～生体物質の高感度リアルタイムモニター～ -...

ダイヤモンド電極の医療分野への展開～生体物質の高感度リアルタイムモニター～

慶應義塾大学理工学部化学科教授

栄長泰明

2

材料としての「ダイヤモンド」

特性数値摘要

新モース硬度 15 地球上の物質中最高

音速 1.8×104m/s 地球上の物質中最高

ヤング率 1050 GPa 地球上の物質中最高

体積弾性率 500 GPa 地球上の物質中最高

熱伝導度 900-2000 W/m·K 地球上の物質中最高

熱膨張率 0.8×10-6/K 地球上の物質中最小

光学的性質透明、等方、屈折、分散何れも大

屈折率 nD=2.417 非常に大

誘電率 5.5 非常に大

化学安定性強酸・強塩基に侵されない非常に大

デバイ温度 2240K 非常に高い

バンドギャップ 5.6eV 非常に大

着火温度約1000℃ 非常に高い

最も人を魅了する材料の一つ

3

ホウ素をドープした「導電性ダイヤモンド」

~ 1018 1019 1020 1021 1022ドープなし

絶縁体

(cm-3)

p型半導体

ダイヤモンド電極

金属性導体

10-2Ωcm

0.01 % 0.1 % 1 %0B/C

[B]

Boron-doped Diamond (BDD)

切削工具

多くの研究開発が盛ん

次世代半導体

4

ダイヤモンド電気化学関連論文数

2005

“Diamond Electrochemistry”

BKC/ Elsevier

Edited by：Akira Fujishima

Yasuaki Einaga

Tata N. Rao

Donald A. Tryk

初の英語本

Year

Edited by：Eric Brillas

Carlos A. Martinez-Huitle

WILEY

2011

“Synthetic Diamond Films”

論文数

初の日本語本

共立出版

2015年12月

栄長泰明著

日本化学会編

1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700

Raman Shift (cm-1

)

Inte

nsi

ty (

a.u

.)

ラマンスペクトル

sp3炭素 1333 cm-1

プラズマ

石英板

基板

真空ポンプ炭素源

H 2

H2

マイクロ波プラズマCVD装置によるダイヤモンド電極の作製

多結晶ダイヤモンド薄膜

20mm

+ ホウ素源B(OCH3)3

(CH3)2CO

マイクロ波

6

ダイヤモンドの電極機能開拓


水処理汚水浄化

オゾン水生成

有機電解合成

環境改善・修復技術

汚染物質センサー

環境センサー

生体計測センサー

医療への応用

Phys. Chem. Chem. Phys. 2011

Sci. Rep. 2012.

Sci. Rep. 2013.

CO2還元による有用物質合成

創薬への応用

Anal. Chem. 2012.

Electrochim. Acta. 2012.

Anal. Chem. 2013.

Anal. Chem. 2014.

Angew. Chem. Int. Ed. 2012.


Bull. Chem. Soc. Jpn. 2013.

Diamond Relat. Mater. 2013.

世界初・センサー実用化へ展開

2011年まで

2011以降

7

ダイヤモンド電極は何がすぐれているか？

広い電位窓

小さな充電電流

物理化学的安定性（高電位の印加が可能）

活性種（OH・など）の高効率生成

酸素発生水素発生

Au

8

ヒスタミンの測定

100μMヒスタミンを含む水溶液

電位 (V vs. SCE)

電流密度

(μA/cm

2)

ダイヤモンド電極では酸素が発生しにくい

ヒスタミンを含まない水溶液

0.1Mリン酸塩緩衝液(pH=7)中における、100μMヒスタミンのリニアスイープボルタモグラム

残留塩素の検出

J. Electroanal. Chem., 612, 29 (2008).・特許第4734097号低濃度領域（0－2ppm : 水道水の分析に有用）においても測定可能

検量線1.2

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0

Cu

rren

t D

en

sity

(m

A/c

m2)

120100806040200

Concentration (mg/l)

6

8

10

12

14

Time (min)

Cu

rre

nt

(nA

)

