identificaciÓn de genes potencialmente indicadores de
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IDENTIFICACIÓN DE GENES POTENCIALMENTE INDICADORES DE CAPACIDAD
GERMINATIVA, VIGOR, LONGEVIDAD Y DORMANCIA EN SEMILLAS DE DIFERENTES
ESPECIES DE PASIFLORAS A PARTIR DE SUS ORTÓLOGOS EN A. thaliana.
STEPHANIE ARIZA PEÑA
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial para optar al título de
Bióloga
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE BIOLOGÍA
BOGOTÁ D.C 2015
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IDENTIFICACIÓN DE GENES POTENCIALMENTE INDICADORES DE CAPACIDAD
GERMINATIVA, VIGOR, LONGEVIDAD Y DORMANCIA EN SEMILLAS DE DIFERENTES
ESPECIES DE PASIFLORAS A PARTIR DE SUS ORTÓLOGOS EN A. thaliana.
STEPHANIE ARIZA PEÑA
____________________________________ ___________________________________ Concepción Judith Puerta Bula Andrea Patricia Forero DECANA ACADÉMICA DIRECTORA DE CARRERA FACULTAD DE CIENCIAS FACULTAD DE CIENCIAS
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IDENTIFICACIÓN DE GENES POTENCIALMENTE INDICADORES DE CAPACIDAD
GERMINATIVA, VIGOR, LONGEVIDAD Y DORMANCIA EN SEMILLAS DE DIFERENTES
ESPECIES DE PASIFLORAS A PARTIR DE SUS ORTÓLOGOS EN A. thaliana.
STEPHANIE ARIZA PEÑA
APROBADO
______________________________ _________________________________________ Wilson Terán Pérez María Lucía Gutiérrez Gómez DIRECTOR JURADO
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NOTA DE ADVERTENCIA Artículo 23 de la resolución Nº 13 de julio de 1946 “La universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Sólo velará porque no se publique nada contrario al dogma y a la moralidad católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se ve en ellos el anhelo de buscar el bien y la justicia”.
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1. RESUMEN .......................................................................................................................................................... 7
2. PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN .................................................................................................................... 8
3. INTRODUCCIÓN .............................................................................................................................................. 9
4. MARCO TEORICO .......................................................................................................................................... 10
4.1 DORMANCIA .................................................................................................................................................... 10 4.1.1 LA DORMANCIA EXÓGENA DE LAS SEMILLAS DE LA FAMILIA PASSIFLORACEAE. ............................................... 11 4.1.2 ASPECTOS MOLECULARES DE LA DORMANCIA. ....................................................................................................... 11 DOG1: UN GEN CRUCIAL PARA LA DORMANCIA DE SEMILLAS EN A. THALIANA. ....................................................... 12 4.2 GERMINACIÓN. ................................................................................................................................................ 13 4.2.1 LOS PROBLEMAS DE GERMINACIÓN DE LAS SEMILLAS DE LAS PASSIFLORACEAE.............................................. 14 4.2.2 VIABILIDAD O CAPACIDAD GERMINATIVA ................................................................................................................ 14 La inactivación del ABA para la liberación de la dormancia y el progreso de la germinación. ...... 14 Los genes CYP707A1 y CP707A2 en la inactivación del ABA y en el aumento de la viabilidad de las semillas. ...................................................................................................................................................................................... 16 4.2.3 LONGEVIDAD. ............................................................................................................................................................... 17 AtLIG6: un gen implicado en la reparación del ADN. ....................................................................................... 17 4.2.4 VIGOR............................................................................................................................................................................. 17 4.2.5 LA RELACIÓN ENTRE LA LONGEVIDAD Y EL VIGOR. ................................................................................................ 18 PIMT 1 Y PIMT2: Dos genes implicados con la longevidad y el vigor germinativo de las semillas. 18 At3g08030: un gen de función desconocida pero asociada a mejorar el vigor y la longevidad de las semillas. ............................................................................................................................................................................... 20 4.3 DISEÑO DE PRIMERS DEGENERADOS SOBRE REGIONES GÉNICAS CONSERVADAS PARA LA IDENTIFICACIÓN
DE GENES HOMÓLOGOS A LOS REPORTADOS EN A. THALIANA. ............................................................................... 20
5. OBJETIVOS ...................................................................................................................................................... 21
5.1 OBJETIVO GENERAL: ....................................................................................................................................... 21 5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS: ................................................................................................................................ 22
6. ASPECTOS METODOLÓGICOS................................................................................................................... 22
6.1 DISEÑO DE PRIMERS DEGENERADOS PARA LOS GENES CANDIDATOS .......................................................... 22 6.2 AMPLIFICACIÓN, CLONACIÓN Y SECUENCIACIÓN DE LOS GENES CANDIDATOS ............................................ 24 6.2.1 MATERIAL VEGETAL. ................................................................................................................................................... 24 6.2.2 GERMINACIÓN DE SEMILLAS. ..................................................................................................................................... 24 6.2.3 EXTRACCIÓN DE ADN DE TEJIDO FOLIAR UTILIZANDO EL PROTOCOLO DE DOYLE & DOYLE (1991). ......... 25 6.2.4 DETERMINACIÓN DE LA CALIDAD, CONCENTRACIÓN Y PUREZA DEL ADN EXTRAÍDO. .................................... 26 6.2.5 AMPLIFICACIÓN DE LOS GENES CANDIDATOS DE LAS PASIFLORAS. ..................................................................... 26 6.2.6 CLONACIÓN DE PRODUCTOS DE PCR: ...................................................................................................................... 28 6.2.7 SECUENCIACIÓN DE PLÁSMIDOS PURIFICADOS ....................................................................................................... 30 6.3 ANÁLISIS DE LAS SECUENCIAS OBTENIDAS Y SUS RELACIONES FILOGENÉTICAS CON SECUENCIAS
HOMÓLOGAS REPORTADAS PARA PLANTAS. ............................................................................................................ 30
7. RESULTADOS ................................................................................................................................................. 31
7.1 DISEÑO DE PRIMERS DEGENERADOS PARA LOS GENES CANDIDATOS .......................................................... 31 7.2 EXTRACCIÓN DE ADN, AMPLIFICACIÓN Y CLONACIÓN DE SECUENCIAS GÉNICAS. ...................................... 31
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7.2.1 GERMINACIÓN DE SEMILLAS. ..................................................................................................................................... 31 7.2.2 DETERMINACIÓN DE LA CALIDAD, CONCENTRACIÓN Y PUREZA DEL ADN EXTRAÍDO. .................................... 32 7.2.3 AMPLIFICACIÓN DE LOS GENES CANDIDATOS DE LAS PASIFLORAS. ..................................................................... 32 7.2.4 VERIFICACIÓN DE CLONES RECOMBINANTES. ......................................................................................................... 37 7.2.5 SECUENCIACIÓN DE PLÁSMIDOS PURIFICADOS ....................................................................................................... 38 7.2.6 ANÁLISIS DE LAS SECUENCIAS CLONADAS OBTENIDAS .......................................................................................... 38 7.2.7 REPRODUCIBILIDAD DE LA AMPLIFICACIÓN DEL GEN AT3G08030. ................................................................... 40
8. DISCUSIÓN ...................................................................................................................................................... 40
8.1 DISEÑO DE PRIMERS DEGENERADOS .............................................................................................................. 40 8.2 PRIMER REPORTE DEL GEN AT3G08030 EN GRANADILLA.......................................................................... 41 8.3 AMPLIFICACIÓN INESPECÍFICA ....................................................................................................................... 42 8.4 DIFICULTADES EN LA AMPLIFICACIÓN ........................................................................................................... 43 8.5 ANÁLISIS FILOGENÉTICO ................................................................................................................................ 45
9. CONCLUSIONES ............................................................................................................................................. 48
10. RECOMENDACIONES ................................................................................................................................. 48
11. BIBLIOGRAFIA ............................................................................................................................................ 49
12. ANEXOS ......................................................................................................................................................... 53
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1. RESUMEN
La baja calidad de las semillas en los cultivos de pasifloras, asociada a una capacidad germinativa
y longevidad reducidas, constituyen un factor limitante en términos de propagación para los
productores en Colombia. Aunque se han desarrollado estudios con tratamientos pregerminativos
para mejorar la calidad de las semillas, los mecanismos moleculares que controlan algunos rasgos
indicadores de calidad como el vigor, la capacidad germinativa o la longevidad, son un aspecto
aún desconocido en las pasifloras, por lo que se hace necesario generar conocimiento básico
acerca de estos procesos biológicos. Objetivo: Identificar genes potencialmente indicadores de
vigor, capacidad germinativa, longevidad y dormancia en semillas de cuatro especies de
pasifloras: Granadilla (P. ligularis Juss.), gulupa (P. edulis Sims.), cholupa (P. maliformis L.) y
maracuyá (P. edulis f. flavicarpa O. Deg.), a partir de sus ortólogos en Arabidopsis thaliana.
Metodología: A partir de la selección de siete genes (At3g08030, AtLIG6, CYP707A1,
CYP707A2, DOG1, PIMT1 y PIMT2) previamente reportados como asociados con rasgos de
calidad (capacidad germinativa, vigor y longevidad) e identificados en la planta modelo A.
thaliana, se diseñaron primers degenerados sobre las regiones proteicas más conservadas por
medio del software CODEHOP, con el fin de amplificar las respectivas secuencias génicas
parciales en diferentes especies del género Passiflora. Los productos de PCR se clonaron en el
vector PGEM-T Easy (Promega) y posteriormente se enviaron a secuenciar los insertos. A partir
de las secuencias obtenidas, se verificó la identidad de la secuencia génica y se realizó un
alineamiento múltiple contra las secuencias reportadas en las bases de datos publicas con el fin de
analizar las relaciones filogenéticas de la secuencia con sus homólogas en diferentes especies
vegetales. Resultados: Primer reporte del gen At3g08030 en una especie de la familia
Passifloraceae (granadilla), un marcador molecular de longevidad y vigor de las semillas de A.
thaliana.
