MAKALAH HUMAN PAPILOMA VIRUS

Oleh :

Alifia Rahardhini Nourma Lubis 112210101021

Kadek Cahya Kusuma 112210101022

Binta Rusydaya D. 112210101023

Liliana A.I.K 112210101024

Puspita Arum Wijayanti 112210101025

Novia Danis Astika 112210101027

Rifqi Wafda Rozana 112210101028

Ni Putu Pertiwi 112210101029

Dessy Pradesyawati 112210101030

Moh Sulthon Habibi 112210101031

BAGIAN BIOLOGI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS JEMBER

2013

BAB 1. PENDAHULUAN

Human Papilloma Virus (HPV) termasuk golongan pavovavirus yang merupakan

virus DNA yang dapat bersifat memicu terjadinya perubahan genetik. HPV berbentuk

ikosahedral dengan ukuran 50-55 nm, 72 kapsomer, dan 2 protein kapsid. HPV

merupakan suatu virus yang bersifat “non enveloped” yang mengandung “double

stranded DNA”. Virus ini juga bersifat epiteliotropik yang dominan menginfeksi kulit

dan selaput lendir dengan karakteristik proliferasi epitel pada tempat infeksi. Infeksi

virus HPV telah dibuktikan menjadi penyebab lesi prekanker, kondiloma akuminata, dan

kanker. Meskipun HPV menyerang wanita, virus ini juga mempunyai peran dalam

timbulnya kanker anus, vulva, vagina, penis, dan beberapa kanker orofaring.

Virus ini menginfeksi membran basalis pada daerah metaplasia dan zona

transformasi serviks. Setelah menginfeksi sel epitel serviks sebagai upaya untuk

berkembang biak, virus ini akan meninggalkan sekuensi genomnya pada sel inang.

Genom HPV berupa episomal (bentuk lingkaran dan tidak terintegrasi dengan DNA

inang) dijumpai pada Carcinoma Insitu (CIN) dan berintegrasi dengan DNA inang pada

kanker invasif. Pada percobaan invitro HPV terbukti mampu mengubah sel menjadi

immortal.

Siklus hidup HPV belum diketahui secara sempurna, tetapi proses timbulnya lesi

sudah banyak diketahui. Tempat infeksi pertama adalah pada sel basal atau sel basal dari

epitel gepeng yang belum matur. Infeksi HPV yang terjadi pada sel basal tersebut dibagi

menjadi 2 jenis yaitu:

1. Infeksi virus laten, yakni infeksi virus yang tidak menghasilkan virus yang infeksius.

Pada saat ini yang terjadi adalah virus tidak berhasil melekat pada permukaan sel tetapi

gagal melakukan perkembangbiakan dan tidak terjadi pematangan dari partikel – partikel

virus. Pada fase ini kelainan struktur sel tidak ditemukan dan HPV hanya bisa dideteksi

dengan metode biomolekuler.

2. Fase produktif, yakni terjadinya pembentukan DNA virus dan membentuk DNA yang

infeksiosus yang disebut virion. Pembentukan DNA virus ini terjadi di sel intermediet

dan permukaan epitel sel gepeng. Virion kemudian menjadi banyak jumlahnya dan

membentuk efek merusak sel yang bias dideteksi dengan cara sitologi dan histopatologi.

Terjadinya keganasan akibat infeksi dari HPV harus memahami terlebih dahulu

tentang genom dari HPV. Bangun HPV terdiri atas 3 subbagian yaitu: URR (Upstein

Regulatory Region), ER ( Early Region), dan LR (Late Region). URR adalah bagian

nonkode yang berperan penting pada pengaturan pembentukan dan transkrip pada

rangkaian ER (Early region). ER dan LR mengandung cetakan bacaan yang terbuka (

Open Reading Frame = ORFs) yaitu bagian genom yang punya kemampuan untuk

membaca jenis protein. ER terbentuk pertama kali pada siklus hidup virus dan mengkode

protein yang sangat berperan pada pembentukan virus, sedangkan LR dibentuk

kemudian untuk mengkode struktur protein virus. URR juga adalah bagian regulator

yang sangat kompleks di mana peranan dan fungsi yang pasti dalam siklus hidup virus

belum diketahui dengan jelas. Bagian ini mengandung tempat ikatan berbagai faktor

transkrip seperti protein activator, faktor transkrip keratinositik spesifik, dan faktor

transkrip lainnya. Ikatan-ikatan ini diatur oleh Early Region ORFs.

