Áhrif efnatoghemilsins plerixafor í bráða mergfrumuhvítblæði
TRANSCRIPT
Áhrif efnatoghemilsins Plerixafor í bráða
mergfrumuhvítblæði
Eykur Plerixafor stýrðan frumudauða hvítblæðisfruma?
Snædís Birna Björnsdóttir
Ritgerð til meistaragráðu
Háskóli Íslands
Læknadeild
Námsbraut í Lífeindafræði
Heilbrigðisvísindasvið
Áhrif efnatoghemilsins Plerixafor í bráða mergfrumuhvítblæði
Eykur Plerixafor stýrðan frumudauða hvítblæðisfruma?
Snædís Birna Björnsdóttir
Ritgerð til meistaragráðu í Lífeindafræði
Umsjónarkennari: Þórarinn Guðjónsson
Meistaranámsnefnd: Sigrún Edda Reykdal og Guðmundur Rúnarsson
Læknadeild
Námsbraut í Lífeindafræði
Heilbrigðisvísindasvið Háskóla Íslands
Júní 2014
The effects of the chemotaxis inhibitor Plerixafor in acute myeloid leukemia
Does Plerixafor increase programmed cell death in leukemia cells?
Snædís Birna Björnsdóttir
Thesis for the degree of Master of Science
Supervisor: Þórarinn Guðjónsson
Masters committee: Sigrún Edda Reykdal og Guðmundur Rúnarsson
Faculty of Medicine
Department of Biomedical Science
School of Health Sciences
June 2014
Ritgerð þessi er til meistaragráðu í Lífeindafræði og er óheimilt að afrita ritgerðina
á nokkurn hátt nema með leyfi rétthafa.
© Snædís Birna Björnsdóttir, 2014
Prentun: Samskipti
Reykjavík, Ísland 2014
3
Ágrip
Hvítblæði er illkynja sjúkdómur í blóðmyndandi frumum líkamans sem einkennist af offjölgun hvítra
blóðkorna í beinmerg af mismunandi þroskastigum eftir tegund hvítblæðis. Illkynja frumur hvítblæðis
eru ýmist af mergfrumu eða eitilfrumu uppruna og getur krabbameinið annað hvort verið brátt eða
langvinnt. Meðferðarúrræðum er ábótavant einkum fyrir fullorðna einstaklinga með bráða hvítblæði þar
sem aðeins 30 – 50% sjúklinga læknast.
Efnatogviðtakinn CXCR4 og bindill hans CXCL12 gegna mikilvægu hlutverki í nýmyndun og
viðhaldi blóðfruma. Við bindingu CXCR4 við CXCL12 færast óþroskaðar frumur í nærumhverfi
beinmergsins þar sem þær fá að vaxa í friði. Í sjúkdómsástandi eins og hvítblæði gefur þessi binding
illkynja frumum vernd frá frumudrepandi krabbameinslyfjum. Plerixafor er fyrsta lyfið sem hindrar
bindingu CXCL12 við CXCR4 sem samþykkt var á markaðnum. Í fyrstu var lyfið notað í meðferð gegn
HIV en í dag er lyfið aðallega notað fyrir stofnfrumusöfnun en lyfið ýtir stofnfrumum úr beinmergnum
og út í blóðrásina þar sem þeim er safnað. Nýjustu notkunarmöguleikar lyfsins eru að losa
hvítblæðisfrumur úr nærumhverfi beinmergsins út í blóðrásina þar sem krabbameinslyf ná til þeirra og
drepa.
Markmið þessarar rannsóknar var að skoða hvaða áhrif efnatoghemillinn Plerixafor hefur á
hvítblæðisfrumur með því að skoða samspil lyfsins við önnur krabbameinslyf, athuga hvort lyfið auki
stýrðan frumudauða, athuga hvort það hafi áhrif á útþroskun AML fruma og skoða áhrif þess á
frumuskrið AML fruma að CXCL12.
Í forrannsókn verkefnisins var hannað frumuræktunarmódel sem nýtist vel til lyfjanæmisprófs í
AML. Stýrður frumudauði var mældur með flúorlitunum Annexin V FITC og Propidium iodide (PI) í
frumuflæðisjá. Til að rannsaka útþroskun fruma var sett upp kólóníuræktun og auk þess sem litað var
með mótefnalitum fyrir sameindum sem einkenna þroskaðar frumur. Frumuskriðstilraun var sett upp í
hefðbundnum frumuskriðsbökkum.
Rannsóknin sýnir fram á að hægt sé að skoða áhrif mismunandi styrkleika krabbameinslyfja á
hvítblæðisfrumur sjúklinga í frumuræktunarmódeli og meta næmi illkynja fruma gegn
krabbameinslyfjum. Rannsóknin sýnir fram á tilhneigingu Plerixafor til að auka frumudauða með
þekktum krabbameinslyfjum í frumuræktunarmódelinu en áhrif Plerixafor til að auka frumudauða eru
skýr í kólóníuræktunum. Ekki er sýnt fram á að Plerixafor auki útþroskun fruma í kólóníuræktun né
með breytingum á tjáningu yfirborðssameinda. Sýnt er fram á hæfni Plerixafor til að hindra frumuskrið í
átt að CXCL12.
Niðurstöðurnar gefa því vísbendingu um frumudrepandi áhrif Plerixafor á hvítblæðisfrumur til
viðbótar við tilfærslu þeirra út í blóðrásina en rannsóknir eiga eftir að leiða í ljós hvort meðferð með
Plerixafor samhliða hefðbundinni krabbameinslyfjameðferð muni bæta meðferðarárangur í bráða
hvítblæði.
4
5
Abstract
Leukemia is a malignant disease of the hematopoietic stem cells, characterized by overgrowth of
white blood cells in the bone marrow of a different stage maturation. Malignant cells are either of
myeloid or lymphoid origin and the leukemia can be either acute or chronic. Treatment results are still
insufficient, especially for adults with acute leukemia in which only 30-50 % of patients are cured.
The chemokine receptor CXCR4 and its ligand CXCL12 play an important role in the proliferation
and maintenance of blood cells. When CXCL12 binds to CXCR4 it causes chemotaxis of immature
blood cells to the bone marrow microenvironment, where they have peace to grow. In leukemia, this
interaction causes chemotaxis of malignant cells to the bone marrow microenviroment where they are
protected from chemotherapy. Plerixafor is the first drug aproved by the Food and Drug administration,
which inhibits the binding of CXCL12 and CXCR4. At first, the drug was used in treatment of HIV, but
today the drug is mainly used for stem cell mobilization in lymphoma and myeloma as it causes the
stem cells to leave the bone marrow and go into the bloodstream where the cells are collected. The
latest ideas for the drug is to mobilize the leukemia cells from the bone marrow microenviroment into
the bloodstream where chemotherapeutic agents can reach them and induce apoptosis.
The aim of this study was to examine the effects of the chemotaxis inhibitor Plerixafor on leukemia
cells by examining the interaction of the drug with other chemotherapeutic agents, investigate if the
drug increases apoptosis, to see if it increases maturation of AML cells and see what effects it has on
chemotaxis of AML cells to CXCL12 .
In the pilot study we designed a cell culture model that is useful to test drug sensitivity and the
effects of Plerixafor on AML cells. Apoptosis was measured by Annexin V FITC and Propidium iodide
(PI) by flow cytometry. Colony forming assay was used to determine increased maturation of AML
cells and in addition maturation was examined by flow cytometry. For the chemotaxis studies we used
conventional chemotaxis wells.
The study demonstrates that it is possible to examine the effect of different concentrations of
chemotherapeutic agents in leukemia cells of patients with the cell culture model and evaluate the
sensitivity of malignant cells against chemotherapy. The study demonstrates that Plerixafor can
potentially increase cell death with known chemotherapeutic agents in the cell culture model, but the
ability of Plerixafor to induce cell death in colony forming assays was confirmed. Plerixafor did not
increase maturation of AML cells in colony forming assays nor by changes in expression of surface
molecules. The study did demonstrate the ability of Plerixafor to inhibit chemotaxis towards CXCL12.
The results of this study give an indication of incresed cell death with Plerixafor in addition to the
known effect on leukemia cell mobilization. Future studies will have to show if Plerixafor combined with
conventional chemotherapy will improve outcome in acute myelogenous leukemia.
6
7
Þakkir
Ég vil byrja á því að minnast Heklu Sigmundsdóttur sem var ein af þeim sem átti hugmyndina á bakvið
verkefnið og bauð mér að taka þátt í því sem diplómaverkefni mitt í lífeindafræði.
Leiðbeinandi minn hún Sigrún Reykdal fær mínar bestu þakkir fyrir samstarfið og alla aðstoðina. Ég
fæ henni seint þakkað fyrir að taka við stjórninni á verkefninu og framlengja verkefnið í
mastersrannsókn. Áhugi hennar, þolinmæði og drifkraftur dreif mig áfram.
Mastersnefndin mín fær einnig þakkir:
Þórarinn Guðjónsson fyrir að hafa samþykkt að vera umsjónarkennari minn með skömmum
fyrirvara, koma með nýtt sjónarhorn á verkefnið og tengja mig við rannsóknarteymið sitt í Læknagarði.
Guðmundur Rúnarsson fyrir aðstoð við öflun á sýnum og uppsetningu á niðurstöðum úr
frumuflæðisjá.
Eftirtaldir aðilar fá kærar þakkir:
Íris Pétursdóttir fyrir ómetanlega aðstoð á rannsóknarstofunni, við yfirferð á ritgerðinni, góð ráð og
vináttu.
Þórir Benediktsson og stafsmenn apóteks Landspítala fyrir að safna lyfjaafgöngum fyrir mig og
aðra aðstoð.
Sævar Ingþórsson fyrir aðstoð við uppsetningu á frumuskriðstilraunum.
Ólafur Eysteinn Sigurjónsson fær þúsund þakkir fyrir að lána mér frumuskriðsbakka (neðri og efri
brunna) sem varð til þess að ég lenti ekki í tímahraki.
Jane Liesveld og Brian H. Smith fyrir að senda mér frumulínurnur.
Helga Ögmundsdóttir fyrir að útvega mér U937 frumulínuna.
Jóhanna Eyrún Torfadóttir og Sigrún Helga Lund fyrir tölfræðiráðgjöf.
Erla Bragadóttir fyrir samveruna á rannsóknarstofunni.
Unnusta mínum, Heiðari Hrafni Halldórssyni og fjölskyldu minni er ég þakklát fyrir að vera alltaf til
staðar fyrir mig, hvetja mig áfram og hafa endalausa trú á mér.
Verkefnið var unnið á rannsóknarkjarna í blóðmeinafræði á Landspítalanum við Hringbraut.
Styrkur fékkst frá Vísindasjóði Landspítala fyrir vinnslu þessa verkefnis 2014.
8
Efnisyfirlit
Ágrip ......................................................................................................................................................... 3
Abstract..................................................................................................................................................... 5
Þakkir ........................................................................................................................................................ 7
Efnisyfirlit .................................................................................................................................................. 8
Myndaskrá ..............................................................................................................................................10
Töfluskrá .................................................................................................................................................10
Listi yfir skammstafanir ...........................................................................................................................11
1 Inngangur........................................................................................................................................13
1.1 Hvítblæði ................................................................................................................................ 13
1.1.1 Bráða hvítblæði.......................................................................................................... 13
1.1.1.1 Bráða mergfrumuhvítblæði (AML) ............................................................................. 14
1.1.1.2 Bráða eitilfrumuhvítblæði (ALL) ................................................................................. 17
1.1.2 Faraldsfræði hvítblæðis á Íslandi............................................................................... 17
1.2 Efnatogviðtakinn CXCR4 ....................................................................................................... 18
1.3 Plerixafor ................................................................................................................................ 21
1.4 Krabbameinslyf ...................................................................................................................... 22
1.4.1 Cytarabine ................................................................................................................. 22
1.4.2 Idarubicin ................................................................................................................... 22
1.4.3 Fludarabine ................................................................................................................ 23
1.4.4 Azacytidine ................................................................................................................ 23
1.5 Inngangur að aðferðarfræði ................................................................................................... 23
1.5.1 Frumuflæðisjá ............................................................................................................ 23
1.5.1.1 Undirbúningur sýna ................................................................................................... 24
1.5.1.2 Mæling sýna .............................................................................................................. 24
1.5.2 Frumuskrið ................................................................................................................. 26
1.5.3 Kólóníuræktun ........................................................................................................... 26
1.5.4 Frumulínur ................................................................................................................. 27
2 Markmið ..........................................................................................................................................28
3 Efni og aðferðir ...............................................................................................................................29
3.1 Þýði rannsóknarinnar ............................................................................................................. 29
3.2 Einangrun hvítblæðisfruma .................................................................................................... 29
3.3 Frumuræktun ......................................................................................................................... 30
3.4 Frysting fruma ........................................................................................................................ 30
9
3.5 Þynning lyfja .......................................................................................................................... 31
3.6 Mótefnalitun og mæling í frumuflæðisjá ................................................................................ 31
3.7 Mæling á stýrðum frumudauða .............................................................................................. 33
3.8 Frumuskrið ............................................................................................................................. 34
3.9 Kólóníuræktanir ..................................................................................................................... 34
3.10 Leyfi ....................................................................................................................................... 35
3.11 Úrvinnsla gagna ..................................................................................................................... 35
4 Niðurstöður .....................................................................................................................................36
4.1 Lyfjanæmispróf ...................................................................................................................... 36
4.2 Áhrif Plerixafor á lifun og stýrðan frumudauða ...................................................................... 38
4.3 Áhrif Plerixafor á frumuskrið AML fruma í átt að CXCL12 ..................................................... 45
4.4 Niðurstöður kólóníuræktunar ................................................................................................. 47
4.5 Tjáning AML fruma ................................................................................................................ 48
5 Umræða ..........................................................................................................................................49
5.1 Lyfjanæmispróf ...................................................................................................................... 49
5.2 Áhrif Plerixafor á lifun og stýrðan frumudauða hvítblæðisfruma ........................................... 50
5.3 Áhrif Plerixfor á útþroskun hvítblæðisfruma .......................................................................... 52
5.4 Áhrif Plerixafor á frumuskrið hvítblæðisfruma ....................................................................... 53
6 Ályktanir ..........................................................................................................................................54
Heimildaskrá ...........................................................................................................................................55
Viðauki 1 .................................................................................................................................................60
Fylgiskjöl .................................................................................................................................................63
10
Myndaskrá
Mynd 1 Samspil CXCR4 og CXCL12 við beinmerginn. ................................................................... 19
Mynd 2 Dreifing leysigeisla til forward og side scatter eftir eiginleikum frumunnar. ......................... 24
Mynd 3 Uppsetning mælieiningar í FACSCalibur............................................................................. 25
Mynd 4 Frumuskrið. .......................................................................................................................... 26
Mynd 5 Hvít- og rauðkornakólóníur. ................................................................................................. 26
Mynd 6 Blóð/beinmergur spunnin niður með Ficoll. ......................................................................... 30
Mynd 7 Túlkun niðurstaðna á mælingum á yfirborðstjáningu fruma. ............................................... 32
Mynd 8 Túlkun niðurstaðna úr mælingum á stýrðum frumudauða. .................................................. 33
Mynd 9 Uppsetning frumuskriðsbrunna. .......................................................................................... 34
Mynd 10 Lyfjanæmispróf á Cytarabine. ........................................................................................... 36
Mynd 11 Lyfjanæmispróf á Idarubicin. ............................................................................................. 37
Mynd 12 Lyfjanæmispróf á Fludarabine. .......................................................................................... 37
Mynd 13 Lyfjanæmispróf á Azacytidine. .......................................................................................... 38
Mynd 14 Mat á lifun og stýrðum frumudauða AML fruma. ............................................................... 39
Mynd 15 Samanburður á lifun fruma eftir 72 klukkustunda ræktun. ................................................ 41
Mynd 16 Samanburður á stýrðum frumudauða eftir 72 klukkustunda ræktun. ................................ 41
Mynd 17 Dauðar frumur eftir 72 klukkustunda ræktun. .................................................................... 42
Mynd 18 Lifandi frumur eftir 1 viku í ræktun. .................................................................................... 43
Mynd 19 Stýrður frumudauði eftir 1 viku í ræktun. ........................................................................... 44
Mynd 20 Dauðar frumur eftir 1 viku í ræktun. ................................................................................... 44
Mynd 21 Frumuskrið sjúklings 6. ...................................................................................................... 46
Töfluskrá
Tafla 1 Þátttakendur rannsóknarinnar. ............................................................................................. 29
Tafla 2 Flúormerkt einstofna mótefni gegn yfirborðssameindum einkjarna fruma. .......................... 32
Tafla 3 Marktækni milli ræktunnar án lyfja og ræktunnar með lyfjum eftir 72 klst. ........................... 40
Tafla 4 Marktækni milli lyfja með og án Plerixafor. ........................................................................... 42
Tafla 5 Plerixafor hindrar frumuskrið í átt að CXCL12. .................................................................... 45
Tafla 6 Marktækni frumuskriðsprófs. ................................................................................................ 46
Tafla 7 Kólóníuræktun. ..................................................................................................................... 47
Tafla 8 Kólóníuræktun frumulínunnar KG-1a. .................................................................................. 47
Tafla 9 Tjáning á yfirborðssameindum AML fruma við mismunandi ræktunaraðstæður. ................ 48
11
Listi yfir skammstafanir
ALL Acute lymphoblastic leukemia
AML Acute myeloid leukemia
APC Allophycocyanin
BFU-E Burst-forming unit - Erythroid
CD Cluster of differentiation
CFU Colony-forming unit
CFU-E Colony-forming unit - Erythroid
CFU-GEMM Colony-forming unit - Granulocyte, erythrocyte, macrophage, megakaryocyte
CFU-GM Colony-forming unit - Granulocyte/Macrophage
CLL Chronic lymphocytic leukemia
CML Chronic myeloid leukemia
CXCL12 Chemokine (C-X-C motif) ligand 12
CXCR4 Chemokine (C-X-C motif) receptor 4
DPBS Dulbecco‘s Phosphate Buffered Saline
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid
EPO Erythropoietin
FAB French-American-British
FBS Fetal bovine serum
FDA Food and Drug Administration
FISH Fluorescent in situ hybridization
FITC Fluorescein isothiocyanate
FSC Forward scattered
G-CSF Granulocyte colony stimulating factor
GM-CSF Granulocyte-macrophage colony stimulating factor
GPCR G-protein-coupled cell surface receptors
HIV Human immunodeficiency virus
HLDA9 The 9th International Conference on Human Leukocyte Differentiation Antigens
HTLV-1 Human T-lymphotropic virus type 1
IMDM Iscove's Modified Dulbecco's Medium
PCR Polymerase chain reaction
PE Phycoerythrin
PerCP Peridinin-chlorophyll-protein
PVSG Polycythemia Vera Study Group
12
RPMI Roswell Park Memorial Institute
SDF-1 Stromal-derived-factor-1
SSC Side scattered
TdT Terminal deoxynucleotidyl transferase
WHO World Health Organization
13
1 Inngangur
1.1 Hvítblæði
Hvítblæði er illkynja sjúkdómur í blóðmyndandi frumum líkamans sem einkennist af offjölgun hvítra
blóðkorna í beinmerg af mismunandi þroskastigi eftir tegund hvítblæðis. Þessar illkynja frumur geta
fundist í blóði sjúklinga og einnig safnast fyrir í milta, lifur og eitlum (Harmening, 2009).
Hvítblæði er skilgreint út frá frumutegundum í tvo meginflokka, það er mergfrumuhvítblæði og
eitilfrumuhvítblæði. Báðum flokkunum er skipt niður í bráða eða langvinnt hvítblæði út frá þroskastigi
frumanna og þannig er um að ræða fjóra aðalflokka hvítblæðis: bráða mergfrumuhvítblæði (acute
myelogenous leukemia, AML), langvinnt mergfrumuhvítblæði (chronic myelogenous leukemia, CML),
bráða eitilfrumuhvítblæði (acute lymphoblastic leukemia, ALL) og langvinnt eitilfrumuhvítblæði (chronic
lymphocytic leukemia, CLL) (Harmening, 2009).
1.1.1 Bráða hvítblæði
Bráða hvítblæði einkennist af óþroskuðum hvítblæðisfrumum sem eru oft kallaðir blastar.
Sjúkdómsmyndunin er bráð og ef sjúkdómurinn er látinn óáreittur getur hann dregið sjúkling til dauða
innan sex mánaða. Beinmergsbilun er mun algengari í byrjun bráða hvítblæðis heldur en í langvinnu
hvítblæði og veldur oft blóðleysi og fækkun á blóðflögum. Magn hvítra blóðkorna í blóði í bráða
hvítblæði getur verið mismunandi, gildin geta verið hækkuð, eðlileg eða jafnvel lækkuð. Sé um
hækkun að ræða fylgir því oftast aukning á blöstum í blóði. Algengustu einkenni bráða hvítblæðis eru
afleiðingar beinmergsbilunar en þau eru þróttleysi, afbrigðilegar blæðingar, hiti og sýkingar.
Rannsóknir á blóðhag og blóðstroki geta gefið mikilvægar vísbendingar um bráða hvítblæði en
beinmergssýni eru tekin til frekari rannsókna (Harmening, 2009).
Alþjóðaheilbrigðismálastofnunin (WHO) ásamt fjölda sérfræðinga hóf vinnu við nýja flokkun
blóðsjúkdóma árið 1995 (Harris o.fl., 1999). Þessi flokkun er endurskoðuð reglulega þar sem öflug
rannsóknarvinna leiðir sífellt eitthvað nytsamlegt í ljós varðandi greiningu og meðferð sjúklinga. Í dag
er stuðst við fjórðu útgáfu sem var gefin út árið 2008. WHO flokkunin byggir á útliti fruma,
frumulíffræði, ónæmisfræðilegum eiginleikum, erfðum og klínískum einkennum (Vardiman o.fl., 2009).
Flokkun WHO leggur meiri áherslu á erfðabreytileika en fyrri flokkanir höfðu gert. Við greiningu
erfðagalla eru notaðar ýmsar sameindaerfðafræðilegar rannsóknir eins og staðbundin þáttapörun með
flúorskimun (fluorescent in situ hybridization, FISH) og kjarnsýrumögnun (polymerase chain reaction,
PCR). Samkvæmt skilgreiningu WHO er miðað við að blastar í beinmerg séu ≥ 20% af mergfrumum
en í French-American-British (FAB) flokkunarkerfinu, sem er eldra blóðsjúkdómaflokkunarkerfi, er
miðað við 30% (Vardiman o.fl., 2002). Þegar greining á bráða hvítblæði er staðfest þarf að greina
frumugerð blastanna til að flokka hvítblæðið sem AML eða ALL. Blóð og beinmergssýni er skoðað í
smásjá og er reynt að greina á milli AML eða ALL blasta en til að staðfesta greininguna eru gerðar
vefjalitanir auk þess að lita frumurnar með sértækum mótefnalitum og mæla í frumuflæðisjá (Sachdeva
o.fl., 2006).