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2. PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN
Dentro de la familia Passifloraceae, el género Passiflora es el grupo de mayor importancia a nivel
comercial, tanto por la producción de frutos exóticos comestibles, así como por la llamativa
forma ornamental de sus flores (Hernández & Bernal, 2000).
Cerca del 90% de las 520 especies de pasifloras son originarias de América (representadas por 4
géneros: Ancistrothyrsus, Dilkea, Mitostemma y Passiflora), siendo Colombia el país con mayor
número de especies reportadas (164) y endémicas (58) (Marín, Caetano, & Posada, 2009).
Dentro de las especies destacadas a nivel nacional se encuentran por un lado la granadilla (P.
ligularis Juss.) y el maracuyá (P. edulis f. flavicarpa O. Deg.), debido a la fuerte demanda
comercial de sus frutos al interior del país y por otra parte, la gulupa (P. edulis Sims.) y la
cholupa (P. maliformis L.), cuyos frutos presentan propiedades nutricionales y organolépticas
llamativas tanto para el mercado nacional como internacional (Gutiérrez et al. 2011).
A pesar de la importancia económica de las pasifloras para Colombia, los cultivos de éstas
especies tienen bajos niveles de productividad, asociados a la siembra de semillas (principal
método de propagación por su bajo costo y facilidad) con bajos porcentajes de germinación, un
proceso que además es lento e irregular (Gutiérrez et al. 2011). Lo anterior se traduce en que las
plántulas derivadas a partir de semillas de baja calidad, presentan problemas de crecimiento y
desarrollo (vigor). Adicionalmente, los cultivos de pasifloras padecen serias enfermedades tanto
fúngicas (Fusariosis), como virales (Potyvirus) que contribuyen a afectar muy significativamente
su producción (Gutiérrez et al., 2011).
Aunque se ha probado el efecto de diferentes tratamientos pregerminativos (como priming,
estratificación y escarificación física y bioquímica de semillas) para mejorar los problemas de
germinación de las pasifloras (Gutiérrez et al., 2011), los estudios acerca de los mecanismos
genéticos y moleculares asociados a rasgos de calidad fisiológica de las semillas como el vigor, la
longevidad y la capacidad germinativa son, según la extensiva búsqueda bibliográfica realizada a
la fecha, inexistentes en pasifloras. Este vacío de conocimiento es un aspecto clave de la biología
de las semillas, que permanece inexplorado no sólo en especies tropicales como las pasifloras,
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sino en términos generales para la enorme mayoría de especies vegetales (Koornneef et al., 2002;
Ligterink et al., 2012).
A pesar de éstas limitantes, los recursos genéticos disponibles para la planta modelo Arabidopsis
thaliana han permitido identificar genes altamente conservados indicadores de capacidad
germinativa (CYP707A1 y CYP707A2), longevidad (AtLIG6) y vigor-longevidad (PIMT1, PIMT2
y At3g08030) (Rajjou et al., 2012). La validación de estos genes se ha realizado en diferentes
especies vegetales, incluyendo algunas filogenéticamente distantes como Wigandia urens y
Ceiba aesculifolia, en las cuáles los ortólogos de At3g08030 pudieron amplificarse exitosamente
con ayuda de primers degenerados (Garza Caligari et al., 2012).
Bajo este contexto se hace viable la identificación de genes potencialmente asociados con
capacidad germinativa, vigor, longevidad y dormancia en semillas de diferentes especies de
pasifloras, a partir de sus ortólogos reportados en A. thaliana, y que puedan convertirse en
indicadores potenciales de estos rasgos. Se espera así que este trabajo permita identificar alguno
de estos genes en pasifloras, abriendo la posibilidad de implementar estudios posteriores de
expresión génica diferencial y así contribuir a desentrañar los mecanismos moleculares y
regulatorios responsables de la baja calidad de las semillas de éste grupo taxonómico.
3. INTRODUCCIÓN
Las semillas, además de representar en la naturaleza la principal estrategia reproductiva de las
plantas con flores (Ventura et al., 2012), también corresponden al insumo más importante de la
industria agrícola, teniendo en cuenta que la productividad de los cultivos depende
principalmente de la calidad de sus semillas (Giraldo et al., 2000).
Según Popinigis (1985), la calidad de las semillas está definida por la sumatoria de sus atributos
genéticos, fisiológicos, sanitarios y físicos, y es por medio de indicadores de calidad fisiológica
como el vigor, la capacidad germinativa (viabilidad) y la longevidad de las semillas que se evalúa
el desempeño de sus funciones vitales.
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En la actualidad, el mejoramiento de la calidad de las semillas se ha centrado en su componente
fisiológico, mediante la inclusión de tratamientos pregerminativos como el priming, la
escarificación y la estratificación (Rajjou et al., 2012; Ventura et al., 2012). Sin embargo, los
aspectos biológicos y moleculares que regulan esta calidad fisiológica de las semillas son aún
poco conocidos (Ligterink et al., 2012).
A pesar de éstos hallazgos, los recursos genéticos, aproximaciones y herramientas moleculares y
genómicas disponibles para la planta modelo A. thaliana, han favorecido el hallazgo de genes
involucrados en la regulación de la germinación que se han convertido en indicadores de calidad
(en términos de longevidad, capacidad germinativa y vigor) de sus semillas, entre ellos figuran
At3g08030, AtLIG6, CYP707A1, CYP707A2, PIMT1 y PIMT2. Además se ha reportado DOG 1
como el principal involucrado en la dormancia de las semillas en A. thaliana (Bentsink et al.,
2006), convirtiéndolo en un gen regulador promisorio para ser identificado y evaluado en
especies que presentan dificultades para germinar, como es el caso de las pasifloras.
4. MARCO TEORICO
4.1 Dormancia
La definición de dormancia (o lantencia, como también se le conoce) es, al igual que la de
germinación, un tema difícil de abordar. Aunque ambas son estados de desarrollo diferentes, la
dormancia sólo puede medirse en ausencia de germinación y por lo tanto su definición se limita
hacia ese enfoque (Copeland & McDonald, 1995).
Para Hilhorst (1995) la dormancia es “el fallo de la germinación de una semilla viable e intacta
bajo condiciones que favorecen la germinación dentro de un periodo de tiempo determinado”. Sin
embargo, Finch-Savage & Leubner-Metzger (2006) resaltan que la dormancia no sólo debe ser
asociada con ausencia o fallo de la germinación, sino que también debe reconocerse como “una
propiedad innata de las semillas que define las condiciones ambientales en las que la semilla es
capaz de germinar”.
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Este rasgo fisiológico de las plantas superiores es heredado genéticamente y su intensidad es
definida por efecto del ambiente durante el desarrollo de las semillas (Copeland & McDonald,
1995; Koornneef et al., 2002). Su principal papel es retrasar la germinación de las semillas, por
medio de una drástica reducción del metabolismo, cuando las condiciones ambientales son
adecuadas pero proporcionan una baja probabilidad para completar su ciclo de vida (Bentsink et
al., 2006), implicando así un importante mecanismo de supervivencia para las plantas (Copeland
& McDonald, 1995; Koornneef et al., 2002).
La ventaja evolutiva del desarrollo de dormancia en algunas especies vegetales, es también
beneficiosa para los cultivos: permite un almacenaje prolongado de las semilla, previene la
brotación precosecha (viviparismo) y ayuda a mantener la calidad de las semillas (Taiz & Zeiger,
2010). No obstante, la persistencia de la latencia en las semillas se vuelve un problema en
términos de productividad, tal como se encuentra en las familias Passifloraceae, Fabaceae,
Malvaceae, Liliaceae, entre muchas otras (Copeland & McDonald, 1995).
4.1.1 La dormancia exógena de las semillas de la familia Passifloraceae.
El epispermo o cubierta seminal, representa en las especies de pasifloras no sólo una barrera
mecánica a la protrusión radicular por su marcado grosor, sino también una limitante química a la
germinación por las moléculas inhibidoras que libera. Esta combinación de dormancia mecánica
y química se conoce como latencia exógena, y es probablemente uno de los factores que explica
la baja germinación de las semillas de las Passifloraceae, el cual se ha venido intentado superar
mediante escarificación mecánica o química (Gutiérrez et al., 2011).
4.1.2 Aspectos moleculares de la dormancia.
La dormancia de las semillas es un rasgo típicamente cuantitativo (de superficial a profunda con
estados intermedios), controlado por múltiples loci que son afectados fuertemente por el ambiente
(Bentsink et al., 2006). Para su estudio se han utilizado principalmente mutantes inducidos en el
modelo A. thaliana, y que han permitido identificar diferentes tipos de genes involucrados en el
control de la germinación.
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Por un lado está el conjunto de genes implicados en la maduración de las semillas: en
Arabidopsis se han reportado como principales actores ABA-insensitive 3 (ABI3), FUSCA3
(FUS3) y LEAFY COTYLEDONS (LEC1 y LEC2), que codifican diferentes factores de
transcripción (Holdsworth, Bentsink, & Soppe, 2008). Mutantes de estos genes se asocian con
una reducción tanto de la maduración de las semillas como de su latencia. Este defecto
simultáneo en la maduración y la dormancia hace implícito que la imposición de la dormancia se
establece en etapas tardías del desarrollo de la semilla (Bentsink et al., 2006).
Por otra parte están los genes directamente relacionados con la ruta de síntesis del ácido abscísico
(ABA) -principal molécula involucrada en la inducción y el mantenimiento de la dormancia en
semillas-, como ABA 1, 9-cis-epoxicarotenoide dioxigenasa (NCEDs) y ABA2/GIN1/SDR1
(Bentsink et al., 2006; Holdsworth et al., 2008), cuyos mutantes presentan bajas concentraciones
de éste regulador durante el desarrollo de las semillas, provocando ausencia de dormancia
primaria (dormancia impuesta en la semilla mientras aún se encuentran unida a la planta madre)
en semillas maduras (Holdsworth et al., 2008).