Late Region (LR) mengandung gen pengkodean protein kapsid (L). Late region

dibagi menjadi L1 dan L2, ada pada akhir siklus hidup HPV, tepatnya di lapisan

granular epidermis. Late region membentuk shell virion dan memainkan peran penting

dalam mediasi virus infektivitas. Untuk mencapai siklus hidup HPV yang sesuai target,

harus mampu mengikat ke permukaan sel reseptor. Heparan sulfat proteoglikan pada

permukaan sel dianggap mengikat situs utama untuk L1 dan L2 dari kelompok evolusi

HPV tertentu namun berbeda sekunder reseptor yang terlibat untuk jenis HPV lainnya.

BAB 2. PEMBAHASAN

2.1 Deskripsi Obat (Cervarix)

Cervarix adalah formulasi bivalen cair (dua antigen) dari recombinant (rangkaian

yang dimodifikasi) human papillomavirus (HPV) tipe 11 dan partikel 16 L1 yang

menyerupai virus (VLPs) yang ditandai dalam sel serangga (jaringan sel ulat kubis

Trichopolsia) dengan menggunakan sistem penandaan baculovirus, dengan adjuvant AS(04)

(SBAS04) yang terdiri dari 3-monophosphoryl lipid A (MPL) yang telah dihilangkan kadar

keasamannya ditambah aluminum potasium sulfat (alum). Seperti Gardasil dari Merck &

Co., Cervarix mengandung recombinant HPV tipe 11 dan VLPs 16 L1 yang menyebabkan

sekitar 70% kasus kanker cervix. Namun, Cervarix tidak mengandung HPV tipe 6 dan VLPs

18 L1 yang mengakibatkan sekitar 90% kasus tumor genital lunak, sebagai contoh, vaksin

ini digunakan hanya untuk kanker cervix tanpa mengharapkan hasil yang signifikan terhadap

pencegahan pada kebanyakan kasus tumor genital lunak.

Cervarix merupakan jenis vaksin bivalen HPV 16/18 L1 VLP vaksin yang diproduksi

oleh Glaxo Smith Kline Biological, Rixensart, Belgium. Pada preparat ini, Protein L1 dari

HPV diekspresikan oleh vektor rekombinan baculovirus dan VLP dari kedua tipe ini

diproduksi yang kemudian dikombinasikan sehingga menghasilkan suatu vaksin yang sangat

merangsang sistem imun . Preparat ini diberikan secara intramuskuler dalam tiga kali

pemberian yaitu pada bulan ke 0, kemudian diteruskan bulan ke 1 dan ke 6 masing-masing

0,5 ml.

2.2 Cara Produksi Cervarix

Pada vaksin HPV Cervarix gen yang disisipkan adalah gen pengkode protein L1.

Protein L1 merupakan protein yang berfungsi dalam pembentukan kapsid bagi Human

Papiloma Virus atau sering disebut mayor viral coat protein. Gen pengkode protein L1

memiliki sekuen DNA yang mengkode protein L1 adalah 5’-

CCACATGTCTCTTTGGCTGCCTAGCG-3’ dan 5’-

GCGGCCGCTCGAGTTACAGCTTACGTTTTTTGC-3’. (San Millán, Sebastián,

Nuñez, Veramendi, & Escribano, 2009)

Source : Purnadanti, 2012

Vektor kloning yang digunakan sebagai media agar target DNA dapat diperbanyak

untuk selanjutnya diekspresikan menjadi protein yang diinginkan adalah pGEM-T.

Kemudian enzim restriksi yang digunakan adalah AfI1 dan NotI. Setelah itu, plasmid

kloning dimasukan ke dalam E. Coli.(Deschuyteneer et al., 2010; San Millán et al.,

2009)

Sementara vektor ekspresi yang digunakan adalah Autographa californica

nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) yang merupakan jenis Baculovirus Expressing sistem.

