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UniversidadMiguelHernández

Dpto.deBioquímicayBiologíaMolecularFacultaddeMedicina

PrácticasdeBioquímicaI

Práctica1:LaBioquímicaenInternet‐Biomoléculasen3DPráctica2:IntroducciónalLaboratoriodeBioquímicaPráctica3:Actividadesenzimáticas.Colinesterasadelsuero

Apellidos..................................................................Nombre....................................................................Nºexpediente.........................................................

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NORMASGENERALESPARALAREALIZACIÓNYEVALUACIONDELASPRÁCTICASDEBIOQUIMICA

Normasgenerales.Introducciónalassesionesprácticas.

Consideracionesprevias.Encada laboratorioesnecesariopreverquecualquier incidentequepuedaafectaralfuncionamientodelaUniversidad,tengaunaincidencianulaomínimasobrelaspersonas,lasinstalacionesy/ola continuidad de las actividades. La organización del laboratorio debe permitir la correcta gestión de laprevencióndelriesgo,imbuidaenlospropiosprocedimientosdetrabajo,prácticasyactividades.

Cualquierpersonaquerealicesusactividadesenellaboratoriodebeconocer:

Reglamentodefuncionamientodellaboratorio.Riesgosparalaseguridadylasaluddelosproductosquímicosexistentes.Riesgobiológicodelosagentesbiológicoempleados.ManualdeAutoproteccióndeemergenciasdelaUMH.Itinerariosysalidasdeemergenciageneralesyparticulares.Localización y señalización de lavaojos y/o duchas de seguridad, extintores (su funcionamiento yadecuación)einterruptoresdesuministroeléctrico.Localizacióndelosbotiquines.Riesgosparaelmedioambientedelosproductosquímicosexistentes.

Enestaintroducciónsepretendequeelalumnotomecontactoconellaboratorio,paralocualseleindicaránlasnormasgeneralesdecomportamientoenelmismo, las reglasde seguridadquehayqueobservar, lasnormasespecíficas en caso de accidente, así como las normas generales para la realización de las prácticas de laasignatura.

Normasgeneralesdellaboratorio

1. Elalumnotienelaobligacióndeleeryestudiarconanticipaciónlasexperienciasarealizarenellaboratorio.

Elfundamentoteórico,silodesconoce,deberábuscarloenloslibrosadecuados.2. Alahoraseñaladaparaelcomienzodelasprácticaselalumnodeberáestarenellugarcorrespondienteyen

supuesto.Seráobligatoriousarunabatablanca.Nodisponerdelabatablancaimplicanopoderrealizarlaprácticadeesedía.

3. Duranteelhorariodeprácticasnosepodrásalirdellaboratoriosinpermisodelprofesor.4. Estáprohibidorealizarpruebasdiferentesalasindicadasenestecuadernodeprácticas.Elalumnoseceñirá

escrupulosamentealmismo.5. Sevalorará la actitudy el comportamiento general que cada alumnoadoptedurante la realizaciónde las

prácticas,aspectoéstedeterminantedelanotafinal.

Reglasdeseguridad Cuandosetrabajaenellaboratorio,tantodeprácticascomodeinvestigación,unosepuedeexponeraunaseriede sustancias cuya característica más importante, desde el punto de vista de la seguridad, es su toxicidad ypeligrosidad. Una actitud de vigilancia y atención es imprescindible en todo momento, aunque no se estéhaciendonada.Pensaryactuarde formaseguraesparte integralde laeducaciónquímica.Nodeberealizarseningúnexperimentoantesdeestarsegurodequesecomprendebienloquesevaahacer,ytrasdarrespuestaaestasdospreguntas:¿Quéeslopeorquepuedepasar?¿Cómolopuedosolucionar?Preguntaralosprofesores,en caso de duda, es una buena costumbre. Para evitar accidentes e incidentes desagradables es necesario elextremarlasprecauciones.Elseguimientoestrictodelassiguientesnormasevitaráalmáximolaposibilidaddeaccidentesenellaboratorio.1. En primer lugar mantener en todo momento las batas y los vestidos abrochados (protección frente a

salpicadurasyderrames).2. Nollevarpulseras,colgantesomangasanchasquepuedanengancharseenlosmontajes.Deberánlavarselas

manosantesydespuésdeentrarysalirdellaboratorioysiemprequehubieracontactoconalgúnproductoquímico.

3. Seevitarállevarpantalóncorto,faldascortas,sandalias,zapatosabiertos,etc.,porrazonesdeproteccióndelapiel.

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4. Enellaboratorioestáprohibidocomer,beberofumar.Nosedebeencenderningunallamanimecheroenellaboratorio.

5. Noconectaraparatoseléctricossinasegurarsedequenohaypeligrodevaporesdedisolventespróximos.Nocolocar jamás productos inflamables cerca de fuentes de calor. Muchas sustancias orgánicas inflamablesoriginanvaporesmásdensosqueelaire,capacesdedesplazarsedistanciasconsiderablesporencimadelamesadelaboratorio.

6. Se tomarán las precauciones necesarias al trabajar con ácidos, bases o sustancias peligrosas para evitaraccidentes. Si se utilizan sustancias en forma de polvo fino, se deberá de utilizar mascarillafundamentalmente en el momento de la pesada para evitar su inhalación. Como norma general, parapipetear disoluciones o sustancias nocivas líquidas o en caso de duda, se utilizará una propipeta. Losdisolventesorgánicosno se verteránpor las pilas, sinoque se almacenarán en los recipientes dispuestosparatalfin.Losácidosybasesconcentradosseneutralizarán,yladisoluciónsalinaresultanteseverteráconlosgrifosabiertos.

7. Unanormageneralpara lapreparacióndedisolucionesdeácidos fuertesesquesiempreseadicionaráelácidosobreelaguaodisoluciónacuosa,alfindeevitarlaproyeccióndeestaúltimacomoconsecuenciadelcalentamientobruscoalmezclarseambasdisoluciones.Sifueranecesariocalentarelcontenidodeuntubodeensayoalallama,seharáconeltuboalgoinclinado,agitandosuavementeyconlabocadeltubodirigidahaciaunlugarenquenohayaningunapersona.

8. Evitarelcontactofísicocondisolventesorgánicos.Norespirarvaporesdedisolvente.(Verapartadosobre"riesgosasociadosalosdisolventes").Cuandoseutilicensustanciasvolátiles(disolventesorgánicoscomoelcloroformo,éter,etc.)semanipularánenlacampanadegasesutilizando,siesnecesario,unamascarilla.

9. Lasgafasdeprotecciónsonobligatoriascuandoelprofesorasíloindique.Nousarnuncalentesdecontacto(losvaporesorgánicospodríandañarlas;porotrolado,losreactivoscáusticosnopuedensereliminadosdelojosilaslentillasestánpuestas).Fíjatedóndeestánsituadoslosbañoslavadoresdeojos.

10. Usar guantes protectores cuando el profesor lo indique. En caso de contacto de productos corrosivos oirritantesverindicacionesmásabajo.

11. El material del laboratorio ha de estar siempre limpio y seco, sin restos de sustancias anteriores. Losresiduossetratarándelasiguienteforma:

A)Materialdecristalroto,papelesyotros.Setiraráenlosrecipientesdestinadosespecialmenteaestefin.B) Productos químicos tóxicos. Se tirarán en contenedores especiales para este fin. No tiresdirectamentealfregaderolosproductosespecialmentetóxicos.C) Sustancias líquidas o disoluciones. Los que puedan verterse al fregadero, se diluiránpreviamente,sobretodosisetratadeácidosydebases.Notiresalfregaderoproductosoresiduossólidosquepuedanatascarlas.Enestoscasosdepositalosresiduosenrecipientesadecuados.

Enelcasoquesegenereunderramederesiduospeligrososdurantelarealizacióndelapráctica,elpapelqueseutiliceparasurecogidatambiénserádepositadoenelcontenedorestablecidoparaesegrupoderesiduospeligrosos.Encasodeduda,preguntaraalgúnresponsablecómoproceder.

12. Unanormageneralqueseañadealascitadasyquecontribuyealaseguridadenellaboratorioesladelrigoryordenenellaboratorio.Conelloqueremosresaltarqueentodomomentosehademantenerunalimpiezayordenadecuadosenellaboratorio.

