双歧杆菌表达的重组人grb-vrb融合蛋白诱导kdr阳性 · pdf...
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201232(7) 南方医科大学学报（J South Med Univ）
血管内皮生长因子(VEGF) 是具有强烈诱导和促
进血管形成作用的血管生长因子该作用通过其与血管
内皮生长因子受体（VEGFR）结合而介导［1］ II 型
VEGFR（VEGFR-2）又称为激酶功能区受体（KDR
Flt-1）是介导VEGF在肿瘤新生血管形成发挥功能的主
要受体VEGF 肽链氨基端 110 个氨基酸残基多肽
（VEGF110）是识别并结合 VEGFR 的区域称为
VEGFR结合肽（VRB）［1-3］恶性肿瘤的生长和转移依
赖于血管生成VEGFR是肿瘤血管生成的特异性分子
标志因而成为抗血管生成治疗的主要靶分子颗粒酶
B（GrB）系淋巴细胞的细胞毒因子之一是淋巴细胞发
挥抗肿瘤抗病毒作用的主要效应分子GrB在穿孔素
或其它破坏细胞膜的分子的协助下能通过细胞膜进入
靶细胞内激活多条信号传导途径诱导细胞凋亡［4-6］
根据恶性肿瘤血管生成的特点和人体细胞免疫的
分子机制有可能利用VRB的导向作用使GrB靶向作
用于肿瘤血管破坏内皮细胞和肿瘤细胞达到治疗肿
瘤的目的我们分别克隆了人VRB基因cDNA片段和
GrB基因cDNA通过基因重组技术构建了pBBADx-
VRBpBBADx-GrB 和 pBBADx-GrB-VRB 表达载体
在大肠杆菌中表达对表达产物的抗血管生成作用进行
了研究［7-9］本实验中我们将这些重组表达载体转化双
歧杆菌L-阿拉伯糖诱导表达重组蛋白研究GrB-VRB
临床研究
双歧杆菌表达的重组人GrB-VRB融合蛋白诱导KDR阳性细胞凋亡陈 蕾 1曾位森 2郑 航 1
南方医科大学 1南方医院肿瘤科2基础医学院细胞生物学教研室广东 广州 510515
Granzyme B-VEGF receptor-binding peptide fusion protein expressed in B longuminduces apoptosis of KDR-positive cellsCHEN Lei1 ZENG Weisen2 ZHENG Hang1
1Department of Oncology Nanfang Hospital 2Department of Cell Biology Southern Medical University Guangzhou 510515 China
摘要目的 在双歧杆菌中表达重组人颗粒酶B-血管内皮生长因子结合肽（GrB-VRB）融合蛋白并研究其对血管内皮生长因子
受体 II（KDR）阳性细胞的作用方法 采用电穿孔法将重组表达载体转入双歧杆菌以ELISA和免疫印迹鉴定表达产物以细
胞增殖试验和TUNEL法分析其对KDR阳性细胞的影响结果 工程化化双歧杆菌培养物的上清和菌体中均有重组产物重组
人GrB-VRB能有效抑制KDR阳性如人脐静脉血管内皮细胞株HUVEC小鼠结肠癌细胞株CT-26细胞增殖细胞死亡这种死
亡的机制是细胞凋亡但对KDR阴性细胞则无这些作用结论 工程化双歧杆菌能分泌性表达重组GrB-VRB融合蛋白其在
VRB的靶向作用下GrB可有效地诱导KDR阳性细胞凋亡
关键词颗粒酶B血管内皮生长因子受体结合肽双歧杆菌细胞凋亡
中图分类号R73054 文献标志码A 文章编号1673-4254（2012）07-1059-05
doi 103969jissn1673-4254201207035 httpwwwcnkinetkcmsdetail441627R201206201118003html
Abstract Objective To express granzyme B-vascular endothelial growth factor (VEGF) receptor-binding peptide (GrB-VRB)fusion protein in Bifidobacteria longum (B longum) and investigate the effects of this fusion protein on the proliferation andapoptosis of cells expressing VEGF receptor II the kinase domain receptor (KDR) Methods The recombinant expressionvectors pBBADx-VRB pBBADx-GrB and pBBADx-GrB-VRB were separately transformed into B longum cells byelectroporation The expressed products were identified by enzyme-linked immunosorbent assay and Western blotting andtheir effects on KDR-positive cells were analyzed using proliferation assay and TUNEL assay Results The expressed productswere detected in both the supernatant and cellular fractions of B longum cells The recombinant GrB-VRB fusion proteinreacted with such KDR-positive cells as human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) and mouse colon cancer cell lineCT-26 and caused obvious cell proliferation inhibition cytotoxicity and cell apoptosis in these cells Conculsion Therecombinant GrB-VRB fusion protein secreted by the engineered B longum cells can induce KDR-positive cell death as theresult of GrB-induced cell apoptosis following the cell recognition by VRBKey words granzyme B vascular endothelial growth factor receptor-binding peptide bifidobacteria apoptosis
基础研究
收稿日期2012-03-25
基金项目广东省医学科研基金（A2009412）广东省自然科学基金
（7300385）
作者简介陈 蕾在读硕士研究生E-mail 100491985qqcom
通讯作者郑 航博士副主任医师硕士生导师电话020-62787749
E-mail zhengh001163com曾位森硕士副研究员硕士生导师电
话020-61647073E-mail wszengfimmucom
middotmiddot1059
南方医科大学学报（J South Med Univ） 第32卷
融合蛋白能否作用于KDRFlt-1阳性的血管内皮细胞
和肿瘤细胞及其作用为口服这种工程化双歧杆菌使之
在肠道内表达重组GrB-VRB靶向性地作用于新生血
管内皮细胞治疗有关肠道肿瘤提供一些实验依据
1 材料与方法
11 材料
重组表达载体 pBBADx-VRBpBBADx-GrB 和
pBBADx-GrB-VRB由本室构建［8-9］长型双歧杆菌人
脐静脉血管内皮细胞株HUVEC小鼠结肠癌细胞株
CT-26人结肠癌细胞株SW480人Burkitts淋巴瘤细胞
株 Raji小鼠成纤维细胞株 NIH3T3 均为本室保存
MRS 培养基购自 DificoPRMI 1640 培养基购自
Gibco新生牛血清（NCS）购自杭州四季青生物工程材
料研究所抗人GrB单克隆抗体购自DakoHRP-羊抗
鼠 Ig抗体购自 Jackson Immuno可溶性膜蛋白相位分
离制备试剂盒为美国GENMED产品人GrB ELISA试
剂盒和人VEGF ELISA试剂盒购自RampD磺酰罗丹明
B（SRB）细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒和TUNEL