0 5 10

100

80

60

40

20

0

Cu

rren

t D

en

sity

(m

A/c

m2)

2.01.51.00.50.0

Concentration (mg/L)

6 ClO- + 3 H2O 2 ClO3- + 4 Cl- + 6 H+ + 3/2 O2 + 6 e-

現状：N,N-ジエチル（DPD）法（ジエチル‐p‐フェニレンジアミン）

プール水道水

10

0.8

0.6

0.4

0.2

Cu

rren

t D

en

sity

(m

A/c

m2)

1.41.31.21.11.00.90.8

Potential (V)

10 uM 20 50 100

Cu

rren

t D

ensi

ty (

mA

/cm

2)

OHOH

OO

OHOH

OO

シュウ酸の検出

10 mM

5 mM

1 mM

0.5 mM0.1 mM0.05 mM 100 nA

y = 110.31x + 159.88

R2 = 0.995

0

500

1000

1500

0 5 10C (mM)

I (n

A)

10 mM

5 mM

1 mM

0.5 mM0.1 mM0.05 mM 100 nA

y = 110.31x + 159.88

R2 = 0.995

0

500

1000

1500

0 5 10C (mM)

I (n

A)

超高感度

Anal. Chem., 78, 3467 (2006).

シュウ酸カルシウム

尿結石通常の尿中 : 70 – 450μ M

●残留塩素

●ヒ素

●グルコース（血糖値）

●シュウ酸

●グルタチオン（がんマーカー）

環境（水）中血液中・尿中・脳内

●6価クロム

●ドーパミンJ. Electroanal. Chem. ,612, 29 (2008).

Anal. Chem. , 78, 6291 (2006).

J. Electroanal. Chem. , 615, 145 (2008)

Chem. Lett., 39, 1055 (2010)

Electrochim. Acta., 55, 2824 (2010).

J. Electrochem. Soc., 158, F173 (2011).

Phys. Chem. Chem. Phys., 15, 142 (2013).

●亜鉛

●カドミウム

●セレン

J. Electroanal. Chem., 626, 156 (2009).

Phys. Chem. Chem. Phys., 13 ,16795 (2011).

Sci. Rep. 3, 3257 (2013).

●pH

Electrochim. Acta., 82, 9 (2012).

Int. J. Electrochem., 2012, 1 (2012).

Anal. Chem ., 78, 3467 (2006).

J. Electroanal. Chem ., 612, 201 (2008).

Anal. Chem., 80, 5783 (2008).

Biosens. Bioelectron., 26, 235 (2010).●アルシンガス


Anal. Chem ., 79, 8608 (2007).

Neuroscience Res., 71, 49 (2011).

Anal. Chem ., 78, 7857 (2006).

Biosens. Bioelectron., 24, 2684 (2009).

●ヨウ素Talanta, 103, 33 (2013).

●BOD（生物化学的酸素要求量）Anal. Chem., 84, 9825 (2012).

●COD（化学的酸素要求量）Anal. Chem., 86, 8066 (2014).

●オキシトシンSci. Rep., 6, 32429 (2016).

Sci. Rep. 2, 901 (2012).

Gastric Cancer, 1-9 (2016).

●タンパク質（がんマーカー）

12

初のダイヤモンド電極搭載センサー

ダイヤモンド電極搭載の重金属分析装置（2010年8月（株）堀場製作所製作）

日本経済新聞2010年8月2日

13

ダイヤモンドマイクロ電極

3次元拡散

小さなオーミック（ＩＲ）低下

小さなバックグランド電流

即応答

支持電解質不要

球拡散限界電流

将来、分析用途のダイヤモンド電極としては中心的存在になるはず！

14

作製条件

平板マイクロ

プラズマ出力 5000 W 2500 W

圧力 120 Torr 60 Torr

H2 流量 500 sccm 300 sccm

積層時間 6 h 12 h

炭素源

+ ホウ素 B(OCH3)3

(CH3)2CO

ダイヤモンドマイクロ電極の作製（マイクロ波プラズマCVD法）

15

ドーパミン（DA）の生体内測定

HO

HONH2

Re-adsorptionReceptor

Synapse

Release

Signal

DA containing vesicle

刺激信号

シナプスでのDA放出と再取り込み快・不快・報酬・学習

Dopamine (DA)