Otro set de genes son los que no interfieren en la síntesis del ABA, pero que podrían participar en
la transducción de la ruta de señalización de éste fitorregulador, favoreciendo la inducción de la
dormancia, como DOF affecting germination (DAG) (Holdsworth et al., 2008).
Por último están los genes identificados mediante análisis de variación natural, que en el caso de
la dormancia, consiste en el gradiente de latencia (superficial a profundo) resultante de la
adaptación de las semillas a diferentes condiciones ambientales. La evaluación de éste rasgo
dentro de una población vegetal mediante análisis de loci de carácter cuantitativo (QTL, del
inglés Quantitative Trait Locus), ha permitido descifrar su variación genética (Bentsink et al.,
2006). En Arabidopsis, DELAY OF GERMINATION (DOG1) es el principal QTL inductor de
dormancia en sus semillas (Graeber et al., 2014).
DOG1: un gen crucial para la dormancia de semillas en A. thaliana.
En A. thaliana, DOG1 (At5g45830) es un gen de 1919 pb que codifica una proteína de 291 aa.
Pertenece a una pequeña familia de genes, junto con 4 integrantes más: DOG1-LIKE 1-4
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(DOGL1-4). Aunque los miembros de la familia DOG1 poseen secuencias conservadas, el único
gen asociado con dormancia es DOG1 (Bentsink et al., 2006).
Con el análisis de la variación natural de la dormancia de una población de Arabidopsis se
comprobó que los alelos de DOG1 se expresan de forma codominante y que juegan un papel
crucial en la inducción de la latencia de sus semillas: mutantes inducidos dog1 no presentan
ningún estado de dormancia (Holdsworth et al., 2008).
La acción precisa de la proteína codificada por DOG1 permanece desconocida, sin embargo, se
ha demostrado que no interfiere en la ruta transducción de señales de ABA: los mutantes dog1
son sensibles al tratamiento con ABA exógena (Bentsink et al., 2006).
La transcripción de DOG1 es exclusiva de las semillas y en A. thaliana, ocurre 9 días después de
la polinización, llegando a su máxima expresión al final del desarrollo. Después de la imbibición
caen sus valores de expresión, lo que, al coincidir con el inicio de la germinación, permite
atribuirle a este gen un carácter de indicador del estado de dormancia (Bentsink et al., 2006).
4.2 Germinación.
La germinación es un proceso que incorpora eventos sucesivos. Empieza con la absorción de
agua por la semilla seca y termina con el alargamiento del eje embrionario, que se hace evidente
con la protrusión de la radícula (Bewley, 1997).
El progreso en la germinación se relaciona directamente con la incorporación de agua por parte
de la semilla, en un proceso trifásico (Finch-Savage & Leubner-Metzger, 2006):
Fase I ó Imbibición: Absorción rápida de agua por la semillas que reactiva el metabolismo
respiratorio y los procesos de transcripción-traducción en el embrión.
Fase II: Cesa la absorción de agua, se movilizan las reservas al embrión y se rompe la testa.
Fase III: Se reanuda la absorción de agua, se expande el embrión, rompiendo el endospermo para
permitir la protrusión de la radícula.
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Dentro de los factores o rasgos importantes asociados con la germinación de las semillas, se
encuentran la capacidad germinativa, el vigor germinativo y la longevidad (Gutiérrez et al.,
2011).
4.2.1 Los problemas de germinación de las semillas de las Passifloraceae.
Se ha reportado en la literatura que los miembros de la familia Passifloraceae tienen una
germinación lenta (Cárdenas, 2011).
En especies que crecen en clima frío, como la granadilla (P. Ligularis), el tiempo estimado de
inicio de germinación está entre los 19 y 25 días después de la siembra, alcanzando un máximo
entre los 30 y 60 días (Cárdenas, 2011), mientras que para gulupa se ha reportado que el inicio
de la germinación se presenta después de los 20 a 30 días de la siembra (Velásquez, Melgarejo, &
Stanislav, 2012).
En especies que crecen en clima cálido, como maracuyá y cholupa, el tiempo de germinación es
más corto respecto a los de clima frío, reportándose para maracuyá a los 9 días de las siembra
(Copete, 2011) y para cholupa después de 5 a 7 días.
Adicionalmente, las pasifloras presentan problemas de uniformidad en la germinación (Escobar,
2011), asociado a bajos porcentajes de germinación y a una baja población de plántulas
establecidas (Gutiérrez et al., 2011), lo que se traduce en problemas de vigor y viabilidad, dos
factores clave en la calidad fisiológica de las semillas y plántulas derivadas..
4.2.2 Viabilidad o capacidad germinativa
La viabilidad de las semillas se mide por su capacidad para germinar y establecer plántulas
normales. Desde un punto de vista fisiológico, representa la capacidad de mantenerse
metabólicamente activas para producir, cuando las condiciones son adecuadas, la energía
necesaria para germinar y establecer plántulas normales (Copeland & McDonald, 1995).
La inactivación del ABA para la liberación de la dormancia y el progreso de la
germinación.
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El ABA es un regulador del desarrollo y crecimiento de las plantas que participa en la inducción
y el mantenimiento de la dormancia en las semillas. La disminución de sus concentraciones
después de la imbibición de la semilla, permite la ruptura de la dormancia y el progreso de la
germinación (Nonogaki et al., 2010).
Existen dos rutas de inactivación del ABA: conjugación y oxidación (Figura 1). La ruta de
conjugación, al igual que la ruta oxidativa, ocurre en el citoplasma del embrión, el endospermo y
la cubierta seminal y consiste en la unión covalente del ABA con un monosacárido, por medio de
una enzima glucosiltransferasa. El principal conjugado, glucosil éster de ABA (ABA-GE), se
almacena en el retículo endoplasmático y en la vacuola, donde se sitúan enzimas glucosidasas
que pueden hacer reversible la conjugación y permitir el reciclaje del ABA (Arc et al., 2013).
Figura 1. Ruta de inactivación del ABA. En el citosol, el ABA puede inactivarse por oxidación (por medio de la
enzima 8’ hidroxilasa codificada por el gen CYP707A) y por conjugación (mediante la unión covalente a un
monosacárido). Ácido faseico (PA), ácido dihidro-faseico (DPA), glucosil éster de ABA (ABA-GE), glucosidasas
(BG), glucosil tranferasa (UGT).
La ruta oxidativa es la principal ruta de inactivación del ABA. Las enzimas 8’ hidroxilasas,
codificadas por genes de la familia CYP707A, son responsables de la formación de grupos
inestables hidroxilo de ABA (7’HO ABA, 8’HO ABA y 9’HO ABA) que por isomerización
espontánea forman el catabolito ácido faseico (PA), el cual se reduce a ácido dihidrofaseico (la
Modificado de Arc et al., (2013).
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forma más inactiva) por una reductasa aún desconocida (Arc et al., 2013). Los grupos hidroxilos
de ABA y sus catabolitos son a su vez un blanco fácil de conjugación (Arc et al., 2013).
Los genes CYP707A1 y CP707A2 en la inactivación del ABA y en el aumento de la
viabilidad de las semillas.
La síntesis y degradación del ABA son procesos clave para regular las concentraciones de ésta
fitohormona que varían durante el desarrollo, maduración y germinación de las semillas, así
como en eventos post-germinativos (Okamoto et al., 2006). Entre las vías de inactivación, la 8’
hidroxilación del ABA es la ruta predominante, catalizada por enzimas codificadas por los genes
CYP707A, pertenecientes a una subfamilia de genes de las P450 monooxigenasas (Arc et al.,
2013; Okamoto et al., 2006)
Aunque se han encontrado cuatro miembros de los CYP707A codificantes de las enzimas 8’
hidroxilasas (CYP707A 1-4), CYP707A1 y CYP707A2 son las principales isoformas involucradas
en la 8’ hidroxilación del ABA, presentando diferentes patrones de expresión (Okamoto et al.,
2006).
Como se mencionó con anterioridad, los niveles de dormancia y por ende el potencial
germinativo, se establecen dependiendo de las concentraciones de ABA durante el desarrollo de
las semillas y no por los encontrados en semillas ya maduras, donde induce y mantiene la
dormancia ya establecida (Okamoto et al., 2006). CYP70A1 es el principal gen expresado en el
catabolismo del ABA en estados intermedios de desarrollo de las semillas. Por medio de
mutantes knock out en cyp707a1, se demostró que la expresión de CYP707A1 afecta directamente
los niveles de dormancia y viabilidad de las semillas, al encontrar que estos mutantes presentaban
un fenotipo más dormante y con menor capacidad germinativa comparado con genotipos
silvestres (Okamoto et al., 2006).
Por otro lado, CYP707A2 es quien presenta mayor expresión durante la germinación de semillas
maduras, relacionándose con la rápida caída de las concentraciones de ABA cuando la semilla
atraviesa la fase de imbibición, lo que permite romper el periodo de latencia y dar paso a la
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germinación. Mutantes cyp707a2 exhiben fenotipos hiperdormantes (Nonogaki et al., 2010;
Okamoto et al., 2006).
4.2.3 Longevidad.
La longevidad de las semillas corresponde al periodo de tiempo en el cual éstas pueden
permanecer almacenadas manteniéndose viables (Taiz & Zeiger, 2010). Aunque la máxima
viabilidad (o máxima capacidad germinativa) de las semillas se alcanza en su madurez
fisiológica, las condiciones que provee la planta madre impiden su germinación (Copeland &
McDonald, 1995). La madurez fisiológica corresponde al punto en el que las semillas alcanzan
su máximo peso seco, debido a la translocación de proteínas, lípidos y carbohidratos desde la
planta madre. Estas macromoléculas sirven como material de reserva para favorecer la
autonomía de la semilla una vez se separa de su planta madre (Copeland & McDonald, 1995).