（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡原位
检测试剂盒购自凯基生物公司PVDF膜购自Pierce电
转化仪为Bio-Rad产品厌氧盒为bioMrieuxregsa产品
12 细菌及细胞的培养
双歧杆菌接种于MRS 培养基中37 厌氧培养
各种细胞株均培养于含10 NCS的RPMI 1640培养基
中置37 5 CO2培养箱中培养2 d换液传代1次
将细胞洗涤后供实验用实验用细胞为状况良好的对数
生长期细胞
13 重组表达载体转化双歧杆菌
采用电穿孔法在电压25 kV电容25 μF电阻
200 Ω 条件下将3种重组表达载体分别转入双歧杆
菌将转化后双歧杆菌接种于含60 μgml氨苄西林的
MRS固体选择培养基37 厌氧培养挑取乳白色圆
形边缘光滑完整的阳性菌落接种于MRS液体培养基
中37 厌氧培养
14 重组蛋白的诱导表达
为了将外源基因转化双歧杆菌的表达产物直接用
于有关细胞实验中重组蛋白的诱导表达在PRMI 1640
培养液（用丙酸调节pH值65左右）中进行基因转化
双歧杆菌接种于PRMI 1640培养基后37 厌氧培养
至D650为06~10时加终浓度为02的L-阿拉伯糖诱
导表达培养24 h取样分离上清和菌体进行鉴定小
量分装培养上清-70 保存备用
15 ELISA
采用VEFG ELISA检测试剂盒测定培养上清中
rhVRB的含量以GrB ELISA试剂盒测定培养上清中
rhGrB和 rhGrB-VRB的含量操作按ELISA试剂盒说
明书进行培养上清中重组蛋白的浓度根据ELISA
测定结果和各重组蛋白的计算相对分子质量折算为摩
尔浓度便于应用于细胞培养实验
16 免疫印迹
分别取经L-阿拉伯糖诱导表达24 h的转基因双歧
杆菌菌体和培养上清经样品处理液煮沸处理后进行
SDS-PAGE（12凝胶）电泳完成后将蛋白转移到
PVDF膜上5脱脂奶粉封闭过夜加抗GrB单克隆抗
体室温反应2 h洗涤后与HRP-兔抗鼠Ig抗体室温反应
2 h加入化学发光剂放入暗盒中压片2~5 min后显
影定影
收取生长状态良好的各细胞株离心洗涤后收集细
胞采用可溶性膜蛋白相位分离制备试剂盒制备各细胞
株的膜蛋白样品操作按说明书进行膜蛋白进行
SDS-PAGE（10凝胶）如上转膜和封闭后加抗Flk-1
单克隆抗体反应余同上
17 细胞生长抑制实验
收集生长状态良好的细胞洗涤后重悬为适当密度
的细胞悬液加入96孔培养板每孔105细胞并加入含
一定终浓度工程化双歧杆菌产物的培养上清培养一定
时间在显微镜下观察拍照保存资料按照SRB细
胞增殖及细胞毒性检测试剂盒说明书进行固定染色
脱色最后在酶联仪上测定D515值
18 TUNEL细胞凋亡原位检测
收集细胞株HUVEC在培养板中每孔加入105细
胞加入含rhGrB-VRB培养上清至rhGrB-VRB终浓度
为 8 nmol培养 24 h取细胞进行涂片固定采用
TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒分析细胞凋亡操作
按照说明书进行
19 统计学分析
实验数据用SPSS 160 统计软件进行单因素方差
分析多个样本均数间每两个均数的比较采用SNK法
（q检验）两样本间用独立样本t检验
2 结果
21 重组蛋白的表达
工程化双歧杆菌经L-阿拉伯糖诱导表达培养24 h
分离各上清以 ELISA 方法检测重组蛋白 rhVRB
rhGrB和 rhGrB-VRB发现有重组蛋白分泌表达其含
量大致在05~10 μgml分离GrB-VRB基因转化双歧杆
菌培养物的菌体和上清进行免疫印迹鉴定发现上清
和菌体样本均在约38 000处出现蛋白条带（图1）表明
除上清中有rhGrB-VRB外菌体内也存在rhGrB-VRB
22 KDRFlk-1在几种不同类型细胞中的表达
将各细胞株的膜蛋白样品进行免疫印迹分析发现
middotmiddot1060
陈 蕾等双歧杆菌表达的重组人GrB-VRB融合蛋白诱导KDR阳性细胞凋亡第7期
HUVEC和CT-26细胞的膜蛋白出现了约 125 000条
带前者很强而后者较弱表明HUVEC表达高水平的
KDRFlk-1CT-26也表达KDRFlk-1但水平较低另
外几个细胞株包括SW480Raji和NIH3T3则否（图2）
23 rhGrB-VRB抑制HUVEC和CT-26细胞生长
加入不同终浓度的各种重组蛋白处理KDRFlT-1
阳性细胞HUVEC 24 hSRB法测定细胞存活水平发
现rhGrB-VRB对HUVEC的增殖具有显著抑制作用并
呈浓度依赖关系rhGrB未见任何影响而 rhVRB显示
轻微的促生长作用（图3）分析 rhGrB-VRB对不同细
胞生长的影响发现低浓度 rhGrB-VRB即对HUVEC
有明显抑制作用（未给出资料）达到一定浓度（8 nmol）
时对较低表达KDRFlt-1的CT-26细胞也有明显的生
长抑制作用但对KDRFlt-1阴性细胞的增殖无任何影
响（图4）
24 rhGrB-VRB对HUVEC的细胞毒作用
用终浓度 8 nmolL rhGrB-VRB处理HUVEC光
镜下观察发现rhGrB-VRB具有快速强烈的细胞毒性
作用作用30 min时光镜下即可观察到细胞发生剧
烈变化处理12 h时大多数细胞死亡裂解仅剩细胞
痕迹而rhGrB处理12 h的细胞则未见明显变化（图5）
25 rhGrB-VRB诱导HUVEC细胞凋亡
以终浓度8 nmolL rhGrB-VRB处理HUVEC 24 h
采用TUNEL法分析细胞凋亡情况发现只加培养液的
对照组仅有少数细胞核TUNEL标记阳性阳性率约
13而rhGrB-VRB处理的实验组细胞绝大多数细胞
核TUNEL标记阳性阳性率达89（图6）
3 讨论
目前尽管肿瘤的治疗进展迅速但仍未能找到确
切有效的治疗药物和措施尤其肿瘤的转移性更是困扰
医学界的一大难题大量研究证明实体瘤的发生发
展和转移都依赖于肿瘤血管的生成当瘤体长大到一
定大小后需要新生血管来提供肿瘤细胞迅速增长所需
要的养分［10-11］许多实验证明抗血管生成治疗是抑制
肿瘤生长和转移的有效途径［12-13］然而目前许多在研
1 2 3 4
45 000
35 000
图1 免疫印迹分析rhGrB-VRB融合蛋白1 诱导前上清 2 诱导24 h菌体 3 诱导12 h培养上
清 4 诱导24 h培养上清
Fig1 Analysis of rhGrb-VRB fusion protein byWestern blotting
图2 免疫印迹分析KDRFlk-1在不同细胞株中的表达1 HUVEC 2 CT-26 3 SW480 4 Raji 5 NIH3T3
Fig2 Analysis of KDRFlt-1 expressions indifferent cells by Western blotting
116 000
1 2 3 4 5
FIK-1
图3 不同浓度重组蛋白对人血管内皮细胞HUVEC增值的影响Fig3 Effects of different recombinant proteins on theproliferation of human umbilical vein endothelial cells(HUVECs)
20
18
16
14
12
10
08
06
04
02
0
D51
5nm
1640VRBGrBGrB-VRB
0 2 4 8 16
ρ重组蛋白(nmolmiddotL-1)
图4 rhGrB-VRB抑制HUVEC和CT-26细胞增殖GrB-VRB 处理组分别与 GrB 处理组和 VRB 处理组比
较 Plt001
Fig4 Inhibition of the proliferation of HUVECs andCT-26 cells by rhGrB-VRB
GrB-VRBGrBVRB
140
120
100
80
60
40
20
0
细胞
存活
率(
)
HUVEC CT-26 NIH3T3
Mr
Mr
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南方医科大学学报（J South Med Univ） 第32卷
的抗血管生成药物只能简单抑制肿瘤血管的形成不能
破坏已经形成的新生血管因而只能限制肿瘤的生长和
转移不能彻底消除肿瘤病灶的问题
近年来我们根据恶性肿瘤血管生成的特点和机体
细胞免疫的分子机制选择VRB作为导向工具以GrB
为效应分子通过基因重组技术使二者形成融合基因
GrB-VRB并以双歧杆菌为载体期望通过口服工程化
双歧杆菌的方式使之在肠道内表达重组GrB-VRB能
靶向性地作用于新生血管内皮细胞诱导新生血管内皮
细胞凋亡达到靶向性治疗肠道肿瘤的目的近年我
们已对双歧杆菌作为效应分子基因载体进行了一些研
