h cre mikrocerrahi y ntem(trk).pdf463.61 kb
TRANSCRIPT
Hücre Üzerine Mikrocerrahi
Uygulamaları
Hücrenin altbirimlerine
ayrılması
Moleküllerin analizi
Prof. Dr. Müjgan Cengiz
Canlı Hücrelerdeki Moleküllerin
İzlenmesi
Mikroskopla inceleme hücrede belli
düzeyde araştırma sağlar.
Hücre sabit bir yapıda değildir. Stabil görünen yapılar bile birleşir ayrılır yeniden organize olur.
Bu dinamik yapının izlenmesinde optik mikroskop kullanılır. Görüntüleme için radyoaktif bileşikler, floresan boyalar(aequorin) kullanılır .
Balık yumurtasına lüminesan protein
olan aquorin verilince serbest Ca
varlığında floresan ışık yayılır.
Spermle birleşen yumurtanın Ca ları
10 saniyede değişir.
Serebellumdaki purkinje
hücrelerindeki kalsiyum değişimi
floresan bir boya ile görünür hale
getirilir.
Hücreye Membrandan geçemeyen maddelerin yerleştirilmeleri.
A) Maddeler hücreye bir mikropipet yardımıyla basınç uyulayarak veya eğer madde elektrik yüklüyse voltaj ugulayarak yerleştirilebilir. Uygulanan voltaj iyonik yük nedeniyle maddeyi hücre içine geçirir. Bu yönteme iontophoresis denir.
B) Hücre zarı kısa ama yoğun bir elektrik şokuna tabi tutularak membran yapısı bozulur ve made membrandan kolayca geçecek hale getirilir.
C) Membranla kaplı veziküller istenilen madde ile yüklenir ve hedef hücreye entegre olarak maddeyi hücre içine geçirir.
D) DNA ile kaplanmış altın partikülleri farklı bir geni çekirdeğe sokar.
Hücrenin Altbirimlerine Ayrılması
Biyokimyasal analizlerin yapılabilmesi için hücrenin doğal yapısının bozulması gereklidir.
Çeşitli hücre altbirimlerinin ayrılması için zarar verici olmayan ayırma yöntlemleri gereklidir.
Bu işlem organellerin kendi fonksiyonlarının korunması için gereklidir.
Doku önce kendisini oluşturan hücre tiplerine ayrılır.
Daha sonra fonksiyon gören organellerine ve makromoleküllerine ayrılır.
Organeller ve Makromoleküller
Ultrasantrifüjleme Yoluyla Ayrılır
Hücreler çeşitli yollarla parçalanabilirler.
A) osmotik şok uygulanabilir
B) Ultrasonik titreşim veya
C) Küçük bir kapta ona uygun bir kolla
ezilebilir veya
D) Blendırda parçalanabilir(kesici
bıçakla).
Bu işlemler hücrenin pek çok zarını
parçalayarak (plazma membranı ve
endoplazmik retikulum membranı)
bazı zarlarda küçük kapalı veziküller
oluşturur.
Bu parçalama işlemi dikkatlice
uygulanırsa, çekirdek, mitokondri,
golgi aygıtı, lizozomlar ve
peroksizomlar gibi organeller zarar
görmeden izole edilebilirler.
Hücrelerin bu süspansiyonu yoğun bir
karışımdır (buna homojenat veya ekstrakt
denir) ve çeşitli membranla çevrili
organelleri içerir. Bu organellerin her biri
farklı büyüklük, yük ve yoğunluğa sahiptir.
Kullanılan homojenizasyon ortamı
dikkatlice seçilmelidir (her organel için
ardarda yapılan deneme yöntemi ile
bulunmuştur).
Homojenatın farklı bileşenleri ayrılacaktır.
Bu şekilde hücre organellerinin ayrılması preparatif ultrasantrifüjleme yoluyla yapılır. Hücre içeriğinin bulunduğu karışım yüksek hızlarda santrifüjlenir.
Preparatif Ultrasantrifüjleme
Bu yöntem hücre komponentlerini
büyüklük ve yoğunluklarına göre
ayırmaktadır:
Genellikle, ayrılacak olan en büyük
birimler en hızlı çöker.
Düşük hızlarda çekirdek sedimenti gibi
büyük bileşenler santrifüj tüpünün
dibinde bir tortu oluştururlar;
Daha yüksek hızlarda mitokondri
pelleti çöker;
Daha yüksek hızlarda ve daha uzun
santrifüjleme işlemlerinde önce küçük
kapalı veziküller daha sonrada
ribozomlar çöker.
Santrifüjleme adımlarının tipik değerleri
şunlardır:
Düşük hız santrifüjleme 1000 g’de 10
dakika
Orta hız santrifüjleme 20,000 g’de 20
dakika
Yüksek hız santrifüjleme 80,000 g’de 1
saat
Çok yüksek hız santrifüjleme 150,000
g’de 3 saat
Bütün bu bileşenler kirlidir, bulaşanların
temizlenmesi için pellet birkaç kez
kullanılan tamponla yıkanıp tekrar
santrifüjlenir.
Yoğunluk Garadienti Santrifüjlemesi
Yoğunluk gradiyenti santrifüjlemesi olarak
adlandırılan diğer bir santrifüjleme yöntemi de
vardır.
Bu işlem santrifüj tüpünün sukroz gibi bir
çözeltinin farklı yoğunluklarda doldurulmasıyla
uygulanır.
