30dansk kemi, 86, nr. 11, 2005

-10123456780

2

4

6

8

10

12

x 106

ppm

Vandprotoner

Fedtsyrer –Alifatiske protoner

-10123456780

2

4

6

8

10

12

x 106

ppm

Vandprotoner

Fedtsyrer –Alifatiske protoner

FØDEVAREANALYSE

Der er en stigende interesse hos forbrugeren og i fødevare-industrien for at sikre, at vores fødevarer er sunde, af høj kva-litet og ikke mindst sikre. Dette kræver hurtige, pålideligeanalysemetoder, gerne med mulighed for at automatisere ana-lysen direkte at- eller online. Spektroskopi er særdeles veleg-net til sådanne formål, og forskellige former for spektroskopibruges allerede i fødevareindustrien, f.eks. fluorescens, infra-rød og nærinfrarød samt lavfelts kernemagnetisk resonans (LF

NMR) spektroskopi.Hidtil har der dog ikkeværet tradition for atanvende højopløst(high resolution, HR)NMR-spektroskopi in-den for fødevare-videnskaben.

Dette på trods af enudbredt anvendelse fraopklaring af kemiskestrukturer for små mo-lekyler i opløsning,strukturopklaring afmediumstørrelse prote-iner til medicinsk an-vendelse ved magne-tisk resonans skanning(MR-scanning).

Netop det faktum, atNMR-spektroskopi erikke-destruktiv og alli-gevel giver kvantitativinformation om heleprøvens sammensæt-ning, struktur samtvandmobilitet og for-deling i endog megetkomplekse matricer,gør metoden særdelesanvendelig til kvali-tetskontrol i fødevare-industrien.

For at øge fortolk-

HR MAS NMR-spektroskopi:En hel ny verden for fødevareforskningenMulighederne er mange ved anvendelse af high resolution magic angle spinning på intaktefødevarer

Af Nanna Viereck1, Helene F. Seefeldt2, Merete H. M. Nielsen1 og Søren B. Engelsen1,1Kvalitet & Teknologi, Institut for Fødevarevidenskab, Levnedsmiddelcentret (LMC), KVL. 2Afd. Genetik og Bioteknologi, DanmarksJordbrugsforskning, Flakkebjerg

ningen og den kvantitative information i sådanne kompleksesystemer er det dog ofte nødvendigt at kombinere NMR-spek-troskopiske resultater med avancerede multivejs kemometriskemetoder. Kombinationen NMR og kemometri har et stort uud-nyttet potentiale og åbner for helt nye muligheder inden forspektroskopisk kvalitetskontrol.

NMR og HR MAS på fødevarerStrategien er derfor at studere en række udvalgte problemstil-linger inden for fødevareforskningen vha. HR NMR-spektro-skopi og samtidig udvikle dataanalyseprogrammel specifikt tilkvantitativ NMR-signalbehandling.

Hidtil har brugen af NMR-spektroskopi til kvantitative for-mål været begrænset. Størst udvikling har der været inden forden farmaceutiske forskning, hvor begrebet metabonomics blevintroduceret for få år siden [1,2].

Metabonomics dækker over »kvantitative målinger af det

Figur 1. Væske 1H NMR-spektrum af fast gul Klovborg ost, 25% fedt.

31 dansk kemi, 86, nr. 11, 2005

FØDEVAREANALYSEmultiparametriske metaboliske respons fra levende organismertil patofysiologiske stimuli eller genetisk modifikation. Respon-set studeres vha. sammenkoblingen af NMR på biologiske væ-sker og multivariat dataanalyse«. I praksis betyder dette, atNMR-spektre af f.eks. blod og urin kan anvendes til at forudsi-ge patienters diagnose på et meget tidligt stadie ud fra små va-riationer i spektrene, der kan findes med multivariat dataanaly-se.