究［14-16］本实验中我们将前期构建的重组表达载体
pBBADx-VRBpBBADx-GrB 和 pBBADx-GrB-VRB
转化长型双歧杆菌经L-阿拉伯糖诱导表达了rhVRB
rhGrB 和 rhGrB-VRB 蛋白有关功能实验证明
rhGrB-VRB蛋白能有效抑制KDRFlk-1阳性细胞如人
脐静脉血管内皮细胞HUVEC和小鼠结肠癌细胞CT-26
的增殖但对KDRFlk-1阴性的细胞则否还发现
rhGrB-VRB蛋白可迅速引起KDRFlk-1阳性细胞死
亡而这种死亡的机制是细胞凋亡本实验未发现人结
图5 rhGrB-VRB对HUVEC的细胞毒作用A 处理前细胞 B rhGrB-VRB处理30 min C rhGrB-VRB处理12 h D rhGrB处理12 h
Fig6 Cytotoxicity of HUVECs mediated by rhGrB-VRB (Original magnification times100)
A B
C D
A B
图6 rhGrB-VRB诱导HUVEC细胞凋亡A 对照组 少数细胞核TUNEL标记阳性 B 实验组 绝大多数细胞核TUNEL标记阳性
Fig6 Apoptosis of HUVECs induced by rhGrB-VRB (Original magnification times400)
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陈 蕾等双歧杆菌表达的重组人GrB-VRB融合蛋白诱导KDR阳性细胞凋亡第7期
肠癌细胞株SW480表达KDRFlk-1下一步将选取多
种人肠道肿瘤细胞株活检或手术切除的新鲜肠道肿瘤
组织进行鉴定并分析其对rhGrB-VRB的敏感性开展
荷瘤动物模型的研究以期为 rhGrB-VRB基因转化分
歧杆菌的临床应用铺平道路
综上利用双歧杆菌表达的重组GrB-VRB蛋白抗
肿瘤血管生成治疗方法模拟了淋巴细胞生理性的作用
机制克服了一般血管抑制剂只能抑制血管生成的缺点
既可破坏肿瘤新生的血管又可直接攻击肿瘤细胞本身
能较好地抑制肿瘤的生长和转移可望彻底消除肿瘤
病灶在防治大肠癌等肠道肿瘤方面取得较大突破
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（编辑陈望忠）
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（编辑吴锦雅）
1050893105089310508931050893105089310508931050893105089310508931050893105089310508931050893105089310508931050893105089310508931050893105089310508931050893105089310508931050893105089310508931050893105089310508931050893105089310508931050893105089310508931050893105089310508931050893105089310508931050893105089310508931050893105089310508931050893105089310508931050893105089310508931050893105089310508931050893105089310508931050893
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南方医科大学学报（J South Med Univ） 第32卷
融合蛋白能否作用于KDRFlt-1阳性的血管内皮细胞
和肿瘤细胞及其作用为口服这种工程化双歧杆菌使之
在肠道内表达重组GrB-VRB靶向性地作用于新生血
管内皮细胞治疗有关肠道肿瘤提供一些实验依据
1 材料与方法
11 材料
重组表达载体 pBBADx-VRBpBBADx-GrB 和
pBBADx-GrB-VRB由本室构建［8-9］长型双歧杆菌人
脐静脉血管内皮细胞株HUVEC小鼠结肠癌细胞株
CT-26人结肠癌细胞株SW480人Burkitts淋巴瘤细胞
株 Raji小鼠成纤维细胞株 NIH3T3 均为本室保存
MRS 培养基购自 DificoPRMI 1640 培养基购自
Gibco新生牛血清（NCS）购自杭州四季青生物工程材
料研究所抗人GrB单克隆抗体购自DakoHRP-羊抗
鼠 Ig抗体购自 Jackson Immuno可溶性膜蛋白相位分
离制备试剂盒为美国GENMED产品人GrB ELISA试
剂盒和人VEGF ELISA试剂盒购自RampD磺酰罗丹明
B（SRB）细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒和TUNEL
（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡原位
检测试剂盒购自凯基生物公司PVDF膜购自Pierce电
转化仪为Bio-Rad产品厌氧盒为bioMrieuxregsa产品
12 细菌及细胞的培养
双歧杆菌接种于MRS 培养基中37 厌氧培养
各种细胞株均培养于含10 NCS的RPMI 1640培养基
中置37 5 CO2培养箱中培养2 d换液传代1次
将细胞洗涤后供实验用实验用细胞为状况良好的对数
生长期细胞
13 重组表达载体转化双歧杆菌
采用电穿孔法在电压25 kV电容25 μF电阻
200 Ω 条件下将3种重组表达载体分别转入双歧杆
菌将转化后双歧杆菌接种于含60 μgml氨苄西林的
MRS固体选择培养基37 厌氧培养挑取乳白色圆
形边缘光滑完整的阳性菌落接种于MRS液体培养基
中37 厌氧培养
14 重组蛋白的诱导表达
为了将外源基因转化双歧杆菌的表达产物直接用
于有关细胞实验中重组蛋白的诱导表达在PRMI 1640
培养液（用丙酸调节pH值65左右）中进行基因转化
双歧杆菌接种于PRMI 1640培养基后37 厌氧培养
至D650为06~10时加终浓度为02的L-阿拉伯糖诱
导表达培养24 h取样分离上清和菌体进行鉴定小
量分装培养上清-70 保存备用
15 ELISA
采用VEFG ELISA检测试剂盒测定培养上清中
rhVRB的含量以GrB ELISA试剂盒测定培养上清中
rhGrB和 rhGrB-VRB的含量操作按ELISA试剂盒说
明书进行培养上清中重组蛋白的浓度根据ELISA
测定结果和各重组蛋白的计算相对分子质量折算为摩
尔浓度便于应用于细胞培养实验
16 免疫印迹
分别取经L-阿拉伯糖诱导表达24 h的转基因双歧
杆菌菌体和培养上清经样品处理液煮沸处理后进行
SDS-PAGE（12凝胶）电泳完成后将蛋白转移到
PVDF膜上5脱脂奶粉封闭过夜加抗GrB单克隆抗
体室温反应2 h洗涤后与HRP-兔抗鼠Ig抗体室温反应
2 h加入化学发光剂放入暗盒中压片2~5 min后显
影定影
收取生长状态良好的各细胞株离心洗涤后收集细
胞采用可溶性膜蛋白相位分离制备试剂盒制备各细胞
株的膜蛋白样品操作按说明书进行膜蛋白进行
SDS-PAGE（10凝胶）如上转膜和封闭后加抗Flk-1
单克隆抗体反应余同上
17 细胞生长抑制实验
收集生长状态良好的细胞洗涤后重悬为适当密度
的细胞悬液加入96孔培养板每孔105细胞并加入含
一定终浓度工程化双歧杆菌产物的培养上清培养一定
时间在显微镜下观察拍照保存资料按照SRB细
胞增殖及细胞毒性检测试剂盒说明书进行固定染色
脱色最后在酶联仪上测定D515值
18 TUNEL细胞凋亡原位检测
收集细胞株HUVEC在培养板中每孔加入105细
胞加入含rhGrB-VRB培养上清至rhGrB-VRB终浓度
为 8 nmol培养 24 h取细胞进行涂片固定采用
TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒分析细胞凋亡操作
按照说明书进行
19 统计学分析
实验数据用SPSS 160 统计软件进行单因素方差
分析多个样本均数间每两个均数的比较采用SNK法
（q检验）两样本间用独立样本t检验
2 结果
21 重组蛋白的表达
工程化双歧杆菌经L-阿拉伯糖诱导表达培养24 h
分离各上清以 ELISA 方法检测重组蛋白 rhVRB
rhGrB和 rhGrB-VRB发现有重组蛋白分泌表达其含
量大致在05~10 μgml分离GrB-VRB基因转化双歧杆
菌培养物的菌体和上清进行免疫印迹鉴定发现上清
和菌体样本均在约38 000处出现蛋白条带（图1）表明
除上清中有rhGrB-VRB外菌体内也存在rhGrB-VRB
22 KDRFlk-1在几种不同类型细胞中的表达