13. Antecualquierdudaosiseproducealgúnaccidente,avisarrápidamentealprofesor.

Normasdeactuación Ordeny limpieza.Elordenes fundamentalparaevitaraccidentes.Mantenereláreade trabajoordenada,sinlibros,abrigos,bolsas,excesodebotesdeproductosquímicosycosasinnecesariasoinútiles.Mantenerlasmesassiempre limpias. Se tienen que limpiar inmediatamente todos los productos químicos derramados. Limpiarsiempreperfectamenteelmaterialyaparatosdespuésdesuuso.Responsabilidad.Trabajar sin prisas, pensando en cadamomento lo que estáshaciendo, y con elmaterial yreactivos ordenados. No se debe gastar bromas, correr, etc. en el laboratorio. No realizar un experimento noautorizado. Un comportamiento irresponsable puede ser motivo de accidentes no deseados y comportar laexpulsióninmediatadellaboratorio.Atención a lo desconocido. No utilizar ni limpiar ningún recipiente de reactivos que no lleve etiqueta.Entregadlo inmediatamente al profesor.No sustituir nunca, sin autorización previa del profesor, un productoquímico por otro en un experimento. No utilizar un equipo o aparato sin conocer perfectamente sufuncionamiento.Nousarunapipetadirectamenteconlaboca,sinoatravésdeunsistemadeaspiración.

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Manipulacióndelvidrio.Noforzaruntubodevidrio,yaque,encasoderuptura,loscortespuedensergravesNousarnuncaequipodevidrioqueestéagrietadooroto.Depositarelmaterialdevidriorotoenuncontenedorparavidrio,noenunapapelera.Manipulacióndeproductosquímicos.‐ Los productos químicos pueden ser peligrosos por sus propiedades tóxicas, corrosivas, inflamables oexplosivas.Muchosreactivos,particularmentelosdisolventesorgánicos,ardenenpresenciadeunallama.Transportedereactivos.Notransportarinnecesariamentelosreactivosdeunsitioaotrodellaboratorio.Lasbotellassetransportansiemprecogiéndolasporelfondo,nuncadeltapón.

Actuacionesencasodeaccidente 1. En caso de accidente, avisar inmediatamente al profesor. En caso de gravedad llamar al 112, o al

teléfono de la universidad 8665 (966658665 para llamada externa). No llevar a cabo actuacionesinseguras;siserealizanprimerosauxilios,hayqueestarseguro/adenoempeorarelestadodelaccidentado(protección)yasegurarseunomismodenosufrirriesgo(autoprotección).

2. Fuego en el laboratorio. Evacuad el laboratorio, de acuerdo con las indicaciones del profesor y laseñalización existente en el mismo. Si el fuego es pequeño y localizado, apagadlo utilizando un extintoradecuado, arena, o cubriendo el fuego conun recipientede tamaño adecuadoque lo sofoque.Retirad losproductosquímicos inflamablesqueesténpróximosfuego.Noutilizarnuncaaguaparaextinguirunfuegoprovocadoporlainflamacióndeundisolvente.Encasodequeelfuegoseaimportante,accionarelpulsadordealarma

3. Fuegoenlaropa.Siseincendialaropa,pedirayudainmediatamente.Tumbarseenelsueloyrodarsobretimismo para apagar las llamas. No correr (al hacerlo se aviva el fuego) ni intentar llegar a la ducha deseguridadsinoestámuycerca.Ayudadaalguienqueseestéquemando.Cubridleconunamantaantifuego,conducidle hasta la ducha de seguridad, si está cerca, o hacedle rodar por el suelo. No utilizar nunca unextintorsobreunapersona.Unavezapagadoel fuego,mantenera lapersonatendida,procurandoquenocojafríoyproporcionarlelosprimerosauxilioshastalallegadadelaasistenciamédica.

4. Quemaduras. Las pequeñas quemaduras producidas por material caliente, baños, placas o mantascalefactoras,etc.,setrataranlavandolazonaafectadaconaguafríadurante10‐15minutos.Desinfectar(porej.conyodo)ycubrircongasas.Noaplicarungüentososustancias(pastadedientes,lejía,etc.)nipuncionesoretirarlasampollassiaparecen.Lasquemadurasmásgravesrequierenatenciónmédicainmediata.

5. Cortes.Loscortesproducidosporlaroturadematerialdecristalsonunriesgocomúnenellaboratorio.Sedebenlavarbien,conabundanteaguacorriente,durante10minutoscomomínimo.Sisonpequeñosydejande sangrar en poco tiempo, lavadlos con agua y jabón, aplicar un antiséptico y taparlos con una vendaoapósito adecuados. Si son grandes o muy profundos y no paran de sangrar, solicitar asistencia médicainmediata.Noretirarnimanipularunposiblecuerpoextrañoenclavado.

6. Actuaciónencasodeinhalacióndeproductosquímicos.Conducirinmediatamentealapersonaafectadaaunsitioconairefresco.Requerirasistenciamédicainmediata.Alprimersíntomadedificultadrespiratoriadebeiniciarselarespiraciónartificialbocaaboca.Identificar,siesposible,elgascausante,usarlamáscaraadecuadaysinolahay,aguantar larespiraciónmientrasseextingueelvapor(abriendoventanas,usandocampanas,etc.).Tratardenoexponerseencualquiercaso.

7. Actuación en caso de ingestión de productos químicos. Antes de cualquier actuación concreta pedirasistenciamédica.Sielpacienteestáinconsciente,ponerlotumbado,conlacabezadelado.Taparloconunamantaparaquenotengafrío.Nodejarlosólo.Nodarlelíquidos,niprovocarelvómito.

8. Derrame o proyección de productos químicos sobre la piel. Los productos químicos que se hayanvertido sobre la piel han de ser lavados inmediatamente con agua corriente abundante, como mínimodurante15minutos.Enelcasodeproductoscorrosivos,ademásdeloanterior,tambiénseretiraráocortarálo más rápidamente posible la ropa, evitando salpicaduras a otras partes del cuerpo. Las duchas deseguridad instaladas en los laboratorios serán utilizadas en aquellos casos en que la zona afectada delcuerposeagrandeynoseasuficienteellavadoenunfregadero.Esnecesariosacartodalaropacontaminadaalapersonaafectadaloantesposiblemientrasestébajoladucha.Recuerdaquelarapidezenellavadoesmuyimportanteparareducirlagravedadylaextensióndelaherida.Proporcionarprimerosauxilioshastalallegadadeasistenciamédica a lapersonaafectada.Avisara tuprofesor. Si unproductoquímico entra encontactocontusojos,eltiempoesesencial,sobretodosielproductoescorrosivo(actuadenmenosde10segundos). Cuanto antes se lave el ojo,menos grave será el daño producido. Lava los dos ojos con aguacorrienteabundantedurante15minutoscomomínimoenunaduchadeojos,y,sinohay,conunfrascoparalavar los ojos. Es necesariomantener los ojos abiertos con la ayuda de los dedos para facilitar el lavadodebajodelospárpados.Esnecesariorecibirasistenciamédica,porpequeñaqueparezcalalesión.Cuidado:nousardemasiadapotenciadechorrodeagua,paraevitarlesionesalojo.

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Normasgeneralesparalarealizacióndelasprácticas

1 Antesdecomenzarlaprácticadeberárevisarquedisponedetodoelmaterialyproductosnecesariosparala

misma,yqueseencuentratodolimpioyenorden.Senotificaráalprofesorcualquieranomalía.Alfinalizarlaprácticadejarátodoelmaterialperfectamentelimpioyordenado,avisandoalprofesordehaberterminadoantesdeabandonarellaboratorio.

2 Las pipetas deben estar bien limpias y secas antes de ser utilizadas. Pipetear siempre con la propipetaadecuada.Nopipetearentrevariaspersonas.

3 Todos los frascos, botellas, etc., han de estar correctamente etiquetados y cerrados, evitando que seconfundan los tapones. Los recipientes donde se almacenan sustancias y disoluciones se deben marcaradecuadamenteutilizandorotuladores,lápicesdeceraoetiquetas.Encadacasoseindicarálasustanciadequesetrataysuconcentración,asícomolafechadepreparación.

4 Sedebendeanotarenelcuadernodeprácticaslasdisolucionespreparadasysuconcentración,asícomoelvolumenpreparadodecadauna.

5 Todos los frascos y botellas que contienen los reactivos preparados deberán situarse en el fondo de labancadaomesadetrabajo,evitandodejarlosenlosbordes.

6 Cada alumno (con independencia de que haya formado parte de un grupo de varias personas) deberápresentaruninformederesultadosdecadaprácticaenlaformaindicadaporelprofesor.

7 Antecualquierdudapreguntaralprofesordeprácticas.8 Se recuerda que para APROBAR la asignatura es necesario superar las prácticas. Las prácticas son

obligatoriasylanoasistenciaalasmismas,salvocausadefuerzamayor,implicalanecesidaddesuperarlasenunaPRUEBATEÓRICAY/OPRÁCTICA,DEACUERDOCONLASDIRECTRICESDELAASIGNATURA.