Tilsvarende udfordringer møder vi i analyser af intakte lev-nedsmidler. Med inspiration fra metabonomics har vi derfor in-troduceret begrebet bromatonomics. Bromatonomics dækkerover »kvantitative målinger af levnedsmidlers funktionelle kva-litetsparametre, studeret vha. NMR på intakte levnedsmidlerevalueret med multivariat dataanalyse«. Der er dog stor forskelpå kropsvæsker og levnedsmidler, idet levnedsmidler ofte fin-des på fast form. Det giver problemer ved brug af NMR, der udover at give kemisk information også er mobilitetsfølsom, dvs.prøvens viskositet betyder meget for spektrenes kvalitet. Man-ge levnedsmidler er hverken helt faste stoffer eller væsker iNMR-spektroskopisk for-stand. De vil ved almindeligvæske-NMR-spektroskopigive dårligt opløste spektremed meget brede linjer (somosten i figur 1). Derimod gi-ver sådanne prøver højt op-løste NMR-spektre, når deranvendes »rotation ved denmagiske vinkel, 54.7o«, HighResolution Magic AngleSpinning (HR MAS) NMR(figur 2). Her roteres prøveni en vinkel på 54.7o til detstatiske magnetfelt. Ved den-ne teknik elimineres linjefor-bredning fra magnetisk føl-somhed (susceptibilitet) ogbidrag fra dipolære veksel-virkninger. Det skyldes, atde matematiske udtryk forkemisk skift anisotropi ogdipol-dipol-vekselvirkningerbegge indeholder et vinkel-afhængigt led (ligning 1).

3cos2θ -1 = 0 (1)

Vælges vinklen til 54.7o, er3cos2θ -1 = 0 og man opnåralene et signal ved detisotropiske kemiske skiftuden dipolær opsplitning.Roteres prøven derudover,får den hurtige bevægelseprøven til at opføre sig næ-sten som en væske, hvor dermidles over hele prøven.

Mange fødevarer indehol-der vand, og vandprotonernegiver også signaler i 1H-spektrene. I mange tilfældeer det ønskeligt at slippe afmed det kraftige signal fravand, f.eks. for at kunneidentificere andre signaler i

Figur 2. HR MAS 1H NMR-spektre af to faste gule oste, 6% og 38% fedt.

▼▼▼▼ ▼▼▼▼▼ ▼

34dansk kemi, 86, nr. 11, 2005

01234567890

1

2

3

4

5

6

7

8x 10

4

ppm

Laktose og sukrose

Pyranoseprotoner

Anomerprotoner

Vandrest

Drikkeyoghurt

Rørt yoghurt

Alifatprotoner

Aromatprotoner

01234567890

1

2

3

4

5

6

7

8x 10

4

ppm

Lactose og sucrose

Pyranoseprotoner

Anomerprotoner

Vandrest

Drikkeyoghurt

Rørt yoghurt

Alifatprotoner

Aromatprotoner

samme område i spektret. Der er udviklet forskellige teknikkertil at undertrykke signalet fra vand. I dette projekt testes enrække af teknikkerne på intakte levnedsmidler, og deres betyd-ning for kvantitativ analyse undersøges. Anvendelsen af felt-gradienter, der varierer det ydre magnetiske felts styrke, for-bedrer yderligere informationen, idet man dermed kan module-re NMR-spektre som funktion af komponenternes egendiffusi-on, også kaldet diffusionsvægtet NMR [3].

HR MAS NMR-spektroskopi har været anvendt i metaboli-ske studier af animalt og humant væv [4,5], og det er nærlig-gende at overføre eksperimenterne til plantevæv og kød, og atudnytte HR MAS NMR-teknologien under forarbejdning somf.eks. kogning, bagning og saltning. Desuden er der mange pro-blemstillinger inden for mejeriområdet, som kan undersøgesvha. HR MAS NMR-spektroskopi.

Overvejelser over spinsidebåndMulighederne er således store, når vi i princippet kan måle påalle typer fødevarer uden at skulle foretage krævende forbe-handling først. Men man er nødt til at foretage visse forholds-regler, før de endelige målinger foretages. Den spektrale breddepå NMR-spektret og spinningshastigheden eller rotations-frekvensen skal passe sammen, så spinsidebånd ikke forstyrrerbilledet af de signaler, man forventer at finde.

Spinsidebånd skyldes prøvens rotation. Sådanne signaler erplaceret på begge sider af det egentlige signal i afstande, der eret multiplum af rotationsfrekvensen (figur 3). Det betyder, at johurtigere prøven roteres, jo længere flyttes sidebåndene ud. Ikomplekse prøver som fødevarer, hvor der forventes signalerfra mange forskellige stoffer, vil spinsidebånd fra samtlige re-sonanssignaler give NMR-spektre, der synes umulige at fortol-ke. Rotationsfrekvensen skal derfor være større end eller ligmed den spektrale bredde. Dette synes jo nemt nok, hvis NMR-spektrometret teknisk kan leve op til rotationsfrekvenser påf.eks. 4000 Hz eller derover. Dog er der også prøven at tage

TetralixPostboks 323 • 2830 Virum

Tlf.: 4583 5438 • Fax: 4583 5448 • e-mail: mail@tetralix.dk

Teknisk oversættelse – kemi og kemiteknikForskrifter – Datablade – Vejledninger – Afhandlinger

Engelsk – Fransk – Italiensk – Norsk

hensyn til, idet en så kraftig rotation eller centrifugering af prø-ven givetvis påvirker matricen.