Baculovirus Exspresssing Vector System merupakan virus yang menginfeksi serangga,

salah satu protein penting yang disandi oleh genom virus ini adalah polihedrin, yang

akan terakumulasi dalam jumlah sangat besar didalam nuclei sel-sel serangga yang

diinfeksi karena gen tersebut mempunyai promoter yang sangat aktif. Promoter ini dapat

digunakan untuk memacu overekspresi gen-gen asing yang diklon ke dalam genom

baculovirus sehingga akan diperoleh produk protein yang sangat banyak jumlahnya di

dalam kultur sel-sel serangga yang terinfeksi. Nantinya protein yang diekspresikan

dalam sel serangga akan dimurnikan dan berubah menjadi VLP (Virus Like Partikel).

(Deschuyteneer et al., 2010)

Baculovirus tersebut akan diekspresikan didalam sel serangga (Eukaryota) yaitu

Trichoplusia nii. Lebih tepatnya diinfeksikan ke sel Trichoplusia nii Hi-5 Rix4446.

Penggunaan organisme eukaryota pada pengekspresian protein tersebut karena dengan

diproduksi pada sel insecta maka akan menghasilkan vaksin dengan imun respon

humoral yang lebih baik dan lebih tinggi serta jumlah yang lebih banyak.(Deschuyteneer

et al., 2010)

Human Papilloma Virus (HPV) (Rekombinan) merupakan rangkaian yang

dimodifikasi dengan 3-monophosphoryl lipid A (MPL) yang telah dihilangkan kadar

keasamannya ditambah adjuvant (zat yang dapat meningkatkan respon kekebalan tubuh

terhadap antigen) aluminum [AS(04)].

2.3 Proses Produksi Cervarix

Pembuatan vaksin ini menggunakan prinsip pengekspresian gen L1 menjadi

Kapsid yang kosong (Virus Like Partikel). Di mana telah kita ketahui L1 berfungsi

dalam membentuk kapsid dari HPV16.

SKEMA PEMBUATAN VAKSIN

HPV-16 L1 cDNA diisolasi terlebih dahulu dari virus HPV. Gen L1 ini

diamplifikasi dengan PCR dengan primer 5’-

CCACATGTCTCTTTGGCTGCCTAGCG-3’ dan 5’-

GCGGCCGCTCGAGTTACAGCTTACG TTTTT TGC-3’. Gen L1 kemudian

disisipkan pada vektor klonning pGEM-T yang dimasukkan ke bakteri E.coli untuk

memastikan protein yang diisolasi sudah benar. Kemudian gen disisipkan pada vektor

ekspresi Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) (salah satu jenis dari

vektor baculovirus) dengan enzim restriksi AfI1 dan NotI. Kemudian setelah vektor

tersisipi oleh gen L1, vector baculovirus dimasukkan ke dalam sel insekta yaitu

Trichoplusia ni yakni pada sel Hi-5 Rix4446. Setelah menginfeksi sel serangga, salah

satu protein penting yang disandi oleh genom virus ini adalah polihedrin, yang akan

terakumulasi dalam jumlah sangat besar didalam nuclei sel-sel serangga yang diinfeksi

karena gen tersebut mempunyai promoter yang sangat aktif. Promoter ini dapat

digunakan untuk memacu overekspresi gen-gen asing yaitu gen L1 yang diklon ke dalam

genom baculovirus sehingga akan diperoleh produk protein L1 yang sangat banyak

jumlahnya di dalam kultur sel-sel serangga yang terinfeksi. Selanjutnya dilakukan

ekstraksi untuk mengeluarkan protein L1 yang sudah diekspresikan. Protein ini akan

menjadi VLP (Virus Like Partikel) yang berupa kapsid virus kosong dimana didalamnya

tidak terdapat materi genetik virus.

- Konstruksi vector ekspresi baculovirus

Gen L1 dikloning ke dalam vektor pGEM-T (Promega), dicerna dengan Not I,

diperlakukan dengan alkali fosfatase. Untuk vektor ekspresi digunakan vektor

Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) Baculovirus Ekspresi

System Setelah itu dilakukan inkubasi selama 72 jam pada suhu 280C.

- Perlakuan pada Serangga

Organisme yang digunakan adalah Trichoplusia ni yang merupakan organisme

eukariot. Dalam proses pembuatan, fifth-instar Trichoplusia ni disuntik dengan

baculoviruses rekombinan dekat proleg (depan rongga tubuh). Kemudian mereka

dikumpulkan, segera dibekukan dan disismpan pada -200C sampai selesai proses.