ニューロン

線条体

黒質

しかし・・・

脳内にはDAの電気化学検出において

妨害物質とされるアスコルビン酸（AA）が多量に存在。

脳内神経伝達物質

16

ドーパミン（DA）とアスコルビン酸（AA）の分離検出

DA＋AA

H

c c c c c c

δ+δ+ δ+

H H H H HH

c c c c c c

δ+δ+ δ+

H H H H H

水素終端

c c c c c c

δ-

oδ- δ-

oOHH H O

H

c c c c c c

δ-

oδ- δ-

oOHH H O

H

酸素終端

陽極酸化・酸素プラズマ処理

陰極還元・水素アニーリング

DA

AA

酸化電位の違いを利用した分子識別検出が可能

O

OHHO

HO

OH

O

c c c c c c

δ-

oδ- δ-

oOHH H O

H

c c c c c c

δ-

oδ- δ-

oOHH H O

H

δ-

δ-

静電反発

アスコルビン酸（AA）

17

電位依存性

Anal. Chem., 79, 8608 (2007).

In vivoでのドーパミン（DA）測定

MFB (Medial Forebrain Bundle;

内側前脳束) に電気刺激

DAの再取り込み阻害剤

in vitroのDAのものと一致

18

反応速度1μM ドーパミン

Slow recover

cf 1uM DA

7

8

9

10

11

-20 0 20 40sec

nA

CF 200mV

Slow response

Increasing

カーボンファイバー電極 oxBDD 1uM DA

0.8

1.0

1.2

1.4

-20 0 20 40sec

nA

oxBDD1000mV

Very stable

Quick response

Quick recover

Quick response

ダイヤモンドマイクロ電極

ダイヤモンド電極・・・非常に早い反応＋安定性

19

ドーパミンはどのタイミングで放出されるのか？

エサなし

エサあり

-0.5 0.0 0.5 1.0 1.5

Curr

ent

time /s

Openドーパミン放出反応

リアルタイム測定ができる！

えさがもらえる雰囲気を感じたとき？えさを見たとき？えさを食べるとき？

20

サル脳における報酬応答

パブロフの実験

ダイヤモンドマイクロ電極によりリアルタイムで報酬応答を確認

Neurosci. Res., 71, 49 (2011) .

光照射のみ（ジュースなし）でドーパミン放出を確認！

光を照射して2秒後にオレンジジュース

21

グルタチオン(Ｌ-γ-glutamyl-L-cysteinyl-glycine, GSH)

酸化型グルタチオン(Glutathione SS Glutathione, GSSG)

抗酸化物質:フリーラジカル・過酸化物などの活性酸素種から細胞を保護する補助的役割

GSH/GSSG 比は酸化的ストレスの指標

癌細胞：正常組織と比較してGSH濃度が高いG. K. Balendiran, et al., Cell Biochem. Funct., 22, 343 (2004).

グルタチオン in vivo 測定：がん評価への応用

●ストレスマーカーとして

●がんそのものの評価

http://ja.wikipedia.org/wiki/%E3%83%95%E3%82%A1%E3%82%A4%E3%83%AB:Glutathion.svg

http://ja.wikipedia.org/wiki/%E3%83%95%E3%82%A1%E3%82%A4%E3%83%AB:Glutathione_disulfide.svg

22

グルタチオン(GSH)

広い電位窓をもつダイヤモンド電極で測定可

1.3V (vs. Ag/AgCl)

腫瘍組織（がん）

正常組織（健康）

グルタチオン濃度

マウス組織 in vivo（生体内）グルタチオン濃度の測定

X線（6Gy）照射後

Sci. Rep., 2, 901 (2012).