Eksemplet i figur 3 stammer fra en undersøgelse af regulerin-gen af konsistensen af ost (her mozzarella), specielt for at un-dersøge vandbindingsforholdene over tid. Mozzarellaprøvenblev udtaget som en lille kube i målene 4 • 4 • 9 mm, der blevplaceret i en 50 µl rotor. Tungt vand (D2O), der ikke giver pro-tonsignaler, og som anvendes til at låse frekvensen underNMR-målingen, blev brugt til at fylde den resterende del af ro-toren op. Der blev foretaget et HR MAS 1H NMR-forsøg, hvorrotationsfrekvensen var 5000 Hz (figur 3). Prøven blev i alt ro-teret 15 minutter. Efter en sådan måling bestod prøven af enklæbrig ostemasse med en smal indre cylinder af vand. Oste-matricen var således totalt forandret, og en daglig gentagelse afforsøget, for at undersøge om vand havde bundet sig anderle-des, var umulig på samme prøve. Det kunne heller ikke udeluk-kes, at prøven ændrede sig under målingen.

I et sådant tilfælde er det nødvendigt at overveje fordele ogulemper ved at rotere prøven så kraftigt. I stedet kan det over-vejes, om matematisk fjernelse af spinsidebåndene er en mulig-hed, idet moderne databehandlingsteknikker åbner mulighedfor det. Desuden er der udviklet forskellige NMR-teknikker tilat undertrykke spinsidebånd. Men det er en anden historie, somvi gemmer til senere!

HR MAS NMR på andre mejeriprodukterIkke kun problemstillinger i faste oste er interessante i HRMAS mejeriapplikationslyset. Også fortykkede surmælks-produkter er velegnede til HR MAS NMR-studier. I figur 4 sesvandundertrykte HR MAS 1H NMR-spektre af drikke- og rørtyoghurt stabiliseret med pektin i en sucroseblanding. Pektinbruges ofte som stabilisator i yoghurt for at undgå sedimente-ring eller valleudskillelse efter syrning. Mekanismen bag stabi-liseringen er dog ikke særlig velkarakteriseret, og HR MASNMR-spektroskopi har potentiale til at analysere yoghurt-stabiliteten.

I de viste spektre (figur 4) er der tydelige signaler for mælke-sukker (lactose) og sucrose, men derudover er der signaler forprotein og fedt i den alifatiske del af spektret samt for aromati-ske aminosyrer i den aromatiske del. Spektrene af de to typeryoghurt varierer meget lidt, men ved kemometrisk behandlingaf data fra et større prøvesæt blev der observeret NMR-signa-ler, der varierede i intensitet i forhold til pektin-/sucrosekon-

Figur 4. HR MAS 1H NMR-spektre af yoghurt stabiliseret med pektin.

FØDEVAREANALYSE

Figur 3. Effekt af MAS-rotationsfrekvensen på mozzarella – spinsidebånd.

35 dansk kemi, 86, nr. 11, 2005

012345678

x 104

ppm

Umoden Cork

Moden Cork

1101

Kulhydrat (stivelse)

Fedt og andre alifatiske protoner

012345678

x 104

ppm

Umoden Cork

Moden Cork

1101

012345678

x 104

ppm

Umoden Cork

Moden Cork

1101

012345678

x 104

ppm

Umoden Cork

Moden Cork

1101

Kulhydrat (stivelse)

Fedt og andre alifatiske protoner

centrationen samt protein-/fedtkoncentrationen. Disse små vari-ationer kunne anvendes til at opdele yoghurtprøverne i stabileog ustabile prøver, men dette kunne ikke forklare mekanismenbag stabiliseringen af yoghurt med pektin alene. For at løseproblemet var det nødvendigt at inddrage andre spektroskopi-former samt målinger af zetapotentiale [6].