Meðferð gegn bráða hvítblæði er flókin og erfið krabbameinslyfjameðferð. Meðferðin miðar að því
að uppræta hvítblæðisfrumurnar, koma aftur af stað eðlilegri blóðmyndun og koma í veg fyrir
14
endurkomu sjúkdóms. Meðferðin skiptist í þrjú stig sem eru innleiðslumeðferð (induction),
framhaldsmeðferð (consolidation) og viðhaldsmeðferð (Kolitz, 2006). Innleiðslumeðferðin er margþætt
fjöllyfjameðferð og markmiðið er að ná fram fullkomnu sjúkdómshléi, uppræta hvítblæðisfrumurnar í
mergnum en hversu vel það gengur gefur góða vísbendingu um lækningu á sjúkdómnum.
Innleiðslumeðferðin er mjög erfið og tekur um einn mánuð (Nagayama o.fl., 2006). Ef sjúklingurinn
kemst í sjúkdómshlé tekur við framhaldsmeðferð en hún fer eftir því hvaða tegund hvítblæðis er um að
ræða og á þessi meðferð að fjarlægja þær krabbameinsfrumur sem eftir eru í líkamanum. Tímalengd
meðferðar fer einkum eftir því hvort um er að ræða mergfrumu- eða eitilfrumuhvítblæði.
Viðhaldsmeðferð er fyrst og fremst beitt í bráða eitilfrumuhvítblæði og tekur hún allt að tvö ár (Ribera
o.fl., 2007).
Meðferð hvítblæðis hefur farið mikið fram síðustu 20 ár en enn er skortur á góðum
meðferðarúrræðum. Einungis um 1/3 fullorðinna læknast en horfur eru betri hjá börnum og ungu fólki
með bráða eitilfrumuhvítblæði þar sem allt að 80% geta læknast með háskammta lyfjameðferðum
(Zhu o.fl., 2010).
1.1.1.1 Bráða mergfrumuhvítblæði (AML)
Bráða mergfrumuhvítblæði er misleitur sjúkdómur sem sameinar hóp illkynja sjúkdóma sem
einkennast af aukningu á einstofna blóðmyndandi forverafrumum af mergfrumu- og/eða mónócýta
(einkirninga) uppruna sem eru fastar á ákveðnu þroskastigi (Ortolani, 2011). AML blastar eru stórir
eða um 15-20 μm í þvermál með hóflegu umfrymi sem er oft kornótt. Litningarnir í kjarnanum láta
ásjón hans vera fínkornótta og stundum sjást fleiri en eitt kjarnakorn (Harmening, 2009). Það sem
einkennir AML blasta eru Auer stafir, en þeir eru til staðar í umfryminu í 60-70% tilfella, og
myeloperoxidase (MPO) sem er ensím sem finnst m.a. í leysikornum í granúlum granúlócýta
(Hasserjian, 2013).
Greining á AML krefst nákvæmrar talningar á blöstum en telja þarf 500 frumur úr beinmergssýni (í
sumum tilfellum er þó sjúkdómsmyndin augljós t.d. þegar blastar eru um 90% allra fruma) og að
minnsta kosti 200 hvít blóðkorn úr blóðsýni til að fá rétt hlutfall blasta en flokkun WHO miðar að því að
þeir séu a.m.k. 20%. Gullstaðallinn við þessa talningu er að telja frumur úr beinmergssogi sem hefur
verið strokið á gler. Hægt er að fara aðrar leiðir eins og að telja frumurnar úr beinmergsvefjasýni eða
meta prósentu blasta úr frumuflæðisgreiningu (Hasserjian, 2013). Til að greina ónæmisfræðilega
svipgerð AML fruma er litað með flúormerktum mótefnum og greint í frumuflæðisjá (Dohner o.fl., 2010)
en nánar er fjallað um mælingar með frumuflæðisjá í kafla 1.5.1.
Búið er að finna fjölda stökkbreytinga og frávik í erfðaefni AML sjúklinga sem veldur fjölgun
einstofna fruma. Einnig eru gallar í frumuhring AML fruma á borð við ferli sem nema DNA skemmdir og
gera við þær. Þetta veldur því að frumur með skemmt DNA halda áfram að skipta sér (Schnerch o.fl.,
2012). Dæmi um algenga stökkbreytingu í AML er stökkbreyting á FMS-like tyrosine kinase 3 (Flt3)
viðtakanum en hún finnst í um 20 - 25% sjúklinga (Kuchenbauer o.fl., 2005). Flt3 stökkbreytingin
veldur því að viðtakinn virkjast án utanaðkomandi áreitis og virkjast þá innanfrumuferlar á borð við
AKT ferlið (nánar í kafla 1.2) og MAP kínasa ferlið, sem veldur aukinni tjáningu á æxlishvetjandi
þáttum á borð við umritunarþáttinn c-Myc og frumur fara því of snemma í S-fasa (Schnerch o.fl.,
2012). Sýnt hefur verið fram á verri horfur sjúklinga sem eru með Flt3 stökkbreytinguna en hægt er að
15
lita fyrir stökkbreytingunni með flúormerktu mótefni gegn CD135. Verri batahorfur fylgja yfirtjáningu á
CD135 sameindinni (Mehta o.fl., 2012).
Samkvæmt Krabbameinsfélagi Bandaríkjanna (American cancer society) er bráða
mergfrumuhvítblæði (AML) algengast í fullorðnum eintaklingum og er óalgengt að sjúkdómurinn
greinist í fólki undir fertugu. Meðalaldur AML sjúklinga er 67 ár og virðist vera aðeins algengara hjá
körlum heldur en konum. Áhætta karla að fá sjúkdóminn er 1:232 en hjá konum er áhættan 1:278
(American cancer society, 2013b).
FAB flokkunin skiptir AML í eftirfarandi hópa:
M0 einkennist af mjög frumstæðum blöstum en þessi flokkur samsvarar 5% allra tilfella af AML
M1 þar sem hlutfall blasta er meira en 90% af myeloid frumum. Er til staðar í 15% tilfella
M2 blastar færri en 90% myeloid fruma og fleiri en 10% þroskaðri forstig, er til staðar í 25%
tilfella sem gerir þetta algengasta undirflokkinn
M3 samanstendur af aukningu á promyelocytum. Þessi flokkur á sér undirflokkinn M3m sem
samanstendur af promyelocytum með microgranúlum. Samtals er þessi flokkur 10% tilfella
af AML
M4 er myelomonocytic leukemia og inniheldur undirflokkinn M4Eo sem einkennist af myelo- og
monoblöstum með beinmergs eosinophiliu. Þessi flokkur er um 20% tilfella
M5 einkennist af monoblöstum, þessi flokkur á við í 10% tilfella
M6 einkennist af forstigum rauðra blóðkorna og mergmisþroskun, á við í um 5% tilfella
M7 einkennist af megakaryoblöstum og mergfibrosu en þessi flokkur á við í 5% tilfella (Harmening, 2009).
Erfitt er að spá fyrir um líffræðilega hegðun AML einungis með flokkun eftir gerð frumanna en þar
kemur flokkunarkerfi WHO vel að notum. WHO flokkunarkerfið byggir á sameindafræðilegum og
erfðafræðilegum eiginleikum krabbameinsfrumanna en FAB flokkunin fær þó að halda í flokknum
óskilgreint AML. WHO flokkunarkerfið samanstendur af eftirfarandi flokkum:
1. AML með endurteknum óeðlilegum litningabreytingum
2. AML með mergmisþroska tengdum breytingum
3. AML með mergmisþroskun tengt undanfarandi meðferð
4. AML ekki flokkað annars staðar
5. AML sarkmein (myeloid sarcoma)
6. AML af völdum Downs heilkennis
7. AML af plasmafrumu / angafrumu uppruna (Blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm)
8. AML af óþekktum uppruna (Vardiman o.fl., 2009)
16
Það eru margir þættir sem taka þarf tillit til varðandi batahorfur sjúklinga t.d. undirflokkur AML,
erfða- og frumufræðilegir þættir og hækkandi aldur er einn af óhagstæðustu forspársþáttunum. Aðrir
þættir sem hafa áhrif á batahorfur eru há gildi hvítra blóðkorna í blóði, saga um fyrri mergmisþroskun
og fyrri krabbameinsmeðferðir. Litningabreytingar (karyotype) hvítblæðisfruma er einn af mikilvægustu
forspársþáttum varðandi svörun við innleiðslumeðferð og lifun. Dæmi um þetta eru flóknar
litningabreytngar sem finnast hjá 10 – 12% sjúklinga og hafa verið tengdar lélegri svörun við meðferð.
Ungt fólk er oft flokkað í þrjá áhættuhópa út frá litningabreytingum sem nefnast hagstæður (good risk),
millistig (intermediate) og óhagstæður (poor risk). Eldri sjúklingar falla ekki eins vel innan þessarar
flokkunar, eldri sjúklingar geta flokkast með hagstæða svipgerð en aldurinn hefur það mikil áhrif að
þeir hafa samt sem áður slæmar batahorfur (Dohner o.fl., 2010).
1.1.1.1.1 Meðferð og eftirfylgni AML sjúklinga
Meðferð gegn AML er sífellt meira miðuð við svipgerð sjúkdóms hjá hverjum sjúklingi fyrir sig og styður
það mikilvægi WHO flokkunarinnar með tilliti til sameinda- og erfðafræðilegra eiginleika (Hasserjian,
2013).
Stöðluð innleiðslumeðferð fyrir sjúklinga á aldrinum 18 til 60 ára er þrír dagar af anthracycline
lyfjum á borð við Idarubicin eða Daunorubicin og fimm dagar af háskammta Cytarabine meðferð. Með
þessari stöðluðu aðferð komast 60 – 80% yngri sjúklinga í fullkomið sjúkdómshlé og er enginn önnur
gerð meðferðar sem gefur betri niðurstöður. Reynt hefur verið að auka svörun sjúklinga með því að
nota fleiri frumudrepandi lyf, t.d. Fludarabine en það hefur ekki gefið betri niðurstöður (Dohner o.fl.,
2010).
Sjúklingar eldri en 60 ára eru líklegri til að vera ónæmir fyrir lyfjameðferð og þeir deyja frekar vegna
meðferðar en yngri sjúklingar. Þrátt fyrir það er stöðluð innleiðslumeðferð þeirra svipuð og hjá yngri
sjúklingum, þriggja daga anthracycline lyfjameðferð og fimm daga Cytarabine meðferð, en í sumum
tilfellum er lægri skammtastærð notuð en það er einstaklingsbundið. Með þessari meðferð fara 50%
sjúklinga í sjúkdómshlé en 15% sjúklinga deyja af völdum meðferðarinnar. Ekki eru allir eldri sjúklingar
sem geta farið í þessa háskammta innleiðslumeðferð og minnkar það batahorfur enn meira. Að
meðaltali komast færri en 30% eldri sjúklinga í fullkomið sjúkdómshlé en færri en 5% læknast alveg
(Dohner o.fl., 2010).
Framhaldsmeðferð er mjög einstaklingsbundin og miðast mikið við svipgerð illkynja fruma og
tegundir stökkbreytinga sem sjúklingar bera. Hjá yngri sjúklingahópnum er oftast notast við
háskammta lyfjameðferð og í sumum tilfellum fara sjúklingar í beinmergsskipti að henni lokinni.
Sjúklingar eldri en 65 ára fara hins vegar yfirleitt ekki í mergskipti (Dohner o.fl., 2010).
Rannsóknum sem ætlað er að stuðla að betri horfum AML sjúklinga í dag beinast mikið að
sameindafræðilegum þáttum. Þar má helst nefna hemla sem hindra virkni viðtaka á yfirborði AML
fruma en þetta er t.d. Gemtuzumab ozogamicin sem bindst CD33 viðtakanum en við það eykst stýrður
frumudauði, ýmsir Flt3 hemlar sem auka svörun AML fruma við lyfjameðferð (Dohner o.fl., 2010) og
Plerixafor sem hindrar bindingu viðtakans CXCR4 sem er til rannsóknar í þessu verkefni.
Vaxtarþættirnir, Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) og Granulocyte
colony-stimulating factor (G-CSF), hafa mikið verið rannsakaðir og sýnt hefur verið fram á að þeir auki
17
frumudrepandi áhrif lyfjameðferða (Estey, 2001). Sýnt hefur verið fram á að með því að gefa
sjúklingum G-CSF á undan lyfjameðferð aukist lifun þeirra sem læknast af sjúkdómnum og heildarlifun
sjúklinga sem flokkast í millistigs áhættuhópinn eykst einnig (Lowenberg o.fl., 2003). Einnig hefur verið
sýnt fram á að með því að gefa sjúklingum GM-CSF á undan lyfjameðferð aukist líkur á sjúkdómshléi
og lifun án endurkomu sjúkdóms (Thomas o.fl., 2007). Rannsóknir á því að gefa vaxtarþætti fyrir
lyfjameðferð eru enn á rannsóknarstigi og er ekki komið inn í hefðbundna meðferð (Dohner o.fl.,
2010). Einnig hefur verið sýnt fram á að gjöf á G-CSF minnkar tjáningu á CXCR4 á mergfrumum og
getur þannig stuðlað að tilfærslu þeirra úr mergnum og út í blóðrásina (H. K. Kim o.fl., 2006).
Ákveðnar reglur gilda um eftirfylgni sjúklinga og mælingar á áhrifum meðferða. Mat á svörun
sjúklinga við lyfjameðferð er gerð á tímabilinu 21 – 28 dögum eftir að meðferð hófst. Við eftirfylgni
sjúklinga er fylgst með blóðhag á eins til þriggja mánaða fresti fyrstu tvö árin en síðan á þriggja til sex
mánaða fresti í allt að fimm ár frá meðferð (Dohner o.fl., 2010).
1.1.1.2 Bráða eitilfrumuhvítblæði (ALL)
Bráða eitilfrumuhvítblæði (ALL) er algengara í börnum en fullorðnum og er áhættan á ALL mest hjá
börnum undir fimm ára aldri. Áhættan minnkar svo eftir 5 ára aldur en eftir fimmtugt fer áhættan
hækkandi og er 1/3 ALL sjúklinga fullorðnir einstaklingar. Áhættan á því að heilbrigður einstaklingur fái
ALL er 1:800 og er áhættan heldur meiri hjá körlum en konum, eins er áhættan meiri hjá hvítum
kynstofni en hjá svörtum. Lífslíkur barna með ALL eru mun betri en hjá fullorðnum en ástæðan fyrir því
er meðal annars að börn þola betur líkamlega erfiðar meðferðir (American cancer society, 2013a).
Munurinn felst einnig í ólíkri frumuerfðafræði og svipgerð blastanna. Frumugerðin L1 er algengust í
börnum en L2 frumugerðin er algengust í fullorðnum auk þess að Philadelphiulitningurinn er algengari
hjá fullorðnum með B frumu ALL en honum fylgja slæmar batahorfur (Morton o.fl., 2007).
Meðferð barna með ALL er ein árangursmesta krabbameinsmeðferð sem völ er á en 80 - 90%
sjúklinga læknast en einungis 30 - 40% fullorðinna ALL sjúklinga eru á lífi fimm árum eftir greiningu
(Toft o.fl., 2013).
1.1.2 Faraldsfræði hvítblæðis á Íslandi
Á Íslandi greinast um 1400 manns með krabbamein á ári hverju en það er fjórföld aukning frá því að
skráning hófst árið 1956. Ástæða þess er fjölgun Íslendinga og þá sérstaklega eldri aldurshópa en
einnig er aukin áhætta með breyttum lífstíl. Samkvæmt tölum frá Krabbameinsskrá voru að meðaltali
sjö karlar og fimm konur sem greindust með bráða hvítblæði á ári á árunum 2006 til 2010. Þetta
samsvarar 1% af öllum krabbameinum sem greindust á þessu tímabili og var meðalaldur við greiningu
49 ára hjá konum en 48 ára hjá körlum. Langvinnt hvítblæði greindist að meðaltali hjá 11 körlum og 5
konum á árunum 2006 til 2010. Meðalaldur karla við greiningu var 64 ár og hjá konum 69 ár.
Langvinnt hvítblæði samsvarar 1,5% af öllum krabbameinum sem greindust á þessu tímabili hjá
körlum en u.þ.b. 1% krabbameina hjá konum. Nýgengi bráða hvítblæðis á þessu tímabili var hjá
körlum 4,2 af 100.000 og hjá konum 3,1 af 100.000. Nýgengi langvinns hvítblæðis á sama árabili var
hjá körlum 4,9 af 100.000 en hjá konum 1,9 af 100.000 (Jónasson o.fl., 2012).
18
1.2 Efnatogviðtakinn CXCR4
Þekktir eru 50 efnatogar og 20 efnatogviðtakar í manninum. Efnatogum og viðtökum þeirra er skipt
upp í fjóra flokka CXC, CC, C og CX3C eftir því hvernig amínósýran cysteine raðast í bindlinum en C
stendur fyrir cysteine og X/X3 stendur fyrir eina eða þrjár amínósýrur sem eru ekki cysteine. Til að
aðgreina þessa flokkun nánar bætist við L í endann (CXCL) ef um er að ræða bindil og R (CXCR) ef
um er að ræða viðtaka. Aftast kemur tölustafur sem er einkennandi fyrir hvern viðtaka eða bindil
(CXCL12 eða CXCR4) (Allen o.fl., 2007). Efnatogviðtaki 4 (CXCR4) er G prótein paraður viðtaki sem
spannar frumuhimnuna sjö sinnum. CXCR4 gengur undir ýmsum nöfnum til dæmis Fusin og ber
Cluster of differentiation (CD) númerið 184. CXCR4 þekkir og virkjast af efnatogbindli 12 (CXCL12)
sem er einnig þekktur undir nafninu stromal-derived-factor-1 (SDF-1). CXCL12 er 8kDa peptíð sem
seytt er af uppistöðuvef beinmergs, þegar CXCL12 bindst viðtaka sínum stuðlar það að frumuskriði til
marklíffæris sem er yfirleitt beinmergurinn (Debnath o.fl., 2013).
Þegar CXCR4 og CXCL12 tengjast virkjast ýmis innanfrumuferli. Þar á meðal eru lifunarferlar eins
og MAP kínasa ferlið (nánar í kafla 1.1.1.1) og AKT ferlið. AKT ferlið spilar lykilhlutverk í lifun, með því
að hindra stýrðan frumudauða, og fjölgun illkynja fruma. Sýnt hefur verið fram á að CXCL12 hindri
virkni BAD sem er frumudauðaprótein og að tjáning á genum sem tengjast lifun fruma eykst í návist
CXCL12 (Teicher o.fl., 2010).
Þegar CXCL12 var fyrst lýst var hann tengdur við vöxt og þroska forvera B fruma (Nagasawa o.fl.,
1994) en CXCL12 er líka mikilvægur fyrir þroskaðar B frumur, sem nefnast plasmafrumur, en þær tjá
CXCR4 sem dregur þær í beinmerginn og heldur þeim þar, þar sem þær starfa. Aðrar plasmafrumur
starfa í eitlum og þar sem bólga er til staðar (Tokoyoda o.fl., 2004). Fljótlega eftir uppgötvun CXCL12
var hann tengdur við efnatog eitilfruma og mónócýta (Bleul o.fl., 1996).
Genið fyrir efnatogviðtakann CXCR4 er staðsett á litningi 2 og er 3389 basapör að lengd og genið
fyrir efnatogbindilinn CXCL12 er staðsett á litningi 10 og er 8036 basapör að lengd. Rannsóknir hafa
sýnt að með því að eyða þessum genum í músum myndast banvæn svipgerð sem einkennist af galla í
þroskun B fruma og mergfruma auk óeðlilegrar þroskunar á taugum, hjarta- og æðakerfi sem staðfestir
hversu mikilvægt samspil CXCR4 og CXCL12 er fyrir þroska ýmissa vefja (J. A. Burger o.fl., 2006).
CXCR4 var fyrst uppgötvaður sem hjálparviðtaki þegar alnæmisveiran (HIV) innlimast í eitilfrumur. Í
einföldu máli þá innlimast HIV veiran í eitilfrumur með því að tengjast yfirborðsviðtakanum CD4 og
hjálparviðtökunum CXCR4 eða CCR5 sem eitilfrumur tjá. Við þessa tengingu fara ýmis ferli af stað
sem endar með sýrustigsháðum samruna veirunnar við frumuhimnuna. Sýnt hefur verið fram á að hjá
sjúklingum smituðum af HIV og tjá CXCR4 verður mikil fækkun á T frumum sem tjá CD4 og
sjúkdómsmyndun er hraðari (Debnath o.fl., 2013).
CXCR4 er tjáður meðal annars af eitilfrumum í blóðrásinni, óþroskuðum T frumum, mónócýtum, B
frumu forverum, plasmafrumum, CD34 jákvæðum forverafrumum í beinmerg fullorðinna, sléttum
vöðvafrumum í æðaveggjum, taugum og þekjufrumum í sjónu litarefni, þörmum og lungnablöðrum
(Balkwill, 2004). Binding CXCR4 við CXCL12 tengist mörgum ferlum í líkamanum, meðal annars er
bindingin stærsti þátturinn í ratvísi blóðmyndandi stofnfruma við beinmerginn (Peled o.fl., 1999) og
tekur þátt í frumufjölgun, lifun og varðveislu frumstæðra blóðmyndandi stofnfruma (CD34 jákvæðar) í
beinmergnum (Balkwill, 2004).
19
Árið 1998 var í fyrsta skipti sýnt var fram á að CXCR4
hefði hlutverk í hvítblæði. Sýnt var fram á að illkynja blastar
sem tjá CD34, tjáðu einnig CXCR4 og að jákvæð fylgni
væri á milli flutninga fruma af völdum CXCL12 og þéttleika
CXCR4 á yfirborði þeirra (Mohle o.fl., 1998). Eins og fram
kom í kafla 1.1.1.1 er algengt að AML sjúklingar nái ekki
löngum sjúkdómshléum og fái bakslag (relapse) sem
orsakast yfirleitt af því að illkynja frumur eru ekki að fullu
upprættar í lyfjameðferð og kallast það minimal residual
disease (MRD). Sýnt hefur verið fram á að very late
antigen (VLA)-4 spili lykilhlutverk í að draga illkynja
hvítblæðisfrumur að uppistöðufrumum (stromal cells)
beinmergsins og að CXCR4 og VLA-4 boð stuðla saman
að öflugara skriði AML fruma undir uppistöðufrumurnar þar
sem þær eru varðar frá frumudauða af völdum
krabbameinslyfja (J. A. Burger o.fl., 2006). Einnig hefur
verið sýnt fram á að mikil tjáning á CXCR4 á
hvítblæðisfrumum AML sjúklinga fylgi verri horfur (Spoo
o.fl., 2007). Á mynd 1 má sjá hvar uppistöðufrumur
beinmergsins sem tjá CXCL12 hafa laðað illkynja blasta
sem tjá CXCR4 í nærumhverfi beinmergsins en þar eru
blastarnir varðir frá krabbameinslyfjum.