23

胃酸（塩酸）

胃壁にある粘膜には胃小窩（胃腺の入口）という微細な穴

胃底腺（固有胃腺）（胃の2/3を占める）に存在する細胞・表層粘液細胞・頚部粘液細胞（副細胞）・壁細胞(parietal cell)・・エネルギーを消費して、小胞体上のプロトンポンプ（H+,K+ATPase）によってH+を腹腔内に汲み出す。このH+と別経路から排出されたCl-から胃酸（塩酸）が産生される

・主細胞

胃粘膜

胃がん細胞は壁細胞がなくなる→胃のpHが上昇

胃炎・胃がん・胃酸過多・逆流性食道炎などの診断に有効

胃液のpHを in vivo測定

Phys. Chem. Chem. Phys., 13 ,16795 (2011).

特許第5311501号

単純な水素発生電流にてpHをモニター

pHの簡便な測定

ポテンシオメトリー（定電流）

-1.6

-1.4

-1.2

-1

-0.8

-0.6

-0.4

-0.2

0

0.2

0 50 100 150 200 250

E v

s. A

g/A

gC

l / V

Time / s

0 A

-50 nA

0.1 M PBS (pH = 7.45)

を注入

Sci. Rep., 3, 3257 (2013).

マウス胃の中のpH直接測定

25

“愛情ホルモン” オキシトシン

✦ホルモン

✓ 子宮収縮

✓ 乳分泌

✦神経伝達物質

✓ 母子間の絆

✓ 信頼関係

✓ 性行動

Shen, H. Nature 2015, 522, 410.

→ 陣痛促進剤

→ 自閉症などの治療への応用

基礎研究の必要性

= 生体内における連続測定の需要

26

0.66 Vで酸化（＝チロシンの反応）

＜サイクリックボルタンメトリー＞

✓オキシトシン（OT） 0.1 mM, リン酸緩衝液 0.1 M (pH 7.4)

✓走査速度: 0.1 V/s

Permentier, H. P. et al. Rapid Communications

in Mass Spectrometry 2003, 17, 1585–1592.

チロシンの反応チロシン

オキシトシン

Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly

オキシトシンの電気化学

27

他電極との比較

BDD グラッシーカーボン白金

S/B 21.0 5.0 N/A

BDD：オキシトシンの高感度な測定が可能

28

0.1

10 µM

検出限界：50 nM (S/N=3)

オキシトシンの連続測定を実現（検出限界：50 nM）

Sci. Rep., 6, 32429 (2016).

29

日経産業新聞 2016.10.6

30

分子素子

センサーデバイス

インフルエンザウイルス

・水晶振動子(QCM) ：質量変化

・表面プラズモン共鳴 (SPR)法 : 光学特性

・電気化学測定：電流、電位

検出法

・抗体

・糖鎖 (多糖)

・ペプチド

認識デバイスセンサーの原理

ヘマグルチニン(HA)

宿主細胞への結合宿主細胞膜との融合

シアリダーゼ（ノイラミニダーゼ, NA）

ウイルスの出芽

インフルエンザウイルス

細胞表面にあるレセプター（シアル酸）と結合

31


HA結合性ペプチド

インフルエンザウイルスペプチドライブラリーから単離された糖鎖ミミックペプチド

・インフルエンザウイルスと選択的に結合・凍結乾燥が可能、安定・デンドリマー化や糖鎖修飾により活性が向上

ヘマグルチニン（HA）結合性ペプチドを利用

HA

32

(A) リンカー分子の電解グラフト

(B) 脱保護によるアルキニル基提示

(C) クリック反応によるペプチド固定化

電解グラフト

BDD*

B アルキニル基提示

C ペプチド固定化

脱保護

Aリンカー分子電界グラフト

クリック反応

ダイヤモンド電極への修飾

Lys

Ala-Arg-Pro-Leu-Arg

Lys(N3)Ala-Arg-Pro-Leu-Arg

N3

アジド基を導入したHA結合性ペプチド

リンカー分子

HAに結合する最小配列ARLPRを分岐させ、HAとの親和性を向上

インフルエンザウイルスの検出

-2

0

2

4

6

8

10

12

1 10 100 1000

ΔR

ct (

koh

m)

[H1N1] (pfu)

peptide

Lys

(ARLPR)2-K-KN3

Lys-N3

(ARLPR)2-K-KN3

(ペプチドあり)Lys-N3

(ペプチドなし)

Rapid test kit

イムノクロマトグラフィー

検出限界 : >1,000 pfu

A. Sakurai et al., Virus 4, (8), 1235 (2012)

20 pfu

選択的

pfu≒ the number of viruses

Proc. Natl. Acad. Sci., 113, 8981 (2016).