Muligheder med HR MAS NMR på hele kernerEt af de vigtigste mål for dansk landbrug er at producere sundeog ernæringsrigtige afgrøder. For at kunne det er det vigtigt athave en detaljeret viden om sammensætningen og ernærings-værdien af det modne korn og karakteren af protein og stivelse.Udviklingen af enkeltkerne HR MAS NMR-spektroskopi eroplagt. Med enkeltkerne HR MAS NMR-spektroskopi er detmuligt at undersøge sammensætningen af forskellige sorter ogforskellige kernefyldningstrin uden at forstyrre det biologiskesystem nævneværdigt – dvs. systemet undersøges næsten somin vivo. I figur 5 ses vandundertrykte HR MAS NMR-spektreaf tre forskellige bygkerner. Sorten Cork er en helt almindeligbygsort, og i figuren ses to forskellige kernefyldningstrin, afhhv. en umoden grøn blød kerne og en moden, hård kerne. Detses, at mængden af stivelse aftager, mens indholdet af fedt ogandre alifater stiger under kernens modning. Det tredje spek-trum er af en moden hård høj ß-glycan mutant bygkerne kaldetlys5f [7]. Denne type kerne har en hel anden NMR-profil, hvorindholdet af protein og fedt ikke er så forskelligt fra Cork-ker-ner, mens stivelsesindholdet er meget mindre, og hvor et signalved 3.3 ppm bliver meget dominerende. Dette signal har betyd-ning for forståelsen af forskellene på de to bygsorter, f.eks. afderes indhold af ß-glycan, og er således højt prioriteret.

Når korn bliver til brødIkke kun metabolismen i afgrøderne inden høst er interessantset ud fra et fødevareindustrielt- og forbrugersynspunkt. Ogsåforarbejdningen af afgrøden til den endelige fødevare kan væregavnlig for den ernæringsmæssige værdi eller for produktetsholdbarhed. Det sidste HR MAS-eksempel er derfor fra et

Figur 5. Hel kerne HR MAS 1H NMR-spektre af forskellige bygsorter.

▼▼▼▼ ▼▼▼▼▼ ▼

FØDEVAREANALYSE

36dansk kemi, 86, nr. 11, 2005

HR MAS NMR-forsøg på rugmel under forarbejdning til rugbrød.I dej- og bageprocessen nedbrydes bl.a. fytinsyre, der binder vita-miner og mineraler komplekst. Ved en effektiv nedbrydning affytinsyren vha. enzymer frigives de bundne vitaminer og minera-ler, så de gøres tilgængelige for mennesker [8]. I figur 6 ses HRMAS NMR-spektre kørt ved samme rotationsfrekvens (5000 Hz)af rugmel, dej før og efter hævning samt af det færdige rugbrød. Ialle tilfældene er prøverne helt tørre, inden de umiddelbart før enmåling er blevet opslæmmet i tungt vand. Rugmel og dej har sam-menlignelige NMR-spektre, hvor kun enkelte signaler i kulhydrat-området adskiller sig for alvor. Derimod har det færdige rugbrøden hel anden NMR-profil, med meget forbredede signaler ikulhydratområdet. Det skyldes sandsynligvis rotationsfrekvensen,idet signalformen som nævnt ovenfor påvirkes og forbredes veden for lille spinningshastighed. Det kunne således se ud til, at enrotationshastighed på 5000 Hz er for lav til kvantitativt at sam-menligne tørrede mel-, dej- og brødprøver. Desuden kan det ikkeundgås, at prøverne opsuger det tilsatte vand under målingerne.Systemet, der undersøges, er derfor en samlet matrice, hvor vandeter fordelt i hele prøven. Et sådant dynamisk system betyder ogsånoget for kvaliteten af spektrene. Som vist er det godt at være påforkant med de mange faldgruber, der kan være i udøvelsen af HRMAS NMR-spektroskopi på komplekse fødevarer.

PerspektiverNMR er vel den mest alsidige og informationsrige analytisketeknik, og anvendelsesmulighederne inden for fødevareområdeter langt fra udforskede. Vi har her nævnt nogle få lovende ap-

FØDEVAREANALYSE

Mørkt rugbrød

Rugmel

Dej

Dej efter hævning

Figur 6. HR MAS 1H NMR på mørkt rugbrød.