Riesgosasociadosalosdisolventes

Esesencialrecordarquelamayoríadelosdisolventesorgánicossoninflamables,yardensiestánexpuestosaunallama.Además,muchossontóxicosocarcinógenos.Porejemplo,muchosdisolventesclorocarbonados,siseacumulanenel organismo, causanundeteriorodel hígado similar a la cirrosisoriginadaporuso excesivodeetanol. El cloroformo y el éter son anestésicos, causando somnolencia y náuseas. En otras palabras, losdisolventesorgánicossontanpeligrososcomoloscompuestosquímicoscorrosivos(p.ej.elácidosulfúrico).Acontinuaciónsecitanalgunosejemplos:

•Ácidoacéticoglacial:essuficientementecorrosivoparacausarquemaduras.Susvaporespuedenirritarlosojosylosconductosnasales.

•Acetona:noesmuytóxicacomparadaconotrosdisolventes.SinembargoesMUYinflamable.•Benceno:seabsorbefácilmenteatravésdelapiel,ypuedeafectara lamédulaóseayprovocar leucemia.

Estáconsideradocomoagentecarcinógenoyafectaalhígadoylosriñones.Ademásesmuyinflamable.•Diclorometano:noesinflamableynoestáconsideradocomocarcinógeno.Siseingierepuededeteriorarel

hígado,ysusvaporespuedenoriginarsomnolenciaynáuseas.•Etanol:esunconocidoagentetóxicoyesextremadamenteinflamable.•Éteretílico:esextremadamente inflamableypuedeoriginarexplosiones (presenciadeperóxidos).Noes

particularmentetóxico,peroengrandesconcentracionespuedeoriginarsomnolenciaynáuseas.•Hexano,pentano, éterdepetróleo:pueden irritar el tracto respiratorioy lapiel.Tambiénpuedenactuar

comotóxicoydepresivosdelsistemanerviosocentral.Sonaltamenteinflamables.•Metanol:mástóxicoqueeletanol,provocaporingestióncegueraymuerte.Esmuyinflamable.•Tolueno:noestáconsideradocomoagentecarcinógeno,peroestantóxicocomoelbenceno.Puedeactuar

comoanestésico,yafectaralsistemanerviosocentral.

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He leído y entiendo las Normas de Seguridad y los Riesgos Asociados al laboratorio Nombre:_________________________ Apellidos: _____________________________ Curso Académico:_________________ Grado:________________________________

Firma:

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PPRRÁÁCCTTIICCAA11::LLaaBBiiooqquuíímmiiccaaeennIInntteerrnneett‐‐BBiioommoollééccuullaasseenn33DD..

Prof.responsable:LuisMiguelGutiérrezPérez(luisguti@umh.es)

IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN

Esevidenteparacualquierestudiantequeseacerqueconcuriosidadalasnuevastecnologíasde la información, que se están abriendo un buen número de posibilidades en apoyo delestudioycomprensióndelabioquímica.Esporelloqueestaprácticaestadedicadaaconocerymanejarestosnuevosrecursos.La Internet(WWWosimplementeWeb)esantetodounafuente inmensa de todo cuanto el ser humano piensa quemerece ser enseñado (sea o nohonesto, esto hay que advertirlo), y por ello existen una variedad casi incatalogable deinformaciónenrelacióncon labioquímica. Enprincipiopodríamosdividirestas fuentesencuantosuinterésennuestrocampoencuatrotipos:A.DireccionesconinterésparalocalizarinformaciónsobrecualquieraspectodelaBioquímicay Biología molecular. Éstas serían la base de partida para localizar otras direccionesespecíficas. Sería el caso de las direcciones URL(Universal Resource Locator):http://www.cellbio.comohttp://www.ncbi.nlm.nih.gov. Todasellasorganizanlabúsquedade direcciones (links) en secciones como: Enseñanza de Bioquímica y Biología Molecular,Protocolosexperimentales,basesdedatos,fuentesdeprogramas,revistasespecializadasetc.B.DireccionesdebasesdedatosconrelevanciaeninvestigaciónydocenciaenBioquímicayBiología Molecular. Éstas pueden ser de especial utilidad para la utilización de recursosdidácticos complejos como la representación de biomoléculas en 3‐D o la utilización derecursosdeinvestigacióncomolabúsquedaoalineamientodesecuenciasodelosvaloresdeseparación de proteínas en 2D‐PAGE. Estas fuentes se especificarán en más detalle conposterioridad. A este tipo de direcciones pertenecen por ejemplo la dirección:http://www.rcsb.org/pdb/.C.Direccionesdeinterésespecíficoenaspectosdeinvestigación.Seríaelcasodedireccionesqueproveendeprotocolosexperimentales,odeforosdediscusiónsobretemasespecíficosdeuncampodeinvestigaciónoinclusolaspertenecientesarevistasespecializadas.Ejemplosdeeste tipo serían las direcciones: http://www.protocol‐online.net , ohttp://bioinformatics.weizmann.ac.il/D.Finalmentesepodránencontrardireccionescuyointerésprincipalseaeldelaeducaciónencampos biológicos o bioquímicos. Un ejemplo de este tipo sería http://esg‐www.mit.edu:8001/esgbio.Dado que este seminario tiene por objeto el mostrar la utilidad de estas fuentes deinformación en el apoyo de la docencia e investigación se centrará en un aspecto concreto

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comoes lasposibilidadesde larepresentaciónymanipulacióndemoléculasbiológicasen3dimensiones.2.BASESDEDATOSDEESTRUCTURASDEBIOMOLÉCULASACCESIBLESENINTERNET.Enlosúltimosañosjuntoalostradicionalesbancosdeestructuraprimariadeproteínasydesecuencia de nucleótidos han aparecido los bancos de estructura tridimensional debiomoléculas. Tantoenladocenciaenbioquímicadondelavisualizaciónymanipulacióndeunamoléculaentresdimensionespermitelamejorcomprensiónderelacionesestructuralescomoen investigacióndonde las relacionesestructura‐funciónestánsiendo la claveparaelmejor entendimiento del diseñomolecular, la existencia de extensos bancos de estructuraespacial de biomoléculas (especialmente de proteínas) son un apoyo inestimable para elbioquímico. Laestructurade lasproteínaspuedealmacenarseenarchivosde coordenadasespacialesdesusátomosconstituyentes,siendoelmásextendidoel tipodearchivoproteindatabase(nombre.pdbonombre.ent).Estosarchivospuedenobtenersedediferentesfuentessiendo los bancos más importantes los correspondientes al Protein Data Bank en EE.UU.(http://www.rcsb.org/pdb/ )ya laSwiss3D ImageCollection (http://expasy.hcuge.ch ) enSuiza.Enestosbancosdeestructurasepuedenhacerusodesistemasdebúsquedamuyversátilesqueincluyenlaposibilidaddeincluircamposdenombrescompletosoparciales, familiasdeproteínas, organismos, técnicas experimentales de obtención de estructura, referenciasbibliográficas(autoresetc.),e incluso fórmulaso laclasificaciónde laComisióndeEnzimas.MientrasqueelProteinDataBankconstituyeunbancomuycompletodearchivospdb(Hayunas20.000estructuras),elbancodelaColecciónSuizadebiomoléculasseespecializaenladirectavisualizacióndelasproteínasensupáginaWeb.conimágenesdetipoGIFyporelloselimitaaunas5000imágenes.Ademásdeestasfuentesprincipalesexistenotrosbancosparala localización de archivos pdb que representan moléculas sencillas como el agua en susdiferentes formas, glúcidos, lípidos, aminoácidos, nucleótidos, fármacos etc.(http://www.nyu.edu/pages/mathmol/library).UnavezdescargadoatravésdeInternetlosarchivosdeseadosdeberemosdedisponerdelosprogramasadecuadosparasuvisualizaciónymanipulación.3. PROGRAMASPARALAVISUALIZACIÓNDEBIOMOLÉCULASEN3D.Existen una gran diversidad de programas para la representación tridimensional debiomoléculas,sinembargopocosdeelloshansidoaceptadoscomostandarddeuso(aceptanarchivos *.pdb)ydesde luegomuchosmenoshan sidodesarrolladosaltruistamenteparaeluso y disfrute libre de la comunidad científica. Entre los últimos 10 años se desarrollaronestosprogramasparautilizarenunPCdotadodelsistemaoperativoWindowsycabecitarelprogramapioneroRasmoldesarrolladoporRobertSayledelaUniversidaddeEdimburgo(sepuedeobtenerhttp://www.umass.edu/microbio/rasmol , o susprogramasgemelosProteinExplorer o Chemscape Chime (http://www.mdli.com), este último desarrollado para serincorporadoennavegadoresInternet(NetscapeyExplorer)yelprogramaSwissPDBViewerdesarrollado por Nicolas Guex de la empresa Glaxo‐Wellcome(http://www.expasy.ch/spdbv/mainpage.htm ) para PC y Apple Mackintosh. Centraré miinterés inicialmente en el primero de éstos, mucho más extendido en uso y con menosrequisitos a la hora de poder utilizarlo (el programa Swiss PDB Viewer requiere