Cuando las semillas superan este punto, comienzan a envejecer y deteriorarse (Pandey, 1996). La
longevidad depende entonces de las estrategias que se activen para contrarrestar estos daños, que
se generan principalmente en ácidos nucleicos y proteínas (Pandey, 1996).
AtLIG6: un gen implicado en la reparación del ADN.
El gen AtLIG6 se ha destacado como el mayor determinante de longevidad de las semillas de A.
thaliana (Rajjou et al., 2012). Este gen codifica la enzima ADN ligasa VI, esencial para unir
ADN de cadena doble o sencilla, que ha sido fragmentado por efecto del estrés oxidativo que se
genera por procesos de deshidratación-rehidratación durante el desarrollo y germinación de las
semillas o por el almacenamiento prolongado de las mismas (Rajjou et al., 2012). En estudios
con mutantes atlig6, se encontró que además de un retraso en la germinación, las semillas de A.
thaliana sufrían un envejecimiento prematuro (pérdida de longevidad) (Waterworth et al., 2010).
4.2.4 Vigor.
En 1876, Fredrich Nobbe determinó que además de la germinación, la velocidad y la uniformidad
de éste proceso son dos parámetros adicionales indicadores de calidad en las semillas (Copeland
& McDonald, 1995), naciendo así el concepto de vigor.
18
Desde un punto de vista operacional, el vigor se define como un rasgo que surge de la sumatoria
de las propiedades que determinan el potencial de un lote de semillas, para lograr una
germinación rápida y uniforme y un óptimo desarrollo de plántulas, bajo un amplio rango de
condiciones ambientales (Rajjou et al. 2012).
Desde un punto de vista más estricto, el vigor se considera un rasgo fisiológico resultante de la
suma de las propiedades que determinan el nivel de actividad y el desempeño de un lote de
semillas durante su germinación y emergencia. El nivel de actividad de las semillas está
establecido por su constitución genética, tamaño, peso e integridad, así como por factores
ambientales y la presencia de patógenos, entre otros (Copeland & McDonald, 1995). Por otra
parte, el desempeño depende de la actividad metabólica de las semillas durante la germinación,
de la velocidad y uniformidad en la germinación y emergencia de las plántulas, y de la habilidad
de las plántulas para emerger bajo condiciones ambientales desfavorables (Copeland &
McDonald, 1995).
4.2.5 La relación entre la longevidad y el vigor.
A pesar de que el vigor y la longevidad son dos rasgos fisiológicos diferentes, los dos confluyen
en un aspecto: requieren la adecuada funcionalidad del proteoma de las células de las semillas
para que los procesos ocurran de forma correcta (Verma et al., 2013).
La integridad de las proteínas de membrana para evitar la lixiviación de iones permite obtener
semillas vigorosas (Verma et al., 2013), mientras que en términos de longevidad, se requiere de
enzimas antioxidantes y proteínas protectoras de choque térmico (Rajjou & Debeaujon, 2008).
PIMT 1 Y PIMT2: Dos genes implicados con la longevidad y el vigor germinativo de las
semillas.
En condiciones naturales, el agua del suelo actúa como un priming que además de mejorar la
viabilidad y el vigor germinativo, rompiendo la dormancia fisiológica, aumenta la longevidad de
las semillas. Sin embargo, en el suelo las semillas también quedan expuestas a factores de estrés
biótico y abiótico que afectan la integridad de sus macromoléculas, acelerando el proceso de
envejecimiento (deterioración) (Garza Caligari et al., 2012).
19
El desequilibrio entre los agentes dañinos del suelo y el priming natural, al igual que el
almacenamiento bajo condiciones subóptimas de temperatura y humedad, causan en las semillas
una rápida y progresiva deterioración que se refleja en la reducción de su vigor germinativo y
longevidad (Garza Caligari et al., 2012; Ogé et al., 2008). Aunque las modificaciones covalentes
que sufren las proteínas de forma espontánea son una de las principales causas de ésta
deterioración (Ogé et al., 2008), existen enzimas que reparan tales daños, como es el caso de la L-
isoaspartil O-metiltransferasa (PIMT) (Ogé et al., 2008; Verma et al., 2013).
Las PIMT son enzimas altamente conservadas. Se han identificado en diferentes tipos de
organismos, incluyendo bacterias, hongos, nematodos, mamíferos y plantas (Verma et al., 2013).
Su función se centra en reducir los residuos anormales isoaspartilo que se acumulan
espontáneamente en las proteínas a partir de la deshidratación y desaminación que sufren
respectivamente, los residuos L-aspartilo y L-asparaginilo de los péptidos (Ogé et al., 2008).
Mediante la transferencia de un grupo metilo de una S-adenosil-L-metionina (AdoMet) al
carboxilo libre del residuo anormal de isoaspartilo, la PIMT participa en el primer paso de la ruta
que convierte los residuos anormales isoaspartilo a los normales L-aspartilo, permitiendo
devolver la estructura original y funcional de las proteínas (Verma et al., 2013).
A diferencia de los otros organismos donde se han encontrado las PIMT, en las plantas (A.
thaliana) existen dos genes codificantes: PIMT1 y PIMT2. La acción reparadora de proteínas por
parte de las enzimas codificadas por estos dos tipos de genes es exclusiva de las semillas y se
asocia en ambos casos con vigor germinativo y longevidad (Ogé et al., 2008; Verma et al.,
2013).
En el caso de PIMT1, la inducción de un mutante de A. thaliana pimt1-1 que aumenta la
acumulación de la enzima PIMT1 (ganancia de función), redujo residuos anormales isoaspartilo
en las proteínas y mejoró la longevidad y el vigor germinativo que las semillas silvestres (Ogé et
al., 2008). Dentro de los sustratos de PIMT1 están las proteínas de choque térmico y algunas
enzimas antioxidantes, las cuales son indispensables para la longevidad de las semillas. Otro
sustrato son las proteínas de membrana, cuya integridad y funcionalidad son requeridas para
obtener alto vigor en las semillas (Verma et al., 2013).
20
En el caso de PIMT2, mutantes obtenidos en garbanzo y que sobre-3expresan el gen también
tienen mejor longevidad y vigor germinativo, pero la acción de las enzimas se realiza
principalmente sobre proteínas nucleares, a diferencia de PIMT1 cuya acción se da más sobre
proteínas citosólicas (Verma et al., 2013).
At3g08030: un gen de función desconocida pero asociada a mejorar el vigor y la
longevidad de las semillas.
Recientemente se describió el gen At3g08030 como un marcador molecular de longevidad y
vigor germinativo. Este gen pertenece a la familia de las “Dominio con función desconocida
642” (DUF642, por sus siglas en inglés Domain of Unknown Function 642”), que codifica
proteínas de pared celular, altamente conservadas y específicas de espermatofitas, con un
dominio de unión a carbohidratos. En el caso de At3g08030, se ha reportado específicamente, que
el dominio de unión es a celulosa (Garza Caligari et al., 2012).
Aunque la acción precisa del gen se desconoce, tratamientos de deterioración controlada
(cambiando condiciones óptimas de temperatura y humedad durante el almacenamiento) en
semillas de A. thaliana y en dos especies más de familias distantes, Wigandia urens y Ceiba
aesculifolia Kunth, permitieron identificar que el transcrito de At3g08030 no se presenta bajo
estas condiciones en ninguna de las 3 especies, pero si cuando las semillas son altamente viables
al ser tratadas con hidropriming y matrix priming antes y después de la deterioración,
demostrando su potencial como marcador molecular de longevidad y vigor en diferentes especies
vegetales (Garza Caligari et al., 2012).
4.3 Diseño de primers degenerados sobre regiones génicas conservadas para la identificación
de genes homólogos a los reportados en A. thaliana.
Los genomas y proteomas completos de la planta modelo A. thaliana y demás recursos asociados,
son una herramienta de fácil acceso para el diseño de primers (cebadores, iniciadores u
oligonucleótidos), que permiten la amplificación de genes homólogos de otras especies vegetales
cuyos genomas son aún desconocidos (Giménez & Colmenares, 2015), como es el caso de las
pasifloras.
21
Existen diversos programas bioinformáticos o herramientas para el diseño de primers
degenerados: Consensus Degenerate Hybrid Oligonucleotide Primer (CODEHOP), ha sido
ampliamente utilizado para diseñar primers degenerados con el fin de identificar genes ortólogos
(genes homólogos en dos especies diferentes, que han divergido de un ancestro común a partir de
un evento de especiación) y parálogos (genes homólogos dentro de un mismo genoma derivados
de un evento de duplicación génica) en plantas, animales y bacterias (Giménez & Colmenares,
2015). CODEHOP es un software que utiliza los bloques conservados de aminoácidos producto
del alineamiento múltiple de secuencias proteicas, para diseñar primers degenerados, destinados a
amplificar mediante PCR las secuencias nucleotídicas entre éstos bloques (Rose et al., 2003).
Los primers degenerados CODEHOP consisten en un pool de primers que presentan una región
degenerada 3’ (core) y una región 5’ consenso no degenerada (clamp). El core representa en cada
primer del pool, una de las posibles combinaciones de los codones que codifican 3-4
aminoácidos de un dominio proteico. El clamp es la secuencia nucleotídica más probable de los
codones que codifican los aminoácidos conservados que flanquean al motivo proteico, por esto su
función es estabilizar la región degenerada durante su fusión a la cadena molde, facilitando la
amplificación (Rose et al., 2003).