37 dansk kemi, 86, nr. 11, 2005

plikationer, men potentialet i HR MAS NMR er meget større,f.eks. inden for studier af hvordan fødevarer smager og føles.Meget tyder på, at vi har flavorneuroner, der reagerer specifiktpå tekstur, og en af de store udfordringer for HR MAS NMR ilevnedsmiddelsammenhæng (bromatonomics) er derfor at klar-lægge de intermolekylære interaktioner i fødevarematricen, derf.eks. skaber mouth feel funktionalitet.

Tak til Mejeribrugets Forskningsfond, der økonomisk støtterdenne satsning, samt til Arla Foods, CP Kelco, Forskningscen-ter Flakkebjerg og Schulstad for prøverne anvendt til spektrenei de viste figurer.

E-mail-adresseNanna Viereck: nav@kvl.dk

Referencer:1. Gartland, K.P.R., Beddell, C.R., Lindon, J.C. and Nicholson, J.K. (1991)

Application of pattern-recognition methods to the analysis andclassification of toxicological data derived from proton nuclear-magnetic-resonance spectroscopy of urine. Molecular Pharmacology 39(5), 629-642.

2. Nicholson, J.K., Lindon, J.C. and Holmes, E. (1999) ‘Metabonomics’:understanding the metabolic responses of living systems topathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis ofbiological NMR data. Xenobiotica 29(11), 1181-1189.

3. Gil, A.M., Duarte, I., Cabrita, E., Goodfellow, B.J., Spraul, M. andKerssebaum, R. (2004) Exploratory applications of diffusion orderedspectroscopy to liquid foods: an aid towards spectral assignment.Analytica Chimica Acta 506, 215-223.

4. Garrod, S., Humpher, E., Connor, S.C., Connelly, J.C., Spraul, M.,Nicholson, J.K. and Holmes, E. (2001) High-resolution 1H NMR andMagic Angle Spinning NMR Spectroscopic Investigation of theBiochemical Effects of 2-bromoethanamine in Intact Renal and HepaticTissue. Magnetic Resonance in Medicine 45, 781–790.

5. Griffin, J.L., Pole, J.C.M., Nicholson, J.K. and Carmichael, P.L. (2003)Cellular environment of metabolites and a metabonomic study oftamoxifen in endometrial cells using gradient high resolution magicangle spinning 1H NMR spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta1619, 151-158.

6. Salomonsen, T. and Sejersen, M.T. (2005) Master thesis: Investigationsof the mechanisms behind stability of yoghurt with pectin. Anexplorative study with emphasis on spectroscopy.

7. Munck, L., Møller, B., Jacobsen, S. and Søndergaard, I. (2004) Nearinfrared spectra indicate specific mutant endosperm genes and reveal anew mechanism for substituting starch with (1 -> 3,1 -> 4)-beta-glucanin barley. Journal of Cereal Science 40, 213-222.

8. Reddy, N.R. (2002) Occurrence, Distribution, Content, and DietaryIntake of Phytate. In Food phytates. Eds. Reddy, N.R & Sathe, S.K.,CRC Press, Inc., Florida, USA

Biolab A/S · Sindalsvej 29 · DK-8240 RisskovTelefon 8621 2866 · Telefax 8621 2301E-mail: sales@biolab.dk

- Automatiseret Fastfaseoprensning GilsonASPEC XL, ASPEC XLi, ASPEC XL4.

- Automatisering af væskehåndtering.- HPLC, LC, SFC kromatografi.- ERWEKA Dissolution systemer.- Avancerede systemer til tabletkontrol.- Salg og kalibrering af Gilson pipetter.

Specialister i

Nyt om...

...interplanetarisk støv

Hver dag kommer der 8 ton støv til jorden fra rummet. Chri-stine Floss, der er geokemiker ved Washington University i St-Louis, har sammen med medarbejdere undersøgt sammensæt-ningen af støv fra jordens stratosfære.

Støvet indeholder carbon C. Dels 12C, og dels det tungere 13C.Floss har opdaget, at støvet i stratosfæren indeholder forholds-vis mindre af det tungere nuclid. De fandt for stratosfærestøv12C/13C = 96 og for almindeligt jordisk støv 12C/13C = 87.

Har denne opdagelse forbindelse med de organiske stoffer,der var basis for livets opståen på jorden – spørger Floss.

Bos

Carbon anomaly from deep space. Chemical & Engineering News. 1. marts2004: 27