35




オゾン水生成

有機電解合成



環境センサー


医療への応用


Sci. Rep. 2012.

Sci. Rep. 2013.


創薬への応用

Anal. Chem. 2012.


Anal. Chem. 2013.

Anal. Chem. 2014.






36

ダイヤモンド電極は高電圧に耐える

ダイヤモンド電極は活性酸素種を効率的に発生させることができる

37

OHラジカルの発生

C. Comninellis, et al., Electrochim. Acta., 54, 2018 (2009). 他

ダイヤモンド電極：

活性種を効率的に発生させることができる

酸素が発生

OHラジカルが有機物を分解

ダイヤモンド：①→②普通の電極：①→③

38

ギ酸を電解HCOOH = 0.01M, 0.6A

ダイヤモンド

白金白金

ダイヤモンド

H2O •OH+H++e-

•OH+HCOOH CO2+H2O+H++e-

ダイヤモンド電極で効率的に有機物を分解

39




オゾン水生成

有機電解合成



環境センサー


医療への応用


Sci. Rep. 2012.

Sci. Rep. 2013.


創薬への応用

Anal. Chem. 2012.


Anal. Chem. 2013.

Anal. Chem. 2014.






40

e-

MeOH

MeO･

H+

Sub.

Sub.

･

ダイヤモンド電極を用いた新しい物質創製

メトキシラジカルの生成による新規反応・新規物質

有機電解合成への展開

試薬フリーの酸化・還元反応金属触媒フリーの合成

電極を使って電気で合成すると・・・

廃棄物が出ない爆発性がない残留金属も出ない電気代は安い!!

41

フローセルを作って高効率化

単位体積当たりの表面積の増大 → 電流効率の増大スケールアップが可能拡散の距離が小さい → 効率的なラジカルとの反応


42

条件を最適化すると・・・

骨芽細胞分化誘導活性を有する 4 を高効率に合成

イソオイゲノール (1) リカリンA (2) 3 4

MeOH, LiClO4

HO

MeO Me

O

MeMe

OMe

OH

OMe

HO

MeO

OMe

O

Me

MeO MeHO

MeO

OMe

OMe

Me

定電位で電解

抗腫瘍・抗炎症活性骨芽細胞分化誘導活性

フロー速度収率（％）

43

反応メカニズム

e- MeOH

MeO･H+

MeO･

MeOH

MeOHE

BDDanode

H+

E

major

Angew. Chem. Int. Ed., 51, 5443 (2012).


44




オゾン水生成

有機電解合成



環境センサー


医療への応用


Sci. Rep. 2012.

Sci. Rep. 2013.


創薬への応用

Anal. Chem. 2012.


Anal. Chem. 2013.

Anal. Chem. 2014.






45

• 燃料

• プラスチック

CO2 CxHyOze-, H+

還元

CO2還元による有用物質生成

46

電解でCO2を還元する試みは1980年代から盛んであった

1) CO2 + 2H+ + 2e- → CO + H2O2) CO2 + 2H+ + e- → HCOOH3) CO2 + 6H+ + 6e- → CH3OH + H2O4) CO2 + 8H+ + 8e- → CH4 + 2H2O5) 2H+ + 2e- → H2

効率が悪い電極の耐久性が乏しい圧力を加えるなど、条件が厳しい

CO2

電解液

e-

CO2

還元生成物

作用電極対電極

酸化反応

電源

メタノール中

41気圧、25℃

J. Electrochem. Soc., 141, 2097 (1994)


47

室温・大気圧下でのCO2還元

ファラデー効率 / %

ホルムアルデヒド (HCHO) HCOOH

HCOOHHCHO

HCOOCH3

HCOOCH3 CO

CO CH4

H2

H2

H2

H2

HCOOCH3

（ホルムアルデヒド）

（ギ酸）

（ギ酸メチル）


グラッシーカーボン

Angew. Chem. Int. Ed., 53, 871 (2014).