Diferentes parámetros se tienen en cuenta al momento de diseñar oligonucleótidos con el fin de
que resulten eficientes durante la amplificación: longitud, porcentaje de guanina citosina (GC),
Tm (temperatura de fusión de los primers a la hebra molde), presencia de G o C en el extremo 3’,
grado de degeneración y grado de “strictness” de la degeneración (Sambrook et al., 2000).
Así contando con toda la variedad de recursos disponibles para A.thaliana y con la herramienta
CODEHOP, se facilita aplicar este conocimiento a la identificación de genes de interés. En este
caso, genes candidatos potencialmente asociados a rasgos de vigor, longevidad, capacidad
germinativa y dormancia en las pasifloras.
5. OBJETIVOS
5.1 Objetivo general:
22
Identificar genes potencialmente asociados con vigor, longevidad, germinación y dormancia de
semillas en 4 especies de pasifloras: granadilla (P. ligularis Juss.), gulupa (P. edulis Sims.),
cholupa (P. maliformis L.) y maracuyá (P. edulis f. flavicarpa O. Deg.) a partir de sus ortólogos
en Arabidopsis thaliana.
5.2 Objetivos específicos:
1. Diseñar primers degenerados para amplificar los genes candidatos At3g08030, AtLIG6,
CYP707A1, CYP707A2, DOG 1, PIMT1 y PIMT2 en cuatro especies de pasifloras (granadilla,
gulupa, cholupa y maracuyá).
2. Amplificar, clonar y secuenciar los genes candidatos At3g08030, AtLIG6, CYP707A1,
CYP707A2, DOG 1, PIMT1 y PIMT2 en cuatro especies de pasifloras (Granadilla, gulupa,
cholupa y maracuyá).
3. Realizar un análisis filogenético con las secuencias de los genes candidatos obtenidas y sus
ortólogos de las bases de datos.
6. ASPECTOS METODOLÓGICOS
La presente investigación se llevó a cabo durante el segundo semestre del año 2015 en el
laboratorio de Biología Molecular Vegetal (LBMV) (206A) de la Pontificia Universidad
Javeriana, en conjunto con el laboratorio de Fisiología Vegetal (LFV) (212 B) de la misma
institución, ambos pertencientes al grupo de investigación de Biología de Plantas y Sistemas
Productivos.
6.1 Diseño de primers degenerados para los genes candidatos
El diseño de los primers degenerados necesarios para llevar a cabo la amplificación de los 7
genes candidatos, se realizó con base en las secuencias proteicas que codifican éstos genes en A.
thaliana, obtenidas de la base de datos pública National Center for Biotechnology Information
(NCBI) (http://www.NCBI.nml.nih.gov/).
23
Para cada secuencia proteica de interés se realizó un alineamiento múltiple contra las secuencias
proteicas de diferentes especies vegetales (Anexo 1) arrojadas por la herramienta COBALT
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/cobalt.cgi?link_loc=BlastHomeLink).
Con el resultado de cada alineamiento, se obtuvieron bloques de secuencias proteicas
conservadas a través del programa BlockMaker
(http://blocks.fhcrc.org/blocks/make_blocks.html), los cuales fueron empleados para el diseño de
los primers degenerados, por medio del software en línea CODEHOP
(http://blocks.fhcrc.org/codehop.html).
Un parámetro general para el diseño de los siete primers en CODEHOP fue la tabla de uso de
codones. Esta herramienta se utiliza para convertir las secuencias peptídicas en secuencias
nucleotídicas, a partir del uso preferencial de codones que tenga el genoma de la especie en
estudio (Rose et al., 2003). Dentro del listado de especies que ofrece ésta herramienta no hubo
ningún miembro de la familia Passifloraceae. Sin embargo, Ricinus communis L. fue la especie
filogenéticamente más cercana al pertenecer al mismo orden taxonómico de las pasifloras
(Malpighiales), razón por la que se utilizó la tabla de uso preferencial de codones de ésta especie
para el diseño de los primers de todos los genes candidatos. De igual forma, la temperatura
también fue un parámetro común, empleando 58°C para el diseño de todos los primers.
El grado degeneración (que corresponde al producto de los nucleótidos en las posiciones
degeneradas) y el “strictness” de la degeneración (que corresponde al grado de representatividad
de los nucleótidos que están en las posiciones degeneradas) utilizados en CODEHOP para el
diseño de cada uno de los primers se muestran en el anexo 2. Para los genes At3g08030, DOG1 y
PIMT2, se requirió aumentar éstos dos parámetros (grado de degeneración 150 y “stricness” de la
degeneración hasta 0,15) puesto que con los parámetros por defecto (grado de degeneración: 128
y “strictness” : 0,00) no se logró obtener la secuencia forward de los primers.
24
6.2 Amplificación, clonación y secuenciación de los genes candidatos
6.2.1 Material vegetal.
Las semillas de cholupa se obtuvieron de un lote de semillas de 7 meses de almacenamiento del
laboratorio de Fisiología Vegetal de la Pontificia Universidad Javeriana, mientras que las semillas
de granadilla, maracuyá y gulupa se obtuvieron de frutos provenientes de almacenes de cadena.
Los frutos de granadilla y maracuyá se seleccionaron en estado 5 de maduración (ICONTEC,
1977), mientras que el fruto de gulupa se escogió en estado 3 (Pinzón et al., 2007). Éstos grados
de madurez corresponden respectivamente, al punto en el que las semillas han alcanzado su
máximo vigor y poder germinativo (Gutiérrez et al., 2011; Pinzón et al., 2007) a lo cual se conoce
como madurez fisiológica (Ruiz et al., 2003).
La extracción de todas las semillas se realizó manualmente. Se les removió el arilo con ayuda de
un colador y agua de grifo y posteriormente se secaron por 5 días bajo sombra en un lugar
ventilado, dejándolas sobre papel absorbente con la intención de disminuir sus niveles de
humedad y así favorecer el proceso de imbibición (Velásquez et al., 2012).
6.2.2 Germinación de semillas.
Debido a la latencia exógena que presentan las semillas de las pasifloras, se probaron dos
diferentes tratamientos pregerminativos de escarificación mecánica: despunte basal y
escarificación con lija, con el fin de mejorar el porcentaje y la velocidad de germinación de las
semillas de maracuyá, granadilla, cholupa y gulupa.
La escarificación mecánica, que consiste en debilitar o remover parcial o completamente la
cubierta seminal, se ha reportado como un buen método para mejorar la velocidad y el porcentaje
de germinación en las pasifloras (Copete, 2011; Cárdenas, 2011 & Gutiérrez et al., 2011). En
semillas de maracuyá y cholupa se han obtenido mejores resultados utilizando la escarificación
mecánica con lija (Wagner et al., 2005), mientras que en granadilla y gulupa, se han logrado con
escarificación mecánica de despunte basal bajo condiciones de oscuridad (Gutiérrez et al., 2011),
razón por la que se eligieron éstos parámetros para replicarlos en el actual trabajo.
25
El despunte basal (cercano al micrópilo) de las semillas de granadilla y gulupa se realizó con un
cortaúñas, procurando evitar daños a la radícula del embrión. Para la escarificación de las
semillas de maracuyá y cholupa, se utilizó una lija de grano fino y se lijó suavemente el extremo
basal de cada semilla (Cárdenas, 2011; Gutiérrez et al., 2011).
Una vez escarificadas, se transfirieron 100 semillas por cada especie a bandejas plásticas sobre
papel absorbente y humedeciéndolas con 25 mL de agua desionizada. Posteriormente se
transfirieron al fitotrón (Panasonic) del LFV, bajo temperatura constante de 26°C, humedad
relativa del 80% y luz-oscuridad (12/12h). Las bandejas con semillas de granadilla y gulupa se
dejaron en oscuridad permanente recubriéndolas con papel aluminio. En cuanto la longitud de la
radícula de las semillas de las cuatro especies alcanzó los 5 mm se consideraron como
germinadas (Delanoy et al., 2006), se transfirieron a bandejas de germinación con sustrato
tierra/turba. Las plántulas de maracuyá y cholupa se dejaron crecer en el vivero del LBMV, bajo
condiciones de temperatura de 28-29°C y luz-oscuridad (16/8h) mientras que las semillas de
granadilla y gulupa se dejaron en el vivero del LFV a 20°C y luz-oscuridad (16/8h).
6.2.3 Extracción de ADN de tejido foliar utilizando el protocolo de Doyle & Doyle (1991).
El ADN genómico de granadilla, maracuyá, cholupa (semillas de gulupa tuvieron poco éxito de
germinación) se extrajo a partir de tejido foliar (material más fácil de trabajar que el de semillas)
de plántulas de aproximadamente 20 días de germinación, siguiendo el protocolo de Doyle &
Doyle (1991).
Se emplearon 4 plántulas diferentes de cada especie vegetal para cada tratamiento. La extracción
de ADN foliar se describe a continuación.
Con nitrógeno líquido se maceraron 20 mg de tejido foliar de cada muestra. El polvo fino
obtenido de cada una se transfirió en un tubo diferente de microcentrífuga de 2 ml a los cuales se
añadieron 900 μl de buffer de extracción (Tris HCl 1M pH 7.5, EDTA 0.5M pH 8.0, citrato de
sodio 10% (p/v) pH 7.6, sarcosyl en agua 5% (p/v), β mercaptoetalnol 2%). Los tubos se
agitaron en vortex y se incubaron a 65°C por 1 hora, invirtiéndolos cada 15 min. Se adicionaron
26
600 μl de cloroformo: alcohol isoamílico (v/v) (24:1) a cada muestra y se centrifugaron a 10.000
r.p.m por 20 min. A nuevos tubos se transfirieron 600 μl del sobrenadante de cada muestra y se
adicionó 900 μl de isopropanol frío (-20°C) y se dejaron incubando durante toda la noche.