- Western Blot dan Analisis Pewarnaan Coomassie

T. ni dihomogenasi dalam buffer fosfat saline 0,5 M NaCl, pH 7,4 (PBS-HS) dan

disonikasi selama 20 detik. Setelah disentrifugasi pada 20000 g selama 5 menit,

supernatan dianggap larut. Protein dipisahkan pada 10% SDS (b/v) gel

poliakrilamida (SDS-PAGE) dan diwarnai dengan Coomassie Brilliant Blue G-250

(BioRad) atau ditransfer ke membran nitroselulosa (Hybond C, GE Healthcare).

Membran diblokir semalam dalam PBS dengan 0,1% (v / v) Tween 20 (PBS-T) dan

4% susu skim (PBS-TM), dan diinkubasi selama 1 jam dengan antibodi primer, Cam

Vir-1 (Abcam) diencerkan 1:25000 dalam PBS-TM. Setelah dicuci dalam PBS-T,

membran diinkubasi selama 1 jam dengan peroxidase conjugated rabbit antimouse

IgG (Sigma) diencerkan 1:25000 dalam PBS-TM. Setelah pencucian, sinyal spesifik

dideteksi menggunakan sistem ECL Lanjutan (GE Healthcare) sesuai dengan

instruksi.

- ELISA Quantification of HPV-16 L1 Protein

Sampel diresuspensi dalam 10 vol (b / v) dari PBS-HS, disonikasi selama 10 s, dan

disentrifugasi pada 20000 g selama 5 menit pada 4 º C untuk menghilangkan

serpihan sel. Sampel diinkubasi dalam 96 sumur polivinil klorida mikro plate

(Costar, Corning) semalam pada 4 º C. Sumur-sumur tersebut diblok dengan PBS-

TM 1% susu skim selama 1 jam pada RT, dicuci tiga kali dengan PBS-T dan

diinkubasi dengan anti-L1 H16.V5 mAb pada 1:500 dalam PBS-TM (1 jam pada 37 º

C). Sumur dicuci tiga kali dengan PBS-T dan diinkubasi dengan pengenceran 1:1500

rabbit anti-mouse IgG peroxidase conjugate dalam PBS-TM (1 jam pada 37 º C).

Setelah tiga pencucian dengan PBS-T, lempeng dikembangkan dengan ABTS [2, 2'-

azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6- sulfonat) Asam] (Roche). Reaksi dibaca pada

405 nm dalam lempeng mikrotiter reader. Standar kurva untuk menghitung jumlah

protein rekombinan dengan H16.V5 mAb dibuat oleh pemurnian lempeng produksi

VLPs dalam sel serangga oleh infeksi baculovirus. VLPs digunakan dalam kisaran

30-150 ng per sumur diencerkan dalam 100 mM PBS pH 7,4 penyangga. Ekstrak

Larva mengandung protein L1 diencerkan (1:1000 untuk 1:8000) untuk

menyesuaikan dengan rentang linier dari standar.

2.4 Pemurnian Vaksin Cervarix

Untuk mendapatkan vaksin HPV (pemurnian / purifikasi) dilakukan dengan

beberapa cara, sesuai dengan sumber atau vector penghasil vaksinnya anntara lain

(Perez-Filgueira et al., 2006) :

Sel Serangga

Proses pemurnian vaksin HPV yang diperoleh dari sel serangga dilakukan dengan

cara:

Sel serangga yang masih dalam tahap berkembang diberikan 50 mg / mL gentamisin,

50 unit / MLE penisilin dan 50 mg / mL streptomisin. masukkan dalam labu ukur

75ml Kemudian pellet yang dihasilkan disentrifugasi dalam 1000g selama 5 menit.

500 mg pellet yang telah terinfeksi sel serangga diresuspensi dalam 8 mL PBS-HS

dan disonikasi selama 2 menit. Sel-sel yang sudah resisten atau terekombinan

terhadap antibiotik tersebut, pelletnya disentrifugasi pada 1000 g selama 5 menit.

Sedangkan untuk ekstrak dilakukan dengan penambahan sukrosa 40% dan

disentrifugasi dalam rotor ayun (Kontron TST4114) selama 2 jam pada 140000 g

pada 40 C. Pelet yang dihasilkan diresuspensi dalam CsCl pada larutan PBS-HS dan

disentrifugasi selama 20 jam pada 260.000 g dalam ember berayun rotor pada 100 C.