将各细胞株的膜蛋白样品进行免疫印迹分析发现
middotmiddot1060
陈 蕾等双歧杆菌表达的重组人GrB-VRB融合蛋白诱导KDR阳性细胞凋亡第7期
HUVEC和CT-26细胞的膜蛋白出现了约 125 000条
带前者很强而后者较弱表明HUVEC表达高水平的
KDRFlk-1CT-26也表达KDRFlk-1但水平较低另
外几个细胞株包括SW480Raji和NIH3T3则否（图2）
23 rhGrB-VRB抑制HUVEC和CT-26细胞生长
加入不同终浓度的各种重组蛋白处理KDRFlT-1
阳性细胞HUVEC 24 hSRB法测定细胞存活水平发
现rhGrB-VRB对HUVEC的增殖具有显著抑制作用并
呈浓度依赖关系rhGrB未见任何影响而 rhVRB显示
轻微的促生长作用（图3）分析 rhGrB-VRB对不同细
胞生长的影响发现低浓度 rhGrB-VRB即对HUVEC
有明显抑制作用（未给出资料）达到一定浓度（8 nmol）
时对较低表达KDRFlt-1的CT-26细胞也有明显的生
长抑制作用但对KDRFlt-1阴性细胞的增殖无任何影
响（图4）
24 rhGrB-VRB对HUVEC的细胞毒作用
用终浓度 8 nmolL rhGrB-VRB处理HUVEC光
镜下观察发现rhGrB-VRB具有快速强烈的细胞毒性
作用作用30 min时光镜下即可观察到细胞发生剧
烈变化处理12 h时大多数细胞死亡裂解仅剩细胞
痕迹而rhGrB处理12 h的细胞则未见明显变化（图5）
25 rhGrB-VRB诱导HUVEC细胞凋亡
以终浓度8 nmolL rhGrB-VRB处理HUVEC 24 h
采用TUNEL法分析细胞凋亡情况发现只加培养液的
对照组仅有少数细胞核TUNEL标记阳性阳性率约
13而rhGrB-VRB处理的实验组细胞绝大多数细胞
核TUNEL标记阳性阳性率达89（图6）
3 讨论
目前尽管肿瘤的治疗进展迅速但仍未能找到确
切有效的治疗药物和措施尤其肿瘤的转移性更是困扰
医学界的一大难题大量研究证明实体瘤的发生发
展和转移都依赖于肿瘤血管的生成当瘤体长大到一
定大小后需要新生血管来提供肿瘤细胞迅速增长所需
要的养分［10-11］许多实验证明抗血管生成治疗是抑制
肿瘤生长和转移的有效途径［12-13］然而目前许多在研
1 2 3 4
45 000
35 000
图1 免疫印迹分析rhGrB-VRB融合蛋白1 诱导前上清 2 诱导24 h菌体 3 诱导12 h培养上
清 4 诱导24 h培养上清
Fig1 Analysis of rhGrb-VRB fusion protein byWestern blotting
图2 免疫印迹分析KDRFlk-1在不同细胞株中的表达1 HUVEC 2 CT-26 3 SW480 4 Raji 5 NIH3T3
Fig2 Analysis of KDRFlt-1 expressions indifferent cells by Western blotting
116 000
1 2 3 4 5
FIK-1
图3 不同浓度重组蛋白对人血管内皮细胞HUVEC增值的影响Fig3 Effects of different recombinant proteins on theproliferation of human umbilical vein endothelial cells(HUVECs)
20
18
16
14
12
10
08
06
04
02
0
D51
5nm
1640VRBGrBGrB-VRB
0 2 4 8 16
ρ重组蛋白(nmolmiddotL-1)
图4 rhGrB-VRB抑制HUVEC和CT-26细胞增殖GrB-VRB 处理组分别与 GrB 处理组和 VRB 处理组比
较 Plt001
Fig4 Inhibition of the proliferation of HUVECs andCT-26 cells by rhGrB-VRB
GrB-VRBGrBVRB
140
120
100
80
60
40
20
0
细胞
存活
率(
)
HUVEC CT-26 NIH3T3
Mr
Mr
middotmiddot1061
南方医科大学学报（J South Med Univ） 第32卷
的抗血管生成药物只能简单抑制肿瘤血管的形成不能
破坏已经形成的新生血管因而只能限制肿瘤的生长和
转移不能彻底消除肿瘤病灶的问题
近年来我们根据恶性肿瘤血管生成的特点和机体
细胞免疫的分子机制选择VRB作为导向工具以GrB
为效应分子通过基因重组技术使二者形成融合基因
GrB-VRB并以双歧杆菌为载体期望通过口服工程化
双歧杆菌的方式使之在肠道内表达重组GrB-VRB能
靶向性地作用于新生血管内皮细胞诱导新生血管内皮
细胞凋亡达到靶向性治疗肠道肿瘤的目的近年我
们已对双歧杆菌作为效应分子基因载体进行了一些研
究［14-16］本实验中我们将前期构建的重组表达载体
pBBADx-VRBpBBADx-GrB 和 pBBADx-GrB-VRB
转化长型双歧杆菌经L-阿拉伯糖诱导表达了rhVRB
rhGrB 和 rhGrB-VRB 蛋白有关功能实验证明
rhGrB-VRB蛋白能有效抑制KDRFlk-1阳性细胞如人
脐静脉血管内皮细胞HUVEC和小鼠结肠癌细胞CT-26
的增殖但对KDRFlk-1阴性的细胞则否还发现
rhGrB-VRB蛋白可迅速引起KDRFlk-1阳性细胞死
亡而这种死亡的机制是细胞凋亡本实验未发现人结
图5 rhGrB-VRB对HUVEC的细胞毒作用A 处理前细胞 B rhGrB-VRB处理30 min C rhGrB-VRB处理12 h D rhGrB处理12 h
Fig6 Cytotoxicity of HUVECs mediated by rhGrB-VRB (Original magnification times100)
A B
C D
A B
图6 rhGrB-VRB诱导HUVEC细胞凋亡A 对照组 少数细胞核TUNEL标记阳性 B 实验组 绝大多数细胞核TUNEL标记阳性
Fig6 Apoptosis of HUVECs induced by rhGrB-VRB (Original magnification times400)
middotmiddot1062
陈 蕾等双歧杆菌表达的重组人GrB-VRB融合蛋白诱导KDR阳性细胞凋亡第7期
肠癌细胞株SW480表达KDRFlk-1下一步将选取多
种人肠道肿瘤细胞株活检或手术切除的新鲜肠道肿瘤
组织进行鉴定并分析其对rhGrB-VRB的敏感性开展
荷瘤动物模型的研究以期为 rhGrB-VRB基因转化分
歧杆菌的临床应用铺平道路
综上利用双歧杆菌表达的重组GrB-VRB蛋白抗
肿瘤血管生成治疗方法模拟了淋巴细胞生理性的作用
机制克服了一般血管抑制剂只能抑制血管生成的缺点
既可破坏肿瘤新生的血管又可直接攻击肿瘤细胞本身
能较好地抑制肿瘤的生长和转移可望彻底消除肿瘤
病灶在防治大肠癌等肠道肿瘤方面取得较大突破
参考文献［1］ Lazarus A Keshet E Vascular endothelial growth factor and
vascular homeostasis［J］ Proc Am Thorac Soc 2011 8(6) 508-11
［2］ Sakurai T Kudo M Signaling pathways governing tumor
angiogenesis［J］ Oncol 2011 81 (Suppl 1) 24-9
［3］ Takahashi S Vascular endothelial growth factor (VEGF) VEGF
receptors and their inhibitors for antiangiogenic tumor therapy［J］
Biol Pharm Bull 2011 34(12) 1785-8
［4］ Ewen CL Kane KP Bleackley RC A quarter century of granzymes
［J］ Cell Death Differ 2012 19(1) 28-35
［5］ Perl M Denk S Kalbitz M et al Granzyme B a new crossroad of
complement and apoptosis［J］ Adv Exp Med Biol 2012 946
135-46
［6］ Kurschus FC Jenne DE Delivery and therapeutic potential of
human granzyme B［J］ Immunol Rev 2010 235(1) 159-71
［7］ 李先茂 曾位森 张亚历 等 血管内皮生长因子受体结合肽介导颗粒
