1986). Se han identificado glicoprotefnas (gB,gC,gD, gE, gG, gH, gl, gK, gl Y gM), las cuales estanpresentes en la superficie de las celulas infectadas, 10que indica que estas rnoleculas estan involucradas enel reconocimiento y la citolisis inmune (Misra, 1981;Van Drunen et el., 1985; Van Drunen et al., 1985; Wuet al., 1998); en interacciones entre el virion y la celulahuesped y entre las celulas infectadas y el sistemainmune (Misra et al., 1981; Van Drunene et et., 1984,Nakamichi et et., 2002). Asl mismo, son las que estaninvolucradas en la produccion de anticuerposneutralizantes, en la adherencia del virus y la penetra-cion del mismo en la celula huesped (Van Drunen etal., 1985). Se ha observado que anticuerpos contra lagM reconocen, adernas, una protefna de 9 kDa aso-ciada espedficamente con una de 39 kDa con funcionaun desconocida (Wu et al., 1998). Por medio deanticuerpos monoclonales se han podido evidenciarepitopes inmunodominantes, mejorar las pruebasdiaqnosticas y evidenciar las funciones de protefnasespedficas de los virus (Ayers et al., 1994; Van Drunenet al., 1984).

EI presente estudio describe el analisis protei-co de cepas de campo y de referencia, con el fin deusar peptidos purificados para la produccion y ca-racterizacion de anticuerpos monoclonales dirigidoscontra protefnas de la nucleocapside del virus de larinotraqueitis bovina infecciosa. Con la normaliza-cion de una prueba de ELISA usando anticuerposmonoclonales para capturar particulas virales, seesta ofreciendo la posibilidad de instaurar tecnicassencillas, de alta sensibilidad y especificidad, para de-tectar la presencia del virus IBA. Por las mismas ca-racterfsticas de los anticuerpos monoclonales (culti-vos inmortales) se contara con una herramientadiaqnostica de acceso continuo, con la cual se pod rannormalizar otro tipo de pruebas que detecten directa-mente el virus IBR en diversos tipos de muestra.

MATERIALES Y METOOOS

Celulas y virus

Se realizaron cultivos de celulas de ririon bovino 0 Madin-Darby (MDBK) (ATCC CCl 22) en frascos roller, loscuales se mantuvieron en crecimiento por 72 horas a37°C en medio esencial minima (SIGMA®) suplemen-tado con suero bovino fetal a17% (laboratorios Hyclone).Con el cultivo de celulas MDBK se cosecharon particu-las virales del pase NO.5 de una cepa campo de IBR,aislada en 1999, proveniente de un toro del hato de laFacultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Uni-versidad Nacional de Colombia. EI virus diluido 1:10 enmedio, fue absorbido durante 1 hora a 3rC. Con unefecto citopatico del 80-100% de las cetulas, elsobrenadante se clarifico centrituqancolo a 15.000 9(Centrffuga Beckman J21) por 20 min a 4°C y se con-servo a -BO°C (Goding, 1980).

Purificaci6n del virus

la concentracion y purificacion viral de la cepa decampo de! virus IBR se realize por medio degradientes continuos de sucrosa al 30% en bufferTEN (NaCI 0,15 M, EDTA 0,005 M, Tris 0,05 M), elcual se centrifuqo a 100.000 9 por 1 hora a 4°C(Ultracentrifuga Beckman Sl50 Rotor SW30). EIpellet del virus fue suspendido en buffer lisis (bu-ffer TEN, 0,5% Nonidet P40, 2mM phenyl methylsulfonil fluoride PMSF) e incubado 15 min a 4°C.EI material virallisado fue suspendido en gradientescontinuos de sucrosa al 30% y se centrifuqo a100.000 9 por 1 hora a 4°C, para obtener el pelletde las nucleocapsides virales (Israel et. et., 1992).las protefnas de las nucleocapsides fueron con-centradas por medio de precipitacion etanolica(Deutscher, 1990).