Mælingar á CXCR4 hafa einnig hagnýt gildi í greiningu frumugerða í CLL en hægt er að greina á
milli CLL fruma úr beinmerg og CLL fruma úr blóði. CLL frumur í skiptingu sem eru staðsettar í
beinmerg eða eitlum tjá lítið af CXCR4 miðað við CLL frumur í blóði sem eru ekki í skiptingu (Bennett
o.fl., 2007). Burger og félagar sýndu fram á að CXCR4 stjórnar hreyfingu CLL fruma yfir æðaþel og yfir
eða undir frumur beinmergsins sem seyta CXCL12 (J. A. Burger o.fl., 1999). Burger og félagar
skoðuðu einnig nánar samband CXCR4 við CLL frumur og komust að því að CXCL12 dregur CXCR4
jákvæðar frumur í nærumhverfi beinmergsins og ver þær fyrir krabbameinslyfjum, líkt og gerist í AML
(J. A. Burger o.fl., 2000).
CXCR4 hefur verið tengt við 23 tegundir krabbameina þar sem hann eflir myndun meinvarpa,
æðamyndun, vöxt og lifun æxla (Wu o.fl., 2010). Í smáfrumu lungnakrabbameini er CXCR4 yfirtjáður
og veldur meinvarpsmyndun í beinmerg auk þess sem tjáning á CXCR4 er notað sem neikvætt
forspárgildi um lifun sjúklinganna (M. Burger o.fl., 2003). Sömu sögu má segja um
blöðruhálskrabbamein þar sem CXCR4 spilar stórt hlutverk í meinvarpsmyndun í beinmerg (Taichman
o.fl., 2002), auk þess að tjáning á CXCR4 er nothæft sem forspárgildi um lifun sjúklinganna en þeir
sem tjá mikið af CXCR4 hafa verri lifun (Akashi o.fl., 2008). Meinvarpsmyndun í
eggjastokkakrabbameini af þekjufrumu uppruna er talin stjórnast af sambandi CXCR4 og CXCL12
(Barbolina o.fl., 2010).
Mynd 1 Samspil CXCR4 og CXCL12 við beinmerginn.
Myndin sýnir hvernig uppistöðufrumur beinmergs tjá CXCL12 og draga illkynja blasta sem tjá CXCR4 í nærumhverfi beinmergs.
20
Vel er þekkt að CXCR4 er tjáð af æxlisfrumum í brjóstakrabbameini. Hlutverk CXCR4 í
brjóstakrabbameini er að efla æxlisvöxt, innrás æxlisfruma í vefi og myndun meinvarpa í vefjum sem
tjá CXCL12, þar á meðal í beinum, lungum, eitlum og lifur. Muller og félagar hafa rannsakað efnatoga í
brjóstakrabbameini og skoðuðu hvaða efnatogviðtakar væru til staðar í eðlilegum brjóstvef og
hinsvegar í brjóstakrabbameinsfrumum. Niðurstöðurnar sýndu fram á þrjú mynstur þ.e. ákveðnir
efnatogviðtakar voru tjáðir í eðlilegum brjóstvef en tjáning þeirra var minni í æxlisfrumunum (CXCR2),
sumir efnatogviðtakar voru bæði tjáðir í eðlilegum brjóstvef og æxlisfrumum (CCR7) og að lokum voru
það efnatogviðtakar sem ekki voru tjáðir í eðlilegum brjóstvef en voru tjáðir af æxlisfrumunum og
tilheyrir CXCR4 þeim hópi. Muller og félagar skoðuðu einnig áhrif efnatoga og komust að því að
CXCL12 er einn öflugasti efnatoginn í brjóstakrabbameini. Síðast en ekki síst skoðuðu þeir áhrif
efnatoghemla á bindingu CXCR4 við CXCL12 og minnkaði myndun meinvarpa í músum til muna við
gjöf efnatoghemla (Muller o.fl., 2001).
Það er ekki eingöngu í krabbameinum þar sem CXCR4 viðtakinn hefur hlutverki að gegna. Í liðagigt
stjórnar CXCR4 viðtakinn frumuskriði T fruma í liði (De Klerck o.fl., 2005). WHIM (Warts,
Hypogammaglobulinemia, Infections, og Myelokathexis) heilkenni er erfðasjúkdómur þar sem genið
sem tjáir CXCR4 er stökkbreytt og veldur því að fullþroskaðir neutrofílar komast ekki út úr
beinmergnum og í blóðrásina (Bachelerie, 2010). Í bandvefsmyndun í lungum dregur CXCL12/CXCR4
bindingin stofnfrumur og fíbróblasta á skemmd svæði í lungum en það veldur óafturkræfri
bandvefsmyndun í lungum (Song o.fl., 2010).
Eftir því sem samband CXCR4 og CXCL12 er rannsakað frekar kemur sífellt meira í ljós um þetta
mikilvæga samband. Ein af þeim uppgötvunum sem hefur verið rannsökuð á síðustu árum er ekki
síður mikilvægur þáttur í þessu sambandi en það er að þegar blóðþurrð verður í vefjum líkamans, til
dæmis í hjarta við hjartaáfall, þá er CXCL12 kallaður á skemmda svæðið til að taka þátt í viðgerðum.
Hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) er umritunarþáttur sem gegnir lykilhlutverki í líkamanum þegar
súrefnisstyrkur lækkar (Ziello o.fl., 2007). HIF-1 eykur einnig tjáningu á CXCL12 á blóðþurrðarsvæðum
(ischemic) í beinu hlutfalli við minnkaða súrefnismettun. Aukin tjáning á CXCL12 laðar stofnfrumur og
aðrar forverafrumur að vefjaskemmdinni. Þannig myndast tímabundið stofnfrumu nærumhverfi fyrir
CXCR4-forverafrumurnar á meðan viðgerð á vefnum stendur. Að viðgerð lokinni þegar súrefnið í
vefnum er orðið eðlilegt, verður CXCL12 tjáning í vefnum eins og hún var fyrir blóðþurrðarskemmdina
(Ceradini o.fl., 2004) (fengið frá (J. A. Burger o.fl., 2006)). Karshovska og félagar sýndu einnig fram á
að HIF-1α hafi bein áhrif á aukningu á CXCR12 í viðgerðum á vefjaskemmdum á æðum (Karshovska
o.fl., 2007).
Þekkt er að lág súrefnisspenna (oxygen tension) er í æxlum og jafnvel súrefnisþurrð. Fiegl og
félagar skoðuðu hvort það sama ætti við í hvítblæði og komust að því að súrefnisspennan í
beinmergnum er minnkuð í hvítblæði sem veldur því að tjáning á CXCR4 er aukin. Þeir komust einnig
að því að með því að auka súrefnisspennuna hættu frumurnar að tjá CXCR4 með því að losa sig við
smáar agnir sem tjáðu CXCR4 (Fiegl o.fl., 2009). Niðurstöður úr svipuðum rannsóknum hafa þó sýnt
andstæðar niðurstöður. Niðurstöður Jing og félaga sýna að tjáning á CXCR4 breytist ekki í
súrefnisþurrð og að seytun á CXCL12 minnki (Jing o.fl., 2012). Það er margt sem gæti spilað inn í
þennan mun á niðurstöðum og þá koma aðallega mismunandi frumuræktunaraðstæður til greina.
21
Nauðsynlegt er að komast að hinu eina rétta í þessu samhengi til að auka þekkingu á CXCR4 og
CXCL12 og samspil þeirra við súrefni þar sem lyfja- og geislameðferð getur haft mikil áhrif á
gegnumflæði og súrefnisspennu beinmergsins (Jing o.fl., 2012).
1.3 Plerixafor
Plerixafor er fyrsta lyfið sem hindrar bindingu CXCL12 bindilsins við CXCR4 viðtakann sem
Bandaríska matvæla- og lyfjaeftirlitið (Food and Drug Administration) samþykkti (Debnath o.fl., 2013).
Fyrst var lyfið notað gegn retróveirum (HIV) þar sem CXCR4 var fyrst bendlaður við HIV. Við langtíma
notkun þess fóru blóðmyndandi stofnfrumur að leita út úr nærumhverfi sínu í beinmergnum (Hendrix
o.fl., 2004). Með þær upplýsingar að vopni var farið að nota lyfið ásamt vaxtarþættinum granulocyte-
colony stimulating factor (G-CSF) til að færa blóðmyndandi stofnfrumur úr beinmerg og út í blóðrásina
þar sem þeim er safnað með notkun frumuskilju og gefnar til baka eftir háskammta
krabbameinslyfjameðferð. Þetta er þó aðeins gert hjá sjúklingum með eitilfrumukrabbamein og
mergæxli (Debnath o.fl., 2013). Nýjustu hugmyndir um notkunarmöguleika lyfsins er eins og áður var
greint frá að losa illkynja hvítblæðisfrumur úr nærumhverfi beinmergsins þar sem krabbameinslyf ná til
þeirra (J. A. Burger o.fl., 2009).
Liesveld og félagar rannsökuðu Plerixafor og komust að því að það hindrar frumuskrið í átt að
CXCL12 í frumuskriðstilraun in vitro og að lyfið hindri einnig útvöxt hvítblæðisfruma í kólóníumyndandi
einingar í methýlcellulósaræktun. Niðurstöðurnar sýndu einnig fram á að Plerixafor hafði ekki áhrif á
lifun AML blasta hvorki úr sjúklingum né frumulínum og að Plerixafor hindraði ekki AKT boðleiðina sem
virkjast þegar CXCL12 bindst CXCR4 (Liesveld o.fl., 2007). Tavor og félagar hafa mikið rannsakað
áhrif Plerixafor á samband CXCR4 og CXCL12. Rannsóknir þeirra á frumulínum sýnir fram á
andstæðar niðurstöður miðað við niðurstöður Liesveld og félaga en þeir sýndu fram á að Plerixafor
getur hamlað fjölgun fruma um allt að 50% auk þess að stuðla að útþroskun hvítblæðisfrumulínunnar
U937 (Tavor o.fl., 2008). Munurinn á þessum rannsóknum gæti legið í því að mismunandi styrkir af
Plerixafor voru notaðir en Liesveld notaði styrki á bilinu 0,1 – 1 mg/mL en Tavor notaði lægri styrki eða
á bilinu 10 – 30 µM.
Liles og félagar skoðuðu hvernig Plerixafor virkar í heilbrigðum einstaklingum. Þátttakendur fengu
einn skammt af Plerixafor sem nam allt að 240 µg/kg og eftir 9 klukkustundir hafði magn CD34
jákvæðra fruma í blóði allt að tífaldast og myndun kólónía í kólóníuræktunum fimmfaldaðist.
Þátttakendur þoldu lyfið vel og aðeins komu fram væg og skammvinn eitrunareinkenni (Liles o.fl.,
2003). Uy og félagar gerðu einnig rannsókn á Plerixafor í AML sjúklingum en þau sprautuðu
þátttakendur rannsóknarinnar með Plerixafor í sama styrkleika og Liles notaði, ásamt öðrum
krabbameinslyfjum þar á meðal Cytarabine. Tilraunin var gerð í tveimur hlutum og í seinni hluta
tilraunarinnar var einn sjúklingur sem fann til aukaverkana sem tengd voru við Plerixafor.
Niðurstöðurnar leiddu í ljós að það varð tvöfalt meiri tilfærsla af AML frumum úr beinmergnum út í
blóðrásina án þess að valda aukningu á hvítum blóðkornum. Þetta staðfestir það sem áður var haldið
fram að Plerixafor trufli bindingu CXCL12 við CXCR4 (Uy o.fl., 2012).
Það er ekki eingöngu í hvítblæði sem CXCR4 spilar lykilhlutverk, því viðtakinn hefur mikilvægu
hlutverki að gegna í öðrum krabbameinum varðandi meinvarpsmyndun og íferð æxla í vef, eins og
sagt var frá í kafla 1.2. Áhrif Plerixfor hefur verið rannsakað meðal annars í eggjastokkakrabbameini af
22
þekjufrumu uppruna, lyfið minnkaði meinvarpsmyndun og íferð æxlisins í frumuskriðstilraun í gegnum
kollagen (Barbolina o.fl., 2010). Í tilraun sem var gerð á sortuæxlisfrumum í músum, minnkaði
Plerixafor meinvarpsmyndun til eitla í holhönd um 62% og til lungna um 49% (M. Kim o.fl., 2010).
Rannsókn var gerð þar sem áhrif Plerixafor á bandvefsmyndun í lungum var könnuð, sýndi að
Plerixafor hindraði frumuskrið stofnfruma og fíbróblasta á skemmda svæðið í lunganu og kom það í
ljós að bandvefsmyndun minnkaði til muna í bleomycin meðhöndluðum músum (Song o.fl., 2010).
Rannsóknir eru í fullum gangi að finna út áhrif þess að blanda Plerixafor inn í lyfjameðferðir
hvítblæðissjúklinga, bæði í nýjum tilfellum og hjá þeim sem hafa fengið bakslag. Helsti ávinningurinn
sem er vænst af þessum rannsóknum er að draga úr endurkomu sjúkdóms (Peled o.fl., 2013).
1.4 Krabbameinslyf
Flókið er að hanna krabbameinslyf þar sem erfitt er að fá lyf til drepa krabbameinsfrumur án þess að
heilbrigðar frumur séu drepnar með. Ástæðan fyrir þessu er að sameindir sem krabbameinsfrumur tjá
er oft að finna í heilbrigðum frumum líka. Munurinn á illkynja og heilbrigðum frumum er að illkynja
frumur hafa oft virkjað vaxtarboð sem hjálpar til við æxlisvöxt auk þess sem hæfni fruma að
framkvæma stýrðan frumudauða er minnkuð. Þar sem að munurinn liggur í ójafnvægi á stjórnun
frumufjölgunar og frumudauða eru krabbameinslyf hönnuð til að hafa áhrif á þessa þætti. Lyf sem ýta
undir stýrðan frumudauða eru mjög algeng en þau geta virkað á mismunandi hátt. Algengast er að
þessi lyf virki á frumuhringinn með því t.d. að hafa áhrif á erfðaefni frumunnar með því að hindra
umritun erfðaefnisins eða eyðileggja það þannig að fruman deyr. Önnur lyf geta virkað á próteinferla
frumunnar, viðtaka eða píplur innan frumunnar (Perry, 2008).
1.4.1 Cytarabine
Cytarabine (1-β-D-arabinofuranosylcytosine, Ara-C) er lyf sem notað er í meðferðir gegn hvítblæði,
sérstaklega bráða hvítblæði. Efnið er pyrimídín sem hindrar frumufjölgun með því að hindra DNA
nýmyndun (J. S. Kim o.fl., 2012). Cytarabine er svokallaður antimetaboliti en það er efni sem hindrar
önnur efni (oft myndefni) í efnaskiptaferlum líkamans sem getur leitt til frumudauða. Cytarabine er
líking af cýtidín þar sem sykursameindinni hefur verið umbreytt úr ríbósa í arabínósa. Þegar
Cytarabine kemur inn í frumuna er því breytt í þrífosfat og keppir það við cýtidín um innlimun í DNA.
Eftir innlimun í DNA hindrar arabínósinn snúning sameinda innan DNA þannig að eftirmyndun
stöðvast. Lyfið hamlar einnig DNA pólýmerasann með sömu afleiðingunum, kemur í veg fyrir
eftirmyndun og lagfæringar á DNA (National cancer institute, e. d.-b).
1.4.2 Idarubicin
Idarubicin (4-demethoxydaunarubicin) tilheyrir anthracyclín lyfjum og er notað til meðferðar á
hvítblæði, þá aðallega AML. Lyfið hamlar DNA eftirmyndun, RNA umritun og próteinmyndun með því
að fara í DNA og trufla virkni tópóísómerasa II. Idarubicin er fitusæknara en önnur anthracyclín og á
því auðveldara með að komast inn fyrir frumuhimnuna (National cancer institute, e. d.-d).
Idarubicin var fyrst kynnt undir lok níunda áratugarins og í framhaldi af því voru gerðar margar
samanburðarrannsóknir á því og Daunarubicin sem leiddu í ljós að Idarubicin væri öflugara og kæmi til
með að leysa Daunarubicin af hólmi (Berman o.fl., 1991). Síðari rannsóknir leiddu i ljós mikilvægi
23
skammtastærða þegar verið er að bera saman mismunandi anthracyclín og hefur háskammta
Daunarubicin reynst jafn áhrifaríkt og hefðbundnir skammtar af Idarubicini (Teuffel o.fl., 2013).
1.4.3 Fludarabine
Fludarabine (fludarabine-5'-monophosphate) er fosfatsalt af flúortengdu núkleótíði antimetaboliti sem
hefur æxlishemjandi virkni og er hliðstætt lyfinu Vidarabine (ara-A) sem er veirueyðandi. Þegar
Fludarabine er komið í mannslíkama affosfórast það hratt í 2-flúor-ara-A sem síðan fosfórýlerast innan
fruma, af völdum deoxýcýtidínkínasa, í virka þrífosfatið 2-flúor-ara-ATP. Þetta myndefni truflar DNA
nýmyndun og hindrar vöxt æxlisfruma með því að hindra DNA pólýmerasa alfa, ríbónúkleótíð
redúktasa og DNA primasa(National cancer institute, e. d.-c).
1.4.4 Azacytidine
Azacytidine (4-amino-1-beta-D-ribofuranosyl-1,3,5-triazin-2(1H)-one) er pýrimídín kirninsleif með
æxlishemjandi virkni og er hliðstætt lyfinu Cytidine. Lyfið er innlimað í DNA og hindrar þar DNA
methýltransferasa sem veldur því að DNA er ekki methýlerað en við það virkjast æxlisbæligen, sem
áður voru þögguð vegna methýleringar, en þau hindra æxlisvöxt. Lyfið er einnig innlimað í RNA og
truflar því líka eðlilega RNA virkni, tRNA cytosine-5-methýltransferasa virkni og próteinmyndun
(National cancer institute, e. d.-a). Azacytidine er notað við mergmisþroskunar sjúkdómum og AML.
Sýnt hefur verið fram á að ef sjúklingum með mergmisþroskun er gefið lyfið aukist lifun þeirra miðað
við önnur hefðbundin lyf, þar sem 50,8% sjúklinga sem fengu Azacytidine voru á lífi eftir 2 ár frá
meðferð en aðeins 26,2% sjúklinga sem fengu önnur lyf (Fenaux o.fl., 2009).
1.5 Inngangur að aðferðarfræði
1.5.1 Frumuflæðisjá
Með flokkunarkerfi WHO á AML jókst mikilvægi greininga á sameinda- og erfðafræðiþáttum illkynja
fruma og í dag gegnir frumuflæðisjáin mjög mikilvægu hlutverki við greiningu og til mats á
meðferðarsvörun við bráða hvítblæði (Peters o.fl., 2011).
Frumuflæðisjá er tiltölulega nýtt tæki í tæknibyltingu síðustu ára en þrátt fyrir það hefur hugmyndin
á bak við tækið verið til í yfir 50 ár. Með sívaxandi úrvali af einstofna mótefnum og tilkomu nema sem
mæla flúorljómun jókst fjölhæfni frumuflæðisjáa og vinsældir tækisins jukust. Þegar alnæmi (AIDS)
breiddist út varð frumuflæðisjáin að venjubundnu tæki á rannsóknarstofum þar sem fylgjast þurfti náið
með T frumu hlutfalli sjúklinga. Fljótlega var farið að nota tækið í venjubundnum rannsóknum í
blóðmeinafræði og krabbameinsfræðum (Sun, 2008).
Frumuflæðisjáin er mjög fjölhæf en hún mælir margar breytur samtímis, t.d. stærð fruma, hve
kornótt umfrymið er, mótefnisvaka á yfirborði frumuhimnu, í umfrymi og kjarna o.fl. (Sun, 2008).
Tæknin á bak við frumuflæðisjár byggir á því að hægt sé að mæla svipgerðir fruma með
vökvastreymi í gegnum tækið. Greining með frumuflæðisjá skiptist í fjóra megin þætti: undirbúningur
sýna, mæling sýna í frumuflæðisjá, greining upplýsinga og túlkun niðurstaðna (Harmening, 2009).
24
1.5.1.1 Undirbúningur sýna
Frumuflæðisjá mælir svipgerð fruma með því að lita fyrir sameindum á yfirborði fruma og ýmsum
innanfrumulitunum. Ýmist er litað beint með flúorlitum eða með flúormerktum mótefnum (Harmening,
2009). Dæmi um flúorlit sem notaður er í þessari rannsókn er propidium iodide (PI) sem litað er með í
mælingum á stýrðum frumudauða, sjá nánar kafla 3.6.
Litun með flúormerktum mótefnum er mjög nákvæm þar sem aðeins þær frumur sem tjá
mótefnavakann sem mótefnaliturinn beinist að litast. Þessi aðferð getur litað bæði innan- og
utanfrumusameindir. Mótefnin sem eru notuð eru ýmist fjölstofna mótefni sem einangruð eru úr
mótsermi eða einstofna mótefni sem eru framleidd úr ódauðlegum B frumu klónum. Einstofna mótefni
eru frekar notuð þar sem þau gefa meiri nákvæmni. Oftast er litað með nokkrum mótefnalitum og til
þess að engin skekkja komi upp eru mismunandi mótefni merkt með mismunandi flúorlitum, en þannig
er hægt að greina á milli mótefnalita og jafnframt greina frumugerðina. Það sem ræður því hvaða
flúorlit mótefni eru merkt með, er hvort mótefnavakar séu í hárri eða lágri þéttni á frumunni. Dæmi um
þetta er að mótefnavakar sem eru í lágri þéttni eru litaðir með björtum flúorlit eins og phycoerythrin
(PE) og mótefnavakar í hárri þéttni eru litaðir með flúorlit í meðal styrk eins og fluorescein
isothiocyanate (FITC) eða peridinin-chlorophyll-protein (PerCP) (Harmening, 2009).
Búið er að koma upp almennu kerfi sem skilgreinir mótefni út frá hvarfgirni (reactivity) mótefnavaka.
Þessi flokkun nefnist „Cluster of differentiation“ en gengur almennt undir skammstöfuninni CD hópar.
Þessir CD hópar eru númeraðir og mótefni innan hvers hóps bindst við sama mótefnið. Búið er að
finna og skilgreina 363 CD hópa samkvæmt nýjustu tölum sem voru samþykktar á níunda alþjóðlega
þinginu um um mótefnavaka á hvítum blóðkornum (Human Leukocyte Differentiation Antigens,
HLDA9) (Human cell differentiation molecules, e. d.).
