HLA Tiplendirmesinde Yeni Nesil Dizileme

Dr. Türker DUMAN

MHC• MHC bölgesi Kr. 6p21’de lokalize olan 4

mega baz yaklaşık 220 gen• Genomunun en yoğun bölgesidir,

genomun büyüklük olarak yaklaşık % 0.1’ine karşılık gelirken bu bölgedeki genler tüm genlerin % 0.6’sını oluşturur.

• Bölgedeki genlerin bir çoğu adaptifimmün cevaptan sorumludur, genlerin yaklaşık %20’ si immünite ile ilişkilidir

• Human lökosit antijeni (HLA), bu genetik bölgenin çekirdekli hücrelerin yüzeyinde eksprese olan ve alloreaktivitedensorumlu hücre yüzey glikoproteinlerinikodlayan bölümüdür.

• HLA genleri genomun en polimorfikgenleri

• MHC bölgesinde bulunan genler

• HLA genlerinin doku ve organ transplantasyonunda önemli bilinmektedir

• Transplantasyonda doku reddi immün sistemin yabancı antijene karşı normal bir yanıtıdır.

HLA Tiplendirmesi

• HLA Tiplendirmesindeki amaç bu alellerin ve kodladıkları antijenlerin belirlenmesidir.

• HLA bölgesindeki polimorfizmleri belirlemek için çeşitli yöntemler kullanılmıştır.

• Terasaki ve Mc Clelland tarafından bulunan hücresel temelli serolojik yöntemler yaklaşık 50 yıldır kullanılmaktadır– bu yöntemlerin çeşitli teknik dezavantajları ve bu olağanüstü

çeşitliliği karşılamada yetersiz kalmaktadır

• Son 30 yılda rekombinant DNA teknolojisi, Sanger zincir sonlanma dizileme yöntemi, Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) gibi moleküler genetik yöntemlerin kullanılmasıyla bu sıra dışı alelik çeşitlilik ortaya konulabilmiştir

• Sınıf I zar içinde sabitlenmiş bir ağır zincir ve beta-2-mikroglobulinoluşan heterodimerdir. Ağır zincirde 2 ve 3. ex sınıf I moleküllerinde peptid bağlama özgünlüğü sorumludur.

• Sınıf II molekülleri, Alfa ve Beta zincirlerinden oluşan bir heterodimerdir. DR Beta zinciri peptide bağlanma özgüllüğünü veren polimorfizmileri içerir. pp zincirin birinci domaini kodlayan 2. ekzonalel farklılıklarının büyük kısmından sorumludur. HLA klas II tiplendirmesinde 2. ekzona odaklanmıştır

Moleküler Yöntemler

• Yaygın

• DNA temellidir

• Serolojik olarak ayırt edilemeyen fakat fonksiyonel olarak ayrı olan HLA alellerini tiplendirmek için geliştirilmiştir.

• 1987 yılında Southern Blot ve RFLP yöntemiyle başlamıştır

• PCR yönteminden sonra giderek yaygınlaşmıştır

• PCR-SSP

• PCR-SSO

• PCR-SBT– Sanger sekanslama en yüksek çözünürlük sunar ve referans

yöntem olarak kabul edilir.

Sanger Dizileme

• Doğruluk ve uzun okuma aralığı (800-1000) yaklaşık 30 yıldır genotiplendirme için altın standart olarak kabul edilmektedir.

• Yüksek maliyet, düşük verimlilik, yüksek iş gücü özellikle büyük bölgelerin sekanslamasında sıkıntı yaratmaktadır.

HLA tiplendirmesinde Sanger

• HLA bölgesindeki polimorfizm yüzdesi yüksek çözünürlükteki tiplendirmeyi zorlaştırmaktadır.

• Tiplendirme de belirsizlik (ambiquity) • Polimorfik bölgelerdeki

nükleotidlerin cis- trans pozisyonu

• amplifiye edilen bölge dışındaki polimorfizmlerdenkaynaklanmaktadır

Yeni Nesil Dizileme (NGS)

• Sanger yönteminin kısıtlamaları daha ucuz ve hızlı sekans teknolojilerine olan ihtiyacı arttırmıştır

• Bu ihtiyaç yeni nesil dizileme yöntemlerinin doğmasına yol açmıştır

• NGS platformları yüksek hacimde paralel dizileme yaparak milyonlarca DNA fragmentinieş zamanlı bir şekilde sekanslar. Bu sayede tüm genomun bir günden kısa sürede sekanslanması mümkündür.

HLA tiplendirmesinde NGS

NGS intronların da dahil olmak üzere büyük bölgeleri

• Uygun maliyet

• Uygulama kolaylığı

• Hızlı dizileme

HLA için– klonal amplifikasyon yaparak cis-trans pozisyon

bilgisini vermesiyle HLA tiplendirmesinde avantajlar sağlamaktadır

NGS

• Farklı NGS platfomları geliştirilmiştir. Sekanslamaaşaması için günümüzde yaygın olarak kullanılan platformlardan öne çıkan bazıları

– Roche 454

– İllumina Miseq

– İon-torrent

Pirosekanslama

• İlk yüksek verimli (high-throughput) sekanslamateknolojisi, Roche firması tarafından 2005 yılında piyasaya sürülen 454 prosequencing cihazıdır (Margulieset 2005).