Electroforesis PAGE-SOS

Se realize una electoforesis en geles denaturantesde poliacrilamida PAGE-SDS como 10 describiolaemly (1990). las proteinas del virus de la cepa decampo aislada en 1999 fueron suspendidas en bu-ffer muestra (2% de SDS, 1% de 2-13mercaptoetanol,10% de glicerol y 0,0001 % de azul de bromofenol enTris HCI 62,5 mM) y se separaron los peptidos engeles de acrilamida al 10%. las protefnas se revela-ron con la tincion de azul de Coomassie y nitrato deplata (Sambrook et. el., 1989).

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Producci6n de los anticuerposmonoclonales

La Ifnea de mieloma P3X63Ag8.653 (Goding, 1980)suministrada por ellaboratorio de bioqufmica del Insti-tuto Nacional de Salud, se mantuvo en crecimiento enmedio Dulbecco modificado con sales de Earles DMEM(Hibrimax SIGMA®), suplementado con suero bovinofetal al 10% (Laboratorios Hyclone), solucion deantibioticos al 1%, glutamina al 2% y betamercaptoetanol 0,1% (SIGMA®); fueron incubadas a3rC y en atmosfera de CO2 al 5%. Las protefnasvirales de la cepa de campo purificadas, concentra-das y separadas en SDS-PAGE preparativa al 10% Yteriidas con azul de Coomassie (128,8; 89,1 y 83,1;50,1 Y 53,7; 39,8; 27,5 kDa) fueron cortadas del gelcuidadosamente, fraccionadas y maceradas en cortesde 1 cm por inocuto; posteriormente los fragmentos delgel se homogeneizaron en PBS pH 7,2 Y luego se mez-claron con adyuvante completo 0 incompleto de Freund.Cada una de las bandas correspondientes a los peptidosse inocularon en ratones de cepa Balb/c (Bioterio Uni-versidad Nacional de Colombia), hembras de seis a ochosemanas de edad, por vfa intraperitoneal. Las fusionesse realizaron de acuerdo con el metoda de Kohler yMilstein, modificando los tiempos de incubacion. La re-lacion de las celulas de mieloma con referencia a lascelulas de bazo de raton inmunizados fue de 1:10, res-pectivamente. Como celulas alimentadoras se usaronleucoitos obtenidos del bazo de ratones no inmunizadosa una concentracion de 3x107 cel/rnl, Para lograr la fu-sion celular se aolciono Polyethylene glycol MW 3000-3700 (Hibrimax SIGMA®). EI tiempo de la fusion fue de5 min y se resuspendio en medio suplementado conHAT (hipoxantina, aminopterina, tirnidina HIBRIMAXSIGMA®). Las fusiones positivas se conservaron enmedio con HAT por dos semanas, luego se cambia elmedio por DMEM-HT (Hipoxantina, TimidinaHIBRIMAXSIGMA®) y se mantuvo por uno semana y posterior-mente este ultimo se sustituyo par DMEM al 15% deSBF. De los pozuelos donde hubo crecimiento de colo-nias, sus sobrenadantes fueron probados por ELISA,dot y seroneutralizacion (Marshal et. el., 1986). Loshfbridomas fueron c1onados por la tecnica de dilucionIfmite (Goding, 1980).

Inmunoensayo enzimatico para IBR (ELISA)

Se usa como prueba de screning para detectar laproouccion de anticuerpos contra protefnas de la cepade campo del virus IBR tanto en ratones inmunizados

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como en los sobrenadantes de los hfbridos fusiona-dos productores de anticuerpos monoespecfficos. Semodifico el rnetodo mrnunoenzirnatico sugerido porVandrunen (1984). La cepa de campo se sonico a 40MHz por 60 a 4°C con intervalos de 30 por dos veces(Ultrasonic Homogenizer Cole Parmer Instruments4710); el antfgeno se diluyo en buffer carbonato/bi-carbonato (Na2COjNaHC030,2 M pH 9,6). En pla-cas de poliestireno Inmulon II, se adicionaron 100 mldel virus diluido y se incubaron una hora a 3rC y 24horas a 4°C en carnara hurneda. Se procedio a lavardos veces con PBS-tween-Ieche (buffer fosfato 0,15M ph 7,2, 0,05% de Tween 20, 5% de lechedescremada) y se bloqueo con esta misma. Luegose agregaron 100 ml a cad a pozo de las dilucionesdel suero de los ratones 1:25, y el sobrenadante con-centrado de los hibridomas. Por ultimo se adiciona-ron 100 III de la protefna G marcada y se revelo conbuffer citrato fosfato pH 5,0, ortophenilendiamina yH202. Se leyeron las absorbancias de cada pozo enun espectototemetro a 492 nm. Como controles po-sitivos se usaron sueros bovinos positivos por sero-neutralizacion y por ELISA y un suero hiperinmunecontra IBR obtenido en conejo; igualmente se utiliza-ron como controles negativos sueros bovinos negati-vos por ELISA y por seroneutralizacion.