ホルムアルデヒドギ酸水素

0.1 M NaCl aq 62.3% 3.16% 22.0%

海水 35.7% 1.52% 57.6%

海水では？

48

日本経済新聞 2014年2月10日夕刊1面

49

CO2還元でホルムアルデヒドが生成するメカニズムは？

CO(ad)

CO2

CH2(ad) H(ad)

H2O

e-HCO2(ad)HCHO(ad)

ギ酸HCHO COHydro

carbon H2

e- e-

·CO2(ad)

e- e-

電極

e-

e-

•CO2－の吸着能が低い表面

•CO2－の吸着能が高い表面

電極

CO2-CO2

-CO2- CO2

-H

電極

CO2-HH HH

·CO2-(ad) CO + CO3

2-+CO2, +e-

·CO2-(ad) HCOO-

(ad)

+H+, +e-

ホルムアルデヒド水素

不活性な電極活性な電極

50




オゾン水生成

有機電解合成



環境センサー


医療への応用


Sci. Rep. 2012.

Sci. Rep. 2013.


創薬への応用

Anal. Chem. 2012.


Anal. Chem. 2013.

Anal. Chem. 2014.






51

オゾン水 “強力な酸化作用” , “残留性がない”

除菌、殺菌、脱臭、脱色水道水浄化器具の洗浄（医療現場）

～電解によるオゾン生成方式～薬品を使わない効率が良い大気中に排出する気体は酸素、水素のみ

オゾン水を作るオゾン水の濃度を測る

現状：酸素の放電によるものが主電解によるものは白金（Pt）電極が用いられている。

52

ダイヤモンド電極ではオゾンを発生させることができる

2H+ 2e-+ +H2OO2 + O3 2.07 V

6H+ 6e-+ +(3H2O O3 2.07 V)

4H+ 4e-+ +2H2O O2 1.23 V

H2O OH H+ e-+ +・ 2.85 V

酸性溶液

塩基性溶液

H2O 2e-+ +2OH-O2 + O3 1.24 V

2H2O 4e-+ +4OH- O2 0.40 V

OH- OH e-+・ 2.04 V

53

2017年2月発売ダイヤモンド電極によるオゾン水手洗い装置の製品化

【オゾン生成】 6H+ 6e-+ +3H2O O31.51 V

4H+ 4e-+ +2H2O O2 1.23 V

2H+ 2e-+ +H2OO2 + O3 2.07 V

従来技術とその問題点

●カーボンファイバー電極

物質の吸着

電極の耐久性が乏しい

感度に限界がある

リアルタイム計測が困難

新技術の特徴・従来技術との比較

• 高感度

• リアルタイム計測が可能

• 耐久性・安定性

• 仮に劣化しても回復処理が可能

想定される用途

• 血液、尿などの測定

• 腫瘍マーカーなどの生体内測定

• 薬物動態と疾病の相関に関する測定

• 治療効果の直接的判定

実用化に向けた課題

• 電極の量産化

• 必要とされる検出対象の絞り込み

• 系によっては選択性が課題

企業への期待

• 生体計測をはじめとしたさまざまな計測を必要とされる企業様

• どのような系のどのような物質の計測が求められているかご教示いただきたい

本技術に関する知的財産権

• 発明の名称：タンパク質又は病原体の新規検出方法

• 公開番号：WO2016/175049

• 出願人：学校法人慶應義塾

• 発明者：栄長泰明, 佐藤智典, 松原輝彦, 山本崇史

お問い合わせ先

慶應義塾大学研究連携推進本部

ＴＥＬ 03-5427-1439

ＦＡＸ 03-5418-6455

e-mail [email protected]

mailto:[email protected]

～生体物質の高感度リアルタイムモニター～ -...

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