1.5.1.2 Mæling sýna
Frumuflæðisjár samanstanda af þremur meginþáttum
sem eru straumtækni, linsur og rafstraumur.
Straumtæknin byggir á þrýstilofti og vökva (saline
sheath) sem flytur sýnið inn í tækið, flytur það um tækið
og endar að lokum í úrgangsdalli. Þegar sýnið berst í
mælieiningu tækisins er hraði sýnisins aukinn og getur
verið á bilinu 1 – 10 m/s. Flæðið er stillt þannig að
aðeins ein fruma í einu fer í gegnum leysigeislana (Sun,
2008). Þegar frumur fara í gegnum leysigeislana eru
hinar ýmsu svipgerðir frumunnar mældar samtímis. Það
sem er mælt í mælieiningu tækisins eru geislar sem eru
framdreifðir (forward scattered (FSC)), geislar sem
dreifast á hlið (side scattered (SSC)) og svo allt að sex flúorlitir. Skynjarar nema ákveðna flúorliti og
eru nemar í nýjum tækjum nefndir eftir litnum sem þeir nema t.d. FITC nemi, PE nemi osfrv. FSC og
SSC mælingar byggja á útliti og lögun frumunnar eins og sést á mynd 2. Eftir því sem frumur eru
stærri því meira merki kemur frá FSC og eftir því sem fruman er flóknari inní sér (t.d. kjarni) því stærra
SSC merki kemur í mælingunni. Hægt er að velja hvort frumuflæðisjáin mæli allar agnir eða stilla
Mynd 2 Dreifing leysigeisla til forward og side scatter eftir eiginleikum frumunnar.
Mynd frá (Sun, 2008).
25
þröskuldinn þannig að hann takmarki mælingar á frumubrotum og öðru rusli. Með því að stilla
þröskuldinn er verið að breyta FSC þannig það mælir bara frumur og agnir sem eru hærri en
þröskuldurinn (Harmening, 2009).
Mynd 3 Uppsetning mælieiningar í FACSCalibur.
Bláu og rauðu geislarnir hæfa frumurnar í flow cell, þaðan fer ljósið frá frumunni í gegnum síur og spegla og endar í viðeigandi nemum sem nema ljós við ákveðna bylgjulengd. Mynd fengin frá (Office of collaborative science, e. d.).
FACSCalibur frá Becton Dickinson var fyrsta frumuflæðisjáin til að vera með tvíþættan leysir en
það veitir meiri sveigjanleika og næmni fyrir greiningu á marglita sýnum (sjá mynd 3). Leysirarnir tveir
eru aðskildir og samanstanda af bláum jónuðum argon leysir (488 nm) og rauðum díóðu leysir (635
nm). Með því að hafa þá aðskilda fæst meiri næmni og meiri sveigjanleiki við notkun ýmissa flúorlita.
Þegar fruma hefur orðið fyrir geislun ferðast ljósið sem hún sendir frá sér í gegnum linsukerfi tækisins
en þar fer ljósið sem fruman gefur frá sér í gegnum linsusíur (filters) sem eru staðsettar á ákveðnum
stöðum auk spegla. Speglarnir og síurnar dreifa, endurspegla, frásoga eða hamla ákveðnar
bylgjulengdir. Þegar búið er að sía út ákveðnar bylgjulengdir ljóssins er geislinn sendur á nema sem
mæla ákveðnar bylgjulengdir ljóss. Algengast er að nemarnir mæli grænt ljós á bylgjulengdinni 515 –
545 nm (FITC nemi), appelsínugult ljós á bylgjulengdinni 564 – 606 nm (PE nemi), rautt ljós á
bylgjulengdinni yfir 670 nm (PerCP nemi) og aðra rauða geisla á bylgjulengdinni 653 – 669 nm (APC
nemi) (Harmening, 2009).
Ljósnemarnir breyta ljósinu í rafboð sem kallast slag, því sterkara sem ljósið er því stærra slag
verður. Í FACSCalibur fer slagið í gegnum magnara áður en því er breytt yfir á tölvutækt form, þar sem
niðurstöðurnar birtast á logaritmískum eða línulegum skala. Logaritmískur skali leyfir veikum og
sterkum merkjum að birtast á sama skala. Hægt er að auka næmni nemanna með því að auka
rafspennu þeirra, þetta er gert þegar litur gefur frá sér veikt merki þá er hægt að auka rafspennuna til
26
að gera litinn skýrari. Þetta virkar einnig öfugt, ef að litur gefur frá sér mjög sterkt merki og lendir
jafnvel útaf skalanum þá er hægt að minnka rafspennu á nemanum (Harmening, 2009).
Þegar tækið hefur mælt sýnin flytjast niðurstöðurnar í tölvu þar sem hægt er að vinna úr þeim í
ákveðnum forritum. Sett eru upp gröf, yfirleitt er notast við depilgröf (dot plot), og hægt að afmarka
frumur sem skoða á nánar t.d. illkynja frumur. Með því að skoða ákveðinn frumuhóp í gröfum með tilliti
til litunar er hægt að greina nákvæmlega gerð og eiginleika fruma (Harmening, 2009).
1.5.2 Frumuskrið
Frumuskriðstilraun á AML frumum byggir á sérstökum
frumuskriðsbökkum sem hafa tvo brunna. Í efri brunninn eru
settar einkjarna hvítblæðisfrumur sem hafa verið einangraðar
úr blóði eða beinmerg auk efnatoghemilsins Plerixafor í
ákveðnum aðstæðum. Í neðri brunninum er æti ásamt
efnatoganum CXCL12. Botninn á efri brunninum er
polyethylene terephthalate (PET) himna sem hefur 8,0 µm göt
þar sem frumur geta skriðið í gegnum ef þær tengjast
efnatoganum í neðri brunninum. Þetta má sjá á mynd 4.
Árið 1973 birtist grein eftir Zigmond og Hirsch þar sem
lagður er grunnur að frumuskriðstilraunum eins og þær
þekkjast í dag, það er tveggja hólfa kerfi með svokallaðri
Millipore himnu á milli hólfa (Zigmond o.fl., 1973). Aðferðin hefur þróast síðan þá og hafa menn verið
að húða efri brunninn með efnum á borð við fibronectin (Voermans o.fl., 2002) eða frumum t.d.
þekjufrumum til að líkja eftir frumuskriði eins og það gerist í líkamanum (Liesveld o.fl., 2007).
Margar rannsóknir hafa verið gerðar á skriði hvítblæðisfruma með ofangreindri aðferð auk
rannsókna á frumuskriði hvítblæðisfruma með tilliti til efnatogans CXCL12 og virkar þessi aðferð vel til
að meta það (C. H. Kim o.fl., 1998).
Frumuskriðstilraun er góð leið til að meta áhrif efnatoga á frumur og ekki síður virkni efnatoghemla.
Liesveld og félagar skoðuðu áhrif efnatoghemilsins Plerixafor á frumuskrið hvítblæðisfruma í átt að
CXCL12 og gaf það góða raun á virkni Plerixafor (Liesveld o.fl., 2007).
1.5.3 Kólóníuræktun
Fyrir um það bil 50 árum birtust fyrstu
greinarnar um kólóníuvöxt fruma (Bradley o.fl.,
1966; Pluznik o.fl., 1965) en þessi uppgötvun
varð til framfara í rannsóknum, greiningum og
meðferðum í blóðmeinafræði.
Kólóníuræktanir eru notaðar til að meta
blóðfrumumyndun á heilbrigðum beinmerg og
í hvítblæði. Kólóníuræktun varpar ljósi á fjölda
forvera fruma og í hvítblæðissjúklingum gefur
Mynd 4 Frumuskrið.
Mynd byggð á (Bio Cat, e. d.)
Mynd 5 Hvít- og rauðkornakólóníur.
Mynd frá Leifi Þorsteinssyni, Blóðbankanum.
27
ræktunin til kynna eiginleika illkynja blasta og endurnýjunarhæfni þeirra (Nara o.fl., 1985). Hægt er að
greina mismunandi frumugerðir blóðfruma út frá kólóníuvexti. Þær forverafrumur sem geta myndað
kólóníur eru kallaðar kólóníumyndandi einingar (Colony Forming Unit, CFU) en einnig er nánar tilgreint
um tegund frumunnar, t.d. er forveri granúlocýta og makrófaga skammstöfuð CFU-GM, forveri rauðra
blóðkorna CFU-E og kólóníur með blönduðum frumuvexti eru kallaðar CFU-GEMM (Nissen-Druey
o.fl., 2005). Sjá má CFU-GM og BFU-E kólóníur á mynd 5.
Kólóníuræktanir hafa meðal annars verið notaðar við stofnfrumumeðferðir til mats á stærð og
gæðum stofnfrumugræðlings til viðbótar við CD34 mælingar. Einnig er hægt að nota kólóníuræktanir til
sjúkdómsgreiningar en þá er óeðlilegur kólóníuvöxtur skoðaður og hægt að meta sjúkdómsgreiningu
út frá því (Nissen-Druey o.fl., 2005).
Kólóníuræktun er oft notuð til að kanna áhrif lyfja og annara efna á hvítblæðisfrumur. Liesveld og
félagar könnuðu áhrif efnatoghemilsins Plerixafor á myndun kólónía með tilliti til aukinnar útþroskunar
AML fruma (Liesveld o.fl., 2007). Zhang og félagar skoðuðu áhrif Fenretinide lyfs sem hindrar
krabbameinsvöxt, á myndun kólónía hjá CD34 jákvæðum hvítblæðis stofnfrumum og báru saman við
eðlilegar CD34 jákvæðar frumur (Zhang o.fl., 2013).
Kim og Broxmeyer notuðu kólóníuræktun til að greina nánar af hvaða gerð blóðfrumumyndandi
forverafrumur væru sem skriðu að CXCL12 í frumuskriðsprófi eins og greint var frá í kafla 1.5.3.
Niðurstöður rannsóknarinnar leiddi í ljós að ekki var afgerandi af hvaða gerð þær forverafrumur voru
sem skriðu að CXCL12 þar sem svipað hlutfall var af BFU-E, CFU-GM og CFU-GEMM (C. H. Kim o.fl.,
1998).
1.5.4 Frumulínur
Rannsóknum á hvítblæði hefur fleytt fram síðustu áratugi og sömu sögu er að segja um
rannsóknaraðferðir. Upp úr 1970 fóru vísindamenn að leita að nýjum aðferðum þar sem
dýrarannsóknir, til dæmis á músum, þóttu ekki samsvara manninum nógu vel og á þessum tíma áttu
þeir í erfiðleikum með að halda ferskum hvítblæðisfrumum úr sjúklingum lifandi í tilraunaglösum.
Fyrstu hvítblæðisfrumulínurnar voru unnar úr músum og gáfu góða mynd meðal annars af
genatjáningu og frumufjölgun en líkt og með aðrar dýrarannsóknir gáfu þær takmarkaðar upplýsingar
um meingerð AML í mönnum. Fljótlega var farið að vinna frumulínur úr hvítblæðissjúklingum og var
KG-1 þriðja frumulínan sem var unnin úr AML sjúklingi (Koeffler o.fl., 1980).
Frumulínan KG-1 var unnin úr hvítblæðisfrumum úr beinmerg frá 59 ára hvítum karlmanni sem var
greindur með bráða hvítblæði í forstigum rauðra blóðkorna (erythroleukemia). Frumurnar voru
mergfrumublastar af makrófaga gerð. Eftir að frumulínunni hafði verið skipt upp 35 sinnum kom nýtt
afbrigði af frumulínunni sem var kallað KG-1a. KG-1a hafði sömu litningagerð (karyotype) og
móðurlínan en frumurnar voru minna þroskaðar og höfðu ekki sömu frumuefnafræðilegu eiginleika og
móðurlínan (Furley o.fl., 1986).
Frumulínan U937 er mónócýta frumulína unnin úr fleiðruvökva frá 37 ára hvítum karlmanni sem var
greindur með eitilfrumukrabbamein (histiocytic lymphoma) (Sundstrom o.fl., 1976).
28
2 Markmið
Markmið rannsóknarinnar eru:
1. Rannsaka áhrif efnatoghemilsins Plerixafor í samspili með krabbameinslyfjunum Idarubicin,
Cytarabine, Fludarabine og Azacytidine á hvítblæðisfrumur úr blóði og beinmerg sjúklinga
með bráða mergfrumuhvítblæði. Meta áhrif á lifun, stýrðan frumudauða og svipgerð
hvítblæðisfruma í frumuræktunum.
2. Rannsaka áhrif mismunandi styrkleika krabbameinslyfja á hvítblæðisfrumur úr sjúklingum með
bráða mergfrumuhvítblæði á lifun og stýrðan frumudauða og meta þannig næmi illkynja fruma
fyrir krabbameinslyfjum.
3. Rannsaka hvort Plerixafor hafi áhrif á útþroskun hvítblæðisfruma í frumuræktun með
kólóníuræktunum og frumuflæðisgreiningu.
4. Meta frumuskrið hvítblæðisfruma með og án Plerixafor og bera saman við CXCR4 tjáningu á
hvítblæðisfrumum með frumuflæðisgreiningu.
29
3 Efni og aðferðir
3.1 Þýði rannsóknarinnar
Alls fengust 14 þátttakendur í rannsóknina, sex karlar og átta konur, á aldrinum 19 til 82 ára en
meðalaldurinn var 63 ár. Upplýsingar um þátttakendur má sjá í töflu 1 en þar kemur einnig fram
greining sjúklinga í FAB flokkunarkerfinu, tjáning sjúklinga á CXCR4, hvert hlutfall blasta í sýnum var
og tegund sýna sem einkjarna frumur voru einangraðar úr. Sýni fengust frá sjúklingum eftir upplýst
samþykki þeirra (sjá fylgiskjöl).
Tafla 1 Þátttakendur rannsóknarinnar.
Taflan sýnir lista yfir þátttakendur rannsóknarinnar en þeir eru númeraðir handahófskennt, greiningu þeirra í FAB flokkunarkerfinu, kyn, aldur, tjáningu á CXCR4 sem er skilgreind sem Pos sé tjáning til staðar, veikt post sé um örlitla tjáningu að ræða og neg ef engin tjáning er til staðar, hlutfall blasta af einangruðum frumum (x táknar að hlutfallið er óþekkt) og tegund sýnis þ.e. blóð- eða beinmergssýni.
Sjúklingur Greining Kyn Aldur CXCR4 Hlutfall blasta Tegund sýnis
1 M2 KK 62 Neg 75,25 Blóð
2 M6 KK 78 Veikt Pos 10,43 Blóð
3 M2 KVK 71 Veikt Pos 88,05 Beinmergur
4 M2 KVK 82 Veikt Pos 93,32 Blóð
5 M0 KVK 64 Neg 13,21 Blóð
6 M2 KK 76 Pos 68,35 Blóð
7 M5 KVK 47 Pos 69,05 Blóð
8 MDS/AML KK 72 Pos 85,47 Beinmergur
9 M5 KVK 73 Veikt Pos 91,53 Blóð
10 AUL KVK 19 Pos 97,93 Blóð
11 M4 KK 69 Pos 78,49 Beinmergur
12 M1 KK 44 Neg x Blóð
13 M4 KVK 53 Veikt Pos x Beinmergur
14 M4 KVK 74 Pos x Beinm & Blóð
Fyrirhugað var að gera rannsóknina einnig á frumulínurnunum KG-1a, MV-411 og U937 sem
fengust frá Jane Liesveld og samstarfsfólki hennar (University of Rochester, Rochester, NY). Erfiðlega
gekk að rækta þær upp og var því tekin ákvörðun um að rannsaka þær seinna, en niðurstöður
kólóníuræktunnar á KG-1a er að finna í kafla 4.4.
3.2 Einangrun hvítblæðisfruma
Hvítblæðisfrumur voru einangraðar með þéttnistigulsaðferð. Í þeirri aðferð er notast við Ficoll
Histopaque (Sigma) sem inniheldur súkrósa fjölliður og natríum diatrizoic en þessi lausn hefur háan
eðlismassa sem veldur því að blóð og beinmergur flýtur ofan á lausninni. Blóð eða beinmergur var
þynnt til helminga með DPBS (Dulbecco‘s Phosphate Buffered Saline) án CaCl2 og MgCL2 (Gibco®),
en með því að hafa lausnina án CaCl2 og MgCl2 er komið í veg fyrir að storkukerfið virkist. Lausnin var
sett varlega ofan á 13 mL Ficoll lagið og var sýnið svo spunnið niður í skilvindu í 30 mín við 1100 rpm.
Að því loknu var einkjarna frumulagið fljótandi ofan á Ficollinu eins og sjá má á mynd 6. Frumulagið
30
var tekið með pípettu ofan af Ficolllausninni og
sett í nýtt glas þar sem komið var að þvottaskrefi
með DPBS sem innihélt CaCl2 og MgCL2
(Gibco®) en með því að hafa þessi efni með í
lausninni er komið í veg fyrir viðloðun frumanna.
Frumulausnin var sett í skilvindu í 10 mín á 1100
rpm. Þvottaskrefið var endurtekið tvisvar. Fyrir
síðasta þvottaskrefið var talningarskref þar sem
frumunar voru blandaðar með nákvæmu magni
(á bilinu 10 mL – 25 mL eftir magni botnfalls) af
DPBS með CaCl2 og MgCL2. Af þeirri lausn voru
50 μL teknir og sett í nýtt glas þar sem 50 μL af
0,4% Trypan blue lausn (StemCell Technologies
inc.) var blandað saman við. Lausnin var síðan
sett á Neubauer blóðfrumutalningargler og í 40x
stækkun í smásjá var talið í tveimur talningarsvæðum. Eftir talninguna var jafna 1 notuð til að reikna
heildarfjölda einkjarna fruma sem voru einangraðar.
Jafna 1 Talning x þynning x rúmmál vökva x 104.
3.3 Frumuræktun
Eftir einangrun einkjarna fruma voru frumurnar leystar upp í Roswell Park Memorial Institute (RPMI)
1640 (Gibco®) æti sem inniheldur glutamine ásamt viðbættu 10% Fetal bovine serum (FBS) (Gibco®)
og 5 mL af sýklalyfjablöndunni Penicillin-Streptomycin (Sigma). Við blöndun fruma við ætið var
frumuþéttnin stillt á 10 x 106 frumur á mL.
Frumurnar voru ræktaðar í 24 brunna ræktunarbakka (Nunc). Í hvern brunn voru settir 100 μL af
frumulausninni og 900 μL RPMI en það samsvarar 1 x 106 fruma í hverjum brunni ræktunarbakkans.
Mismunandi styrkir lyfja voru notaðir í ræktunina og sjá má í kafla 3.5 hvernig lyfin voru þynnt og magn
lyfja í hverjum brunni. Frumuræktunin fór fram í frumuræktunarskáp við 37°C og 5% CO2.
Frumulínur voru ræktaðar eftir leiðbeiningum frá ATCC um meðhöndlun frumulínanna þar sem
frumulínurnar komu upphaflega frá því fyrirtæki. Frumulínurnar KG-1a og MV-411 voru ræktaðar með
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) (Stemcell technologies) með 20% FBS en U937 var
ræktuð í RPMI æti með 10% FBS.
Vaxtarþáttunum Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) og Granulocyte
colony-stimulating factor (G-CSF) (Stemcell technologies) var bætt út í allar ræktanir en þeir hafa
jákvæð áhrif á skiptingu, virkjun og viðhaldi frumanna. Með því að nota vaxtarþættina er umhverfi
frumanna í ræktinni líkara nærumhverfi þeirra í beinmerg og blóði.
3.4 Frysting fruma
Frumur sjúklinganna voru geymdar með því að frysta þær í fljótandi köfnunarefni.
Frumur voru einangraðar og taldar eins og sagt var frá í kafla 3.1. Ákveðið var hversu margar
frumur skyldi frysta í hverju frystiglasi (Nunc) sem rúmaði 1,8 mL en það voru á bilinu 6,3 x 106 til 30 x
Mynd 6 Blóð/beinmergur spunnin niður með Ficoll.
Mynd byggð á (Bui, 2013).
31
106 frumur. Frumurnar voru leystar upp til helminga í RPMI æti með 10% FBS á móti blöndu af
dimethyl sulfoxide (DMSO) og FBS sem var blönduð í hlutföllunum 1:4. Eftir að frumublandan var
komin í frystiglösin voru þau sett í 10 mínútur á ís og svo í Nalgene frystibox, sem innihélt 250 mL af
100% isopropyl alcoholi og sett í -70°C frystiskáp yfir nótt. Daginn eftir var sýnunum komið fyrir í
fljótandi köfnunarefni við -196°C.
Frumurnar voru þýddar í hitabaði við 37°C. Frumurnar voru síðan fluttar úr frystiglösunum yfir í
stærri glös þar sem 9 mL af RPMI æti var bætt út í, í dropatali. Þetta var síðan sett í skilvindu í 5
mínútur á 1500 rpm og að því loknu var flotið tekið ofan af og 20 mL af æti bætt út á frumurnar.
Frumurnar voru svo taldar eins og áður var sagt frá (sjá kafla 3.1).
Við ræktun fruma úr frystingu þurfti ræktunin að innihalda 10x fleiri frumur en venjulega vegna
hugsanlegra affalla vegna frystingarinnar, það er 10 x 106 frumur voru ræktaðar í hverjum brunni.
Yfirleitt voru frumurnar settar upp í ræktun í einn til tvo sólahringa án lyfja til að ná sér eftir frystinguna.
Eftir það voru frumurnar taldar og eftirlifandi frumur voru settar upp í ræktun (1 x 106 frumur/mL) og
önnur próf í sömu styrkleikum og ferskar frumur.
3.5 Þynning lyfja
Cytarabine var blandað í Apóteki Landspítalans, 100 mg/mL. Þetta var þynnt í 4 mL RPMI æti og
síðan voru 500 μL af þeirri lausn teknir og sett í 50 mL RPMI. Af þessari þynntu lausn voru teknir 8 μL
og settir í ákveðna brunna til að rækta frumurnar með 200 ng styrk.
Idarubicin var blandað í Apóteki Landspítalans, 5 mg í 5 mL. Þetta var þynnt í 4 mL RPMI æti og
síðan voru 500 μL af þeirri lausn teknir og sett í 50 mL RPMI. Af þessari þynntu lausn voru teknir 2 μL
og settir í ákveðna brunna til að rækta frumurnar með 50 ng styrk.
Fludarabin var blandað í Apóteki Landspítalans, 25 mg/mL. Teknir voru 100 µL af lyfinu og sett í 50
mL RPMI æti. Af þessari blöndu voru teknir 5,7 µL og settir í ákveðna brunna til að rækta frumurnar
við 20µM styrk.
Azacytidine var blandað í Apóteki Landspítalans, 25 mg/mL. Teknir voru 100 µL af lyfinu og sett í
50 mL RPMI æti. Af þessari blöndu voru teknir 9,6 µL og settir í ákveðna brunna til að rækta frumurnar
við 20 µM styrk.