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Quickdraw3D, obtenible de Apple en su dirección web: http://www.apple.com pero eltamañodeesteprogramadeunas8MBhacemásdifícilsuobtención).Hoy en día se utilizan versiones integradas derivadas de Rasmol como Jmol, estas estánintegradasenelnavegadorypresentandeformamás intuitivatodas lascapacidadesde losprogramasoriginales.4. UTILIZACIÓNDEJMOLPARAELESTUDIODEUNAPROTEINAMODELO.Primero necesitaremos una proteína que sea un modelo interesante para estudiar lascapacidades de dichos programas nosotros propondremos el estudio de la estructuratridimensionaldeHemoglobina.Primero entre en la página del banco de datos de estructuras del Protein Databank(http://www.rcsb.org/pdb/), y haga una búsqueda de las estructuras almacenadas sobredichaproteína.Seconscientedelavariabilidaddeformasalmacenadasysusdiferencias.Una vez elegida una molécula es el momento de comprender las diferentes opciones derepresentación estructural (átomos, esqueleto, cartoons etc), de color o incluso lasposibilidadesderepresentacióndelassuperficies.El siguiente aspecto del programa será analizar las partes fundamentales de la estructurarelacionadasconlafuncióndelaproteínaparaelloutilizaremosotrasopcionescomoLigandsoLigandsandpocket.También se aprenderá a la utilización de estos programas para la determinación dedimensionesmoleculares ydistancias entre átomos, para ello se ospropondrádimensionalalgunasdelasproteínasdeinterésenmetabolismocondimensionesmasextremas.5. EXTENSIONDELOSPROGRAMASALESTUDIODEOTRASBIOMOLECULAS.Hasta ahora hemos mostrado el empleo de la visualización 3D a proteínas pero es muysencilloimportararchivosestructuralesdeotrasmoléculasdeinterésbiológico.Paraellosepuede partir de bases de datos conocidos como la indicadahttp://www.nyu.edu/pages/mathmol/library, o simplemente utilizar una búsqueda deInternetdecaráctergeneralizado(empleandoeltipodemoléculaabuscaryeltipodearchivopdbcomoguíaenlabúsqueda).RealizaremoslabúsquedadeunarchivoestructuraldelADNyrealizaremosunestudiodesuscaracterísticas dimensionales fundamentales como las dimensiones de los surcos mayor ymenorolasdistanciasentrebasesemparejadas.6. REALIZACIONDEGRAFICOSDEMOLECULASENALTACALIDADExisten programas que aunque seanmenos intuitivos permiten posibilidades de análisis yrepresentación de biomoléculas muy interesantes. Este es el caso del programaSwissPDBViewer (http://www.expasy.org/spdbv/), que constituye una herramienta deinvestigación para el estudio de distanciasmoleculares y de parámetros estructurales. LacapacidaddeesteprogramaresideenlaseleccióndeunaminoácidoparaexplorarsuentornoverFigura1),ymásaúnparainclusomutardiversosresiduosparaposteriormenteentendercomodichasmutacionesafectanalaestructuradelaproteína.Elprogramapermiteasímismo

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una diversidad de cálculos que incluyen la realización de diagramas de Ramachandran, talcomosemuestraenlamismaFigura1.

Lacombinacióndeesteprogramaconelrepresentador tridimensional (renderización3D) denominado Povray(Http://www.povray.org), permite larepresentación de moléculas en el sistemagráfico de más calidad de cuantos se hanmencionado en este trabajo, la viveza deluces y texturas obtenida con dichosprogramaspuedeserobservadaen laFigura 2,representando dos moléculassimultáneamente.En la práctica realizaremos algunasrepresentaciones de alta calidad conmoléculas de interés biológico comofármacos, aminoácidos, proteínas, ácidosgrasos,etc.

Figura 1. Copia de pantalla de la ejecución del programa SWISS-3D PDBVIEWER. Se muestra la capacidad de éste para la observación de las relaciones entre aminoácidos en una región concreta del complejo protéico de fusión vesicular (SNARE complex), formado por 4 cadenas pertenecientes a 3 proteínas (sintaxina, SNAP-25 y sinaptobrevina). En el recuadro se observa el diagrama de Ramachandran de éstas.

Figura 2. Moléculas de glúcido y ácido graso tratadas por Swiss 3D Viewer y representadas por Povray, incorporando fuentes de luz y texturas.

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CUESTIONES‐INFORMEPRÁCTICANº1NOMBREYAPELLIDOS............................................................................................NºMATRICULA..............................................................................................................FECHADELAPRÁCTICA...........................................................................................GRUPO...............................................................................................................................

1. ¿Las bases de datosmanejadas poseen únicamente proteínas o estructuras deotrassustancias?,indiquequeotrostiposdemoléculassepuedenencontrar.

2. Utilizando la hemoglobina comomolécula ejemplo, que número de estructurasson accesibles para su estudio estructural. Indique el porqué de dichavariabilidad.

3. Utilizandolasfuncionesdemediciónindique:Tamañoaproximadodelahemoglobina.AnchoxlargoxprofundidadDeunadelascadenasquelaforman.DistanciasentreelátomodeFedelgrupoHemoylosaminoácidosmáscercanosdelacadenadeglobinayelOmascercanotransportado.4. Busque dos proteínas de relevancia en el estudio delmetabolismo con lasdimensiones mas extremas y determine su tamaño tal como hizo con lahemoglobina.Proteínamásgrande;Proteínamáspequeña;4. Obtener un archivo pdb representativo de la estructura delADN y realizar las

medicionesquecaracterizandichaestructura.5.Localicelosarchivosdeestructurayrepresenteenaltacalidadlasmoléculasqueleindiqueelprofesor,salvandolosarchivosgráficosobtenidos.

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PPRRÁÁCCTTIICCAA22::IInnttrroodduucccciióónnaallaasspprrááccttiiccaassddeellaabboorraattoorriioo..DDiissoolluucciioonneessttaammppoonneess,,mmeeddiicciióónnddeeppHHyyaaccttiivviiddaaddeennzziimmááttiiccaa

Prof.responsable:ManuelCriadoHerrero(manuel.criado@umh.es)

OOBBJJEETTIIVVOOSSGGEENNEERRAALLEESS

En esta práctica se pretende que el alumno tome contacto con el laboratorio debioquímica.Seindicaránalalumnounasnormasgeneralesderealizaciónydeseguridad.Seledescribiráelmaterialdelaboratorioyseharáespecialhincapiéenlaimportanciadelcorrectouso de las unidades de masa, volumen y concentración, así como del cuidado, correctautilización y limpieza del material utilizado. Especial hincapié se hará en el manejo de lasdistintasclasesdepipetas.Adicionalmenteselesenseñaráamanejarelcolorímetro.

Unavezestablecidas lasnocionesbásicasdemanejodemateriales seprocederáa lapreparación de disoluciones tampón y la medición del pH de las mismas mediante el pH‐metro.Enlasegundapartedelapráctica,yconelfindecontinuarejercitandoloaprendidoencuanto a pipeteo de líquidos ymanejo del colorímetro, se realizará la determinación de lafosfatasa alcalina en una muestra problema a partir de la elaboración de un patrón deconcentraciones conocidas. Una vez terminada la práctica se procederá a la limpieza delpuesto de trabajo así como del material utilizado, lo que será tenido en cuenta en laevaluacióndelapráctica.Finalmenteseentregaránlashojasderesultadosalprofesor.

OOBBJJEETTIIVVOOSSEESSPPEECCÍÍFFIICCOOSS

Elalumnoalfinalizarlaprácticadeberásercapazde:1. Conocerlasnormasdeseguridaddeunlaboratorio.2. Distinguirentrelosdistintosmaterialesutilizadosenellaboratorio.3. Utilizarcorrectamentelasunidadesdemasa,volumenyconcentración.4. Medirunvolumendeterminadoconelmenorerrorposible.5. PrepararunadisolucióntampónymedirsupH6. Aprenderelfuncionamientoylautilizacióndeuncolorímetro.7. Deducirunaactividadenzimáticaapartirdeunarectapatrón8. Aprenderyllevaralaprácticalasnormasdelimpiezadelmaterialdeunlaboratorio.

IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN

PPRRIIMMEERRAAPPAARRTTEE

Lamedida de líquidos es una de las operacionesmás comunes en el laboratorio deBioquímica.Elusodeprobetasymatracesaforadosesfrecuenteenellaboratoriodequímica.Ademásdeestos,laspipetasgraduadasymicropipetasautomáticassonusadasamenudoenellaboratoriodebioquímica.Enestaprácticaejercitaremossuusoparaprepararunasolucióntampón.

14

Para manipular líquidos con las pipetas graduadas usaremos un dispositivodenominadoPipetusyqueesencialmenteesunapequeñabombaquepermiteaspirarlíquidoseleccionandoundeterminadovolumenyposteriormentedepositarlodondeseanecesario.