Inmunodot

EI inmunodot se usa como prueba confirmatoria paradetectar anticuerpos producidos por los hfbridomas.En papel de nitrocelulosa se fijo el antfgeno (cepa decampo fraccionada por sonicacion), se bloqueo conTTBS-Ieche (Buffer Tris salina pH 7,5, 0,05% de Tween20, leche descremada 5%), se adiciono el anticuerpoprimario; se adiciono el conjugado (Ia protefna G mar-cad a con peroxidasa) al que se Ie adiciono el sustrato(Buffer acetato, HP2 y solucion de aminoetilcarbazolen dimetil formamida) (Deutscher, 1990).

Western blot

La tecnica de western blot de Burnett en 1981 se usapara analizar la reactividad de anticuerpos monoclonalesproducidos por hfbridos fusionados. La cepa de campofue sometida a fraccionamiento en dos ciclos desonicacion, y sus protefnas se concentraron por preci-pitacion etanolica (Deutscher, 1990). Las protefnas sesepararon por electroforesis PAGE-SDS al 10% Lospeptidos fueron transferidos a papel de nitrocelulosa(Inmobilon P) con el equipo Trans Blot de Biorad a 80

ANTICUERPOS MONOCLONALES CONTRA PROTEINAS DE LA NUCLEOcApSIDE DEL VIRUS IBR

mAmp por 90 minutos. La inmunodeteccion de lospeptidos transferidos se realize con sueros positivos ynegativos y con los sobrenadantes con anticuerposmonoclonales 0 producidos.

Seroneutral izaci6n

Por medio de la prueba de seroneutralizacion, se ana-lizaron los sobrenadantes de los hibridos productoresde anticuerpos contra las proteinas del virus de la cepade campo en estudio. Se realizaron diluciones en base2 con medio de los sueros bovinos positivos y negati-vos usados como sueros control, de los sobrenadantesde los hibridomas. Se adicionaron 50 III de la suspen-sion del virus (dilucion de trabajo) que contenia 100DITC 50% del virus de la cepa de campo con la quese realize este estudio. Las cajas se incubaron a 3rCdurante una hora. Se adiciono la suspension de celu-las MDSK en todos los pozos de la caja. Las placas sesellaron e incubaron a 3rC por 72 horas.

RESULTADOS Y DISCUSION

Es bien conocida la importancia de los anticuerposmonoclonales en el desarrollo de rnetodos de diag-nostico, ya sea mediante su uso directo 0 comoreactivos para la purittcacton de rnoleculas de interes;adernas, con pocas cantidades de antigeno una vezse logren producir, se obtiene un reactivo bioloqico in-mortal. Todas estas propiedades hacen de ellos unaherramienta ideal para la puriticacion y el estudio deproteinas. Como parte de una estrategia encaminadaa la normalizaci6n de metodologias que permitan laproduccion de anticuerpos hornoqeneos contra el vi-rus de ISR, y su uso en posteriores ensayos que faci-liten la estandarizaci6n de pruebas diaqnosticas paraeste agente viral, se produjeron anticuerpos mono-clonales contra proteinas de una cepa de campo delvirus de la rinotraqueitis bovina infecciosa.