Plerixafor var fengið frá MedKoo Biosciences í Bandaríkjunum. Lyfið var 1 g í duftformi og var það
leyst upp í 5 mL af sterílu vatni (stofnlausn). Af þessari stofnlausn voru teknir 100 μL og settir í 2 mL af
sterílu vatni. Af þeirri blöndu voru teknir 79 μL og sett í viðeigandi brunna ræktunarinnar, styrkur lyfsins
var því 1 μmól í hverjum brunni.
3.6 Mótefnalitun og mæling í frumuflæðisjá
Fyrir ræktun, eftir 72 klukkustundir og viku í rækt voru sameindir sem eru einkennandi fyrir
hvítblæðisfrumurnar skoðaðar en markmiðið var að athuga hvort tjáning sameindanna myndi breytast
við ræktun með krabbameinslyfjum og Plerixafor.
Frumur voru teknar úr rækt, settar í glas og spunnar niður í skilvindu við 1100 rpm í 10 mínútur.
Eftir skilvinduna var ætið tekið ofan af og 1 mL DPBS var bætt út á frumurnar og vortexað. Næst voru
100 μL af frumulausninni sett í 6 glös og 1 μL af flúormerktum einstofna mótefnum úr töflu 2 sett í
viðeigandi glös. Á meðan mótefnalitirnir voru að bindast viðtökum í sýninu voru þau sett í ísskáp í 30
32
mínútur. Að þeim tíma loknum var komið að þvottaskrefi þar sem 500 μL af DPBS var bætt út í og
skilið niður í 10 mín við 1100 rpm. Flotið var tekið ofan af og 400 μL DPBS bætt við. Að þessu loknu
var sýnið tilbúið til mælingar í frumuflæðisjá en notast var við FACSCaliburTM
frá Becton Dickinson
(San Jose, California, Bandaríkin) í þessari rannsókn.
Tafla 2 Flúormerkt einstofna mótefni gegn yfirborðssameindum einkjarna fruma.
Mótefni Litur Isotýpa Klón Framleiðandi Einkennir
mIgG1 FITC mIgG1 X40 BD Ósértæka bindingu
mIgG1 PE mIgG2 X41 BD Ósértæka bindingu
mIgG1 APC mIgG3 X42 BD Ósértæka bindingu
CD 117 PE mIgG1 104D2 BD Blastar
CD 34 APC mIgG1 8G12 BD Blastar
CD 13 PE mIgG1 WM15 BD Granúlócýta & mónócýta
CD 184 PE mIgG2a 12G5 BD Hvít blóðkorn
CD 14 FITC mIgG2a M5E2 BioLegend Granúlócýta
CD 33 APC mIgG1 P67.6 BD Granúlócýta & mónócýta
CD 133 PE mIgG2 AC133 Macs Blastar
CD 11b APC mIgG2a D12 BD Hvít blóðkorn
CD 11c PE mIgG2b S-HCL-3 BD Hvít blóðkorn
Við uppsetningu niðurstaðna úr frumuflæðisjánni var valið að skoða eingöngu tjáningu blasta en
þær eru valdar út frá forward og side scatter. Hlið voru síðan útbúin út frá isotýpukontrólum (Mouse
IgG1) þannig að allar frumur á því depilgrafi myndu lenda í neðra vinstra horni. Þetta hlið var síðan
sett á viðeigandi depilgröf og þannig er hægt að meta hvort frumur séu að tjá ákveðnar sameindir,
þetta má sjá á mynd 7.
Mynd 7 Túlkun niðurstaðna á mælingum á yfirborðstjáningu fruma.
Á mynd A eru frumur skoðaðar út frá forward og side scatter og eru þær frumur valdar sem lenda á blasta svæðinu (rauður hringur). Á mynd B eru neikvæðum viðmiðunarsýnum stillt upp PE á móti APC en valið er að sjá eingöngu blastana sem voru valdir á mynd A. Hlið var sett á þannig að allar frumur myndu lenda innan neðri vinstri dálks. Á mynd C er búið að setja hliðið sem búið var til á mynd B á grafið CD13 PE á móti CD34 APC. Frumur sem lenda í neðri vinstri dálk eru CD13 og CD34 neikvæðar, frumur sem lenda í neðri hægri dálk eru CD13 jákvæðar en CD34 neikvæðar, frumur sem lenda í efri vinstri dálk eru CD34 jákvæðar en CD13 neikvæðar og frumur sem lenda í efri hægri dálk eru CD34 og CD13 jákvæðar.
33
3.7 Mæling á stýrðum frumudauða
Stýrður frumudauði (apoptosis) er eðlilegur hluti af þroskun, öldrun og jafnvægisferlum sem viðhalda
réttum fjölda fruma í vef. Stýrður frumudauði er líka hluti af varnarviðbrögðum frumunnar vegna
ónæmisviðbragða og ef frumur skemmast af völdum sjúkdóms eða eiturefna. Lyfja og geislameðferðir
gegn krabbameinum stuðla að frumuskemmdum sem valda því að frumur deyja af völdum stýrðs
frumudauða (Elmore, 2007).
Til að mæla stýrðan frumudauða var litað með Annexin V FITC og Propidium iodide (PI). Annexin V
FITC er prótein sem bindst við phospholipid phosphatidylserine (PS) sem er venjulega staðsett í innra
lagi fosfóllípíðlaga fruma, en PS nær í gegnum ytra fosfóllípíðlag fruma í stýrðum frumudauða. Liturinn
PI litar ekki lifandi frumur með heilar frumuhimnur en frumur með skemmdar frumuhimnur eða dauðar
eru gegndræpar fyrir PI og litast. Út frá þessum upplýsingum var hægt að meta hvort frumur væru
lifandi eða dauðar. Ef frumur voru Annexin V FITC neikvæðar og PI neikvæðar voru þær metnar
lifandi, frumur á frumstigum stýrðs frumudauða voru Annexin V FITC jákvæðar en PI neikvæðar og
frumur sem voru langt komnar í stýrðum frumudauða eða dauðar lituðust Annexin V FITC jákvæðar og
PI jákvæðar (BD Biosciences, 2008).
Frumur voru teknar úr rækt, sýnin sett í glös og spunnin niður í skilvindu. Ætið var svo tekið ofan af
og 1 mL DPBS var bætt út á frumurnar og vortexað. 100μL af frumulausninni voru sett í tvö ný glös þar
sem í annað glasið fór 5 μL af Annexin V FITC og 5 μL af PI, í hinu glasinu voru ólitaðar frumur. Þessi
blanda var vortexuð og látin standa við stofuhita í myrkri í 15 mínútur. Að 15 mínútunum loknum var
400 μL af þynntum Binding Buffer bætt út í öll glösin. Mæling sýnanna var gerð innan klukkutíma í
frumuflæðisjá. Túlkun niðurstaðna úr frumuflæðisjá má sjá á mynd 8.
Mynd 8 Túlkun niðurstaðna úr mælingum á stýrðum frumudauða.
Niðurstöður mælinga úr frumuflæðisjánni voru settar upp í depilgraf. Hlið var sett á frumurnar í ólitaða sýninu (mynd lengst til vinstri) því þær frumur eru neikvæðar fyrir litunum og þjóna hlutverki sem viðmiðunarsýni. Sama hliðið var límt á depilgrafið af lituðu frumunum (miðju mynd). Að þessu loknu er hægt að túlka frumurnar sem lifandi lendi þær í neðra horninu vinstra megin, í stýrðum frumudauða lendi þær í neðra horninu hægra megin (Annexin V FITC jákvæðar og PI neikvæðar) og dauðar lendi þær í efra horninu hægra megin (Annexin V FITC jákvæðar og PI jákvæðar). Taflan hægra megin við myndirnar sýnir hversu mörg prósent fruma lenda í hverju horni.
34
3.8 Frumuskrið
Einkjarna frumur sem var búið að
einangra (kafli 3.1) og frysta (kafli
3.4), voru þýddar og settar í ræktun
án lyfja (kafli 3.3) í 24 til 48
klukkustundir. Að forræktun lokinni
voru frumurnar taldar (kafli 3.1) og
þynntar þannig að 5 x 105 frumur
væru í 100 µL RPMI æti með 10%
FBS en það er frumuþéttnin sem
fór í efri brunn frumuskriðsbakkans
sem einnig er kallað insert (BD Falcon™, Bandaríkin). Botninn á efri brunninum er polyethylene
terephthalate (PET) himna með 8,0 µm holum sem frumur geta tengst efnatoga úr neðri brunni og
skriðið í gegnum. Frumuskriðsprófið var þannig sett upp að í efri brunninn fór 100 µL af
frumublöndunni ýmist með eða án efnatoghemilsins Plerixafor í styrkjunum 1 µmól og hinsvegar 10
µmól. Í neðri brunn frumuskriðsbakkans (BD Falcon™, Bandaríkin) fóru 600 µL RPMI æti með 10%
FBS og 100 ng af efnatoganum SDF-1α (CXCL12) (Stemcell technologies, Kanada). Á mynd 9 sést
hvernig insertið lýtur út eitt og sér en líka hvernig það er þegar það er komið ofan í neðri brunn
frumuræktunarbakkans. Frumuskriðsprófið var sett upp í tvöföldu fyrir hvern sjúkling. Frumurnar voru
settar í hitaskáp við 37°C og 5% CO2 en lesið var af eftir 3 klukkustundir og 24 klukkustundir. Til að
skoða niðurstöður frumuskriðsins var neðri brunnurinn tæmdur, settur í glas og spunnið niður í 10
mínútur á 1100 rpm. Tekið var ofan af sýninu og 1 mL DPBS sem innihélt CaCl2 og MgCL2 bætt við.
Þessi lausn var notuð til talningar á frumum sem höfðu skriðið, eins og sagt var frá í kafla 3.1.
Viðmiðunarsýni voru af tveimur gerðum, jákvætt og neikvætt viðmiðunarsýni. Jákvæða
viðmiðunarsýnið samanstóð af 100 µL frumublöndu og 500 µL æti sem sett var beint í neðri brunninn
en það líkir eftir 100% frumuskirði. Neikvæða viðmiðunarsýnið samanstóð af 100 µL frumublöndu í efri
brunni og 600 µL æti í neðri brunni án efnatoga.
3.9 Kólóníuræktanir
Einkjarna frumur voru einangraðar og taldar eins og greint var frá í kafla 3.1. Því næst var sett ákveðið
magn af Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) (Stemcell technologies) æti sem inniheldur 2%
FBS, á frumurnar og blandað vel til að fá rétta þynningu eða 1 x 105 frumur á 100 μL. Af þessari
frumulausn voru teknir 200 μL og sett í 2 mL af methylcellulose æti, lausnin blönduð og látin bíða í 5
mínútur. Ræktað var með methylcellulose ætinu MethoCult™ H4434 Classic (Stemcell technologies)
sem inniheldur vaxtarþættina erythropoietin (EPO), sem örvar rauðkorna kóloníur, og einnig CFU-GM,
IL-3 og Stem cell factor sem örva hvítkorna kólóníur. Að loknu 5 mínúta biðskrefinu var 1,1 mL af
frumu-methylcellulosa blöndunni sett á tvær 35 mm petriskálar og í þriðju skálina var sett 3 mL af
sterílu vatni. Lok var sett á skálarnar með ætinu en vatnsskálin var opin. Skálunum þremur var komið
fyrir í einni 100 mm petriskál og var henni einnig lokað. Frumurnar voru ræktaðar í 14 daga við 37°C
og 5% CO2.
Mynd 9 Uppsetning frumuskriðsbrunna.
(Mynd byggð á (BD Falcon, e. d.))
35
Eftir 14 daga í ræktun voru kólóníuræktanirnar skoðaðar í 40x stækkun í ljóssmásjá. Talinn var
hver frumuræktunardiskur á sérstökum talningardiski. Taldar voru allar kólóníur og þeim var skipt upp í
tvo flokka: rauðkorna kólóníur BFU-E en það eru fleiri en 200 rauðkornablastar, hvítkorna kóloníur
CFU-GM (40 og fleiri blastar).
3.10 Leyfi
Leyfi fyrir rannsókninni voru fengin frá siðanefnd Landspítalans sem fékk númerið 36/2013,
framkvæmdarstjóra lækninga, yfirlækni blóðlækningadeildar og yfirlækni rannsóknarkjarna í
blóðmeinafræði. Tilkynning var send til Persónuverndar og fékk hún númerið S6388/2013.
3.11 Úrvinnsla gagna
Stuðst var við lýsandi tölfræði við samanburð á ræktunarniðurstöðum og marktækni var reiknuð út
með pöruðu T prófi og Wilcoxon prófi en í báðum prófunum var P gildi minni en 0,05 talið marktækt.
Lýsandi tölfræði, myndir og töflur voru unnar í Microsoft Excel 2010 en marktækniprófin voru reiknuð í
IBM SPSS Statistics 21. Niðurstöður mælinga úr frumuflæðisjá voru unnar í BD Cell Quest Pro version
6,0 sem er frá sama framleiðanda og frumuflæðisjáin, BD Bioscience (San Jose, California,
Bandaríkin).
36
4 Niðurstöður
4.1 Lyfjanæmispróf
Rannsóknin hófst á lyfjanæmisprófi og var lyfjanæmi athugað á alls sjö sjúklingum en mismunandi
fjöldi er á bakvið hvert lyf eða frá einum sjúklingi og upp í fimm. Í lyfjanæmisprófinu voru einkjarna
frumur ræktaðar með krabbameinslyfjunum Cytarabine, Idarubicin, Fludarabine og Azacytidine í
mismunandi styrkleikum en markmiðið var að finna hentugan styrkleika lyfsins án þess að drepa allar
frumur. Lifun fruma og stýrður frumudauði var metinn með flúorlitunum Annexin V FITC og PI. Leitast
var eftir að hafa lifandi frumur um 50% til þess að hægt væri að meta áhrif Plerixafor á frumudauða.
Niðurstöður lyfjanæmisprófsins má sjá á myndum 10, 11, 12 og 13.
Mynd 10 Lyfjanæmispróf á Cytarabine.
Myndin sýnir lifun og frumudauða eftir 72 klukkustundir og 1 viku í ræktun. Út frá þessum niðurstöðum var styrkleiki Cytarabine í rannsókninni ákveðinn, 200 ng. Myndin sýnir meðaltal og staðalskekkju en á bakvið lyfjanæmispróf án lyfja eru fimm sjúklingar en á bakvið Cytarabine lyfjanæmi eru 4 sjúklingar.
37
Mynd 11 Lyfjanæmispróf á Idarubicin.
Myndin sýnir lifun og frumudauða eftir 72 klukkustundir og 1 viku í ræktun. Út frá þessum niðurstöðum var styrkleiki Idarubicin í rannsókninni ákveðinn, 50 ng. Myndin sýnir meðaltal og staðalskekkju en á bakvið lyfjanæmispróf án lyfja eru fimm sjúklingar en á bakvið Idarubicin lyfjanæmi er aðeins einn sjúklingur.
Mynd 12 Lyfjanæmispróf á Fludarabine.
Myndin sýnir lifun og frumudauða eftir 72 klukkustundir og 1 viku í ræktun. Út frá þessum niðurstöðum var styrkleiki Fludarabine í rannsókninni ákveðinn, 20 µM. Myndin sýnir meðaltal og staðalskekkju en á bakvið lyfjanæmispróf án lyfja eru fimm sjúklingar en á bakvið Fludarabine lyfjanæmi er aðeins einn sjúklingur.
38
4.2 Áhrif Plerixafor á lifun og stýrðan frumudauða
Einkjarna frumur ellefu hvítblæðissjúklinga voru einangraðar með þéttnistigulsaðferð. Frumurnar voru
ræktaðar við mismunandi skilyrði þ.e. án lyfja, með Plerixafor eingöngu, með krabbameinslyfjum
eingöngu og með bæði krabbameinslyfjum og Plerixafor. Stýrður frumudauði var metinn fyrir ræktun,
eftir 72 klukkustundir í ræktun og eftir 1 viku í ræktun með því að lita frumur með Annexin V FITC og
PI og mælt í frumuflæðisjá. Niðurstöðurnar má sjá á mynd 14.
Mynd 13 Lyfjanæmispróf á Azacytidine.
Myndin sýnir lifun og frumudauða eftir 72 klukkustundir og 1 viku í ræktun. Út frá þessum niðurstöðum var styrkleiki Azacytidine í rannsókninni ákveðinn, 20 µM. Á bakvið lyfjanæmispróf án lyfja eru fimm sjúklingar. Á bakvið 10 µM Azacytidine í 72 klukkustundir eru 5 sjúklingar en eftir 1 viku þrír sjúklingar. Á bakvið 20 og 50 µM Azacytidine eru tveir sjúklingar. Myndin sýnir meðaltal og staðalskekkju.
39
Mynd 14 Mat á lifun og stýrðum frumudauða AML fruma.
Myndin sýnir niðurstöður ræktunnar hjá 11 hvítblæðissjúklingum á frumudauða, lifun og stýrðum frumudauða á þremur tímapunktum (fyrir ræktun, eftir 72 klukkustundir og 1 viku) við ræktun án lyfja, með Plerixafor og með krabbameinslyfjunum fjórum með/án Plerixafor. Myndin sýnir meðaltal og staðalvillu.
40
Marktækt færri lifandi frumur voru í ræktun eftir 72 klst með Cytarabine +/- Plerixafor, Idarubicin +/-
Plerixafor og Fludarabine +/- Plerixafor borið saman við ræktun án lyfja sbr töflu 3. Ekki náðist þó
marktækur munur á fjölda lifandi fruma í ræktun með Azacytidine og Plerixafor eftir 72 klst borið
saman við ræktun án lyfja (P= 0,051). Í öllum samsetningum krabbameinslyfja +/- Plerixafor var
marktæk aukning á dauðum frumum eftir 72 klst í ræktun miðað við ræktun án lyfja en hins vegar var
eingöngu marktæk aukning á stýrðum frumudauða í ræktun með Cytarabine +/- Plerixafor, Idarubicin
og Fludarabine (tafla 3).
Tafla 3 Marktækni milli ræktunnar án lyfja og ræktunnar með lyfjum eftir 72 klst.
Taflan sýnir P gildi sem var reiknað með T prófi og Wilcoxon prófi. Marktækur munur er ef P er ≤ 0,05 og er táknaður með rauðu letri í töflunni. Niðurstöður sem eru P ≤ 0,1 eru táknuð með fjólubláau letri.
Marktækni án lyfja vs:
T próf Wilcoxon T próf Wilcoxon T próf Wilcoxon
Plerixafor 0,085 0,11 0,541 0,859 0,196 0,062
Cytarabine 0,016 0,004 0,021 0,026 0,018 0,004
Cytarabine+Plerixafor 0,012 0,016 0,027 0,033 0,013 0,013
Idarubicin 0,02 0,016 0,027 0,033 0,042 0,033
Idarubicin+Plerixafor 0,009 0,008 0,219 0,155 0,013 0,021
Fludarabine 0,011 0,003 0,028 0,033 0,009 0,016
Fludarabine+Plerixafor 0,005 0,013 0,644 0,286 0,027 0,021
Azacytidine 0,141 0,066 0,998 0,173 0,045 0,011
Azacytidine+Plerixafor 0,08 0,051 0,619 0,515 0,038 0,028
Lifandi Stýrður frumudauði Dauðar
Mynd 15 sýnir súlurit fyrir lifandi frumur eftir 72 klukkustundir eingöngu og ber saman mismunandi
krabbameinslyf og krabbameinslyf ásamt Plerixafor. Á mynd 16 er stýrður frumudauði af völdum
lyfjanna borinn saman eftir 72 klukkustundir og á mynd 17 er frumudauði af völdum lyfjanna borinn
saman eftir 72 klukkustundir.
41
Með því að bera saman niðurstöður lyfja með og án Plerixafor á mynd 15 sést að að færri frumur
eru á lífi með með viðbættu Plerixafor við ræktun með Idarubicin og Azacytidine en ekki við önnur
ræktunarskilyrði.
Mynd 15 Samanburður á lifun fruma eftir 72 klukkustunda ræktun.
Myndin sýnir hlutfall lifandi fruma eftir 72 klukkustunda ræktun (meðaltal 11 sjúklinga) án lyfja, með Plerixafor, krabbameinslyfjum og krabbameinslyfjum ásamt Plerixafor.
Mynd 16 Samanburður á stýrðum frumudauða eftir 72 klukkustunda ræktun.
Myndin sýnir hlutfall fruma í stýrðum frumudauða eftir 72 klukkustunda ræktun (meðaltal 11 sjúklinga) án lyfja, með Plerixafor, með krabbameinslyfjum og krabbameinslyfjum ásamt Plerixafor.
42
Mynd 16 sýnir að færri frumur eru í stýrðum frumudauða eftir ræktun með krabbameinslyfjum og
Plerixafor heldur en við ræktun eingöngu með krabbameinslyfjum.
Með því að bera saman niðurstöður á mynd 17 sést að fleiri frumur eru dauðar eftir ræktun með
krabbameinslyfjum og Plerixafor en hjá frumum ræktuðum eingöngu með krabbameinslyfjum.
Tafla 4 Marktækni milli lyfja með og án Plerixafor.
Taflan sýnir P gildi sem voru reiknuð með T prófi og Wilcoxon prófi. Marktækur munur er ef P er ≤ 0,05 og er táknaður með rauðu letri í töflunni. Niðurstöður sem eru ≤ 0,1 eru táknuð með fjólubláau letri.
Marktækni á milli:
T próf Wilcoxon T próf Wilcoxon T próf Wilcoxon
Cytarabine / Cytarabine+Plerixafor 0,436 0,534 0,249 0,374 0,483 0,423
Idarubicin / Idarubicin+Plerixafor 0,086 0,131 0,44 0,79 0,188 0,155
Fludarabine / Fludarabine+Plerixafor 0,172 0,328 0,068 0,091 0,404 0,549
Azacytidine / Azacytidine+Plerixafor 0,038 0,075 0,558 0,767 0,197 0,066
DauðarLifandi Stýrður frumudauði
Marktækur munur á lifun AML fruma ræktuðum með krabbameinslyfum með eða án Plerixafor
(tafla 4) fékkst aðeins í einu tilfelli en það var á milli Azacytidine og Azacytidine með Plerixafor. P gildið
er ekki langt frá marktæknimörkum í T prófi á lifun milli Idarubicine og Idarubicine með Plerixafor.
Mynd 17 Dauðar frumur eftir 72 klukkustunda ræktun.
Myndin sýnir hlutfall dauðra fruma eftir 72 klukkustunda ræktun (meðaltal 11 sjúklinga) án lyfja, með Plerixafor, með krabbameinslyfjum og krabbameinslyfjum ásamt Plerixafor.
