CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS.

En cromatografía líquida, la fase móvil es un líquido que circula a través de una columna en la que está contenida la fase estacionaria. La fase móvil no sólo arrastra al analito, sino que existen interacciones intensas entre el analito y la fase móvil.

La retención cromatográfica es función de:

La fase móvil. La fase estacionaria. El analito.

Todas las especies que pueden disolverse pueden separarse eligiendo la combinación adecuada de fase móvil y fase estacionaria.

Componentes básicos en un equipo de HPLC:

MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS EN HPLC

Hay cinco métodos cromatográficos:

CROMATOGRAFÍA DE REPARTO: La cromatografía de reparto es hoy en día el método más utilizado. La cromatografía de reparto se divide en “fase normal”, y “fase reversa”, cuyas principales diferencias radican en las distintas polaridades de sus fases estacionarias y móviles.

Cromatografía en fase normal: En esta cromatografía a diferencia de en fase reversa, la fase estacionaria es polar y la móvil apolar. Las fases estacionarias se obtienen haciendo reaccionar químicamente los centros silanoles activos de la sílice con un trialquilclorosilano.

La retención también (como la de fase reversa) tiene lugar en esa especie de capa líquida depositada químicamente, como consecuencia de la distinta solubilidad relativa en la fase estacionaria (polar) y la fase móvil (apolar). Donde el analito menos polar será el primero que se eluye y el más polar el último en eluir.

Cromatografía en fase reversa: En la cromatografía de fase reversa su fase estacionaria en apolar, y la fase móvil polar. Las fases estacionarias han sido obtenidas haciendo reaccionar químicamente los centros silanoles activos de la sílice con un trialquilclorosilano.

La retención se produce en esta especie de capa líquida depositada químicamente como consecuencia de la distinta solubilidad relativa entre la fase estacionaria (apolar) y la fase móvil (polar).

Los compuestos más retenidos son los más apolares. La retención y selectividad se controlan fundamentalmente con la composición de la fase móvil. Para obtener una fase móvil de fuerza de elución óptima, se ensayan mezclas de metanol, acetonitrilo o tetrahidrofurano en agua.

APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFÍA DE REPARTO

Como aplicaciones de la cromatografía de reparto en productos de alimentación: edulcarantes artificiales, antioxidantes, aflatoxinas, aditivos en bebidas refrescantes, colorantes, aminoácidos, proteinas, carbohidratos, lípidos.

CROMATOGRAFÍA IÓNICA: La cromatografía iónica se usa para separar y determinar especies iónicas. La fase móvil es un líquido acuoso y salino que contiene un disolvente orgánico como metanol o acetonitrilo y un compuesto iónico que aporta un contraion de carga opuesta al analito. La elución de los pares iónicos se consigue mediante una disolución acuosa de metanol u otro disolvente orgánico soluble en agua. La fase estacionaria es una resina de intercambio iónico. Se trata de un material polimérico (Ej: poliestireno), que contiene muchos grupos funcionales por molécula y prácticamente insoluble en agua.

Hay dos tipos de cromatografía iónica, que se clasifican según el método empleado, para evitar que la alta conductividad de la fase móvil interfiera en la medida de conductividad del analito. Estos dos tipos son:

Con detector conductimétrico y supresión química: Se coloca una columna supresora del eluyente inmediatamente después de la columna analítica (de baja capacidad). Esta columna supresora es un intercambiador iónico de alta capacidad y de signo opuesto a la columna analítica, que convierte los iones del eluyente en especies moleculares

poco ionizadas y no retiene los iones del analito. La columna supresora se debe regenerar periódicamente. Veamos las reacciones entre el eluyente y el supresor:

La primera reacción de la imagen se corresponde a cuando la columna analítica es catiónica.

La segunda reacción de la imagen corresponde a cuando la columna analítica es aniónica:

Fig. 9: Reacciones en cromatografía con detector conductimétrico y supresión química.

Con detector conductimétrico y supresión electrónica: Se utilizan fases móviles de conductividad muy baja y diluida. Su conductividad se corrige de forma electrónica. Comparada con la supresión química, requiere un equipo más sencillo, pero menos sensible.

APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFÍA IÓNICA:

Como aplicaciones de la cromatografía iónica está el análisis de drogas y sus metabolitos, sueros, conservantes de alimentos, mezclas para vitaminas, azúcares, y preparaciones farmacéuticas.

CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN: También conocida como cromatografía en geles permeables o de filtración en geles. Es una técnica que se aplica particularmente a especies de alto peso molecular.

La fase estacionaria está compuesta de partículas de sílice o polímeros en forma de gel, que contienen una red de poros uniformes. La retención está basada en el tamaño de las moléculas. Si las moléculas con más grandes que los poros, no pueden penetrar en ellos (sólo pasan las partículas), y son las primeras que se eluyen. Si las moléculas son más pequeñas que los poros, penetran en ellos recorriendo caminos mucho

más largos, y serán las últimas en eluir. Si las moléculas tienen un tamaño intermedio, podrán penetrar en los poros más grandes (camino recorrido intermedio). Por tanto, el tiempo de residencia medio en los poros, depende del tamaño afectivo de las moléculas de los analitos.

La retención no se controla con la fase móvil, se controla eligiendo la fase estacionaria, cuya elección vendrá determinada por:

Si la separación se realiza en fase acuosa (filtración en gel), o en fase orgánica.

El rango de pesos moleculares (tamaños) que contienen la muestra que queremos analizar.

Cabe observar, que este tipo de separación difiere de los demás que han sido considerados, en que no implica una interacción química o física entre los analitos y la fase estacionaria. De hecho, se procura evitar este tipo de interacciones, dado que originan una mala eficacia de la columna.

APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN DE TAMAÑOS

Como aplicación referida a productos alimenticios en cromatografía por exclusión de tamaños: separación de ácidos grasos, determinación de glucosa fructosa y sacarosa en zumos enlatados.

CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN:

APLICACIONES DEL HPLC (CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTO DESEMPEÑO) EN MEDICAMENTOS Y FARMACIA

La Cromatografía Líquida de Alto Desempeño (HPLC, por sus siglas en inglés) se usa en la industria médica y farmacéutica para analizar productos y los ingredientes que se usan para hacerlos. A menudo, este análisis lo desarrolla un laboratorio de control de calidad de la empresa farmacéutica. Los químicos que contratan a estos fabricantes tienen muestras de funcionamiento de materias primas o productos terminados por medio de máquinas de HPLC y después se analizan los resultados.

Beneficios

Un beneficio para la empresa farmacéutica en el uso de la cromatografía líquida de alto desempeño es la seguridad en la calidad que brinda este análisis. Otro es que los métodos HPLC son relativamente estándar en la industria. Esto significa que las nuevas contrataciones con experiencia en el campo farmacéutico requieren de un entrenamiento mínimo antes de que comiencen a desarrollar un análisis en los laboratorios. Además, el desempeño estándar del análisis HPLC permite contratar a los fabricantes para transferir métodos en sus instalaciones de la empresa que contrata la producción.

Función

La HPLC se usa para analizar materias primas y productos terminados para asegurarse que la calidad de los niveles previamente establecidos se cumpla. La HPLC comienza en forma de una manguera de alta presión que genera y mide una tasa de flujo especializada desde la reserva que soporta al solvente. Un inyector introduce la muestra de forma continua en la fase de vapor del flujo móvil que lleva la muestra hacia la columna de la HPLC. Un detector se usa para medir las bandas separadas del compuesto conforme se eluden desde la columna HPLC. La fase móvil saca el detector y se puede recolectar o enviar para hacer pruebas.