酶B靶向性抗肿瘤血管生成［J］ 第四军医大学学报 2002 23(21)
1929-32
［8］ 李先茂 曾位森 张亚历 血管生长因子部分多肽抗血管生成的研究
［J］ 中华肿瘤杂志 2002 24(5) 448-50
［9］ 李先茂 曾位森 张亚历 等 颗粒酶B的表达纯化和鉴定［J］ 第四军
医大学学报 2002 23(17) 1556-8
［10］Zhang C Wang QT Liu H et al Advancement and prospects of
tumor gene therapy［J］ Chin J Cancer 2011 30(3) 182-8
［11］Adham SA Sher I Coomber BL Molecular blockade of VEGFR2
in human epithelial ovarian carcinoma cells［J］ Lab Invest 2010 90
(5) 709-23
［12］Linkous AG Yazlovitskaya EM Novel therapeutic approaches for
targeting tumor angiogenesis［J］ Anticancer Res 2012 32(1) 1-12
［13］Waldner MJ Neurath MF Targeting the VEGF signaling pathway in
cancer therapy［J］ Expert Opin Ther Targets 2012 16(1) 5-13
［14］Long RT Zeng WS Chen LY et al Bifidobacterium as an oral
delivery carrier of oxyntomodulin for obesity therapy inhibitory
effects on food intake and body weight in overweight mice［J］ Int J
Obes (Lond) 2010 34(4) 712-9
［15］龙若庭 曾位森 罗深秋 等 胃泌素调节激素在双歧杆菌中的表达及
其转化双歧杆菌对肥胖小鼠体质的影响［J］ 南方医科大学学报
2009 29(9) 1796-8
［16］Deng Q Zeng W Yu Z Signal peptide of Arabinosidase enhances
secretion of interferon-alpha2b protein by Bifidobacteria longum
［J］ Arch Microbiol 2009 191(9) 681-6
（编辑陈望忠）
（上接1058页）［6］ Varma D Baylis O Wride N et al Viscogonioplasty an effective
procedure for lowering intraocular pressure in primary angle
closure glaucoma［J］ Eye (Lond) 2007 21(4) 472-5
［7］ Harasymowycz PJ Papamatheakis DG Ahmed I et al
Phacoemulsification and goniosynechialysis in the management of
unresponsive primary angle closure［J］ J Glaucoma 2005 14(3)
186-9
［8］ 葛 坚 问题和争论是学科发展的动力-原发性闭角型青光眼分类争论
的启示［J］ 中华眼科杂志 2006 42(11) 964-6
［9］ Takanashi T Masuda H Tanito M et al Scleral indentation
optimizes visualization of anterior chamber angle during
goniosynechialysis［J］ J Glaucoma 2005 14(4) 293-8
［10］Mori K Ikushima T Ikeda Y et al Double-mirror goniolens with
dual viewing system for goniosurgery［J］ Am J Ophthalmol 2007
143(1) 154-5
［11］Lima FE Magacho L Carvalho DM et al A prospective comparative
study between endoscopic cyclophotocoagulation and the Ahmed
drainage implant in refractory glaucoma［J］ J Glaucoma 2004 13
(3) 233-7
［12］Philippin H Wilmsmeyer S Feltgen N et al Combined cataract
and glaucoma surgery endoscope-controlled erbium YAG-laser
goniotomy versus trabeculectomy［J］ Graefes Arch Clin Exp
Ophthalmol 2005 243(7) 684-8
［13］Wilmsmeyer S Philippin H Funk J Excimer laser trabeculotomy
a new minimally invasive procedure for patients with glaucoma［J］
Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 2006 244(6) 670-6
［14］Tham CC Leung DY Kwong YY et al Effects of phacoemulsification
versus combined phaco-trabeculectomy on drainage angle status in
primary angle closure glaucoma (PACG)［J］ J Glaucoma 2010 19
(2) 119-23
［15］Kiuchi Y Tsujino C Nakamura T et al Phacoemulsification and
trabeculotomy combined with goniosynechialysis for unco-
ntrollable chronic angle-closure glaucoma［J］ Ophthalmic Surg
Lasers Imaging 2010 41(3) 348-54
（编辑吴锦雅）
1050893105089310508931050893105089310508931050893105089310508931050893105089310508931050893105089310508931050893105089310508931050893105089310508931050893105089310508931050893105089310508931050893105089310508931050893105089310508931050893105089310508931050893105089310508931050893105089310508931050893105089310508931050893105089310508931050893105089310508931050893105089310508931050893105089310508931050893105089310508931050893
middotmiddot1063
陈 蕾等双歧杆菌表达的重组人GrB-VRB融合蛋白诱导KDR阳性细胞凋亡第7期
HUVEC和CT-26细胞的膜蛋白出现了约 125 000条
带前者很强而后者较弱表明HUVEC表达高水平的
KDRFlk-1CT-26也表达KDRFlk-1但水平较低另
外几个细胞株包括SW480Raji和NIH3T3则否（图2）
23 rhGrB-VRB抑制HUVEC和CT-26细胞生长
加入不同终浓度的各种重组蛋白处理KDRFlT-1
阳性细胞HUVEC 24 hSRB法测定细胞存活水平发
现rhGrB-VRB对HUVEC的增殖具有显著抑制作用并
呈浓度依赖关系rhGrB未见任何影响而 rhVRB显示
轻微的促生长作用（图3）分析 rhGrB-VRB对不同细