• Bu cihaz pirosekanslama tekniği denilen bir yöntem ile çalışmaktadır.

• Pirosekanslama “sentezleyerek sekanslama” prensibine dayanmaktadır. Sanger sekanslamadanfarkı, dideoksinükleotid ile zincir sonlanma tekniği yerine nükleotid birleşmesi sonucunda salınan pirofosfatın belirlenmesine dayanmasıdır.

• DNA küçük fragmanlara ayrılır ve dizileme primerlerini taşıyan adaptörler eklenir. • Adaptörleri taşıyan DNA fragmanları mikroreaktörler içerisinde emülsiyon bazlı klonal amplifikasyon• Ardışık olarak akan nükleotitlerinin tamamlayıcı nükleotidin DNA ya bağlanması polimeraz pirofosfat (PPi) açığa

çıkmasını sağlar. • ATP sülfirilaz PPi'ı kantitatif olarak ATP'ye dönüştürür • ATP, lüsiferaz enzimi aracılığıyla lusiferinin oksilusiferine dönüşmesini sağlar. Oksilusiferin görülebilir bir ışık yaratır. • Bu ışığın şiddeti ATP miktarıyla doğru orantılıdır ve bu sayede tek nükleotid tekrarları tespit edilir. • Bu ışığı yaratan kemilüminesan sinyalin hangi nükleotidin bağlanması sırasında oluştuğu tespit edilir. • Ortaya çıkan bu ışık CCD kamera tarafından kaydedilir

• Roche 454 genotiplendirmede kullanılan ilk yeni nesil sekanstır

• Fakat sangere göre maliyet ve verim açısından çok fazla bir ilerleme değildir.

• Daha kısa okuma uzunluğuna sahip NGS platformlarında 454 e göre daha düşük maliyet ve daha yüksek veri avantajı vardır.

ILLUMİNA

• Illumina platformu polimeraz temelli sentezleyerek sekanslama ve köprü amplifikasyonu yöntemini kullanmaktadır.

• Illumina® firması tarafından piyasaya sürülen ilk cihaz GenomeAnalyzer’dır. Daha sonra yüksek kapasiteli HiSeq ve ticari laboratuvarlariçin MiSeq cihazları da aynı firma tarafından piyasaya sürülmüştür.

• Illumina NGS Sistemi HLA dışı uygulmalarda kullanılan en yaygın NGS platformudur. *

• Bu cihazlar da adaptör bağlanmış DNA kütüphanelerine ihtiyaç duymaktadır, sekanslanacak bölgeler adaptörler yardımı ile çoğaltılmaktadır.

• Reaksiyon, yüzeyinde oligonükleotidlerin bulunduğu “flow cell” adı verilen özel aparatlarda gerçekleşmektedir.

• Teknik üç temel aşama içermektedir. Bunlar; hedef bölgelerin seçimi (capture), seçilen bu bölgelerin sekanslaması ve veri analizidir

*Liu L et al. J Biomed Biotechnol 2012:2012:251364

Ion-Torrent

• DNA'nın polimerizasyonu sırasında ortaya çıkan Hidrojen iyonlarının saptanmasına dayanır.

• Tek bir Kalıp DNA dizisini içeren mikrokuyuya tek tip nükleotid akışı uygulanır.

• Verilen nükleotid kalıp ipliğe komplementer olduğu durumda yeni oluşan ipliğin yapısına katılır ve hidrojen iyonu salınımı olur.

• Hidrojen iyonlan hipersensitif iyon sensorleri tarafından algılanır.

• Kalıp DNA'da nükleotid tekrarlarının varlığı durumunda tek siklusta birden fazla nükleotid yeni ipliğin yapısına girer, salınan hidrojen iyonları artar ve daha fazla elektronik sinyal elde edilmesiyle DNA dizisi belirlenir

NGS ve Sanger temelli dizilemede çözünürlüğün karşılaştırılması

-Lange et al. BMC Genomics 2014,15:63

Veri Analizi

• Kısa okuma uzunluklarına sahip Roche, Illumina, Ion-torrent NGS platformlarının tek bir DNA küçük parçalara ayrılarak sekanslanmaktadır

• Bu küçük baz dizileri daha sonra bilinen bir referans genom kullanılarak yada bilinen HLA alellerinin verileri ile kıyaslanarak birleştirilmektedir

• Elde edilen sekansların kalitesini belirleyebilmek için doğru bir DNA referansı gereklidir

• HLA bölgesinin hiper polimorfik doğası polimorfizmleridoğru sıralanabilmeleri için zorluk oluşturabilmektedir

HLA Database

• HLA veri bankası bugüne kadar HLA nın daha polimorfikbölgelerine odaklanmıştır.

• NGS yaygınlaştıkça ve dizileme bölgeleri genişledikçe veribankasına yeni alellerin girişi artacaktır

• 2010 yılında güncellenen HLA numenkülatorü yeni bölgelerden gelebilecek dizi bombardımanını karşılamaya uygun

• Bu güne kadar tecrübeler sınıf1 için ex 2,3 ve sınıf 2 için ex2 bölgelerine dayanan HLA uyum algoritmaları üzerinde büyük bir etkisi olmayacağını düşündürmektedir

• Sekans verilerindeki artışla beraber klasik ex lar dışındaki polimorfizmlerin etkilerinin klinik olarak araştırılmasını gerektirmektedir.