43
Sömu sögu er að segja með bæði T próf og Wilcoxon próf á stýrðum frumudauða milli Fludarabine og
Fludarabine með Plerixafor.
Marktækni var ekki reiknuð á niðurstöðum ræktana eftir 1 viku þar sem þær niðurstöður byggja
aðeins á þremur sjúklingum. Á mynd 18 sést munur á lifun á milli ræktana með krabbameinslyfi og
ræktana með krabbameinslyfi og Plerixafor, þar sem færri frumur eru lifandi með viðbættu Plerixafor
nema með Fludarabine.
Mynd 18 Lifandi frumur eftir 1 viku í ræktun.
Myndin sýnir hlutfall lifandi fruma eftir ræktun í 1 viku (meðaltal 3 sjúklinga) án lyfja, með Plerixafor, með krabbameinslyfjum og krabbameinslyfjum ásamt Plerixafor.
44
Á mynd 19 sést að stýrður frumudauði er aukinn í ræktunum með krabbameinslyfi og Plerixafor
miðað við frumur ræktaðar með krabbameinslyfi eingöngu, nema með Fludarabine.
Mynd 19 Stýrður frumudauði eftir 1 viku í ræktun.
Myndin sýnir hlutfall fruma í stýrðum frumudauða eftir ræktun í 1 viku (meðaltal 3 sjúklinga) án lyfja, með Plerixafor, með krabbameinslyfjum og krabbameinslyfjum ásamt Plerixafor.
Mynd 20 Dauðar frumur eftir 1 viku í ræktun.
Myndin sýnir hlutfall dauðra fruma eftir ræktun í 1 viku (meðaltal 3 sjúklinga) án lyfja, með Plerixafor, með krabbameinslyfjum og krabbameinslyfjum ásamt Plerixafor.
45
Á mynd 20 sést að fleiri frumur eru dauðar eftir ræktun með krabbameinslyfi og Plerixafor heldur en
hjá frumum ræktuðum með krabbameinslyfi einu og sér.
4.3 Áhrif Plerixafor á frumuskrið AML fruma í átt að CXCL12
Frumuskriðstilraun var gerð á einkjarna frumum níu AML sjúklinga við þrjár aðstæður, það er án lyfja,
með 1 µM Plerixafor og með 10 µM Plerixafor. Frumur sem höfðu skriðið voru taldar á tveimur
tímapunktum, eftir þrjár klukkustundir og 24 klukkustundir. Niðurstöðurnar má sjá í töflu 5 og á mynd
21 má sjá niðurstöður fyrir sjúkling 6, en á þeirri mynd sjást áhrif Plerixafor á frumuskrið að CXCL12.
Tafla 5 Plerixafor hindrar frumuskrið í átt að CXCL12.
Taflan sýnir meðaltal talinna fruma úr frumuskriðsprófi án lyfja, með 1 µM Plerixafor og með 10 µM Plerixafor eftir þrjár klukkustundir og eftir 24 klukkustundir. Taflan sýnir meðaltal, staðalfrávik og staðalvillu.
Sjúklingur 3 klst 24 klst 3 klst 24 klst 3 klst 24 klst
1 10000 x 10000 x x x
2 80000 85000 30000 20000 25000 30000
3 0 0 0 0 x x
4 45000 10000 5000 5000 0 0
6 150000 280000 20000 40000 0 50000
7 30000 20000 0 0 x x
9 195000 115000 110000 70000 45000 5000
10 70000 5000 5000 10000 0 0
11 0 x 0 x x x
Meðaltal 64444 73571 20000 20714 14000 17000
Staðalfrávik 68440 101231 35267 25889 20433 22249
Staðalvilla 22813 38262 11756 9785 9138 9950
Án Plerixafor 1 µM Plerixafor 10 µM Plerixafor
Gert var parað T próf og Wilcoxon próf til að meta marktækan mun milli aðstæðna. Marktækur
munur fékkst við allar aðstæður miðað við frumuskrið án Plerixafor eftir 3 klukkustundir. Marktækur
munur fékkst á frumuskriði eftir 3 klukkustundir með 1 µM Plerixafor og 10 µM Plerixafor. Marktækni
frumuskriðsprófs má sjá í töflu 6.
46
Tafla 6 Marktækni frumuskriðsprófs.
Taflan sýnir P gildi sem voru reiknuð með T prófi og Wilcoxon prófi. Marktækur munur er ef P er ≤ 0,05 og er táknaður með rauðu letri í töflunni. Niðurstöður sem eru ≤ 0,1 eru táknuð með fjólubláu letri.
T próf Wilcoxon T próf Wilcoxon T próf Wilcoxon T próf Wilcoxon T próf Wilcoxon
Án Pler 3 klst
1 µM Pler 3 klst 0,017 0,028
10 µM Pler 3 klst 0,015 0,042 0,16 0,039
Án Pler 24 klst 0,773 0,463 0,219 0,042 0,167 0,043
1 µM Pler 24 klst 0,011 0,027 0,626 0,715 0,131 0,104 0,156 0,058
10 µM Pler 24 klst 0,027 0,043 0,5 0,461 0,844 0,593 0,12 0,043 0,435 0,68
Án Pler 24 klst 1 µM Pler 24 klstÁn Pler 3 klst 1 µM Pler 3 klst 10 µM Pler 3 klst
Mynd 21 Frumuskrið sjúklings 6.
Myndin sýnir niðurstöður frumuskriðs hjá sjúklingi 6 þar sem áhrif Plerixafor koma skýrt fram.
47
4.4 Niðurstöður kólóníuræktunar
Kólóníuræktun var gerð á einkjarna frumum átta hvítblæðissjúklinga og frumulínunni KG-1a.
Kólóníuræktunin var gerð á tveimur skálum við þrjár aðstæður, án lyfja, með 1 µM Plerixafor og 5 µM
Plerixafor. Vöxtur kólónía var skoðaður í smásjá eftir 14 daga í ræktun, þá voru kóloníur taldar og
flokkaðar í tvo hópa, BFU-E og CFU-GM. Niðurstöður kólóníuræktunar sjúklinga má sjá í töflu 7 og
niðurstöður KG-1a í töflu 8.
Tafla 7 Kólóníuræktun.
Taflan sýnir meðaltal talinna kólónía úr rækt án lyfja, með 1 µM Plerixafor og 5 µM Plerixafor. Niðurstöðunum er skipt upp í rauðkorna kólóníur (BFU-E) og hvítkorna kólóníur (CFU-GM). Myndin sýnir meðaltal, staðalfrávik og staðalskekkju.
Sjúklingur
BFU-E CFU-GM BFU-E CFU-GM BFU-E CFU-GM
3 30 23 0 6 0 2,5
4 5 4,5 0 0 0 0
6 0 94 0 0,5 0 0
7 1 7 0 1 0 0
8 6,5 7 0,5 1 0 0
9 2 151 0 4,5 0 0
10 22,5 9,5 0 12 0 0,5
11 5,5 29,5 0 1 0 0,5
Meðaltal 9,06 40,69 0,06 3,25 0,00 0,44
Staðalfrávik 11,03 53,45 0,18 4,12 0,00 0,86
Staðalvilla 3,90 18,90 0,06 1,46 0,00 0,31
Án lyfja 1 µM Plerixafor 5 µM Plerixafor
Marktækni var reiknuð með Wilcoxon prófi og fékkst marktækur munur á BFU-E kólóníum
ræktuðum án lyfja og BFU-E kólóníum ræktuðum með 1 µM Plerixafor (P = 0,018) og BFU-E kólóníum
ræktuðum án lyfja og með 5 µM Plerixafor (P = 0,018).
Marktækur munur fékkst á CFU-GM kólóníum ræktuðum án lyfja og CFU-GM kólóníum ræktuðum
með 1 µM Plerixafor (P = 0,017) og CFU-GM kólóníum ræktuðum án lyfja og með 5 µM Plerixafor (P =
0,012).
Marktækur munur fékkst einnig á CFU-GM kólóníum ræktuðum með 1 µM Plerixafor og CFU-GM
kólóníum ræktuðum með 5 µM Plerixafor (P = 0,018).
Tafla 8 Kólóníuræktun frumulínunnar KG-1a.
Taflan sýnir meðaltal talinna kólónía úr rækt án lyfja, með 1 µM Plerixafor og 5 µM Plerixafor. Niðurstöðunum er skipt upp í rauðkorna kólóníur (BFU-E) og hvítkorna kólóníur (CFU-GM).
Frumulína
BFU-E CFU-GM BFU-E CFU-GM BFU-E CFU-GM
KG-1a >200 1 53,5 0 0 0
Án lyfja 1 µM Plerixafor 5 µM Plerixafor
48
4.5 Tjáning AML fruma
Einkjarna frumur sem voru einangraðar úr blóði þátttakanda voru litaðar með flúormerktum mótefnum
gegn yfirborðssameindum sem eru einkennandi fyrir AML frumur. Tjáning sameindanna var mæld í
frumuflæðisjá. Niðurstöðurnar voru túlkaðar og má sjá niðurstöður tveggja sjúklinga í töflu 9 en hina
níu sjúklingana má sjá í viðauka 1. Þegar tjáning breytist frá upphafspunkti ræktunar (0 punkti) er
tjáningin táknuð með rauðu letri.
Tafla 9 Tjáning á yfirborðssameindum AML fruma við mismunandi ræktunaraðstæður.
Taflan sýnir tjáningu yfirborðssameinda sem eru einkennandi fyrir AML frumur. 0 p táknar tjáningu fyrir ræktun og ÷ stendur fyrir ræktun án lyfja. Niðurstöðurnar eru táknaðar sem pos sé tjáning til staðar en neg sé engin tjáning. Ef breyting er á tjáningunni frá 0 punkti er hún táknuð með rauðu letri.
0 p ÷ Pler Cyta Cyt+Ple Ida Ida+Ple Fluda Fluda+Ple
CD 117 pos pos pos pos pos neg neg pos pos
CD 34 pos pos pos pos pos neg pos pos neg
CD 184 pos pos neg pos neg neg neg pos neg
CD 14 neg pos neg pos neg neg neg neg neg
CD 33 pos pos pos pos pos pos pos pos pos
CD 13 pos pos pos pos pos pos pos pos pos
CD 133 pos pos neg neg neg neg neg neg neg
CD 11b pos pos pos pos pos neg neg pos pos
CD 11c pos pos pos pos pos neg neg pos pos
0 p ÷ Pler Cyta Cyt+Ple Ida Ida+Ple Fluda Fluda+Ple
CD 117 pos pos pos pos pos pos pos pos pos
CD 34 pos pos pos pos pos pos pos pos pos
CD 184 neg neg neg neg neg neg neg neg neg
CD 14 pos neg neg neg neg neg neg neg neg
CD 33 pos pos pos pos pos pos pos pos pos
CD 13 pos pos pos pos pos pos pos pos pos
CD 133 pos pos pos pos pos neg neg pos pos
CD 11b pos pos pos pos pos pos neg pos pos
CD 11c pos neg neg neg neg neg neg neg neg
Sjúklingur 4
Sjúklingur 5
Í töflu 9 sjást breytingar á tjáningu fruma frá upphafspunkti (táknað með rauðu letri) en allar
breytingarnar eru frá því að frumur tjá sameindir yfir í enga tjáningu. Tjáning á CD184 helst í hendur
við ræktun með og án Plerixafor. Sameindirnar CD11b og CD11c benda til aukinnar útþroskunar
fruma séu þær jákvæðar en í töflunni sést ekki breyting á CD11b og CD11c úr neikvæðu í jákvæða
tjáningu.
49
5 Umræða
Mikil þörf er á bættum meðferðarúrræðum í bráða mergfrumuhvítblæði. Erfitt hefur verið að finna hina
eina réttu meðferð þar sem meingerð sjúkdómsins er svo flókin, en þá er nauðsynlegt að kafa niður í
hinar minnstu sameindir fruma í leit að lækningu. Í þessari rannsókn var einblínt á viðtakann CXCR4
þar sem samspil hans við hefðbundin krabbameinslyf með og án efnatoghemilsins Plerixafor var
skoðað. Til að meta þessi áhrif voru settar upp tvenns konar frumuræktanir, annarsvegar hefðbundin
rækt með RPMI æti þar sem lifun og tjáning fruma með og án lyfja var metin og hinsvegar kólóníurækt
þar sem útþroskun fruma var metin með þeim fjölda kólónía sem frumurnar gátu myndað. Einnig var
sett upp frumuskriðspróf til að meta virkni Plerixafor til að hindra frumuskrið í átt að CXCL12.
Rannsóknin staðfestir niðurstöður forrannsóknarinnar (Björnsdóttir, 2013), að
frumuræktunarmódelið sem var hannað í forrannsókninni virkar til að skoða lyfjanæmi AML fruma við
krabbameinslyfjum og efnatoghemlinum Plerixafor. Plerixafor sýnir tilhneigingu til að auka frumudauða
þrátt fyrir að marktækur munur fáist aðeins á lifun milli Azacytidine og Azacytidine með Plerixafor. Áhrif
Plerixafor á frumudauða fara hinsvegar ekki á milli mála í kólóníuræktunum og fæst marktækur munur
á milli kólónía ræktuðum með eða án Plerixafor. Sýnt er fram á hæfni Plerixafor til að hindra
frumuskrið í átt að CXCL12. Ekki er sýnt fram á að Plerixafor auki útþroskun fruma í kólóníuræktun né
með breytingum á tjáningu yfirborðssameinda.
5.1 Lyfjanæmispróf
Rannsóknin hófst á lyfjanæmisprófum þar sem áhrif mismunandi styrkleika krabbameinslyfja á AML
frumur voru rannsökuð. Áhrifin voru rannsökuð á einkjarna frumum AML sjúklinga sem voru
einangraðar úr blóði eða beinmerg og ræktaðar með mismunandi styrkjum krabbameinslyfja en miðað
var við að finna hentugan styrk sem myndi gefa lifun upp á 50%. Með því að halda 50% fruma lifandi
var hægt að meta áhrif Plerixafor á frumudauða.
Niðurstöður lyfjanæmisprófs á Cytarabine á mynd 10 sýnir að 200 ng Cytarabine gefur lifun upp á
55% og samsvarar því sem hentugur styrkur til að meta frumudauða að viðbættu Plerixafor og var því
valinn. Niðurstöður á lyfjanæmisprófi á Idarubicin á mynd 11 sýnir að 50 ng Idarubicin gefur 52% lifun
og var því valinn sem hentugur styrkur. Þrátt fyrir að Idarubicin hafi aðeins verið prófað á einum
sjúkling byggðist mat á styrkleika Idarubicin einnig á niðurstöðum forrannsóknarinnar (Björnsdóttir,
2013). Niðurstöður á lyfjanæmisprófi á Fludarabine á mynd 12 sýnir að 20 µM Fludarabine gefur 53%
lifun og var því valinn hentugur styrkur. Aðeins einn sjúklingur stendur á bakvið styrkleikann 20 µM
Fludarabine en búið var að rannsaka lægri styrki á tveimur sjúklingum þar á meðal 10 µM sem gaf
lifun upp á 57% sem benti til þess að 20 µM væri líklegur styrkur. Fludarabine er frábrugðið hinum
krabbameinslyfjunum í rannsókninni að því leiti að það er langvirkara og halda drápsáhrif þess áfram
eftir 1 viku í ræktun á meðan helmingunartími hinna lyfjana er það stuttur að þau eru hætt að drepa
frumurnar og þær frumur sem lifðu af byrja að fjölga sér. Niðurstöður á lyfjanæmisprófi á Azacytidine á
mynd 13 sýnir að niðurstöður eru ófullnægjandi þar sem valið var að nota 20 µM styrk sem gefur rúma
70% lifun en það er ekki marktækur munur á þeim styrkleika við ræktun án lyfja. Næsti styrkleiki sem
var prófaður á Azacytidine er 50 µM sem gefur 45% lifun sem er heldur lág en að því sögðu hefði
50
hentugur styrkur af Azacytidine sem gefur um 50% lifun verið á milli 20 og 50 µM. Ástæðan fyrir því að
ekki náðist að gera Azacytidine lyfjanæmi var að skortur varð á lyfinu í langan tíma og þegar það
fékkst aftur var orðin of skammur tími til að setja upp fleiri lyfjanæmi og 20 µM talinn hentugur styrkur.
Niðurstöður lyfjanæmisprófsins staðfesta þær vísbendingar sem fengust í forrannsókninni að hægt
væri að skoða virkni krabbameinslyfja á þennan hátt. Rannsóknir hafa áður verið gerðar á lyfjanæmi
Cytarabine, Idarubicin og Azacytidine þegar lyfin voru ný á markaði en frumuræktunum hefur farið
fram síðan þá þannig að möguleiki væri á að endurskoða þessar rannsóknir með bættum aðferðum
(Curtis o.fl., 1995; Nara o.fl., 1986; Wang o.fl., 1987). Lyfjanæmispróf með MTT aðferð hefur verið
gerð á Fludarabine á AML frumum úr börnum og gaf góða raun (Hubeek o.fl., 2006).
5.2 Áhrif Plerixafor á lifun og stýrðan frumudauða hvítblæðisfruma
Frumuræktunarmódelið var sett upp á AML frumum ellefu sjúklinga eftir að hentugir styrkleikar úr
lyfjanæmisprófi lágu fyrir með því markmiði að meta áhrif Plerixafor á lifun og stýrðan frumudauða.
Niðurstöðurnar í töflum og myndum er að finna í kafla 4.2.
Ræktað var án lyfja til að meta breytingu á lifun fruma vegna breyttra aðstæðna en AML frumur eru
mjög viðkvæmar fyrir ræktun, hjá sjúklingum 4, 7 og 10 voru til að mynda innan við 10% fruma lifandi
eftir 72 klukkustunda ræktun án lyfja. Þessir sjúklingar voru engu að síður hafðir með í útreikningum
þar sem áhrif lyfja sáust í flestum tilfellum.
Ræktað var með Plerixafor til að meta áhrif þess á lifun og stýrðan frumudauða án
krabbameinslyfja í rækt en ekki fékkst þó marktækur munur milli ræktunnar með Plerixafor og
ræktunnar án lyfja. Ræktað var með lágmarksstyrkleika Plerixafor, 1 µmól, en það hefði þurft að rækta
frumur með Plerixafor í hærri styrkleika til að athuga hvort marktækur munur myndi fást þar sem P
gildið er ekki langt frá því að vera marktækt með pöruðu T prófi eða 0,085.
Ræktað var með krabbameinslyfi annarsvegar og hinsvegar með bæði krabbameinslyfi og
Plerixafor til að meta muninn á lifun og stýrðum frumudauða. Marktækur munur milli þessara
aðstæðna fékkst aðeins á milli Azacytidine með og án Plerixafor með T prófi (P = 0,038). P gildið er
ekki langt frá marktæknimörkum í T prófi á lifun milli Idarubicine og Idarubicine með Plerixafor. Sömu
sögu er að segja með bæði T próf og Wilcoxon próf á stýrðum frumudauða milli Fludarabine og
Fludarabine með Plerixafor. Þessar niðurstöður er að finna í töflu 4. Þar sem P gildið er ekki langt frá
marktækni í sumum tilfellum bendir aftur til þess að rækta hefði mátt með hærri styrkleika Plerixafor en
það sem spilar stærsta hlutverkið í þessum útreikningum er lítill fjöldi sjúklinga. Fjöldi sjúklinga sem
settir voru upp í frumuræktunarmódelið voru ellefu á átta mánaða tímabili en það verður að teljast gott
miðað við lága tíðni sjúkdómsins. Í tölfræðilegum útreikningum fást vissulega sterkari niðurstöður sé
fjöldinn meiri. Athygli skal vakin á því að krabbameinslyf með Plerixafor jók frumudauða líka hjá
sjúklingum sem tjáðu ekki CXCR4.
Frumur þriggja einstaklinga voru ræktaðar í frumuræktunarmódelinu í eina viku og má sjá
niðurstöður á myndum 18, 19 og 20. Marktækni var ekki reiknuð vegna lítils fjölda þáttakanda en ef
súlur eru bornar saman má sjá á mynd 18 mun á lifun á milli ræktana með krabbameinslyfi og ræktana
með krabbameinslyfi og Plerixafor, þar sem færri frumur eru lifandi með viðbættu Plerixafor nema hjá
Fludarabine. Á mynd 19 sést munur á stýrðum frumudauða á milli ræktana með krabbameinslyfi og
ræktana með krabbameinslyfi og Plerixafor, þar sem fleiri frumur eru í stýrðum frumudauða með
51
viðbættu Plerixafor nema hjá Fludarabine. Munur á dauðum frumum á milli ræktana með
krabbameinslyfjum og ræktana með krabbameinslyfi og Plerixafor má sjá á mynd 20 en þar eru fleiri
frumur dauðar með viðbættu Plerixafor. Þessar niðurstöður benda til þess að Plerixafor hafi
langverkandi áhrif.
Samanburður á tímapunktum ræktanna á mynd 14 sýnir að í öllum tilfellum nema hjá frumum
ræktuðum með Fludarabine með og án Plerixafor eru fleiri frumur lifandi eftir ræktun í eina viku miðað
við frumur ræktaðar í 72 klukkustundir. Þetta stafar af helmingunartíma krabbameinslyfjanna en fyrir
Azacytidine er hann 3,5 – 4,2 klukkustundir, fyrir Cytarabine er helmingunartími upphafsfasa 10 – 15
mínútur og hægari loka fasi er 2,5 – 3 klukkustundir, fyrir Idarubicin er helmingunartíminn 18
klukkustundir og helmingunartími afleiðu Idarubicin sem nefnist Idarybicinol er 50 klukkustundir,
helmingunartími fyrri fasa Fludarabine er 0,6 klukkustundir og seinni fasa 9,3 klukkustundir.
Prófað var að setja frumur tveggja AML sjúklinga upp í ræktun með Plerixafor í 72 klukkustundir en
að þeim loknum var krabbameinslyfum bætt út í og ræktað í á aðrar 72 klukkustundir (samtals sex
sólarhringar). Lifun og stýrður frumudauði var metinn eftir ræktunina með Annexin V FITC og PI.
Niðurstöðurnar leiddu í ljós að þegar Cytarabine var bætt út í ræktun með Plerixafor jókst frumudauði
miðað við frumuræktun með Cytarabine þar sem Plerixafor var sett út í á sama tíma (niðurstöður ekki
sýndar). Önnur krabameinslyf sýndu ekki fram á mun milli ræktanna.
Rannsóknin gefur ákveðnar vísbendingar um að Plerixafor geti aukið frumudauða AML fruma.