胞生长的影响发现低浓度 rhGrB-VRB即对HUVEC
有明显抑制作用（未给出资料）达到一定浓度（8 nmol）
时对较低表达KDRFlt-1的CT-26细胞也有明显的生
长抑制作用但对KDRFlt-1阴性细胞的增殖无任何影
响（图4）
24 rhGrB-VRB对HUVEC的细胞毒作用
用终浓度 8 nmolL rhGrB-VRB处理HUVEC光
镜下观察发现rhGrB-VRB具有快速强烈的细胞毒性
作用作用30 min时光镜下即可观察到细胞发生剧
烈变化处理12 h时大多数细胞死亡裂解仅剩细胞
痕迹而rhGrB处理12 h的细胞则未见明显变化（图5）
25 rhGrB-VRB诱导HUVEC细胞凋亡
以终浓度8 nmolL rhGrB-VRB处理HUVEC 24 h
采用TUNEL法分析细胞凋亡情况发现只加培养液的
对照组仅有少数细胞核TUNEL标记阳性阳性率约
13而rhGrB-VRB处理的实验组细胞绝大多数细胞
核TUNEL标记阳性阳性率达89（图6）
3 讨论
目前尽管肿瘤的治疗进展迅速但仍未能找到确
切有效的治疗药物和措施尤其肿瘤的转移性更是困扰
医学界的一大难题大量研究证明实体瘤的发生发
展和转移都依赖于肿瘤血管的生成当瘤体长大到一
定大小后需要新生血管来提供肿瘤细胞迅速增长所需
要的养分［10-11］许多实验证明抗血管生成治疗是抑制
肿瘤生长和转移的有效途径［12-13］然而目前许多在研
1 2 3 4
45 000
35 000
图1 免疫印迹分析rhGrB-VRB融合蛋白1 诱导前上清 2 诱导24 h菌体 3 诱导12 h培养上
清 4 诱导24 h培养上清
Fig1 Analysis of rhGrb-VRB fusion protein byWestern blotting
图2 免疫印迹分析KDRFlk-1在不同细胞株中的表达1 HUVEC 2 CT-26 3 SW480 4 Raji 5 NIH3T3
Fig2 Analysis of KDRFlt-1 expressions indifferent cells by Western blotting
116 000
1 2 3 4 5
FIK-1
图3 不同浓度重组蛋白对人血管内皮细胞HUVEC增值的影响Fig3 Effects of different recombinant proteins on theproliferation of human umbilical vein endothelial cells(HUVECs)
20
18
16
14
12
10
08
06
04
02
0
D51
5nm
1640VRBGrBGrB-VRB
0 2 4 8 16
ρ重组蛋白(nmolmiddotL-1)
图4 rhGrB-VRB抑制HUVEC和CT-26细胞增殖GrB-VRB 处理组分别与 GrB 处理组和 VRB 处理组比
较 Plt001
Fig4 Inhibition of the proliferation of HUVECs andCT-26 cells by rhGrB-VRB
GrB-VRBGrBVRB
140
120
100
80
60
40
20
0
细胞
存活
率(
)
HUVEC CT-26 NIH3T3
Mr
Mr
middotmiddot1061
南方医科大学学报（J South Med Univ） 第32卷
的抗血管生成药物只能简单抑制肿瘤血管的形成不能
破坏已经形成的新生血管因而只能限制肿瘤的生长和
转移不能彻底消除肿瘤病灶的问题
近年来我们根据恶性肿瘤血管生成的特点和机体
细胞免疫的分子机制选择VRB作为导向工具以GrB
为效应分子通过基因重组技术使二者形成融合基因
GrB-VRB并以双歧杆菌为载体期望通过口服工程化
双歧杆菌的方式使之在肠道内表达重组GrB-VRB能
靶向性地作用于新生血管内皮细胞诱导新生血管内皮
细胞凋亡达到靶向性治疗肠道肿瘤的目的近年我
们已对双歧杆菌作为效应分子基因载体进行了一些研
究［14-16］本实验中我们将前期构建的重组表达载体
pBBADx-VRBpBBADx-GrB 和 pBBADx-GrB-VRB
转化长型双歧杆菌经L-阿拉伯糖诱导表达了rhVRB
rhGrB 和 rhGrB-VRB 蛋白有关功能实验证明
rhGrB-VRB蛋白能有效抑制KDRFlk-1阳性细胞如人
脐静脉血管内皮细胞HUVEC和小鼠结肠癌细胞CT-26
的增殖但对KDRFlk-1阴性的细胞则否还发现
rhGrB-VRB蛋白可迅速引起KDRFlk-1阳性细胞死
亡而这种死亡的机制是细胞凋亡本实验未发现人结
图5 rhGrB-VRB对HUVEC的细胞毒作用A 处理前细胞 B rhGrB-VRB处理30 min C rhGrB-VRB处理12 h D rhGrB处理12 h
Fig6 Cytotoxicity of HUVECs mediated by rhGrB-VRB (Original magnification times100)
A B
C D
A B
图6 rhGrB-VRB诱导HUVEC细胞凋亡A 对照组 少数细胞核TUNEL标记阳性 B 实验组 绝大多数细胞核TUNEL标记阳性
Fig6 Apoptosis of HUVECs induced by rhGrB-VRB (Original magnification times400)
middotmiddot1062
陈 蕾等双歧杆菌表达的重组人GrB-VRB融合蛋白诱导KDR阳性细胞凋亡第7期
肠癌细胞株SW480表达KDRFlk-1下一步将选取多
种人肠道肿瘤细胞株活检或手术切除的新鲜肠道肿瘤
组织进行鉴定并分析其对rhGrB-VRB的敏感性开展
荷瘤动物模型的研究以期为 rhGrB-VRB基因转化分
歧杆菌的临床应用铺平道路
综上利用双歧杆菌表达的重组GrB-VRB蛋白抗
肿瘤血管生成治疗方法模拟了淋巴细胞生理性的作用
机制克服了一般血管抑制剂只能抑制血管生成的缺点
既可破坏肿瘤新生的血管又可直接攻击肿瘤细胞本身
能较好地抑制肿瘤的生长和转移可望彻底消除肿瘤
病灶在防治大肠癌等肠道肿瘤方面取得较大突破
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vascular homeostasis［J］ Proc Am Thorac Soc 2011 8(6) 508-11
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1929-32
［8］ 李先茂 曾位森 张亚历 血管生长因子部分多肽抗血管生成的研究
［J］ 中华肿瘤杂志 2002 24(5) 448-50
［9］ 李先茂 曾位森 张亚历 等 颗粒酶B的表达纯化和鉴定［J］ 第四军
医大学学报 2002 23(17) 1556-8
［10］Zhang C Wang QT Liu H et al Advancement and prospects of
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［11］Adham SA Sher I Coomber BL Molecular blockade of VEGFR2
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(5) 709-23
［12］Linkous AG Yazlovitskaya EM Novel therapeutic approaches for
targeting tumor angiogenesis［J］ Anticancer Res 2012 32(1) 1-12
［13］Waldner MJ Neurath MF Targeting the VEGF signaling pathway in
cancer therapy［J］ Expert Opin Ther Targets 2012 16(1) 5-13
［14］Long RT Zeng WS Chen LY et al Bifidobacterium as an oral
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Obes (Lond) 2010 34(4) 712-9
［15］龙若庭 曾位森 罗深秋 等 胃泌素调节激素在双歧杆菌中的表达及
其转化双歧杆菌对肥胖小鼠体质的影响［J］ 南方医科大学学报
2009 29(9) 1796-8
［16］Deng Q Zeng W Yu Z Signal peptide of Arabinosidase enhances
secretion of interferon-alpha2b protein by Bifidobacteria longum