Por último se centrifugaron todos los tubos a 13.000 r.p.m. por 20 min a 4°C, se descartó el
sobrenadante y se lavó el pellet con 1 ml de etanol al 70%. Se centrifugaron de nuevo a 13.000
r.p.m por 5 min, se descartó el sobrenadante y se dejó secar el pellet con el tubo invertido. El
ADN de cada muestras fue resuspendido en 50 μl de buffer TE (Tris HCl 10mM pH 8.0, EDTA
50 mM pH 8.0), con 5 μl de ARNasa incubados a 37°C por 30 min.
6.2.4 Determinación de la calidad, concentración y pureza del ADN extraído.
El ADN extraído de cada muestra fue corrido por electroforesis horizontal, en geles de agarosa al
1% (p/v), teñidos con SYBR®Safe (Invitrogen) y visualizados en un transiluminador de luz UV
para comprobar su integridad.
Las concentraciones (ng/μl) de las muestras se estimaron por espectrofotometría de
absorbancia a una longitud de onda de 260 nm utilizando el espectrofotómetro
NanoDropTM 1000. La pureza del ADN también se estimó con el mismo equipo, a través de la
relación de absorbancia A260 / A280 nm.
6.2.5 Amplificación de los genes candidatos de las pasifloras.
Inicialmente se realizó una Reacción en Cadena de la Polimersa (PCR, por sus siglas en inglés)
con primers universales (Rub3_F 5’ -GTGCCAGACGTGGATACCG- 3’ y Rub3_R
5’ -CAACAGCCAGCCCTTCAT- 3’) que amplifican la enzima que cataliza el primer paso de la
ruta de la fijación de carbono en la fotosíntesis: Rubisco (ribulosa 1-5 bifosfato
carboxilasa/oxigenasa), con el fin de verificar que el ADN de las extracciones fuera
amplificable. Las condiciones de la reacción se describen en las tablas 1 y 2. Posteriormente se
utilizaron 0,5 μl del producto de ésta PCR como molde para reamplificar la reacción bajo las
mismas condiciones de la primera PCR.
27
A partir de los resultados anteriores, se realizó una nueva PCR utilizando los diferentes primers
degenerados diseñados. Se utilizaron condiciones inespecíficas (Tablas 3 y 4) de amplificación
para aumentar la probabilidad de obtener amplificación con todos los primers en una misma
PCR.
Tabla 2. Concentraciones de los reactivos usados para amplificar (ADN molde a 100ng/μl ) y reamplificar (molde:
0,5 μl del producto de PCR) el gen de Rubisco.
Del producto de ésta PCR se utilizaron 0,5 μl como molde para reamplificar la reacción bajo las
condiciones de la tabla 2 y 3.
Cabe la pena resaltar que en todas las PCR se implementó como control negativo el master mix
de reactivos sin ADN (reemplazado por agua estéril) y como control positivo para las PCR con
primers de Rubisco ADN de papa con integridad, concentración y pureza comprobadas.
Tabla 3. Condiciones de ciclado inespecíficos utilizados para amplificar y reamplificar los 7 genes de interés.
Los productos de PCR fueron visualizados en geles de agarosa al 2% (p/v) teñidos con
SYBR®Safe y visualizados en un transiluminador de luz UV.
Tabla 4. Concentraciones de los reactivos utilizados para amplificar los 7 genes de interés.
Reactivo Concentración
BufferGreenGoTaq 1X
BiolinedNTPmix 0,2mM
Primerforward 1μM
Primerreverse 1μM
BiolineMgCl2 1,5mM
BiolaseDNAPolymerase 1U
DNA *
20μl
Proceso Temperatura Tiempo
Desnaturalizacióninicial 95°C 5min
Desnaturalización 94°C 30s
Hibridación 50°C 30s
Extensión 72°C 90s
Extensiónfinal 72°C 3min
ProgramadeamplificacióndePCR
40ciclos
28
El tamaño esperado para cada uno de los genes de interés se calculó durante la construcción de
los primers, a partir de los bloques de las secuencias proteicas conservadas que éstos flanquean.
El número de aminoácidos resultante se multiplicó por 3 para calcular el número total de
nucleótidos esperados para cada gen (Tabla 5).
Tabla 5. Tamaños esperados de los genes de interés.
6.2.6 Clonación de productos de PCR:
Los productos de PCR amplificados con los primers degenerados y purificados desde el gel de
agarosa con el kit Wizard® SV gel and PCR clean up system (Promega), fueron clonados con el
kit PGEM®-T Easy vector system I (Promega) siguiendo las indicaciones del fabricante.
La ligación se realizó basada en los siguientes volúmenes :
Tabla 6. Volúmenes de los reactivos utilizados para la ligación del producto de PCR al vector.
Reactivo Concentración
BufferGreenGoTaq 1X
BiolinedNTPmix 0,2mM
Primerforward 3μM
Primerreverse 3μM
BiolineMgCl2 3mM
BiolaseDNAPolymerase 1U
DNA 100ng/μl
20μl
GenTamañoesperado
(nucleótidos)
At3g08030 909
AtLIG6 867
CYP707A1 1080
CYP707A2 726
DOG1 393
PIMT1 636
PIMT2 657
Reactivo Volumen(μl)
Aguaestéril 1,3
Buffer2xrápidodeligación 5
ProductodePCR 2
VectorpGEM-TEasy(50ng) 0,5
T4ADNligasa 1,2
10μl
29
La transformación se ejecutó en células químicamente competentes de E. coli. DH5 α por medio
de choque térmico y se dejaron crecer en cajas Petri con medio sólido LB- agar- ampicilina- X-
GAL- IPTG. Posteriormente se seleccionaron los clones recombinantes teniendo como agente
selectivo el color de las colonias. Las colonias negativas presentaron un color azul, resultado de
la interacción del producto de la hidrólisis (por acción de β-galactosidasas) del compuesto X-
GAL con el IPTG. En las colonias positivas, al tener interrumpido el gen de la enzima β-
galactosidasa por la integración del inserto, no se presentó la reacción que da el color azul,
quedando las colonias de color blanco (Rodríguez, 2007).
Tabla 7. Condiciones de ciclado para verificar los clones recombinantes.
De las colonias positivas de cada pareja de primers se escogieron 5 al azar para verificar los
clones recombinantes mediante PCR (Tablas 7 y 8), utilizando como molde las colonias
bacterianas directamente y como cebadores los primers universales del M13 F 5'- GTA AAA
CGA CGG CCA GTG- 3' y M13 R 5'- GGA AAC AGC TAT GAC CAT G-3' que hibridan sobre
el plásmido recombinante en las regiones que flanquean el inserto.
Tabla 8. Concentraciones de los reactivos para verificar los clones recombinantes. * Como ADN molde se utilizó la
colonia bacteriana positiva picada con una punta blanca de 0,5 - 10 μl.
Proceso Temperatura Tiempo
Desnaturalizacióninicial 95°C 7min
Desnaturalización 94°C 30s
Hibridación 50°C 30s
Extensión 72°C 1min
Extensiónfinal 72°C 3min
ProgramadeamplificacióndePCR
27ciclos
Reactivo Concentración
BufferGreenGoTaq 1X
BiolinedNTPmix 0,2mM
Primerforward 0,5μM
Primerreverse 0,5μM
BiolineMgCl2 1,5mM
BiolaseDNAPolymerase 1U
DNA *
20μl
30
Finalmente se purificaron los plásmidos con el kit UltraClean® 6 Minute Mini Plasmid Prep Kit
(MO BIO) siguiendo las recomendaciones del fabricante y se verificaron los plásmidos por PCR
con las mismas condiciones de ciclado y reactivos empleados en la verificación de clones.
6.2.7 Secuenciación de plásmidos purificados
Los plásmidos purificados se enviaron a secuenciar en ambos sentidos (forward y reverse) a la
compañía MACROGEN Inc. (Corea).
6.3 Análisis de las secuencias obtenidas y sus relaciones filogenéticas con secuencias
homólogas reportadas para plantas.
Previo al análisis de las secuencias nucleotídicas obtenidas, se eliminaron manualmente los
segmentos contaminantes del vector identificados con el programa Vecscreen
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/vecscreen/) y se descartaron las secuencias con resultados del
cromatograma poco fiables.
Con el programa online Cap3 (http://doua.prabi.fr/software/cap3) se ensamblaron las secuencias
forward/reverse y se recuperó la secuencia consenso. Las secuencias nucleotídicas libres de
vector (consenso y no complementarias) se tradujeron a proteínas empleando la herramienta
Transeq de la suite EMBOSS (http://www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_transeq/), esto con el fin de
identificar el marco de lectura con la mayor cobertura de la secuencia y sin presencia de codón de
parada. Las secuencias así traducidas se comprobaron mediante una búsqueda de homología
empleando el software Blastp (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) sobre bases de datos de
proteínas NR restringida a plantas. Se verifico así la identidad del producto amplificado.
Finalmente, junto con la secuencia proteica del gen ortólogo en A. thaliana obtenida de TAIR
(https://www.arabidopsis.org/ ; p ej. para el gen aAt3g08030 o DUF642, se empleó la accesión
número 1009121672) y las 20 secuencias más parecidas según análisis Blastp (20 E-value más
bajos), y con esta selección se realizó un alineamiento múltiple con el programa CLUSTAL
OMEGA (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) del NCBI. El resultado del alineamiento se
editó manualmente con el fin de ajustar todas las secuencias para que estuvieran de igual tamaño.
31
Con las secuencias alineadas y del mismo tamaño, se realizó la construcción de un fenograma
con el software MEGA (Molecular Evolutionary Genetic Analysis) versión 6.06. Para el análisis
se empleó el método de Máxima Parsimonia, que se fundamenta en encontrar el árbol con menor
número de cambios evolutivos, basándose en que la evolución se favorece con el menor número
de mutaciones (Michu, 2007). El análisis fue diseñado con un bootstrap de 100 réplicas para
brindar apoyo estadístico a la topología del árbol obtenido.