Pipetus Pipetasgraduadasdedistintosvolúmenes

PPaarraaaassppiirraarrllííqquuiiddooiinnttrroodduucciimmoossllaa PPaarraaddeeppoossiittaarreellllííqquuiiddooaappooyyaammoossllaappuunnttaaddeellaappiippeettaaeenneellmmiissmmooyyaapprree‐‐ ppuunnttaaddeellaappiippeettaaeennllaappaarreeddddeellttuubboottaammoosseellbboottóónnssuuppeerriioorr((fflleecchhaannee‐‐ yyaapprreettaammoosseellbboottóónniinnffeerriioorr((fflleecchhaaggrraa))hhaassttaaaallccaannzzaarreellvvoolluummeennddeesseeaa‐‐ bbllaannccaa))hhaassttaaeevvaaccuuaarrttooddooeellllííqquuiiddooddoo..SSiiffuueerraanneecceessaarriiooeennrraassaarrííaammooss ooaallccaannzzaarruunnddeetteerrmmiinnaaddoovvoolluummeenn..ccoonneellbboottóónniinnffeerriioorr..

15

PPaarraammaanniippuullaarrppeeqquueeññoossvvoollúúmmeenneessuussaarreemmoossllaassmmiiccrrooppiippeettaassaauuttoommááttiiccaass((vvééaasseeeelleessqquueemmaaaabbaajjoo))

((AA)) ((BB)) ((CC))

PPaarraa ppiippeetteeaarr ccoonn mmiiccrrooppiippeettaass aauuttoommááttiiccaass ffiijjaarreemmooss pprriimmeerroo eell vvoolluummeenn ddeesseeaaddooccoonnllaarruueeddaayyccoollooccaarreemmoossuunnaappuunnttaa..AAccoonnttiinnuuaacciióónnrreeaalliizzaarreemmooss lloo iinnddiiccaaddooeennllaassffiigguurraassddeeaarrrriibbaaccoommoossiigguuee((vveerrppáággiinnaassiigguuiieennttee))::

Punta

Rueda para fijar el volumen

Eyector de puntas

16

((AA)) CCoonn eell ddeeddoo ppuullggaarr pprreessiioonnaannddoo eell eexxttrreemmoo ddeell éémmbboolloo yy bbaajjaaddoo hhaassttaa eell pprriimmeerr ttooppeeiinnttrroodduucciirreemmoossllaappuunnttaaddeepplláássttiiccooeenneellllííqquuiiddooaaeexxttrraaeerr

((BB))LLeevvaannttaarreemmoosslleennttaammeenntteeeellppuullggaarrppaarraaqquueeeellllííqquuiiddooaasscciieennddaappoorrllaappuunnttaa

((CC)) AAppooyyaarreemmooss llaa ppuunnttaa eenn llaa ppaarreedd ddeell rreecciippiieennttee ddoonnddee qquueerraammooss vveerrtteerr eell llííqquuiiddoo yypprreessiioonnaarreemmoosseellppuullggaarrddeennuueevvoossoobbrreeeelleexxttrreemmooddeelléémmbboolloohhaassttaaqquueettooddooeellllííqquuiiddoohhaayyaassiiddooeevvaaccuuaaddoo

CCoonn eell ffiinn ddee pprraaccttiiccaarr eell uussoo ddee ppiippeettaass yy mmiiccrrooppiippeettaass pprreeppaarraarreemmooss vvaarriiaassssoolluucciioonneess ttaammppóónnyymmeeddiirreemmoossssuuppHH,,aaccttiivviiddaaddeesseessttaass ttaammbbiiéénnmmuuyyúúttiilleessyy ffrreeccuueenntteesseenneellllaabboorraattoorriiooddeebbiiooqquuíímmiiccaa..

LLaassssoolluucciioonneess ttaammppóónneessttáánn ffoorrmmaaddaass,,eennggeenneerraall,,ppoorrmmeezzccllaassbbiinnaarriiaassddeeuunnáácciiddoooobbaasseeddéébbiilleessccoonnllaaccoorrrreessppoonnddiieenntteessaallggeenneerraaddaaccoonnbbaasseeooáácciiddooffuueerrtteess..PPoorreejjeemmpplloo,,áácciiddooaaccééttiiccoo ((áácciiddoo ddéébbiill)) ++ aacceettaattoo ssóóddiiccoo ((ssaall ddee eessttee áácciiddoo ccoonn uunnaa bbaassee ffuueerrttee)).. OO ttaammbbiiéénnhhiiddrróóxxiiddoo aammóónniiccoo ((bbaassee ddéébbiill)) ++ cclloorruurroo aammóónniiccoo ((ssaall ddee eessttaa bbaassee ccoonn uunn áácciiddoo ffuueerrttee)).. SSuuuuttiilliiddaadd rraaddiiccaa eenn qquuee mmaannttiieenneenn llaa ccoonncceennttrraacciióónn ddee HH++ pprrááccttiiccaammeennttee iinnvvaarriiaabbllee eenn llaassddiissoolluucciioonneess eenn llaass qquuee eessttáánn pprreesseenntteess,, lloo qquuee rreessuullttaa ddee ggrraann iimmppoorrttaanncciiaa ttaannttoo eenn eellllaabboorraattoorriiooddeebbiiooqquuíímmiiccaaccoommooeennlloossfflluuiiddoosspprreesseenntteesseennlloosssseerreessvviivvooss..

PPoorrttaannttoo,,eennnnuueessttrroopprrááccttiiccaaccaaddaaggrruuppoouuttiilliizzaarrááddoossccoommppoonneenntteessqquueemmeezzccllaaddoosseennddiissttiinnttaass pprrooppoorrcciioonneess ddaarráánn lluuggaarr aa ddiissttiinnttooss ppHHss qquuee ssee mmeeddiirráánn ccoonn eell ppHH‐‐mmeettrroo..OObbvviiaammeennttee,,eellrraannggooddeeppHHoobbtteenniiddooddeeppeennddeerrááddeellaappaarreejjaaddeeccoommppoonneenntteessuussaaddaa..

EEnn ccuuaannttoo aall ppHH‐‐mmeettrroo ccoonnssiissttee bbáássiiccaammeennttee eenn uunn eelleeccttrrooddoo sseennssiibbllee aa llaaccoonncceennttrraacciióónnddeeHH++yyuunnvvoollttíímmeettrrooccaappaazzddeeddeetteeccttaarruunnaaffuueerrzzaaeelleeccttrroommoottrriizz..

EEll vviiddrriioo ddeell eelleeccttrrooddoo aaccttúúaa ddee mmeemmbbrraannaa sseemmiippeerrmmeeaabbllee aa llooss HH++.. CCuuaannddoo sseeiinnttrroodduuzzccaa eenn uunnaa ddiissoolluucciióónn ssee pprroodduucciirráá uunn mmoovviimmiieennttoo ddee HH++ sseeggúúnn llaa ddiiffeerreenncciiaa ddeeccoonncceennttrraacciióónn eennttrree llaa ddiissoolluucciióónn yy eell iinntteerriioorr ddeell eelleeccttrrooddoo.. EEssttoo pprroodduucciirráá uunnaa ccoorrrriieenntteeeellééccttrriiccaa ddeetteeccttaaddaa ppoorr eell vvoollttíímmeettrroo yy ttrraadduucciiddaa eenn vvaalloorr ddee ppHH,, aall hhaabbeerrssee ccaalliibbrraaddoopprreevviiaammeenntteeeellppHH‐‐mmeettrrooccoonnuunnaaddiissoolluucciióónnddeeppHHccoonnoocciiddoo..

Electrodo Vidrio semipermeable a H

+ Electrodo  Voltímetro

Calibrado para  medición de pH

17

SSEEGGUUNNDDAAPPAARRTTEE

EEnn eessttaa ppaarrttee ddee llaa pprrááccttiiccaa ccoonnttiinnuuaarreemmooss eejjeerrcciittaannddoo eell uussoo ddee mmiiccrrooppiippeettaass yyddeetteerrmmiinnaarreemmooss uunnaa aaccttiivviiddaadd eennzziimmááttiiccaa,, lloo qquuee ddaarráá ooppoorrttuunniiddaadd ddee uussaarr oottrroo aappaarraattooeesseenncciiaall ddeell llaabboorraattoorriioo ddee bbiiooqquuíímmiiccaa ccoommoo eess eell eessppeeccttrrooffoottóómmeettrroo,, eenn nnuueessttrroo ccaassoo uunnaavveerrssiióónnbbáássiiccaa((ccoolloorríímmeettrroo))yyaaqquueemmeeddiirreemmoosseennllaazzoonnaavviissiibblleeddeelleessppeeccttrroo..