Dentro de los procesos previos a la producci6n delinrnunoqeno, se ensayaron varios metod os de concen-traci6n y purificaci6n de particulas virales, siendo el masefectivo la ultracentrifugaci6n con colchones de sucrosaaI30%, 10cual coincide con 10reportado por Israel (1992).Por otra parte, se disefi6 una estrategia para la obten-ci6n de nucleocapsides para obviar los potenciales ries-gos de contaminaci6n que se corren con el virus de dia-rrea viral bovina cepa no citopatica, evitando la obtenci6nde componentes estructurales externos del virus de ISR,siendo esta la primera aproximaci6n que se reporta en

CARRfL 2

KDa 19311286

7057

39

36

Figura 1. SDS-PAGE 10% preparativa de la cepa de campo delvirus IBR tefiida con azul de Coomassie. Carril 1: patron de pesomolecular. Carril 2: peptidos virales separados.

la literatura, con relaci6n a una probable contarninacioncon el virus de diarrea viral bovina.

Las proteinas de las nucleocapsides fueron con-centradas por precipitaci6n etan61ica para ser someti-das a PAGE-SDS preparativa al 10%. EI gel se colo-reo con azul de Coomassie para detectar proteinasen el range de mg. Los peptidos virales de mayor con-centraci6n proteica fueron: 128,8; 89,1 Y 83,1; 50,1 Y53,7; 39,8; 27,5 kDa (veasefigura 1), seleccionandosepara este estudio la proteina de 39,8 kDa, la cual evi-denci6 diversos comportamientos en pruebas deseroneutralizaci6n, dot, western blot y ELISA, ya queen cada prueba, el antigeno se us6 de manera dife-rente (denaturado, sonicado, virus completo con pro-teinas nativas).

La concentracion aproximada de protefnas viralespor cm de gel inoculado a cada raton fue de 20 Ilg/ml;esto coincide con 10reportado por Goding, quien indi-ca que una concentracion optima de antigeno debeestar entre 10 a 50 Ilg (Goding, 1980). De los ratoneshembras inmunizados con las band as se tom6 mues-tra de sangre de la vena coxal antes de cada inmuni-zacion para observar la seroconversi6n detectada porELISA. Se obtuvo una seroconversi6n hacia el dfa 14

.de-inmunizaci6n, y los anticuerpos se mantuvieron

.h~sta el dia 'del sacrificio (vease figura 2).. \...r

... 117.... 1 ,

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Esquema de inoculacion

Figura 2. Titulaci6n por ELISA de anticuerpos IgG anti IBR de lossueros de ratones Balb/c inmunizados con los peptidos del virus IBR.

Para la fusi6n celular se trabaj6 con la linea demieloma X-63 AgS653 por no producir anticuerpos pro-pios y por su estabilidad. Las celulas de mieloma fueronfusionadas con las celulas de bazo de ratonesinmunizados, y se seleccionaron usando como sup le-mento en el medio el HAT,produciendose sobrenadantesricos en anticuerpos que reconocen de manera diversala proteina de 39,S kDa (vease figura 3).

Se obtuvieron ocho hibridos positivos, que pordiluci6n limite originaron 56 c1onos productores de an-ticuerpo monoespecifico, Los hfbridos iniciales se se-leccionaron de acuerdo con los resultados de la prue-

•Figura 3. Hibridomas producidos por la fusi6n de las celulas debazo de ratones inmunizados con protefnas de la cepa de campodel virus IBR y celulas de mieloma (10x).

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ba ELISA, Y adernas se probaron por inmunodot yseroneutralizaci6n. Los sobrenadantes de loshibridomas son positives por inmunodot, y cuatro deellos fueron positivos por seroneutralizaci6n (vease ta-bla 1). Lo anterior indica que los anticuerposmonoclonales producidos reconocen esta proteina dediversas formas, ya que en cada prueba el antigenose us6 de manera diferente (denaturado, sonicado,virus completo con proteinas nativas). En la seroneu-tralizaci6n, el anticuerpo monoespecifico reconoce laproteina viral nativa y no permite la penetraci6n delvirus en la celula huesped (MDBK); por tanto, hay re-conocimiento del anticuerpo con la proteina, 10 quepermite sugerir, de acuerdo con los resultados de estetrabajo, la posible presencia de estas proteinas en laenvoltura del virus, ya que se han reportado proteinasde 9 kDa ligadas con una proteina no identificada de39 kDa, las cuales estan asociadas con la gM cuyopapel se relaciona con la penetraci6n de la membranay la fusi6n celula-celula (Wu, 1995).