7. RESULTADOS
7.1 Diseño de primers degenerados para los genes candidatos
Siguiendo las recomendaciones propuestas por Rose et al., (2003), se diseñaron con el software
CODEHOP 14 primers degenerados, uno forward (F) y uno reverse (R) para amplificar cada gen
candidato (Tabla 9).
Tabla 9. Lista de primers diseñados en CODEHOP. La secuencia en mayúscula corresponde a la región clamp del primer y en minúscula a la
región degenerada (core). La Tm mostrada no tiene en cuenta concentraciones de Mg+2 ni dNTP.
Nombre Secuencia(5'-3')Tamaño
(pb)Tm°C
At3g08030F: TGTTCATGCTGTTAGACTGggnaaygadgc 30 62,5
At3g08030R: AGGAAAAACTCTAACTTGATCAAGAaynggnccrca 36 63,3
AtLIG6F: CTGTTCCTGGTTGCTACTTATGTTrtnggnaarga 35 62,1
AtLIG6R: TGTGGAACACCATTAGTAATCTTAgcnarcatngg 35 61,5
CYP707A1F: CCAGGTACTATGGGTTGGccntayntngg 29 63,2
CYP707A1R: CAGCATTTCCAGCTTAGCCarytcrttncc 30 62,9
CYP707A2F: TCAAGAAATGAAGAGGTATGCTttyrangtngc 33 60,3
CYP707A2R: TGATGAAGCAAAATAAGCATTtcnadyttngc 32 58,4
DOG1F: CTATGCTTTGGATGGGTggntgymgncc 28 64,6
DOG1R: TCGATCTCTCATTTTACcccankbntgca 29 61,5
PIMT1F: TTCTCCAATGCCAATTGGTyayaaygynac 30 60,3
PIMT1R: GAGCATCTCTAGAAGTCAGTGGAayrtancknac 34 61,1
PIMT2F: AGAAGGTTGCTGAAGTTatggarrmnrt 28 59,0
PIMT2R: CATCCAGATTCTTATCAACAACCtknarrtcytg 34 59,4
7.2 Extracción de ADN, amplificación y clonación de secuencias génicas.
7.2.1 Germinación de semillas.
La germinación de semillas de las especies de pasifloras fue exitosa en 3 de los casos: granadilla,
cholupa y maracuyá. Los días de germinación de éstas especies tratadas con escarificación
mecánica con lija (maracuyá y cholupa) y con escarificación por despunte basal (granadilla)
fueron menores (dos semanas aproximadamente) a lo reportado en la literatura para granadilla y
32
maracuyá sin recibir ningún tratamiento (60 días y 30 días respectivamente) (Cárdenas, 2011;
Velásquez et al., 2012). En el caso de la cholupa se obtuvieron valores muy similares (en
promedio germinaron a los 5 días) a los de la cholupa sin tratamiento, similar a lo reportado por
Gutiérrez et al., (2011).
La germinación de las semillas de gulupa fue poco exitosa. Tardaron aproximadamente 3 meses
en germinar 8 semillas de las 100 utilizadas. Además, el crecimiento de las plántulas fue lento y
dificultó la extracción de ADN para comparar los tres métodos de precipitación de ADN.
7.2.2 Determinación de la calidad, concentración y pureza del ADN extraído.
De manera general se obtuvo ADN de buena calidad, reflejado en la presencia de bandas íntegras
largas (> 10 Kb). La concentración promedio de ADN fue de 156,8 ng/μl para cholupa, 272,4
ng/μl para granadilla y 422,3 ng/μl para maracuyá (Anexo 4). En cuanto a la pureza, se obtuvo
una relación de absorbancia de A 260 /A280=1,80 en las 4 especies (Anexo 4), que es generalmente
aceptada como indicador de ADN puro (Olson & Morrow, 2012). Valores por encima o por
debajo, indican presencia de contaminantes (proteínas, fenoles, guanidina o agentes utilizados en
la extracción) en el ADN (Olson & Morrow, 2012).
7.2.3 Amplificación de los genes candidatos de las pasifloras.
Se presentó dificultad para amplificar el ADN de las extracciones. Del total de las muestras
obtenidas con el protocolo de Doyle & Doyle (1991), sólo una de las muestras de granadilla
extraída generó una banda del tamaño esperado (250 pb) al reamplificar la PCR con los primers
de Rubisco. Al utilizar éste ADN como molde para probar los primers degenerados diseñados, no
se obtuvo ningún resultado en la PCR ni en su reamplificación.
Al evaluar de nuevo la calidad del ADN de la muestra de granadilla se encontró un barrido de
bandas indicador de degradación del ADN. Aunque se repitieron las extracciones con el mismo
protocolo no fue posible amplificar de nuevo el ADN de granadilla ni el de las otras dos especies
(cholupa y maracuyá).
Las dificultades presentadas en la amplificación de los genes de interés en las pasifloras,
conllevó a plantear nuevas estrategias metodológicas.
33
Considerando el alto contenido de polifenoles y polisacáridos presentes en las hojas de las
pasifloras (Carvajal De Pabón et al., 2011) y que los protocolos de extracción de ADN incluyen
compuestos que pueden reducir la sensibilidad de la PCR (etanol, EDTA, sarcosyl, isopropanol,
mercaptoetanol) (Schrader et al., 2012), se contemplaron posibles moléculas inhibidoras de PCR
presentes en el ADN directamente o adquiridas durante la extracción.
Como alternativa para remover los inhibidores, mejorar la eficiencia (máxima amplificación que
se puede obtener a determinado número de ciclos) y la especificidad (exclusiva amplificación del
fragmento esperado) de las PCR (utilizando los primers de Rubisco y los primers degenerados)
se empleó un mix de adyuvantes (DMSO 5%, glicerol 5%, BSA0.6 mg/ml, DTT 10 mM) en la
reacción (Sambrook et al., 2000).
A pesar de los beneficios de los adyuvantes de PCR (Tabla 10) no se obtuvieron buenos
resultados al incluirlos en la PCR de los primers de Rubisco ni en la PCR de los primers
degenerados con las muestras de ADN de ambos protocolos de extracción.
Tabla 10 . Modo de acción y efecto de los adyuvantes implementados en la PCR de los dos protocolos de extracción.
Otra alternativa fue utilizar el Kit de PCR de plantas 3G (KAPABIOSYSTEMS) que contiene
una ADN polimerasa diseñada para tolerar inhibidores comunes de la PCR en plantas, como
polifenoles y polisacáridos (Schori et al., 2013).
El kit permite trabajar con la muestra cruda (0,5 mm de diámetro foliar) evitando posibles
inhibidores que puedan surgir de los protocolos de extracción de ADN. Se utilizaron los primers
de Rubisco para verificar que el ADN de las cuatro especies fuera amplificable. Las condiciones
de ciclado y las concentraciones de los reactivos (Anexo 9 y 10) se establecieron con base en las
recomendaciones del fabricante. A pesar de las ventajas del kit, tampoco se obtuvieron resultados
Tipodeadyuvante Mododeacción EfectoenlaPCR Referencias
Albúminadesuerobovino
(BSA)
LimpiayneutralizacontaminantesinhibitoriosdelaTaq
quesepuedenpresentarenlosBuffersdeextraccióno
enelADN.
Disminuyemoléculasque
interfierenenlaPCR
(Schraderetal.,2012;
Schorietal.,2013)
Ditiotreitol(DTT)EstabilizalaTaqpolimerasaalprotegerlos4residuosde
cisteínadelaenzima.Aumentalaeficiencia
(Nagaietal.,1988)
Dimetilsulfóxido(DMSO)
Rompelospuentesdehidrógeno(especialmenteG-C)
facilitandola
desnaturalizacióndeladoblecadenadelADN,
reduciendolaTmyfacilitandoelaccsesodelprimerala
hebramolde
Aumentalaespecificidady
laeficiencia
(Nagaietal.,1988;
Simonovicetal.,2012)
Glicerol
Favoreceladesnaturalizacióndeladoblecadenadel
ADNyporendedeestructurassecundarias,favoreciendo
elaccesodelosprimers.
Aumentalaespecificidady
laeficiencia(Nagaietal.,1988)
34
de amplificación del ADN de ninguna de las especies vegetales en las PCR control con los
primers de Rubisco.
Por último se decidió emplear el protocolo de extracción de ADN de Doyle & Doyle (1991)
modificado por Solano-Flórez et al., (2009), que tuvo buenos resultados en términos de
amplificación de ADN en el caso de la especie P. ligularis (granadilla). Este protocolo se
implementó para las cuatro especies vegetales. Se describe a continuación:
Con nitrógeno líquido se maceraron 300 mg de tejido foliar de cada muestra. El polvo fino
obtenido de cada una se transfirió en un tubo diferente de microcentrífuga de 2 ml a los cuales se
añadieron 700 μl de buffer de extracción (Tris HCl 100 mM pH 8, EDTA 20 mM pH 8.0, NaCl
1.4 M, CTAB 2%, β mercaptoetanol 2%, PVP 1%). Los tubos se agitaron en vortex y se
incubaron a 65°C por 30 min, invirtiéndolos cada 5 min. Se adicionaron 750 μl de cloroformo:
alcohol isoamílico (v/v) (24:1) a cada muestra y se centrifugaron a 8.000 r.p.m por 5 min.
Tabla 11. Concentración y pureza (A260 / A280 nm) de las muestras de granadilla con el protocolo de extracción
Doyle & Doyle (1991) modificado por Solano-Flórez et al., (2009).