CCoommoo eennzziimmaa ssee hhaa eelleeggiiddoo llaa ffoossffaattaassaa aallccaalliinnaa,, qquuee eessttáá iimmpplliiccaaddaa eenn eell ttrraannssppoorrttee ddeemmeettaabboolliittooss aa ttrraavvééss ddee llaassmmeemmbbrraannaass cceelluullaarreess.. EEssttaa eennzziimmaa hhiiddrroolliizzaa éésstteerreess ffoossffóórriiccooss aappHHbbáássiiccoo lliibbeerraannddoo ffoossffaattoo iinnoorrggáánniiccoo..EEssttáápprreesseenntteeeennccaassii ttooddooss llooss tteejjiiddooss,, ssoobbrree ttooddooeennhhííggaaddoo,, rriiññóónn,, iinntteessttiinnoo yy hhuueessoo.. LLaa aalltteerraacciióónn ddee ssuu ccoonncceennttrraacciióónn eenn ssuueerroo ppuueeddee oorriieennttaarrssoobbrree eell eessttaaddoo ddee uunn ddeetteerrmmiinnaaddoo tteejjiiddoo.. AAssíí ppoorr eejjeemmpplloo,, uunn aauummeennttoo eenn llooss nniivveelleess ddeeffoossffaattaassaa aallccaalliinnaa ppuueeddee iinnddiiccaarr aabbuussoo eenn eell ccoonnssuummoo ddee aallccoohhooll,, aanneemmiiaa,, ccáánncceerr ((hhuueessooss,,pprróóssttaattaa,, eettcc..)) yy oottrraass eennffeerrmmeeddaaddeess hheeppááttiiccaass,, rreennaalleess,, eettcc.. PPoorr eell ccoonnttrraarriioo,, nniivveelleess bbaajjoossppuueeddeenniinnddiiccaarrccrreettiinniissmmooyyddééffiicciittddeevviittaammiinnaaCC..PPoorroottrroollaaddoo,,llaaccoonncceennttrraacciióónnddeeffoossffaattaassaaaallccaalliinnaaeessddeeppeennddiieenntteeddeellaaeeddaadd,,ssiieennddoobbaassttaanntteemmáássaallttaadduurraanntteellaaiinnffaanncciiaa..

LLaaddeetteerrmmiinnaacciióónnddeeffoossffaattaassaaaallccaalliinnaasseebbaassaaeennllaassiigguuiieenntteerreeaacccciióónn::

DDeemmaanneerraaqquueessiieellaabboorraammoossuunnaarreeccttaappaattrróónnccoonnddiiffeerreenntteessccoonncceennttrraacciioonneessddeeppNNPPsseerree‐‐mmoossccaappaacceessddeeddeetteerrmmiinnaarrllaaccoonncceennttrraacciióónnddeeffoossffaattaassaaaall‐‐ccaalliinnaaddeeuunnaammuueessttrraapprroobbllee‐‐mmaaaappaarrttiirrddeellaaaabbssoorrbbaanncciiaaoobbsseerrvvaaddaaccoommoorreessuullttaaddooddeellaaaacccciióónnddeellaaeennzziimmaassoobbrreeeellssuussttrraattooppNNPPPP

p‐nitrofenilfosfato (pNPP)    p‐nitrofenol (pNP)

   Fosfatasa   

Condiciones    Alcalinas 

p‐nitrofenolato (amarillo A

410)  

p‐nitrofenol (pNP)

 A410

Muestra problema

U/L

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MMAATTEERRIIAALLEESSyyRREEAACCTTIIVVOOSSGuióndeprácticasPipetusPipetasgraduadasde5y10mlMicropipetasautomáticasde0,1y1mlpH‐metroTubosde50mlUnconjuntodedosdisolucionesparaprepararsolucióntampónFrascolavadorVasodeprecipitadosTubosdeensayoCajasdepuntasamarillas(0,1ml)yazules(1ml)VortexColorímetroSolucionesdemanitol,MgCl2, p‐nitrofenol (pNP),p‐nitrofenilfosfato(pNPP),NaOHytampóncarbonatoSoluciónproblemadefosfatasaalcalinaGradillaBañodeaguaa30oCOrdenadoreimpresora

PPRROOCCEEDDIIMMIIEENNTTOOPPRRIIMMEERRAAPPAARRTTEE::PPrreeppaarraacciióónnddeeddiissoolluucciioonneessttaammppóónnDe acuerdo con lo indicado en la introducción sobre la naturaleza de los tampones sesuministrará a cada grupo un conjunto de dos componentes (A/B, C/D o E/F) quedebidamentemezcladosdeberíanproducirunadisolucióntampónconunpHdeterminado.

1.Numerardel1al4cuatrotubosde50mlsuministrados

2.Utilizandolaspipetasymicropipetasadecuadas(segúnseindicaacontinuación)pipetearen los tubos del paso 1 las siguientes cantidades (en ml) dependiendo del grupo decomponentesdeladisolucióntampónquesehansuministrado.

Tubo A(ml) B(ml) Tubo C(ml) D(ml) Tubo E(ml) F(ml)

1 19.84 0.16 1 16.06 3.94 1 17.6 2.4 2 17.78 2.22 2 11 9 2 12.42 7.58 3 8.26 11.74 3 7.48 12.52 3 9.88 10.124 0.74 19.26 4 1.66 18.34 4 8.05 11.95

1 2 3    4

19

Ejemplo1:siqueremospipetear17.78mldeberíamospipetear10y7mlconlapipetade10ml.Luegopipetear780lconlamicropipetade1ml.Ejemplo2:siqueremospipetear9.88mldeberíamospipetear9mlconlapipetade10ml.Luegopipetear800lconlamicropipetade1mly80lconlamicropipetade100l.Ensuma,usarlaspipetasde5y10mlparacantidadesenterasdemlylasmicropipetasparacantidadesmenoresde1ml(micropipetade1000l)y0,1ml(micropipetade100l). 3.Cerrarcada tuboconsucorrespondiente tapónymezclar suavementevolteandoel tubounascuantasveces.

4.ProcederalamedidadelpHdecadaunodelostubos,paralocual:Seenjuagaráelelectrodoconunchorrodeaguadestiladadeunfrascolavador

Sesecaráelelectrodoconunpapel.Nofrotar,solosecarellíquidoquepuedaquedaradheridoalelectrodo.

20

Seintroduciráelelectrodoencadatubode50mldelpaso2sumergiéndoseaprox.unos2‐3cmenladisolucióncuyopHsequieremedir.Seesperaráhastaobtenerunvalorestableyseanotaráconbolígrafo(NOlápiz)enlatabladeresultadosdelfinaldelaprácticaindicandoquéparejadecomponentessehausadoparahacereltampón.Esteproceso(enjuagar,secareintroducirelelectrodo)serepetiráparacadaunodelostuboscuyopHsevayaamedir.Atención:loselectrodossonfrágiles.Importantemanejarlosconcuidado,evitandoungolpeconlasparedesdelostubosoconcualquierotrasuperficie.Unavezsehasecadoconunpapelelelectrodo,estedebesumergirse inmediatamenteen líquido,yasea ladisoluciónamediro ladealmacenaje siyano sevaausarmás.Nuncadejarque seseque.

PPRROOCCEEDDIIMMIIEENNTTOOSSEEGGUUNNDDAAPPAARRTTEE::DDeetteerrmmiinnaacciióónnddee llaaaaccttiivviiddaadd ffoossffaattaa‐‐ssaaaallccaalliinnaaeennuunnaammuueessttrraapprroobblleemmaa

1.Preparar7tubos,marcarloscomoseindicaypipetearelvolumendecadadisoluciónenlindicadoenlatabladeabajo.Mezclarenelagitadorvortex.Cuidado:Añadirlamuestradeenzima(tuboM)enúl‐timolugar,despuésdeañadidotodolodemás,mez‐claryrápidamentepasaralpaso2.

Tubo Tampón Carbonato

Manitol MgCl2 pNP (producto)

pNPP (sustrato)

Muestra (enzima)

B 800 100 100 - - - 1 775 100 100 25 - - 2 750 100 100 50 - - 3 725 100 100 75 - - 4 700 100 100 100 - - 5 650 100 100 150 - - M 650 100 100 - 100 50

2-3 cm

1 2 3 4 5 M

B

21

2. Incubarlostubosdurante15mina30oCenbañodeagua.

3. Sacar los tubosdelbañoydetener la reacciónañadiendoacada tubo1mlde3NNaOH.Mezclarconvortex.Cuidado:Manipular ladisolucióndeNaOH conprecaución ya que es caustica y puededañarlapielylaropa.

4. Medir la absorbancia a 410 nmde cada uno de los tubos del paso 3 en un colorímetro.Antesdeprocederajustarelblanco(teclaR)coneltuboB.Anotarcadaunadelasmedidasconunbolígrafo(Nolápiz)enlahojaderesultadosdelfinal.