Þetta eru svipaðar niðurstöður og Tavor og félagar birtu árið 2004 en í rannsókn þeirra var notast við
ónæmisbældar mýs með mennskum AML frumum. Með því að bæta CXCL12 við frumur sem tjá
CXCR4 jókst lifun frumanna. Þegar Plerixafor var bætt í rannsóknarmódelið hindraði það CXCR4
viðtakann og lifun AML frumanna sem tjá viðtakann minnkaði (Tavor o.fl., 2004). Tavor og félagar
gerðu einnig rannsókn á áhrifum Plerixafor á lifun AML frumulínunnar U937 í ræktun í sjö til níu daga
og fengu þær niðurstöður að allt að 90% fruma ræktuðum með Plerixafor dó (Tavor o.fl., 2008).
Þessar niðurstöður styðja þær vísbendingar sem fengust úr ræktunum eftir eina viku að Plerixafor hafi
langverkandi áhrif.
Liesveld og félagar gátu ekki sýnt fram á að Plerixafor hefði bein áhrif á lifun, stýrðan frumudauða
né frumufjölgun AML blasta. Þau prófuðu að forrækta frumur með CXCL12 og bættu svo Plerixafor
við, en það hafði engin áhrif á frumurnar (Liesveld o.fl., 2007).
Nervi og félagar sýndu fram á að með því að gefa músum með AML Plerixafor urðu 1,6 sinnum
fleiri hvít blóðkorn í blóðrás músa og blastar í blóðrásinni jukust um nífallt. Þeir skoðuðu einnig áhrif
Plerixafor á lyfjameðferð í músum og komust að því að AML frumur urðu næmari fyrir Cytarabine og
jókst lifun músanna með því að bæta Plerixafor í meðferð, miðað við mýs sem fengu enga meðferð og
mýs sem fengu aðeins Cytarabine (Nervi o.fl., 2009).
Talið er að Plerixafor auki stýrðan frumudauða með því að hindra ýmis innanfrumuferli sem virkjast
þegar CXCR4 og CXCL12 bindast. Þar á meðal eru lifunarferlar, sem CXCL12 virkjar eins og MAP
kínasa ferlið, AKT ferlið og/eða virkjun BAD sem er frumudauðaprótein sem CXCL12 hindrar (Teicher
o.fl., 2010).
Uy og félagar gerðu in vivo rannsókn á áhrifum Plerixafors í AML sjúklingum, niðurstöðurnar sýndu
fram á að tilfærsla AML blasta í blóðrás jókst tvöfalt í sjúklingunum. Rannsóknin sýndi fram á að
52
raunhæfur kostur er að sameina Plerixafor við önnur krabbameinslyf í lyfjameðferðum AML sjúklinga
(Uy o.fl., 2012).
Vinna við að þróa öflugari efnatoghemla er á fullu skriði en POL5551 er nýr efnatoghemill sem
hindar bindingu CXCR4 við CXCL12. Rannsókn á virkni POL5551 í músum bendir til að hann virki
fljótt og sé góður til að færa blóðmyndandi stofnfrumur úr beinmergnum og í blóðrásina og að sú virkni
sé skilvirkari er Plerixafor og G-CSF (Karpova o.fl., 2013).
Það eru ekki bara efnatoghemlar sem hafa áhrif á CXCR4 en Gul og félagar hafa sýnt fram á að
Valproic sýra hafi áhrif á tjáningu CXCR4 á AML frumulínur. Hjá CD34 neikvæðum frumum minnkaði
Valproic sýra tjáningu CXCR4 á yfirborði frumanna með því að minnka tjáningu á geni CXCR4, en þar
með minnkaði frumuskrið að CXCL12. Aftur á móti hjá CD34 jákvæðum frumum jók Valproic sýran
yfirborðstjáningu CXCR4 og frumuskrið að CXCL12 jókst því einnig. Áhrif Valproic sýru á AML frumur
er því breytileg eftir þroskastigi þeirra (Gul o.fl., 2010).
Eftir því sem rannsóknir á efnatogviðtakanum CXCR4 leiða meira í ljós um mikilvægi hans í AML
hefur áhugi á fleiri efnatogviðtökum vaknað. Sýnt hefur verið fram á að efnatogviðtakinn CXCR2 og
bindill hans Interleukin 8 auki æðamyndun, meinvarpsmyndun og ónæmi gegn krabbameinslyfjum í
æxlum. Schinke og félagar sýndu fram á að í AML frumulínum er CXCR2 yfirtjáður og að
efnatoghemillinn SB-332235 sem hindrar CXCR2 jók stýrðan frumudauða AML fruma og minnkaði
kólóníuvöxt AML fruma (Schinke o.fl., 2013).
5.3 Áhrif Plerixfor á útþroskun hvítblæðisfruma
Sýnt hefur verið fram á víðtæk áhrif Plerixafor þar á meðal áhrifum þess á útþroskun fruma (Tavor
o.fl., 2008). Til að kanna þessi áhrif voru settar upp kólóníuræktanir en niðurstöður úr þeim má sjá í
kafla 4.4 auk þess sem litað var fyrir yfirborðssameindum AML fruma en þær niðurstöður eru að finna í
kafla 4.5.
Ef áhrif Plerixafor á kólóníuræktanir er skoðuð virðist vera að Plerixafor hafi frekar letjandi áhrif á
útþroskun hvítblæðisfrumanna heldur en að auka hana. Kólóníur sem ræktaðar voru með Plerixafor
voru mun minni en kólóníur ræktaðar án lyfja. Það sem kólóníuræktanirnar sýndu frekar fram á var
áhrif Plerixafor á frumudauða og langtíma áhrif þess, þar sem þær frumur sem eru ræktaðar með
Plerixafor deyja og mynda fáar eða engar kólóníur.
Litað var fyrir yfirborðssameindum hvítblæðisfruma með flúormerktum mótefnum og mælt í
frumuflæðisjá. Tjáningin er einstaklingsbundin en markmiðið með tilraununum var að skoða hvort
tjáning hjá frumunum myndi breytast í rækt með og án krabbameinslyfja og með og án Plerixafor.
Niðurstöðurnar má sjá í kafla 4.5 og viðauka 1.
Breytileiki sem kemur fram á tjáningu yfirborðssameinda má mestmegnis rekja til frumudauða. Það
sem er áhugaverðast að lesa út úr þessum töflum er að þegar frumur eru ræktaðar er með Plerixafor
sést að lyfið er að bindast viðtaka sínum þar sem engin tjáning á CD184 mælist hjá frumunum en það
skýrist af því að viðtakinn er bundinn Plerixafor. Skoðuð var tjáning á sameindunum CD11b og CD11c
en út frá þeim sameindum er hægt að meta þroska frumanna, en samkvæmt niðurstöðum á tjáningu
CD11b og CD11c varð ekki útþroskun á hvítblæðisfrumunum. Þessar niðurstöður styrkja því frekar
tilgátur um að Plerixafor auki frumudauða.
53
Tjáning á CXCR4 er mismunandi eftir undirflokkum AML en lítil tjáning er á M0, M1, M2 og M6 en
meiri tjáning á þroskaðari frumum eins og í M3, M4 og M5 (Gul o.fl., 2010). Þetta er alveg
samsvarandi við tjáningu sjúklinganna í rannsókninni og greiningu þeirra en hana má finna í töflu 1.
Tavor og félagar gerðu rannsókn árið 2008 þar sem þeir ræktuðu AML frumur sjúklinga og AML
frumulínur, þar á meðal U937, með Plerixafor. Þeir fengu þær niðurstöður að frumur ræktaðar í 9 daga
með Plerixafor sýndu marktækan mun á útþroskun bæði í smásjá, þar sem frumur fengu fleiri granúlur
og fóru að líkjast makrófögum, og með mótefnalitun, þar sem tjáning á CD15 og CD11b jókst, miðað
við frumur ræktaðar án Plerixafor (Tavor o.fl., 2008). Liesveld og félagar fengu aftur á móti þá
niðurstöðu í sínum rannsóknum að Plerixafor hefði letjandi áhrif á útþroskun AML fruma með
kólóníuræktun (Liesveld o.fl., 2007). Ástæðan fyrir þessum mun á rannsóknunum liggur mögulega í
skammtastærð Plerixafor en minni skammtur var notaður í þessari rannsókn (1μmól/ml) heldur en í
rannsókn Liesveld (0,1 – 1 mg/mL) og rannsókn Tavor (10μg/mL).
5.4 Áhrif Plerixafor á frumuskrið hvítblæðisfruma
Frumuskriðstilraun var gerð á einkjarna frumum níu AML sjúklinga við þrjár aðstæður það er án lyfja,
með 1 µM Plerixafor og með 10 µM Plerixafor. Frumur sem höfðu skriðið voru taldar á tveimur
tímapunktum, eftir þrjár klukkustundir og 24 klukkustundir. Niðurstöðurnar má sjá í töflu 5 og á mynd
21 má sjá niðurstöður fyrir sjúkling 6, en á þeirri mynd sjást áhrif Plerixafor á frumuskrið að CXCL12
mjög vel og það er ekki háð styrkleika Plerixafor þar sem lágmarksstyrkleiki (1 µmól) sýnir hæfni
Plerixafor að hindra frumuskrið að CXCL12. Marktækur munur fékkst á frumuskriði við allar aðstæður
(1 og 10 µM Plerixafor eftir 3 og 24 klukkustundir og án Plerixafor eftir 24 klukkustundir) miðað við
frumuskrið án Plerixafor eftir 3 klukkustundir. Marktækur munur fékkst á frumuskriði eftir 3
klukkustundir með 1 µM Plerixafor og 10 µM Plerixafor. Ekki kom fram minnkun á frumuskriði hjá
sjúklingi 1 með Plerixafor en það er útaf því að viðkomandi var ekki með CXCR4 tjáningu á
hvítblæðisfrumunum.
Þessar niðurstöður samsvara fyrri niðurstöðum en Liesveld og félagar könnuðu einnig áhrif
Plerixafor á frumuskrið heilbrigðra CD34 jákvæðra fruma og AML blasta að CXCL12 í gegnum
naflastrengs þekjufrumulag (HUVEC) og beinmergsþekjufrumulag. Tilraunin var sett upp við
mismunandi styrki Plerixafor frá 0,01 mg/mL að 1 mg/mL en eins og í þessari rannsókn var ekki munur
á frumuskriði með auknum styrkleika Plerixafor frá 0,1 mg/mL og upp í 1 mg/mL (Liesveld o.fl., 2007).
54
6 Ályktanir
Rannsóknin sýnir fram á að hægt sé að meta áhrif mismunandi styrkleika krabbameinslyfja á
hvítblæðisfrumur sjúklinga í einföldu frumuræktunarmódeli og þannig meta næmi illkynja fruma gegn
krabbameinslyfjum. Þessi aðferð gæti mögulega nýst við val krabbameinslyfjameðferðar hjá
sjúklingum sem svara illa krabbameinslyfjameðferð. Rannsóknin sýnir fram á tilhneigingu Plerixafor til
að auka frumudauða með þekktum krabbameinslyfjum í frumuræktunarmódelinu en áhrif Plerixafor á
frumudauða eru hinsvegar skýr í kólóníuræktunum. Ekki er sýnt fram á að Plerixafor auki útþroskun
fruma í kólóníuræktun né með breytingum á tjáningu yfirborðssameinda. Sýnt er fram á hæfni
Plerixafor til að hindra frumuskrið í átt að CXCL12.
Helstu gallar rannsóknarinnar er lítill rannsóknarhópur en erfitt er að álykta út frá svo litlu þýði.
Skammtastærð Azacytidine hefði þurft að vera hærri en þrátt fyrir það var sýnt fram á marktækan mun
milli ræktunnar með Azacytidine og Azacytidine ásamt Plerixafor.
Næstu skref eru að skoða áhrif Plerixafor á frumulínurnar sem fengust frá Liesveld. Skoðuð verða
áhrif aukins styrks af Plerixafor í samspili með krabbameinslyfjum og lyfjanæmi frumulínanna kannað.
55
Heimildaskrá
Akashi, T., Koizumi, K., Tsuneyama, K., Saiki, I., Takano, Y. & Fuse, H. (2008). Chemokine receptor CXCR4 expression and prognosis in patients with metastatic prostate cancer. Cancer Sci, 99(3), 539-542. doi: 10.1111/j.1349-7006.2007.00712.x.
Allen, S. J., Crown, S. E. & Handel, T. M. (2007). Chemokine: receptor structure, interactions, and antagonism. Annu Rev Immunol, 25, 787-820. doi: 10.1146/annurev.immunol.24.021605.090529.
American cancer society. (2013a, 18. janúar). What are the key statistics about acute lymphocytic leukemia? Sótt 28. janúar, 2013, frá http://www.cancer.org/cancer/leukemia-acutelymphocyticallinadults/detailedguide/leukemia-acute-lymphocytic-key-statistics.
American cancer society. (2013b, 18. janúar). What are the key statistics about acute myeloid leukemia? Sótt 1. Febrúar, 2013, frá http://www.cancer.org/cancer/leukemia-acutemyeloidaml/detailedguide/leukemia-acute-myeloid-myelogenous-key-statistics.
Bachelerie, F. (2010). CXCL12/CXCR4-axis dysfunctions: Markers of the rare immunodeficiency disorder WHIM syndrome. Dis Markers, 29(3-4), 189-198. doi: 10.3233/dma-2010-0736.
Balkwill, F. (2004). The significance of cancer cell expression of the chemokine receptor CXCR4. Semin Cancer Biol, 14(3), 171-179. doi: 10.1016/j.semcancer.2003.10.003.
Barbolina, M. V., Kim, M., Liu, Y., Shepard, J., Belmadani, A., Miller, R. J. o.fl. (2010). Microenvironmental regulation of chemokine (C-X-C-motif) receptor 4 in ovarian carcinoma. Mol Cancer Res, 8(5), 653-664. doi: 10.1158/1541-7786.mcr-09-0463.
BD Biosciences. (2008). FITC Annexin V apoptosis detection kit I Sótt 6. febrúar, 2013, frá http://www.bdbiosciences.com/external_files/pm/doc/tds/cell_bio/live/web_enabled/6693KK_556547.pdf.
BD Falcon. (e. d.). BD Falcon™ Individual Cell Culture Inserts and Companion Plates Sótt 12. Apríl, 2014, frá http://www.ebiotrade.com/buyf/productsf/BD%20Falcon/353182.htm.
Bennett, F., Rawstron, A., Plummer, M., de Tute, R., Moreton, P., Jack, A. o.fl. (2007). B-cell chronic lymphocytic leukaemia cells show specific changes in membrane protein expression during different stages of cell cycle. Br J Haematol, 139(4), 600-604. doi: 10.1111/j.1365-2141.2007.06790.x.
Berman, E., Heller, G., Santorsa, J., McKenzie, S., Gee, T., Kempin, S. o.fl. (1991). Results of a randomized trial comparing idarubicin and cytosine arabinoside with daunorubicin and cytosine arabinoside in adult patients with newly diagnosed acute myelogenous leukemia. Blood, 77(8), 1666-1674.
Bio Cat. (e. d.). Chemotaxis Assays Sótt 1. Apríl, 2014, frá http://www.biocat.com/cgi-bin/page/sub2.pl?main_group=cell_biology&sub1=cell_migration&sub2=chemotaxis_assays.
Björnsdóttir, S. B. (2013). Áhrif efnatoghemla í bráða og langvinnu hvítblæði. Getur lyfið Plerixafor haft áhrif á útþroskun hvítblæðisfruma? , Háskóli Íslands, Reykjavík.
Bleul, C. C., Fuhlbrigge, R. C., Casasnovas, J. M., Aiuti, A. & Springer, T. A. (1996). A highly efficacious lymphocyte chemoattractant, stromal cell-derived factor 1 (SDF-1). J Exp Med, 184(3), 1101-1109.
Bradley, T. R. & Metcalf, D. (1966). The growth of mouse bone marrow cells in vitro. Aust J Exp Biol Med, 44(3), 287-300.
Bui, V. T. (2013). Purifying NK cells/ monocytes Sótt 16. Apríl, 2014, frá http://nkcellspurification.blogspot.com/2013/02/purifying-nk-cells-monocytes.html.
Burger, J. A., Burger, M. & Kipps, T. J. (1999). Chronic lymphocytic leukemia B cells express functional CXCR4 chemokine receptors that mediate spontaneous migration beneath bone marrow stromal cells. Blood, 94(11), 3658-3667.
Burger, J. A. & Kipps, T. J. (2006). CXCR4: a key receptor in the crosstalk between tumor cells and their microenvironment. Blood, 107(5), 1761-1767. doi: 10.1182/blood-2005-08-3182.
Burger, J. A. & Peled, A. (2009). CXCR4 antagonists: targeting the microenvironment in leukemia and other cancers. Leukemia, 23(1), 43-52. doi: 10.1038/leu.2008.299.
Burger, J. A., Tsukada, N., Burger, M., Zvaifler, N. J., Dell'Aquila, M. & Kipps, T. J. (2000). Blood-derived nurse-like cells protect chronic lymphocytic leukemia B cells from spontaneous apoptosis through stromal cell-derived factor-1. Blood, 96(8), 2655-2663.
Burger, M., Glodek, A., Hartmann, T., Schmitt-Graff, A., Silberstein, L. E., Fujii, N. o.fl. (2003). Functional expression of CXCR4 (CD184) on small-cell lung cancer cells mediates migration, integrin activation, and adhesion to stromal cells. Oncogene, 22(50), 8093-8101. doi: 10.1038/sj.onc.1207097.
56
Ceradini, D. J., Kulkarni, A. R., Callaghan, M. J., Tepper, O. M., Bastidas, N., Kleinman, M. E. o.fl. (2004). Progenitor cell trafficking is regulated by hypoxic gradients through HIF-1 induction of SDF-1. Nat Med, 10(8), 858-864. doi: 10.1038/nm1075.
Curtis, J. E., Minden, M. D., Minkin, S. & McCulloch, E. A. (1995). Sensitivities of AML blast stem cells to idarubicin and daunorubicin: a comparison with normal hematopoietic progenitors. Leukemia, 9(3), 396-404.
De Klerck, B., Geboes, L., Hatse, S., Kelchtermans, H., Meyvis, Y., Vermeire, K. o.fl. (2005). Pro-inflammatory properties of stromal cell-derived factor-1 (CXCL12) in collagen-induced arthritis. Arthritis Res Ther, 7(6), R1208-1220. doi: 10.1186/ar1806.
Debnath, B., Xu, S., Grande, F., Garofalo, A. & Neamati, N. (2013). Small molecule inhibitors of CXCR4. Theranostics, 3(1), 47-75. doi: 10.7150/thno.5376.
Dohner, H., Estey, E. H., Amadori, S., Appelbaum, F. R., Buchner, T., Burnett, A. K. o.fl. (2010). Diagnosis and management of acute myeloid leukemia in adults: recommendations from an international expert panel, on behalf of the European LeukemiaNet. Blood, 115(3), 453-474. doi: 10.1182/blood-2009-07-235358.
Elmore, S. (2007). Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicol Pathol, 35(4), 495-516. doi: 10.1080/01926230701320337.
Estey, E. H. (2001). Growth factors in acute myeloid leukaemia. Best Pract Res Clin Haematol, 14(1), 175-187. doi: 10.1053/beha.2000.0122.
Fenaux, P., Mufti, G. J., Hellstrom-Lindberg, E., Santini, V., Finelli, C., Giagounidis, A. o.fl. (2009). Efficacy of azacitidine compared with that of conventional care regimens in the treatment of higher-risk myelodysplastic syndromes: a randomised, open-label, phase III study. Lancet Oncol, 10(3), 223-232. doi: 10.1016/s1470-2045(09)70003-8.
Fiegl, M., Samudio, I., Clise-Dwyer, K., Burks, J. K., Mnjoyan, Z. & Andreeff, M. (2009). CXCR4 expression and biologic activity in acute myeloid leukemia are dependent on oxygen partial pressure. Blood, 113(7), 1504-1512. doi: 10.1182/blood-2008-06-161539.
Furley, A. J., Reeves, B. R., Mizutani, S., Altass, L. J., Watt, S. M., Jacob, M. C. o.fl. (1986). Divergent molecular phenotypes of KG1 and KG1a myeloid cell lines. Blood, 68(5), 1101-1107.
Gul, H., Marquez-Curtis, L. A., Jahroudi, N., Larratt, L. M. & Janowska-Wieczorek, A. (2010). Valproic acid exerts differential effects on CXCR4 expression in leukemic cells. Leuk Res, 34(2), 235-242. doi: 10.1016/j.leukres.2009.05.014.
Harmening, D. M. (2009). Clinical hematology and fundamentals og hemostasis (Fifth ed.). Philadelphia, USA: F.A. Davis Company.
Harris, N. L., Jaffe, E. S., Diebold, J., Flandrin, G., Muller-Hermelink, H. K., Vardiman, J. o.fl. (1999). World Health Organization classification of neoplastic diseases of the hematopoietic and lymphoid tissues: report of the Clinical Advisory Committee meeting-Airlie House, Virginia, November 1997. J Clin Oncol, 17(12), 3835-3849.
Hasserjian, R. P. (2013). Acute myeloid leukemia: advances in diagnosis and classification. Int J Lab Hematol, 35(3), 358-366. doi: 10.1111/ijlh.12081.
Hendrix, C. W., Collier, A. C., Lederman, M. M., Schols, D., Pollard, R. B., Brown, S. o.fl. (2004). Safety, pharmacokinetics, and antiviral activity of AMD3100, a selective CXCR4 receptor inhibitor, in HIV-1 infection. J Acquir Immune Defic Syndr, 37(2), 1253-1262.
Hubeek, I., Peters, G. J., Broekhuizen, R., Zwaan, C. M., Kaaijk, P., van Wering, E. S. o.fl. (2006). In vitro sensitivity and cross-resistance to deoxynucleoside analogs in childhood acute leukemia. Haematologica, 91(1), 17-23.
Human cell differentiation molecules. (e. d.). HLDA9 Workshop. Sótt 21. febrúar, 2013, frá http://hcdm.org/HLDA9Workshop/tabid/60/Default.aspx.
Jing, D., Wobus, M., Poitz, D. M., Bornhauser, M., Ehninger, G. & Ordemann, R. (2012). Oxygen tension plays a critical role in the hematopoietic microenvironment in vitro. Haematologica, 97(3), 331-339. doi: 10.3324/haematol.2011.050815.
Jónasson, J. G. & Tryggvadóttir, L. (2012). Krabbamein á Íslandi - Upplýsingar úr Krabbameinsskrá fyrir tímabilið 1955-2010. Reykjavík: Krabbameinsfélagið.
Karpova, D., Dauber, K., Spohn, G., Chudziak, D., Wiercinska, E., Schulz, M. o.fl. (2013). The novel CXCR4 antagonist POL5551 mobilizes hematopoietic stem and progenitor cells with greater efficiency than Plerixafor. Leukemia, 27(12), 2322-2331. doi: 10.1038/leu.2013.266.
Karshovska, E., Zernecke, A., Sevilmis, G., Millet, A., Hristov, M., Cohen, C. D. o.fl. (2007). Expression of HIF-1alpha in injured arteries controls SDF-1alpha mediated neointima formation in apolipoprotein E deficient mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 27(12), 2540-2547. doi: 10.1161/atvbaha.107.151050.