［J］ Arch Microbiol 2009 191(9) 681-6
（编辑陈望忠）
（上接1058页）［6］ Varma D Baylis O Wride N et al Viscogonioplasty an effective
procedure for lowering intraocular pressure in primary angle
closure glaucoma［J］ Eye (Lond) 2007 21(4) 472-5
［7］ Harasymowycz PJ Papamatheakis DG Ahmed I et al
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186-9
［8］ 葛 坚 问题和争论是学科发展的动力-原发性闭角型青光眼分类争论
的启示［J］ 中华眼科杂志 2006 42(11) 964-6
［9］ Takanashi T Masuda H Tanito M et al Scleral indentation
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goniosynechialysis［J］ J Glaucoma 2005 14(4) 293-8
［10］Mori K Ikushima T Ikeda Y et al Double-mirror goniolens with
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drainage implant in refractory glaucoma［J］ J Glaucoma 2004 13
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［12］Philippin H Wilmsmeyer S Feltgen N et al Combined cataract
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goniotomy versus trabeculectomy［J］ Graefes Arch Clin Exp
Ophthalmol 2005 243(7) 684-8
［13］Wilmsmeyer S Philippin H Funk J Excimer laser trabeculotomy
a new minimally invasive procedure for patients with glaucoma［J］
Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 2006 244(6) 670-6
［14］Tham CC Leung DY Kwong YY et al Effects of phacoemulsification
versus combined phaco-trabeculectomy on drainage angle status in
primary angle closure glaucoma (PACG)［J］ J Glaucoma 2010 19
(2) 119-23
［15］Kiuchi Y Tsujino C Nakamura T et al Phacoemulsification and
trabeculotomy combined with goniosynechialysis for unco-
ntrollable chronic angle-closure glaucoma［J］ Ophthalmic Surg
Lasers Imaging 2010 41(3) 348-54
（编辑吴锦雅）
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南方医科大学学报（J South Med Univ） 第32卷
的抗血管生成药物只能简单抑制肿瘤血管的形成不能
破坏已经形成的新生血管因而只能限制肿瘤的生长和
转移不能彻底消除肿瘤病灶的问题
近年来我们根据恶性肿瘤血管生成的特点和机体
细胞免疫的分子机制选择VRB作为导向工具以GrB
为效应分子通过基因重组技术使二者形成融合基因
GrB-VRB并以双歧杆菌为载体期望通过口服工程化
双歧杆菌的方式使之在肠道内表达重组GrB-VRB能
靶向性地作用于新生血管内皮细胞诱导新生血管内皮
细胞凋亡达到靶向性治疗肠道肿瘤的目的近年我
们已对双歧杆菌作为效应分子基因载体进行了一些研
究［14-16］本实验中我们将前期构建的重组表达载体
pBBADx-VRBpBBADx-GrB 和 pBBADx-GrB-VRB
转化长型双歧杆菌经L-阿拉伯糖诱导表达了rhVRB
rhGrB 和 rhGrB-VRB 蛋白有关功能实验证明
rhGrB-VRB蛋白能有效抑制KDRFlk-1阳性细胞如人
脐静脉血管内皮细胞HUVEC和小鼠结肠癌细胞CT-26
的增殖但对KDRFlk-1阴性的细胞则否还发现
rhGrB-VRB蛋白可迅速引起KDRFlk-1阳性细胞死
亡而这种死亡的机制是细胞凋亡本实验未发现人结
图5 rhGrB-VRB对HUVEC的细胞毒作用A 处理前细胞 B rhGrB-VRB处理30 min C rhGrB-VRB处理12 h D rhGrB处理12 h
Fig6 Cytotoxicity of HUVECs mediated by rhGrB-VRB (Original magnification times100)
A B
C D
A B
图6 rhGrB-VRB诱导HUVEC细胞凋亡A 对照组 少数细胞核TUNEL标记阳性 B 实验组 绝大多数细胞核TUNEL标记阳性
Fig6 Apoptosis of HUVECs induced by rhGrB-VRB (Original magnification times400)
middotmiddot1062
陈 蕾等双歧杆菌表达的重组人GrB-VRB融合蛋白诱导KDR阳性细胞凋亡第7期
肠癌细胞株SW480表达KDRFlk-1下一步将选取多
种人肠道肿瘤细胞株活检或手术切除的新鲜肠道肿瘤
组织进行鉴定并分析其对rhGrB-VRB的敏感性开展
荷瘤动物模型的研究以期为 rhGrB-VRB基因转化分
歧杆菌的临床应用铺平道路
综上利用双歧杆菌表达的重组GrB-VRB蛋白抗
肿瘤血管生成治疗方法模拟了淋巴细胞生理性的作用
机制克服了一般血管抑制剂只能抑制血管生成的缺点
既可破坏肿瘤新生的血管又可直接攻击肿瘤细胞本身
能较好地抑制肿瘤的生长和转移可望彻底消除肿瘤
病灶在防治大肠癌等肠道肿瘤方面取得较大突破
参考文献［1］ Lazarus A Keshet E Vascular endothelial growth factor and
vascular homeostasis［J］ Proc Am Thorac Soc 2011 8(6) 508-11
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［3］ Takahashi S Vascular endothelial growth factor (VEGF) VEGF
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135-46
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［7］ 李先茂 曾位森 张亚历 等 血管内皮生长因子受体结合肽介导颗粒
酶B靶向性抗肿瘤血管生成［J］ 第四军医大学学报 2002 23(21)
1929-32
［8］ 李先茂 曾位森 张亚历 血管生长因子部分多肽抗血管生成的研究
［J］ 中华肿瘤杂志 2002 24(5) 448-50
［9］ 李先茂 曾位森 张亚历 等 颗粒酶B的表达纯化和鉴定［J］ 第四军
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［12］Linkous AG Yazlovitskaya EM Novel therapeutic approaches for
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［13］Waldner MJ Neurath MF Targeting the VEGF signaling pathway in