5. Utilizando los ordenadores del laboratorio que ya estarán preparados, representargráficamente la concentración de p‐nitrofenol (pNP) en abcisas frente a la absorbanciamedida en ordenadas (tubos 1 a 5). Ajustar a una recta. A partir de la recta deducir laconcentración de fosfatasa alcalina de la muestra problema basándose en la absorbanciamedidaeneltuboM.

6. Imprimirlagráficaconsuscorrespondientesdatosparaentregarlaalfinaldelaprácticaalprofesor.

PPRROOCCEEDDIIMMIIEENNTTOOFFIINNAALL..SSííggaannsseelloossppaassoossttaallyyccoommoosseeddeettaallllaann,,ssiinnoommiittiirrnnaaddaa::

1. Limpiartodoydejarlocomoseencontróalprincipio.Paraello: Verterloslíquidosdelostubosenelbidóncorrespondiente Enjuagarlostubosconaguadelgrifoydespuésconaguadestilada.Nousardetergente.

Asegurarsedesulimpiezaydejarlosescurriendobocaabajo Enjuagarpipetasycualquierotromaterialquesehayausadodelamismaformaqueen

elpuntoanterior Dejartodoordenadosobrelamesada

2. Enseñaralprofesorelpuestodetrabajo.

3. Entregaralprofesor: Lahojaderesultadosdelfinaldelaprácticaconlosdatosanotadosenlasdospartesde

lapráctica Lahojaimpresaapartirdeloscálculoshechosenelordenador

(El nombrede losalumnos de cada grupodebeirescritoentodaslashojas)

Atención:Acceso al vídeo de la práctica 2 de Bioquímica I de Medicina

http://bit.ly/1KAGvnx

Título: Lec620 Práctica 2: Introducción al Laboratorio de Bioquímica (umh1025 2015-16)

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HHOOJJAADDEERREESSUULLTTAADDOOSSDDEELLAAPPRRÁÁCCTTIICCAA22BBIIOOQQUUÍÍMMIICCAAIIMMEEDDIICCIINNAANNOOMMBBRREEGGRRUUPPOODDEEPPRRÁÁCCTTIICCAASSFFEECCHHAADDEELLAAPPRRÁÁCCTTIICCAAPPAARRTTEE11

CCoommppoonneenntteess((iinnddiiccaarrccoonnuunnccíírrccuulloo))AA//BBCC//DDEE//FF

TTuubboonnºº ppHHmmeeddiiddoo

11

22

33

44 PPAARRTTEE22

TTuubboo MMeeddiiddaaddeeAA441100

CCoonncceennttrraacciióónn((UU//ll))

11 2255

22 5500

33 7755

44 110000

55 115500MM11//MM22//MM33**

**IInnddiiccaarrccoonnuunnccíírrccuullooeellttiippooddeemmuueessttrraa

23

24

PPRRÁÁCCTTIICCAA33::CCIINNÉÉTTIICCAAEENNZZIIMMÁÁTTIICCAA::CCoolliinneesstteerraassaaddeellssuueerroo..

PPrrooff..RReessppoonnssaabbllee::JJaavviieerrSSaaeezzVVaalleerroo((jj..ssaaeezz@@uummhh..eess))

IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN En los vertebrados existen dos tipos de colinesterasas, enzimas que hidrolizan preferentemente los ésteres de colina, la acetilcolinesterasa (AChE) y la butirilcolinesterasa (BuChE). Son codificadas por genes distintos, y se distinguen por la preferencia de sustrato (acetilcolina y butirilcolina), sus características cinéticas, y el efecto de inhibidores: iso-OMPA (tetraisopropil pirofosforamida), inhibe preferente BuChE, y BW (dibromuro de 1,5 bis (4-alildimetilamoniofenil) pentan-3-ona) inhibe AChE.

La AChE es una enzima vital, por su papel en la hidrólisis de la acetilcolina liberada en las sinapsis colinérgicas, aunque posiblemente desempeña otras funciones, ya que está presente en tejidos no colinérgicos. La función de la BuChE no ha sido aún totalmente establecida y no se conoce sustrato biológico específico, aunque también puede cumplir un papel en la hidrólisis de acetilcolina.

Para el ensayo de AChE y BuChE en el laboratorio, usamos tio-análogos de sus sustratos específicos (que no biológicos), en una reacción conocida como método de Ellman (*). *A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochem Pharmacol. 1961;7:88-95

En el ensayo, la reacción se produce en presencia de DTNB (ácido ditiobis-nitrobenzoico), el cuál reacciona con la tiocolina que se libera. Apreciamos el curso de la reacción por el incremento de color, que nos indicará el incremento de producto con el tiempo. El aumento de color lo medimos en un colorímetro a una longitud de onda de 410 nm (determinaremos el incremento de absorbancia/unidad de tiempo).

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OOBBJJEETTIIVVOOSS En esta práctica el alumno realizará la medición del curso temporal de una reacción enzimática y determinará los parámetros cinéticos de constante de Michaelis (KM) y velocidad máxima (Vmax). Como fuente de enzima se utilizará la butirilcolinesterasa (abreviada BuChE), también llamada colinesterasa plasmática. El alumno habrá de ser capaz de:

Medir actividades enzimáticas por técnicas colorimétricas Representar gráficamente el curso temporal de la reacción y valorar la linearidad del proceso Calcular actividades enzimáticas, expresando el resultado en unidades de actividad

enzimática Observar una cinética michaeliana y representar la curva de velocidad frente a concentración

de sustrato Determinar las constantes cinéticas por la representación de Lineweaver-Burk

MMAATTEERRIIAALLEESS yy RREEAACCTTIIVVOOSS

Colorímetro Tubos de ensayo y gradilla; micropipetas y pipetas de 5 y 10 ml, y diversos frascos Material biológico: suero (contiene la enzima BuChE) Butiriltiocolina (BuTCh) 6 mM en agua Tampón fosfato 0.1M pH 7,4 Ácido 5,5’-ditiobis nitrobenzoico (DTNB), 0.9 mM, en tampón fosfato 0.1M pH 7,4 El alumno traerá: cronómetro, calculadora y regla para las gráficas.

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MMÉÉTTOODDOO Ensayo de actividad enzimática El alumno va a observar: 1) La formación de producto con el tiempo.

2) El efecto de la concentración de sustrato. Preparación de disolución diluida de suero (enzima) El tubo de ensayo etiquetado "enzima" (distinto a todos los demás de la gradilla), contiene 1 ml de suero y 9 ml de tampón fosfato pH 7.4. Tener en cuenta que es una disolución 1:10 para realizar los cálculos del factor “f” (ver más adelante; ya que al pipetear 1ml, tomamos sólo 0.1 ml suero). Recordar mezclar bien cada vez que pipeteis. Procedimiento: 1) Disponer de tubos de ensayo pequeños utilizables en el colorímetro. Etiquételos del 1 al 6 (más un tubo para el cero o blanco).

2) A continuación, prepare los tubos 1 al 6 de acuerdo con el protocolo del esquema siguiente.

Esquema protocolo ensayo actividad enzimática

B 1 2 3 4 5 6 Sustrato 6mM NO 0,05 0,1 0,2 0,4 0,5 1,0

Agua (ml) 2 0,95 0,9 0,8 0,6 0,5 0,0 DTNB (ml) 1 1 1 1 1 1 1

No añadir el enzima hasta el momento de la medida Enzima (ml) NO 1 1 1 1 1 1

Volumen total:          3 ml              3 ml             3 ml              3 ml              3 ml             3 ml             3 ml  Para ello:

Añadir el volumen de sustrato (butiril-tiocolina o BuTCh) y de agua indicado para completar.

Añadir 1 ml de disolución de DTNB (agitar y esperar 2 minutos hasta primera medida).

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3) Antes de la primera medida de actividad, usar el tubo “blanco” que contiene sólo 2 ml de agua y 1 ml de DTNB (volumen total 3 ml), y usarla para hacer el ‘autocero’ del colorímetro.

4) Ahora va a añadir la enzima. Tenga en cuenta que una vez añadida la enzima ya ha empezado la reacción enzima-sustrato. Tenga a mano: la disolución de enzima, un trocito de parafilm, una pipeta de 1 ml y un reloj o cronómetro con el que pueda medir segundos. Debe terminar la reacción en un tubo para añadir la enzima al siguiente.

El procedimiento es el siguiente:

Añadir 1 ml de enzima, mezclar dándole la vuelta tapando el tubo con parafilm, poner en marcha el cronómetro, inmediatamente después introducir el tubo en el colorímetro, cada 20 segundos, durante 2 minutos, anote el valor de absorbancia (a 410 nm).