Fraksi yang dihasilkan diukur dengan refraktometer.

Larva

Untuk mengekstraksi vaksin HPV dari larva, dilakukan dengan cara:

500mg larva ditambahkan dengan 8mL PBS-HS kemudian dihomogenisasi dengan

blender dan disonikasi selama 2 menit. Selanjutnya disentrifugasi dalam 20000gr

selama 5 menit pada suhu 4 derajat celcius. Supernatan yang dihasilkan ditambahkan

dengan sukrosa 40%. Proses selanjutnya dilakukan sama seperti pemurnian vaksin

HPV pada sel serangga.

Mikroskop elektron dan pelabelan immunoglobulin

Sampel fraksi dinyatakan positif apabila dalam gradient CsCl yang didialisis dengan

PBS-HS mengambang pada filter (ukuran pori 0.2 um, Millipore). Sehingga sampel

harus ditempatkan ke grid tembaga yang berlapis karbon (ukuran 400 jala), ditutupi

dengan membran Formvar dan diwarnai dengan uranil asetat 1% selama 1 menit.

Sampel diperiksa di bawah Zeiss EM 910 Transmisi Mikroskop Elektron (TEM)

yang beroperasi pada 60 dan 80 kV.

Analisis perakitan L1 dengan pengendapan sukrosa

Untuk mengidentifikasi bentuk perakitan dari L1, ekstrak yang larut dari sel serangga

dan larva disiapkan untuk keperluan Blotting Barat. Sampel dimasukkan ke dalam

gradient yang berupa sukrosa. Setelah 2 jam sampel disentrifugasi pada 150.000 g

dalam ember rotor berayun, ditentukan densitasnya dengan refraktometri dan

dianalisis dengan ELISA Vir-1 Antibodi Cam (Abcam). Hasil sedimentasi L1

dikalibrasi dengan katalase hati sapi sebagai penandanya. Sapi tersebut diimunisasi

secara injeksi intraperitoneal dengan CsCl dari larva yang telah dimurnikan

(menggunakan Adjuvant Freund lengkap). Serum yang dihasilkan selanjutnya

dititrasi dengan VLPs yang telah dimurnikan (Gardasil, Merck) dengan ELISA di

piring microtitre pada 40 C dan diencerkan dengan PBS (pH 7,4). Tahapan yang

terakhir dilakukan adalah piring diinkubasi selama 1 jam pada 370 C dengan anti-IgG

dari kambing (antibodi horseradish peroksidase yang terkonjugasi). Tahap pencucian

dalam analisis perakitan L1 ini harus dilakukan setiap langkah ketika menggunakan

PBS-T. Sehingga bisa didapatkan absorbansi pada panjang gelombang 405 nm yang

diukur dengan pembacaan plat pada mikrotiter. Titer antibodi dinyatakan sebagai

pengenceran serum tertinggi yang dapat menghasilkan dua kali absorbansi yang

merata untuk serum pra-imun.

2.5 Bentuk Sediaan Cervarix

Vaksin ini diberikan dengan cara intramuskuler 0,5 cc diulang tiga kali, produk

Cervarix diberikan bulan ke 0,1 dan 6 sedangkan Gardasil bulan ke 0, 2 dan 6

(Dianjurkan pemberian tidak melebihi waktu 1 tahun). Pemberian booster (vaksin

ulangan), respon antibodi pada pemberian vaksin sampai 42 bulan, untuk menilai

efektifitas vaksin diperlukan deteksi respon antibodi. Bila respon antibodi rendah dan

tidak mempunyai efek penangkalan maka diperlukan pemberian Booster.

Vaksin profilaksis akan bekerja efisien bila vaksin tersebut diberikan sebelum

individu terpapar infeksi HPV. Infeksi HPV yang menyerang organ genitalis biasanya

ditularkan melalui hubungan seksual dan, dan imunisasi siberikan untuk melakukan

perlindungan terhadap sejumlah besar penyakit yang dihasilkan oleh infeksi virus

tersebut. Sebagai target populasi dari imunisasi ini adalah wanita sebelum puber dan usia

remaja. Hal ini disebabkan pada usia – usia tersebut dimulainya aktivitas seksual

seseorang.