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［14］Long RT Zeng WS Chen LY et al Bifidobacterium as an oral
delivery carrier of oxyntomodulin for obesity therapy inhibitory
effects on food intake and body weight in overweight mice［J］ Int J
Obes (Lond) 2010 34(4) 712-9
［15］龙若庭 曾位森 罗深秋 等 胃泌素调节激素在双歧杆菌中的表达及
其转化双歧杆菌对肥胖小鼠体质的影响［J］ 南方医科大学学报
2009 29(9) 1796-8
［16］Deng Q Zeng W Yu Z Signal peptide of Arabinosidase enhances
secretion of interferon-alpha2b protein by Bifidobacteria longum
［J］ Arch Microbiol 2009 191(9) 681-6
（编辑陈望忠）
（上接1058页）［6］ Varma D Baylis O Wride N et al Viscogonioplasty an effective
procedure for lowering intraocular pressure in primary angle
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［8］ 葛 坚 问题和争论是学科发展的动力-原发性闭角型青光眼分类争论
的启示［J］ 中华眼科杂志 2006 42(11) 964-6
［9］ Takanashi T Masuda H Tanito M et al Scleral indentation
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study between endoscopic cyclophotocoagulation and the Ahmed
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(3) 233-7
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and glaucoma surgery endoscope-controlled erbium YAG-laser
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Lasers Imaging 2010 41(3) 348-54
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陈 蕾等双歧杆菌表达的重组人GrB-VRB融合蛋白诱导KDR阳性细胞凋亡第7期
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种人肠道肿瘤细胞株活检或手术切除的新鲜肠道肿瘤
组织进行鉴定并分析其对rhGrB-VRB的敏感性开展
荷瘤动物模型的研究以期为 rhGrB-VRB基因转化分
歧杆菌的临床应用铺平道路
综上利用双歧杆菌表达的重组GrB-VRB蛋白抗
肿瘤血管生成治疗方法模拟了淋巴细胞生理性的作用
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既可破坏肿瘤新生的血管又可直接攻击肿瘤细胞本身
能较好地抑制肿瘤的生长和转移可望彻底消除肿瘤
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［14］Long RT Zeng WS Chen LY et al Bifidobacterium as an oral
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［15］龙若庭 曾位森 罗深秋 等 胃泌素调节激素在双歧杆菌中的表达及
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（编辑陈望忠）
（上接1058页）［6］ Varma D Baylis O Wride N et al Viscogonioplasty an effective
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［8］ 葛 坚 问题和争论是学科发展的动力-原发性闭角型青光眼分类争论
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［9］ Takanashi T Masuda H Tanito M et al Scleral indentation
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goniosynechialysis［J］ J Glaucoma 2005 14(4) 293-8
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dual viewing system for goniosurgery［J］ Am J Ophthalmol 2007
143(1) 154-5
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(3) 233-7
［12］Philippin H Wilmsmeyer S Feltgen N et al Combined cataract
and glaucoma surgery endoscope-controlled erbium YAG-laser
goniotomy versus trabeculectomy［J］ Graefes Arch Clin Exp
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［13］Wilmsmeyer S Philippin H Funk J Excimer laser trabeculotomy
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Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 2006 244(6) 670-6
［14］Tham CC Leung DY Kwong YY et al Effects of phacoemulsification
versus combined phaco-trabeculectomy on drainage angle status in
primary angle closure glaucoma (PACG)［J］ J Glaucoma 2010 19
(2) 119-23
［15］Kiuchi Y Tsujino C Nakamura T et al Phacoemulsification and
trabeculotomy combined with goniosynechialysis for unco-
ntrollable chronic angle-closure glaucoma［J］ Ophthalmic Surg
Lasers Imaging 2010 41(3) 348-54
（编辑吴锦雅）
1050893105089310508931050893105089310508931050893105089310508931050893105089310508931050893105089310508931050893105089310508931050893105089310508931050893105089310508931050893105089310508931050893105089310508931050893105089310508931050893105089310508931050893105089310508931050893105089310508931050893105089310508931050893105089310508931050893105089310508931050893105089310508931050893105089310508931050893105089310508931050893
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