57
Kim, C. H. & Broxmeyer, H. E. (1998). In vitro behavior of hematopoietic progenitor cells under the influence of chemoattractants: stromal cell-derived factor-1, steel factor, and the bone marrow environment. Blood, 91(1), 100-110.
Kim, H. K., De La Luz Sierra, M., Williams, C. K., Gulino, A. V. & Tosato, G. (2006). G-CSF down-regulation of CXCR4 expression identified as a mechanism for mobilization of myeloid cells. Blood, 108(3), 812-820. doi: 10.1182/blood-2005-10-4162.
Kim, J. S., Beadle, J. R., Freeman, W. R., Hostetler, K. Y., Hartmann, K., Valiaeva, N. o.fl. (2012). A novel cytarabine crystalline lipid prodrug: hexadecyloxypropyl cytarabine 3',5'-cyclic monophosphate for proliferative vitreoretinopathy. Mol Vis, 18, 1907-1917.
Kim, M., Koh, Y. J., Kim, K. E., Koh, B. I., Nam, D. H., Alitalo, K. o.fl. (2010). CXCR4 signaling regulates metastasis of chemoresistant melanoma cells by a lymphatic metastatic niche. Cancer Res, 70(24), 10411-10421. doi: 10.1158/0008-5472.can-10-2591.
Koeffler, H. P. & Golde, D. W. (1980). Human myeloid leukemia cell lines: a review. Blood, 56(3), 344-350.
Kolitz, J. E. (2006). Current therapeutic strategies for acute myeloid leukaemia. Br J Haematol, 134(6), 555-572. doi: 10.1111/j.1365-2141.2006.06219.x.
Kuchenbauer, F., Kern, W., Schoch, C., Kohlmann, A., Hiddemann, W., Haferlach, T. o.fl. (2005). Detailed analysis of FLT3 expression levels in acute myeloid leukemia. Haematologica, 90(12), 1617-1625.
Liesveld, J. L., Bechelli, J., Rosell, K., Lu, C., Bridger, G., Phillips, G., 2nd o.fl. (2007). Effects of AMD3100 on transmigration and survival of acute myelogenous leukemia cells. Leuk Res, 31(11), 1553-1563. doi: 10.1016/j.leukres.2007.02.017.
Liles, W. C., Broxmeyer, H. E., Rodger, E., Wood, B., Hubel, K., Cooper, S. o.fl. (2003). Mobilization of hematopoietic progenitor cells in healthy volunteers by AMD3100, a CXCR4 antagonist. Blood, 102(8), 2728-2730. doi: 10.1182/blood-2003-02-0663.
Lowenberg, B., van Putten, W., Theobald, M., Gmur, J., Verdonck, L., Sonneveld, P. o.fl. (2003). Effect of priming with granulocyte colony-stimulating factor on the outcome of chemotherapy for acute myeloid leukemia. N Engl J Med, 349(8), 743-752. doi: 10.1056/NEJMoa025406.
Mehta, S. V., Shukla, S. N. & Vora, H. H. (2012). Comprehensive FLT3 Analysis in Indian Acute Myeloid Leukaemia. J Blood & Lymph, 2(1). doi: 10.4172/2165-7831.1000102.
Mohle, R., Bautz, F., Rafii, S., Moore, M. A., Brugger, W. & Kanz, L. (1998). The chemokine receptor CXCR-4 is expressed on CD34+ hematopoietic progenitors and leukemic cells and mediates transendothelial migration induced by stromal cell-derived factor-1. Blood, 91(12), 4523-4530.
Morton, L. M., Turner, J. J., Cerhan, J. R., Linet, M. S., Treseler, P. A., Clarke, C. A. o.fl. (2007). Proposed classification of lymphoid neoplasms for epidemiologic research from the Pathology Working Group of the International Lymphoma Epidemiology Consortium (InterLymph). Blood, 110(2), 695-708. doi: 10.1182/blood-2006-11-051672.
Muller, A., Homey, B., Soto, H., Ge, N., Catron, D., Buchanan, M. E. o.fl. (2001). Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis. Nature, 410(6824), 50-56. doi: 10.1038/35065016.
Nagasawa, T., Kikutani, H. & Kishimoto, T. (1994). Molecular cloning and structure of a pre-B-cell growth-stimulating factor. Proc Natl Acad Sci U S A, 91(6), 2305-2309.
Nagayama, J., Tomizawa, D., Koh, K., Nagatoshi, Y., Hotta, N., Kishimoto, T. o.fl. (2006). Infants with acute lymphoblastic leukemia and a germline MLL gene are highly curable with use of chemotherapy alone: results from the Japan Infant Leukemia Study Group. Blood, 107(12), 4663-4665. doi: 10.1182/blood-2005-11-4728.
Nara, N., Curtis, J. E., Senn, J. S., Tritchler, D. L. & McCulloch, E. A. (1986). The sensitivity to cytosine arabinoside of the blast progenitors of acute myeloblastic leukemia. Blood, 67(3), 762-769.
Nara, N. & McCulloch, E. A. (1985). The proliferation in suspension of the progenitors of the blast cells in acute myeloblastic leukemia. Blood, 65(6), 1484-1493.
National cancer institute. (e. d.-a). Azacitidine Sótt 13. mars, 2014, frá http://www.cancer.gov/drugdictionary?CdrID=39153.
National cancer institute. (e. d.-b). Cytarabine. Sótt 15. mars, 2013, frá http://www.cancer.gov/drugdictionary?CdrID=39015.
National cancer institute. (e. d.-c). Fludarabine phosphate Sótt 13. mars, 2014, frá http://www.cancer.gov/drugdictionary?CdrID=39244.
National cancer institute. (e. d.-d). Idarubicin (Code C562). Sótt 15. mars, 2013, frá http://ncit.nci.nih.gov/ncitbrowser/ConceptReport.jsp?dictionary=NCI%20Thesaurus&code=C562.
58
Nervi, B., Ramirez, P., Rettig, M. P., Uy, G. L., Holt, M. S., Ritchey, J. K. o.fl. (2009). Chemosensitization of acute myeloid leukemia (AML) following mobilization by the CXCR4 antagonist AMD3100. Blood, 113(24), 6206-6214. doi: 10.1182/blood-2008-06-162123.
Nissen-Druey, C., Tichelli, A. & Meyer-Monard, S. (2005). Human hematopoietic colonies in health and disease. Sviss: Karger.
Office of collaborative science. (e. d.). BD FACSCalibur Sótt 14. Apríl, 2014, frá http://ocs.med.nyu.edu/cores-and-shared-resources/cytometry-and-cell-sorting-core/instrumentation-and-services/bd-facscalib.
Ortolani, C. (2011). Flow cytometry of hematological malignancies. England: Wiley-Blackwell. Peled, A., Petit, I., Kollet, O., Magid, M., Ponomaryov, T., Byk, T. o.fl. (1999). Dependence of human
stem cell engraftment and repopulation of NOD/SCID mice on CXCR4. Science, 283(5403), 845-848.
Peled, A. & Tavor, S. (2013). Role of CXCR4 in the pathogenesis of acute myeloid leukemia. Theranostics, 3(1), 34-39. doi: 10.7150/thno.5150.
Perry, M. C. (2008). The Chemotherapy source book (Fourth ed.). Philadelphia, USA: Lippincott Williams & Wilkins.
Peters, J. M. & Ansari, M. Q. (2011). Multiparameter flow cytometry in the diagnosis and management of acute leukemia. Arch Pathol Lab Med, 135(1), 44-54. doi: 10.1043/2010-0387-rar.1.
Pluznik, D. H. & Sachs, L. (1965). The cloning of normal “mast” cells in tissue culture. Journal of Cellular and Comparative Physiology, 66(3), 319-324. doi: 10.1002/jcp.1030660309.
Ribera, J. M., Ortega, J. J., Oriol, A., Bastida, P., Calvo, C., Perez-Hurtado, J. M. o.fl. (2007). Comparison of intensive chemotherapy, allogeneic, or autologous stem-cell transplantation as postremission treatment for children with very high risk acute lymphoblastic leukemia: PETHEMA ALL-93 Trial. J Clin Oncol, 25(1), 16-24. doi: 10.1200/jco.2006.06.8312.
Sachdeva, M. U., Ahluwalia, J., Das, R., Varma, N. & Garewal, G. (2006). Role of FAB classification of acute leukemias in era of immunophenotyping. Indian J Pathol Microbiol, 49(4), 524-527.
Schinke, C., Giricz, O., Gordon, S. A. K., Barreyro, L., Bhagat, T. D., Pellagatti, A. o.fl. (2013). Inhibition Of CXCR2 As a Therapeutic Strategy In AML and MDS. Paper presented at the The American Society of Hematology 2013 Annual Meeting.
Schnerch, D., Yalcintepe, J., Schmidts, A., Becker, H., Follo, M., Engelhardt, M. o.fl. (2012). Cell cycle control in acute myeloid leukemia. Am J Cancer Res, 2(5), 508-528.
Song, J. S., Kang, C. M., Kang, H. H., Yoon, H. K., Kim, Y. K., Kim, K. H. o.fl. (2010). Inhibitory effect of CXC chemokine receptor 4 antagonist AMD3100 on bleomycin induced murine pulmonary fibrosis. Exp Mol Med, 42(6), 465-472. doi: 10.3858/emm.2010.42.6.048.
Spoo, A. C., Lubbert, M., Wierda, W. G. & Burger, J. A. (2007). CXCR4 is a prognostic marker in acute myelogenous leukemia. Blood, 109(2), 786-791. doi: 10.1182/blood-2006-05-024844.
Sun, T. (2008). Flow cytometry and immunohistochemistry for hematologic neoplasms. Philadelphia, USA: Lippincott Williams & Wilkins.
Sundstrom, C. & Nilsson, K. (1976). Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). Int J Cancer, 17(5), 565-577.
Taichman, R. S., Cooper, C., Keller, E. T., Pienta, K. J., Taichman, N. S. & McCauley, L. K. (2002). Use of the stromal cell-derived factor-1/CXCR4 pathway in prostate cancer metastasis to bone. Cancer Res, 62(6), 1832-1837.
Tavor, S., Eisenbach, M., Jacob-Hirsch, J., Golan, T., Petit, I., Benzion, K. o.fl. (2008). The CXCR4 antagonist AMD3100 impairs survival of human AML cells and induces their differentiation. Leukemia, 22(12), 2151-5158. doi: 10.1038/leu.2008.238.
Tavor, S., Petit, I., Porozov, S., Avigdor, A., Dar, A., Leider-Trejo, L. o.fl. (2004). CXCR4 regulates migration and development of human acute myelogenous leukemia stem cells in transplanted NOD/SCID mice. Cancer Res, 64(8), 2817-2824.
Teicher, B. A. & Fricker, S. P. (2010). CXCL12 (SDF-1)/CXCR4 pathway in cancer. Clin Cancer Res, 16(11), 2927-2931. doi: 10.1158/1078-0432.ccr-09-2329.
Teuffel, O., Leibundgut, K., Lehrnbecher, T., Alonzo, T. A., Beyene, J. & Sung, L. (2013). Anthracyclines during induction therapy in acute myeloid leukaemia: a systematic review and meta-analysis. Br J Haematol, 161(2), 192-203. doi: 10.1111/bjh.12233.
Thomas, X., Raffoux, E., Botton, S., Pautas, C., Arnaud, P., de Revel, T. o.fl. (2007). Effect of priming with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in younger adults with newly diagnosed acute myeloid leukemia: a trial by the Acute Leukemia French Association (ALFA) Group. Leukemia, 21(3), 453-461. doi: 10.1038/sj.leu.2404521.
59
Toft, N., Birgens, H., Abrahamsson, J., Bernell, P., Griskevicius, L., Hallbook, H. o.fl. (2013). Risk group assignment differs for children and adults 1-45 years with acute lymphoblastic leukemia treated by the NOPHO ALL-2008 protocol. Eur J Haematol. doi: 10.1111/ejh.12097.
Tokoyoda, K., Egawa, T., Sugiyama, T., Choi, B. I. & Nagasawa, T. (2004). Cellular niches controlling B lymphocyte behavior within bone marrow during development. Immunity, 20(6), 707-718. doi: 10.1016/j.immuni.2004.05.001.
Uy, G. L., Rettig, M. P., Motabi, I. H., McFarland, K., Trinkaus, K. M., Hladnik, L. M. o.fl. (2012). A phase 1/2 study of chemosensitization with the CXCR4 antagonist plerixafor in relapsed or refractory acute myeloid leukemia. Blood, 119(17), 3917-3924. doi: 10.1182/blood-2011-10-383406.
Vardiman, J. W., Harris, N. L. & Brunning, R. D. (2002). The World Health Organization (WHO) classification of the myeloid neoplasms. Blood, 100(7), 2292-2302. doi: 10.1182/blood-2002-04-1199.
Vardiman, J. W., Thiele, J., Arber, D. A., Brunning, R. D., Borowitz, M. J., Porwit, A. o.fl. (2009). The 2008 revision of the World Health Organization (WHO) classification of myeloid neoplasms and acute leukemia: rationale and important changes. Blood, 114(5), 937-951. doi: 10.1182/blood-2009-03-209262.
Voermans, C., van Heese, W. P., de Jong, I., Gerritsen, W. R. & van Der Schoot, C. E. (2002). Migratory behavior of leukemic cells from acute myeloid leukemia patients. Leukemia, 16(4), 650-657. doi: 10.1038/sj.leu.2402431.
Wang, C. & McCulloch, E. A. (1987). Sensitivity to 5-azacytidine of blast progenitors in acute myeloblastic leukemia. Blood, 69(2), 553-559.
Wu, B., Chien, E. Y., Mol, C. D., Fenalti, G., Liu, W., Katritch, V. o.fl. (2010). Structures of the CXCR4 chemokine GPCR with small-molecule and cyclic peptide antagonists. Science, 330(6007), 1066-1071. doi: 10.1126/science.1194396.
Zhang, H., Mi, J. Q., Fang, H., Wang, Z., Wang, C., Wu, L. o.fl. (2013). Preferential eradication of acute myelogenous leukemia stem cells by fenretinide. Proc Natl Acad Sci U S A, 110(14), 5606-5611. doi: 10.1073/pnas.1302352110.
Zhu, X., Ma, Y. & Liu, D. (2010). Novel agents and regimens for acute myeloid leukemia: 2009 ASH annual meeting highlights. J Hematol Oncol, 3, 17. doi: 10.1186/1756-8722-3-17.
Ziello, J. E., Jovin, I. S. & Huang, Y. (2007). Hypoxia-Inducible Factor (HIF)-1 regulatory pathway and its potential for therapeutic intervention in malignancy and ischemia. Yale J Biol Med, 80(2), 51-60.
Zigmond, S. H. & Hirsch, J. G. (1973). Leukocyte locomotion and chemotaxis. New methods for evaluation, and demonstration of a cell-derived chemotactic factor. J Exp Med, 137(2), 387-410.
60
Viðauki 1
61
0 p ÷ Pler Cyta Cyt+Ple Ida Ida+Ple Fluda Fluda+Ple Aza Aza+Ple
CD 117 pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos
CD 34 pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos
CD 184 neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg
CD 14 pos neg pos neg pos pos pos pos pos pos pos
CD 33 pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos
CD 13 pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos
CD 133 pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos
CD 11b pos pos pos neg pos pos pos pos pos pos pos
CD 11c pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos
0 p ÷ Pler Cyta Cyt+Ple Ida Ida+Ple Fluda Fluda+Ple Aza Aza+Ple
CD 117 pos neg pos neg neg neg neg neg neg neg neg
CD 34 pos neg pos pos neg neg neg neg neg neg neg
CD 184 pos pos neg pos neg pos neg pos neg pos neg
CD 14 pos pos pos pos neg neg neg neg neg neg neg
CD 33 pos pos pos pos neg neg neg neg neg neg neg
CD 13 pos pos pos pos neg neg neg neg neg neg neg
CD 133 pos neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg
CD 11b pos pos pos pos neg neg neg neg neg neg neg
CD 11c pos pos pos pos neg neg neg neg neg neg neg
0 p ÷ Pler Cyta Cyt+Ple Ida Ida+Ple Fluda Fluda+Ple Aza Aza+Ple
CD 117 pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos
CD 34 pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos
CD 184 pos pos neg pos neg pos neg pos neg pos neg
CD 14 neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg
CD 33 pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos
CD 13 pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos
CD 133 neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg
CD 11b pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos
CD 11c pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos
0 p ÷ Pler Cyta Cyt+Ple Ida Ida+Ple Fluda Fluda+Ple Aza Aza+Ple
CD 117 pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos
CD 34 pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos
CD 184 pos pos neg neg neg neg neg neg neg neg neg
CD 14 pos neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg
CD 33 pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos
CD 13 pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos
CD 133 pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos
CD 11b pos neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg
CD 11c pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos
0 p ÷ Pler Cyta Cyt+Ple Ida Ida+Ple Fluda Fluda+Ple Aza Aza+Ple
CD 117 neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg
CD 34 pos pos pos pos neg pos pos pos pos pos pos
CD 184 pos pos neg pos neg pos neg pos neg pos neg
CD 14 pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos
CD 33 pos pos pos pos neg pos pos pos pos pos pos
CD 13 pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos
CD 133 neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg
CD 11b pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos
CD 11c pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos
Sjúklingur 1
Sjúklingur 2
Sjúklingur 3
Sjúklingur 6
Sjúklingur 7
62
0 p ÷ Pler Cyta Cyt+Ple Ida Ida+Ple Fluda Fluda+Ple Aza Aza+Ple
CD 117 pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos
CD 34 pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos
CD 184 pos pos neg pos neg pos neg pos neg pos neg
CD 14 pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos
CD 33 pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos
CD 13 pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos
CD 133 pos neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg
CD 11b pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos
CD 11c pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos
0 p ÷ Pler Cyta Cyt+Ple Ida Ida+Ple Fluda Fluda+Ple Aza Aza+Ple
CD 117 pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos
CD 34 pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos
CD 184 pos pos neg pos neg neg neg pos neg neg neg
CD 14 neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg
CD 33 pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos
CD 13 pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos
CD 133 pos pos pos pos pos neg neg pos pos pos pos
CD 11b pos pos pos neg neg neg neg pos pos neg neg
CD 11c pos pos pos pos pos neg neg pos pos pos pos
0 p ÷ Pler Cyta Cyt+Ple Ida Ida+Ple Fluda Fluda+Ple Aza Aza+Ple
CD 117 neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg
CD 34 pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos
CD 184 pos pos neg pos neg pos neg pos neg pos neg
CD 14 neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg
CD 33 neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg
CD 13 pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos
CD 133 pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos
CD 11b neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg
CD 11c pos pos pos pos pos pos neg pos pos pos pos
0 p ÷ Pler Cyta Cyt+Ple Ida Ida+Ple Fluda Fluda+Ple Aza Aza+Ple
CD 117 pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos
CD 34 pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos
CD 184 pos neg neg pos neg pos neg pos neg neg neg
CD 14 pos pos pos pos pos neg neg pos pos pos pos
CD 33 pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos
CD 13 pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos
CD 133 pos pos pos pos pos neg neg pos pos pos pos
CD 11b pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos
CD 11c pos pos pos neg pos neg neg neg neg neg neg
Sjúklingur 10
Sjúklingur 11
Sjúklingur 8
Sjúklingur 9
63
Fylgiskjöl
64
Upplýst samþykki fyrir þátttöku í vísindarannsókninni: „Áhrif efnatoghemilsins Plerixafor í bráða mergfrumuhvítblæði“
Ágæti viðtakandi Fyrirhugað er að framkvæma ofangreinda rannsókn en hún er framhaldsrannsókn og mastersverkefni í Lífeindafræði við Háskóla Íslands. Leitað er til einstaklinga sem hafa nýlega greinst með bráða hvítblæði og eru í meðferð á Blóðlækningadeild LSH. Upplýsingar um mögulega þátttakendur voru fengnar hjá læknum Blóðlækningadeildar. Ábyrgðarmaður rannsóknar: Sigrún Reykdal, læknir á Landspítala, sími: 825-5123, netfang: [email protected] Aðrir rannsakendur: Snædís Birna Björnsdóttir, mastersnemi í lífeindafræði Íris Pétursdóttir, lífeindafræðingur Guðmundur Rúnarsson, læknir Þórarinn Guðjónsson, prófessor Inntak rannsóknar og markmið: Sýnt hefur verið fram á að ýmis efni í blóði geta haft áhrif á svörun hvítblæðisfruma við lyfjameðferð þ.á.m. svokallaður efnatogahemill Plerixafor. Markmið þessarar rannsóknar er að kanna á rannsóknarstofu lifun hvítblæðisfruma úr sjúklingum í návist Plerixafor og krabbameinslyfja. Sýni verða fengin hjá einstaklingum í hvítblæðismeðferð. Leyfi fyrir rannsókninni hefur verið fengið hjá siðanefnd LSH og tilkynnt til Persónuverndar. Hvað felst í þátttöku? Þegar þú þarft að fara í blóðrannsókn eða mergsýnatöku verður í eitt til tvö skipti tekið aukalega 8 ml af blóði og 5-10 ml af mergsýni. Rannsóknin stendur frá október 2013 til júní 2014. Þér ber engin skylda til að taka þátt í þessari vísindarannsókn. Þú getur hætt þátttöku hvenær sem er, án eftirmála og það hefur ekki áhrif á þá heilbrigðisþjónustu sem þú færð á Landspítala. Áhætta og ávinningur Ekki er um auka áhættu að ræða þar sem engin sýni verða tekin eingöngu vegna rannsóknarinnar. Enginn beinn ávinningur er fyrir þátttakendur. Vonast er til að rannsóknin geti síðar stuðlað að nýjum meðferðarmöguleikum hjá sjúklingum með bráða hvítblæði.
65
Varðveisla og eyðing gagna Gögn verða varðveitt hjá rannsóknaraðilum innan LSH. Ekki verður unnið með nein persónuleg gögn. Engin lífsýni verða varðveitt eftir rannsókn. Mér hefur verið kynntur tilgangur þessarar vísindarannsóknar og í hverju þátttaka mín er fólgin. Ég er samþykk(ur) þátttöku. Upplýst samþykki er í tvíriti og heldur þátttakandi eftir öðru eintakinu.
Undirskrift þáttakanda Dagsetning
Undirskrift ábyrgðamanns/rannsakenda Dagsetning
Ef þú hefur spurningar um rétt þinn sem þáttakandi í þessari vísindarannsókn eða vilt hætta þátttöku í rannsókninni getur þú snúið þér til siðanefndar Landspítala,Eirbergi v/Eiríksgötu, 101 Reykjavík, Sími 543-7465, fax 5431479, tölvupóstur: [email protected]