Sebaiknya vaksiniasi secara rutin diberikan untuk wanita umur 11 – 12 dengan

dosis pemberian. Serial vaksin bisa dimulai saat wanita tersebut berumur 9 tahun. Selain

itu vaksin juga direkomendasikan untuk diberikan pada umur 13 – 26 tahun yang tidak

mendapat pengulangan vaksin atau tidak mendapatkan vaksin secara lengkap. Idealnya

vaksin diberikan sebelum usia yang rentan kontak dengan HPV yaitu wanita yang akan

memasuki usia seksual aktif sehingga wanita yang mendapat vaksinasi tersebut bisa

merasakan keuntungan dari pemberian vaksin. Selain itu apabila vaksin siberikan pada

usia tersebut, respons kekebalan tubuh yang dihasilkan akan lebih besar dibandingkan

bila diberikan setelah pubertas. Vaksin dikocok lebih dahulu sebelum dipakai dan

diberikan secara muskuler sebanyak 0,5 dan sebaiknya disuntikkan pada lengan (otot

deltoid).

BAB 3. KESIMPULAN

Dari penjelasan pada Bab sebelumnya, dapat ditulis beberapa kesimpulan sebagai

berikut.

3.1 Human Papilloma Virus (HPV) termasuk golongan pavovavirus yang

merupakan virus DNA yang dapat bersifat memicu terjadinya perubahan genetik.

3.2 Cervarix adalah formulasi bivalen cair dari recombinant (rangkaian yang

dimodifikasi) human papillomavirus (HPV) tipe 11 dan partikel 16 L1 yang

menyerupai virus (VLPs).

3.3 Cervarix dibuat dari protein L1 rekombinan, diekspresikan pada serangga

melalui baculovirus rekombinan.

3.4 Vaksin Cervarix diberikan dengan cara intramuskuler 0,5 cc diulang tiga kali,

produk Cervarix diberikan bulan ke 0,1 dan 6.

DAFTAR PUSTAKA

Deschuyteneer, M., Elouahabi, A., Plainchamp, D., Plisnier, M., Soete, D., Corazza, Y.,

Lockman, L., Giannini, S., & Deschamps, M. 2010. Molecular and structural

characterization of the L1 virus-like particles that are used as vaccine antigens in

CervarixTM, the AS04-adjuvanted HPV-16 and -18 cervical cancer vaccine.

Landes Bioscience, 6(5): 407–419.

Fernández San Millán, A., Gómez Sebastián, S., Núñez, M. C., Veramendi, J., &

Escribano, J. M. 2010. Human papillomavirus-like particles vaccine efficiently

produced in a non-fermentative system based on insect larva. Retrieved from

http://digital.csic.es/handle/10261/48483

Gondo, Harry Kurniawan. Vaksin dan Human Papiloma Virus (HPV) untuk Pencegahan

Kanker Serviks Uteri. Surabaya : Fakultas Kedokteran wijaya Kususma

Perez-Filgueira, D. M., Gonzalez-Camacho, F., Gallardo, C., Resino-Talavan, P.,

Blanco, E.,Gomez-Casado,E., Alonso, C., and Escribano, J. M. 2006.

Optimization and Validation of recombinant serological tests for African Swine

Fever diagnosis based On detection of th p30 protein produced in Trichoplusia ni

larvae. J"Clin"Microbiol 44(9), 3114A21.

Perez-Filgueira, D. M., Resino-Talavan,P., Cubillos, C., Angulo, I., Barderas, M. G.,

Barcena, J., And Escribano, J.(M. (2007). Development of a low cost, insect larvae

derived Recombinant subunit vaccine against RHDV. Virology 364(2), 422A30.

Purnadanti, Sinta. 2012. Ekspresi Protein Fusi E6/GFP dan E7/GFPpada Sel HeLa.

Skripsi. Tidak Diterbitkan. Depok : Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan

Alam Program Studi Biologi Universitas Indonesia =

San Millán, A. F.-, Sebastián, S. G., Nuñez, M. C., Veramendi, J., & Escribano, J. M.

2009. Human papillomavirus like particles vaccine efficiently produced in a non-

fermentative system based on insect larva. Instituto de Agrobiotecnología

(Universidad Pública de Navarra-CSICGobierno de Navarra), Campus

Arrosadía, 31006 Pamplona, Spain.