Oluşturulan yoğunluk gradienti (en yoğun
bölümü tüpün en altındadır)aşağıdan yukarıya
doğru azalan yoğunluklarda hazırlanır ve
ayırma işlemi sırasında bu bantlar birbirine
karışmaz.
Daha iyi bir ayırım yapabilmek için
homojenat yoğun olmayan bir tuz
çözeltisi içinde santrifüj tüpünün
üzerine ince bir pipet yardımıyla
uygulanır (santrifüj tüpü %5 ile %20
arasında tabakalandırılmış sukroz
çözeltisiyle hazırlanmıştır).
Santrifüjleme yapıldığı zaman,
karışımdaki çeşitli bileşenler gradient
boyunca farklı bantlara hareket ederler,
her bir bileşen hız sedimentasyonu
denilen bir işlemle farklı hızda çöker.
Bunu izleyen santrifüjlemede farklı
bileşenler tek tek toplanır, basitçe bu
işlem santrifüj tüpünün tabanının
delinmesiyle gerçekleştirilir.
Parçalanmış hücrelerde kompleks
işlemlerin moleküler ayrıntılarının
incelenmesi
Ultrasantrifüjle izole edilmiş olan organellerin
ve diğer büyük hücresel alt birimlerin
çalışılması farklı hücresel bileşenlerin
anlaşılmasına çok büyük katkılar yapmıştır.
Santrifüjleme ile saflaştırılmış
mitokondri ve kloroplastlarla yapılan
deneylerde bu organellerin temel
fonksiyonları ve enerjiyi hücrelerin
kullanabileceği şekle nasıl
dönüştürdüğü gösterilmiştir.
Benzer şekilde, düz ve granüllü
endoplazmik retikulumdan
(mikrozomlar) oluşan salgı vezikülleri
birbirinden ayrılarak hücrelerde bu
kompartmanların fonksiyonları
incelenmiştir.
Proteinler kromatografi yöntemi ile
ayrılırlar
Proteinler kolon kromatografisi ile
ayrılabilirler. Bu yöntemde çözeltideki
protein karışımı geçirgen katı bir
matriks ile doldurulmuş kolondan
geçirilir.
Farklı proteinler matriks ile
etkileşimlerine bağlı olarak farklı
zamanlarda kolondan ayrılırlar ve akış
zamanına göre kolonun ucundan
toplanırlar (şekil).
Örnek (farklı moleküllerin karışımı) kolonun üstüne uygulanır.
Matriks, sellüloz gibi geçirgen bir maddedir.
Büyük miktarda sıvı kolondan geçirilir.
Moleküller tabandan toplanır.
Farklı örnek bileşenleri farklı hızlarda hareket ederler.
Ve ayrı tüplerde toplanırlar.
Kromatografide üç tip matriks
kullanılmaktadır.
İyon-değişim kromatografisi (A)
kullanılan matriksin taşıdığı yük, ters
yükteki moleküllerin geçişini engeller.
Kullanılan matriks tipleri;
Dietillaminoetilselüloz (DEAE-cellulose)
pozitif yük taşır ve karboksimetilselüloz
(CM-cellulose) negatif yük taşır.
Jel filtrasyon kromatografisi (B) matriks
inert ama geçirgendir. Moleküller
matriksten geçecek kadar küçüktür fakat
kolondan yavaş geçerler.
Matriks materyallerinden olan
polisakkaridin por büyüklüğüne göre
farklı tipleri vardır (dekstran, agroz veya
akrilamid). Bu özelliğinden dolayı çeşitli
molekül ağırlığındaki moleküllerin
ayrılmasında kullanılır.
Affinite kromatografisi (C) özel bir
liganda kovalent olarak bağlanmış suda
çözünmez bir matriks içerir. Bu ligand bir
antikor molekülü veya özel bir proteini
bağlayan bir enzimin substratı olabilir.
• Bu substrat özel bir proteini bağlayabilir.
•Enzim molekülü immobilize substrata bağlanır.
•Bu enzim tutulmuş olur. Sıvının kalan kısmı akar.
•Daha sonra bu immobilize enzim diğer bir çözeltiyle bu bölgeden uzaklaştırılır.
• Bu çözelti antijen-antikor kompleksi oluşturabilir veya ayrılacak bileşiğe uygun yüksek tuz içeren bir çözelti veya farklı pH’da bir bileşik olabilir.
•Aranan bileşik saf olarak ayrılır.
Elektroforez
Bir proteinin büyüklüğü ve altbirim kompozisyonu SDS poliakrilamid jel elektroforezi tarafından saptanabilir.
Proteinler net negatif veya net pozitif yük taşırlar.
Protein içeren bir çözeltiye elektrik yükü uygulandığında proteinler büyüklük, yük ve şekline bağlı olarak göç ederler.
Bu teknik nişasta gibi geçirgen bir matriks içine uygulanan proteinleri ayırmak için kullanılır.
Her protein molekülü çok sayıda negatif yüklü
SDS molekülü bağlar.
Bu işlem proteinin yükünü maskeler.
Proteinin pozitif elektroda göç etmesini
sağlar.
Daha sonra voltaj uygulanır.
Poliakrilamid jel moleküler elek olarak
davranır.
Büyük moleküller küçüklerden sonra göç
eder.
Protein karışımı ayrı protein bantları olarak
görülür.