Lo anterior indica que con estos monoclonalesse podrian realizar estudios futuros sobre la funci6nde esta glicoprotefna M. Por western blot se detecta-ron cinco c1onos de los 56 que reconocen la proteinade 39,S kDa (vease figura 4), 10 que confirma la es-pecificidad de los anticuerpos monoclonales produ-cidos, los cuales pueden servir como instrumento parainvestigar el papel funcional de esta proteina viral ysu relaci6n con la celula infectada. Los anticuerposmonoclonales producidos reconocen el virus de IBR,ya que son especificos para una proteina (39,S kDa)que la com parten el virus de referencia (Iowa) y lacepa de campo aislada en 1999.

Tabla 1. ldentificacion de los hibridomas productoresde anticuerpos monoclonales positivos para laprotefna de 39,8 kDa de la cepa del virus ISR.

Designaci6n PRUEBAS

del hibrido Elisa' (Abs) Inmunodot S. N. (TItulo)

1 0,344 (+) Np2 0,450 (+) Np3 0,533 (+) Negativo4 0,483 (+) 1/165 0,493 (+) 1/646 0,402 (+) Negativo7 0,439 (+) 1/648 0,623 (+) 1/128

c+ 0,420 (+) 1/64c- 0,028 (-) Negativo

(Np: no procesado)

ANTICUERPOS MONOCLONALES CONTRA PROTEINAS DE LA NUCLEOcApSIDE DEL VIRUS IBR

CARRIL 2 3 4

39.8 kDa]

!J

Figura 4. ldentificacion por western blot de la proteina de 39,8kOa del virus IBR previa PAGE-SOS 12%. Carriles 1, 2, 3 Y 4:reconocimiento de la proteina de 39,8 kOa por los anticuerposmonoclonales producidos.

Esto se confirm6 mediante una prueba de ELISAde captura, donde se fijaron los anticuerposmonoclonales a la fase s6lida; posteriormente seadicion6 el virus. Este complejo Ag-Ac formado porlos anticuerpos monoclonales y de forma indepen-diente tanto con la cepa de campo como con la dereferencia (Iowa), fue reconocido por un segundoanticuerpo bovino anti IBR, al que se Ie fij6 la protei-na G marcada con peroxidasa. Esto indica que losanticuerpos monoclonales pueden reconocer partf-culas virales de manera especifica y permiten su re-comendaci6n como herramienta diagn6stica paradetectar la presencia del virus IBA.

En conclusi6n, se logr6 normalizar una meto-dologia para la obtenci6n de nucleocapsides del vi-rus de IBR; se seleccion6 la proteina de 39,8 kDapor su particular respuesta observada en el desa-rrollo de diferentes procesos; se pudo establecer porpruebas serol6gicas (ELISA) el reconocimiento dela cepa de campo como de la cepa de referenciaIowa por los anticuerpos monoclonales producidos;la prueba de ELISA y el inmunodot son sensiblescomo pruebas de screning en la determinaci6n deanticuerpos monoclonales contra peptidos deiIBR.Por todo 10 anterior, los anticuerpos monoclonalesproducidos contribuiran como una herramienta enel mejoramiento diagn6stico, gracias a las caracte-risticas que poseen los anticuerpos monoclonalescomo son su alta especificidad, homologfa y sensi-bilidad. Por tal raz6n, con estos anticuerpos se po-

dran normalizar tecnicas de diagn6stico como ELISA,inmunofluorescencia, inmunoperoxidasa, etc., tecni-cas que pod ran ofrecer diagn6sticos precisos quecontribuyan con el control de la enfermedad .

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo fue desarrollado con el apoyo de la Uni-dad Investigativa de la Universidad Nacional de Co-lombia (Dinain) en el concurso en categorfa de tra-bajos de maestria, Dinain 2000, y dentro del programade posgrado con la participaci6n del Bioterio de laFacultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia dela Universidad Nacional de Colombia.

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