Entre las medidas de los distintos tubos, si otro compañero está esperando, cede el uso del colorímetro. * En general es preferible iniciar la reacción añadiendo el sustrato, pero en esta práctica conviene dispararla con la enzima. Ello nos lleva a despreciar el valor de hidrólisis espontánea. Un inconveniente del método es la interferencia que producen los grupos tioles libres presentes en las proteínas de la muestra, los cuales al reaccionar también con el DTNB pueden alterar la medida enzimática. Ello se evita, en parte, incubando las muestras con el DTNB, antes de añadir el sustrato, hasta que los grupos tioles se valoren convenientemente. La adición de inhibidores es necesaria si la muestra puede contener AChE y BuChE, si sólo una de ellas está presente, como es el caso, se pueden omitir.

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CCÁÁLLCCUULLOOSS DDEE AACCTTIIVVIIDDAADD EENNZZIIMMÁÁTTIICCAA

Una Unidad Internacional de actividad enzimática (UI o U) es la cantidad de enzima que transforma 1 μmol de sustrato por minuto (unidad de tiempo) en las condiciones de ensayo (1 U= 1 mol/min)

Partimos de la Ley de Lambert-Beer, ya que la relación absorbancia / concentración sigue dicha Ley de Lambert-Beer:

Absorbancia = ×C×L Siendo:

= coeficiente de extinción molar del cromóforo (litro / mol×cm) C = concentración molar de producto formado (moles / litro) L = longitud del paso óptico (para la cubeta de medida usada: 1 cm)

Por tanto podemos despejar la concentración del producto, y el resto de parámetros los conocemos:

C = Abs / (×L) En nuestra reacción colorimétrica: 1,36×104 (moles / litro) y L = 1 (cm).

Así, para calcular la actividad enzimática usaremos el valor del incremento de absorbancia (Abs) frente al tiempo (aparición de producto coloreado).

Dicho de otro modo, debemos calcular la aparición de producto (o desaparición de sustrato) por tiempo. En la ecuación de Lambert-Beer dividimos entre tiempo… C/ t = (Abs/ t) / (×L) Y ya tendremos estimación de la actividad enzimática. Para los cálculos del Abs lo primero se representa la absorbancia de cada tubo, en los tiempos sucesivos, frente al tiempo, y comprobamos si la misma es más o menos lineal. *para los cálculos debe usarse sólo su tramo lineal

La pendiente de la recta de Abs frente a tiempo nos proporcionaría el dato del incremento de absorbancia (Abs) frente al tiempo (Abs /seg o min), ya que en y = m×x + n; y la pendiente o m = y / x, en este caso y=Abs y x= tiempo. Para facilitar los cálculos sin la necesidad de obtener el valor numérico de la pendiente también podemos directamente calcular el Abs por min yendo a valores obtenidos experimentalmente que se ajusten mejor a la recta [por ej. calcular la diferencia de Absorbancia entre los segundos 0 y 60 seg, o 20 y 80 seg, o 40 y 100 seg, etc. (siempre 1 min)]. Así, si sustituimos este dato (Abs / min) en la ecuación: C/ t = (Abs/ t) / (×L), obtendremos el valor de actividad enzimática: C/min (moles / Litro×min). Obviamente debemos considerar los volúmenes de muestra (y totales) que usamos. Así, en realidad para calcular la actividad enzimática por ml, empleamos la expresión:

Actividad en U/ml (µmol / min×ml) = [(Abs/min)×103×Vt] / [1,36×104×1×Vm]

Donde Vt es el volumen total en la cubeta, y Vm el volumen de muestra (enzima). 103 es un factor de conversión [resultante de pasar de moles a μmoles (103), y de litros a ml (103]

Para simplificar los cálculos, conviene calcular un factor “f” tal que:

Actividad en U/ml (µmol×min-1×ml-1) = (Abs/min) ×f

Calculad dicho factor f para nuestros ensayos. Así pues, debe comprobar la linealidad de Abs gráficamente, calcular el Abs/min y multiplicar este valor por el factor “f” para obtener la actividad (velocidad de reacción) en mol/min /ml suero

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RESULTADOS *Entregar al Profesor esta hoja de manera individual junto a las de cálculo después de la práctica y antes de abandonar el laboratorio CUESTIONES PRÁCTICA NOMBRE Y APELLIDOS: GRUPO (al que pertenece): FECHA DE LA PRÁCTICA: 1.1. ¿Por qué es mejor usar butiriltiocolina que acetiltiocolina para medir la actividad de butirilcolinesterasa? 1.2. ¿Y por qué usar butiriltiocolina y no butirilcolina en este ensayo (método de Ellman)? 1.3. ¿Por qué prescindimos de inhibidores de colinesterasas para el ensayo de la butirilcolinesterasa en el suero de pollo? 2.1. En la práctica, y para realizar el ajuste manual en la gráfica de velocidad frente a [sustrato], asumimos que se cumple la ecuación de Michaelis – Menten, ¿a qué tipo de curva ajustamos dicha representación? ¿qué representa la KM en dicha gráfica? 2.2. ¿De qué grafica es más exacto realizar los cálculos de KM y Vmáx? (según gráfica representada más adelante) 3.- En las hojas siguientes deberá incluir los siguientes cálculos: - Las tablas de Abs y las gráficas de absorbancia frente a tiempo - Tabla con valores de Abs/min, v, 1/v, [S], 1/ [S] para cada tubo - Gráfica de v frente a S y gráfica de 1/v frente a 1/S (realizadas con el ordenador) - Valor obtenido de KM y Vmáx (con unidades) A continuación se recogen los DATOS y CÁLCULOS (entregar sólo una copia por pareja de prácticas)

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REGISTRO DE LOS DATOS EXPERIMENTALES Comprobar la linealidad del incremento de Absorbancia y calcular el ∆Abs/min para al menos 2 intervalos de 1 min, usar el valor promedio como ∆Abs/min de cada tubo

TUBO 1 T (sg) Abs410

0 20 40 60 80

100 120

TUBO 2 T (sg) Abs410

0 20 40 60 80

100 120

TUBO 3 T (sg) Abs410

0 20 40 60 80

100 120

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(continuación)

TUBO 4 T (sg) Abs410

0 20 40 60 80

100 120

TUBO 5 T (sg) Abs410

0 20 40 60 80

100 120

TUBO 6 T (sg) Abs410

0 20 40 60 80

100 120

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Calculad la actividad enzimática en U/ml suero (mol/min×mL de suero) Con el cálculo del factor “f” es inmediato el cálculo de la actividad (v0, velocidad de reacción)

Actividad en U/ml (µmol×min-1×ml-1) = (Abs/min) ×f

INDIQUE SU VALOR f= Realizar ahora el cálculo para cada tubo ([S0]): TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3 TUBO 4 TUBO 5 TUBO 6Abs/min V(µmol×min-1×ml-1) S (µM) *Para conocer la concentración de sustrato final en cada uno de los tubos, debe aplicar la fórmula de que los equivalentes iniciales y finales de sustrato.

Vi × Si = Vf × Sf Por ejemplo, para el tubo 1: 0.05ml × 6mM = 3ml × S1 → (S1 = 0.1 mM)

B 1 2 3 4 5 6 Sustrato 6mM NO 0,05 0,1 0,2 0,4 0,5 1,0

Agua (ml) 2 0,95 0,9 0,8 0,6 0,5 0,0 DTNB (ml) 1 1 1 1 1 1 1 Enzima (ml) NO 1 1 1 1 1 1

VVoolluummeenn ttoottaall:: 33 mmll 33 mmll 33 mmll 33 mmll 33 mmll 33 mmll 33 mmll De la misma forma anterior, halle las concentraciones S2 hasta S6, y expresarlas en valores µM. Contamos pues con 6 pares de valores, v0, [S0], (uno por cada tubo) para la representación de Michaelis–Menten: v0 frente a [S0] Representación de la Ecuación de Michaelis-Menten La representación se realizará en los ordenadores del laboratorio, bajo las indicaciones del profesor responsable. Una vez representados los puntos se realizará un “ajuste manual” a una hipérbola rectangular. Téngase en cuenta la dificultad del ajuste al representar tan sólo 6 puntos; por ello el cálculo de la Vmax ni la KM se realizará en la gráfica de dobles inversos.

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En la práctica no suelen calcularse la Vmax ni la KM a partir de la curva de saturación, es poco preciso, por lo que usamos la representación de Lineweaber-Burk o de dobles inversos, por lo que primero calculamos 1/v y 1/[S] de la tabla anterior TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3 TUBO 4 TUBO 5 TUBO 61/V 1/S Con estos 6 pares de valores, 1/v0, 1/[S0], (uno por cada tubo) realizamos la representación de dobles inversos calculando los valores de Vmax y KM por los puntos de intersección con los ejes

De nuevo recurrimos al uso del ordenador para la representación de la gráfica y en este caso también para el ajuste de la recta y los puntos de corte con los ejes de donde obtendremos los valores de la Vmax y la KM (puntos de corte. Indicar dichos valores con sus unidades correspondientes.