A nuevos tubos se transfirieron 300 μl del sobrenadante de cada muestra y se adicionó 2/3 del
volumen de isopropanol frío y se dejaron incubando durante toda la noche a -20°C. Las muestras
se centrifugaron a 14.000 rpm durante 5 min. El pellet fue lavado con etanol 76% - acetato de
amonio 10 mM, centrifugado a 8.000 rpm por 10 min, secado a temperatura ambiente,
resuspendido en buffer TE (Tris Hcl 10 mM pH 8.0, EDTA 50 mM pH 8.0) y tratado con 5 μl
RNAsa a 37°C por 30 min.
Muestrasdegranadilla
MuestraConcentración
(ng/µl)
Absorbancia(nm)
260/280
Absorbancia(nm)
260/230
5 108,23 2,00 1,42
21 209,71 2,03 1,43
24 224,15 1,97 1,42
49 184,13 1,99 1,52
35
Figura 2. Verificación de la integridad de las muestras de granadilla con el protocolo de extracción de Doyle &
Doyle (1991), modificado por Solano-Flórez et al., (2009). M: Marcador de tamaño 1kb (Generuler).
Para amplificar el ADN se utilizaron las mismas condiciones de PCR que para el primer
protocolo. Los resultados arrojaron buenas concentraciones de ADN y pureza para todas las
extracciones, sin embargo, sólo se obtuvo amplificación con los primers universales de Rubisco y
con los primers degenerados diseñados con una de las muestras de ADN de granadilla.
En principio se midió la calidad, concentración y pureza del ADN de las 4 muestras de granadilla
(5, 21, 24 y 49) (Tabla 11 y figura 2) y se utilizaron como molde para la PCR con los primers de
Rubisco, utilizando las mismas condiciones de PCR de las tablas 1 y 2. Sólo con la muestra 21 se
obtuvo la amplificación de una banda del tamaño esperado (250 pb) (Figura 3).
Figura 3. Amplificación con primers de Rubisco de la muestra 21 de granadilla. (-): Control negativo. (+): Control
positivo. M: Marcador de tamaño 1kb (Generuler).
36
Tras verificar la amplificación del ADN, se utilizó la muestra 21 para una nueva PCR utilizando
los primers degenerados bajo condiciones de amplificación inespecífica (baja temperatura de
hibridación, alta concentración de primers y MgCl) (Tablas 3 y 4 ). Los primers degenerados
At3g08030, CYP707A1 y PIMT2, permitieron la amplificación de múltiples bandas tenues
(Anexo 5).
Con el propósito de aumentar la especificidad y la cantidad de producto amplificado, se diluyó el
producto de la PCR en agua estéril (1/25) y se utilizó como ADN molde para reamplificar la
reacción, en éste caso en un gradiente de temperatura de hibridación (o anillamiento), diseñado
para seleccionar las condiciones térmicas óptimas (Tabla 12). Se utilizó un termociclador
MyCycler (Biorad) y las concentraciones de reactivos indicadas en la tabla 2 (excepto por el
ADN).
5 μl del producto de PCR fueron corridos por electroforesis horizontal, Como resultado, se
obtuvo de nuevo amplificación con los primers At3g08030, CYP707A1 y PIMT 2, pero las
bandas continuaron siendo tenues (Figura 4).
Tabla 12. Gradiente de temperatura y demás condiciones de ciclado utilizadas para reamplificar los 7 genes de
interés con el ADN de granadilla 21.
Las bandas producto de los primers At3g08030 y PIMT2 tuvieron un tamaño aproximado a los
300pb y se observaron a lo largo del gradiente, mientras que la de CYP707A1 sólo se obtuvo a
los 62°C con un tamaño aproximado de 700pb. Aunque con los primers DOG1 se obtuvo un
barrido, no se identificaron bandas definidas dentro del gradiente térmico. Los demás primers no
generaron ningún amplicón.
Proceso Temperatura Tiempo
Desnaturalizacióninicial 95°C 5min
Desnaturalización 94°C 30s
Hibridación 50-62°C 30s
Extensión 72°C 90s
Extensiónfinal 72°C 3min
ProgramadeamplificacióndePCR
40ciclos
37
Figura 4. Amplificación mediante PCR en gradiente de temperatura de los 7 genes candidatos.Se empleó la muestra
de ADN 21 y los productos de PCR se analizaron por electroforesis. En la tabla se describe la numeración y
distribución de las muestras y el gradiente de temperatura utilizado. M: Marcador de tamaño 1kb (Generuler).
Tras verificar la presencia de amplificación, se cortaron y purificaron las bandas de los
amplicones (Figuras 2) obtenidas con los primers At3g08030, CYP707A1 y PIMT 2, a pesar de
que no cumplían con los tamaños esperados (Tabla 5); se tuvo en cuenta que el tamaño de los
genes de las pasifloras es desconocido y puede variar respecto a los de Arabidopsis, especie en
quién se basó la estimación de tamaño.
7.2.4 Verificación de clones recombinantes.
Aunque se esperaba en la verificación de los 5 clones recombinantes de cada pareja de primers,
amplicones de igual tamaño (tamaño de la banda de PCR + 220 bp del tamaño del vector), no fue
lo observado con los primers At3g08030 y PIMT2 (Figura 5) . Para el gen At3g08030 se
escogieron para purificación de plásmidos los clones 1, 2, 3 y 4; para PIMT2 los clones 6,7 y 9 y
para CYP707A1 los clones 1, 4 y 5. Tras la confirmación del tamaño de inserto de los plásmidos
purificados, se descartó únicamente el clon 4 de los primers CYP707A1.
50·C 50.8·C 52.3·C 54.4·C 57.3·C 59.5·C 61.1·C 62·C
1 2 3 4 5 6 7 8 At3g08030
9 10 11 12 13 14 15 16 AtLIG6
17 18 19 20 21 22 23 24 CYP707A1
25 26 27 28 29 30 31 32 CYP707A2
33 34 35 36 37 38 39 40 DOG1
41 42 43 44 45 46 47 48 PIMT1
49 50 51 52 53 54 55 56 PIMT2
250
500 750
1000
38
Figura 5. Confirmación del tamaño de inserto en los clones recombinantes obtenidos. Se realizó PCR sobre colonias.
Los clones llevan el mismo nombre de los pocillos. A. Clones 1, 2, 3, 4 y 5 obtenidos con los primers At3g08030 .
B. Clones obtenidos con los primers CYP707A1 (1,2,3,4,5) y con los primers PIMT2 (6,7,8,9,10). (-): Control
negativo.
7.2.5 Secuenciación de plásmidos purificados
En total se enviaron a secuenciar los insertos de 9 plásmidos en ambas cadenas. Los plásmidos
llevan los mismos nombres de los clones. Para el gen At3g08030 se enviaron los plásmidos 1, 2 ,
3 y 4; para CYP707A1 los plásmidos 1 y 5, y para PIMT2 los plásmidos 6, 7 y 9.
Las secuencias obtenidas, forward y reverse, se encuentran en el anexo 6.
7.2.6 Análisis de las secuencias clonadas obtenidas
Una vez recibidas las secuencias por parte del proveedor del servicio de secuenciación, se
procedió a ensamblar las lecturas de ambas cadenas del inserto, previamente filtradas por calidad
y eliminando fragmentos del vector. El mayor ruido en el cromatograma se obtuvo de las
secuencias obtenidas con el primer reverse At3g08030 del clon 1, primer reverse CYP707A1 del
clon 1, con el primer reverse PIMT2 del clon 6 y con el primer forward PIMT2 del clon 9, razón
por la que se descartaron para la generación del consenso.
Empleando el programa Cap 3, y tras eliminar fragmento del vector, se obtuvo una secuencia
consenso para: At3g08030 clon 2, clon 3 y clon 4; CYP707A1 clon 5 y PIMT2 clon 7 (anexo 7).
Tras la traducción y selección del marco de lectura abierto de la secuencia génica clonada, el
resultado del análisis BLAST indicó altos niveles de identidad entre la secuencia proteica
39
consenso At3g08030 del clon 4 (Anexo 8) y el dominio proteico conservado de la proteína
DUF642 (codificada por el gen At3g08030) en diferentes especies vegetales, confirmando el
éxito de la amplificación y clonación realizadas.
Figura 6 . Alineamiento múltiple con CLUSTAL OMEGA. Los * indican aminoácidos idénticos
para todas las especies.
40
Para el caso de los insertos correspondientes a los genes CYP707A1 y PIMT2, el análisis BLAST
no arrojó identidad de los mismos con genes homólogos en las bases de datos. Así, el clon 5
presentó homología con la proteína NADH deshidrogenasa subunidad 5, y la secuencia reverse
PIMT2 del clon 9 presentó homología con la proteína GAG de los retrovirus.
Las demás secuencias insertadas no presentaron homología alguna con las secuencias proteicas
de la base de datos NR del NCBI.
Debido a que la secuencia consenso At3g08030 del clon 4 fue la única con identidad esperada,
fue la única igualmente empleada para el análisis filogenético. La traducción de esta secuencia
generó la proteína hipotética, que se nombró DUF642 clon 4, de 102 aminoácidos:
El alineamiento múltiple se realizó entre la secuencia traducida (DUF642 clon 4), los 20 mejores
hits del análisis Blast y la secuencia proteica de DUF642 de A. thaliana, obteniéndose secuencias
altamente similares, lo cual confirma que las DUF642 son proteínas altamente conservadas
(Figura 6).
7.2.7 Reproducibilidad de la amplificación del gen At3g08030.
Aunque se probaron nuevas extracciones con material foliar de granadilla utilizando el protocolo
de extracción de Doyle & Doyle (1991) modificado por Solano-Flórez (2009), se presentaron
dificultades al momento de reproducir la amplificación del gen At3g08030.
8. DISCUSIÓN
8.1 Diseño de primers degenerados
En general se obtuvieron buenos resultados en cuanto a los parámetros de diseño de los 7 primers
degenerados. Por un lado, la Tm entre cada primer forward y su respectivo reverse no tuvo
diferencias mayores a los 5°C, lo cual es recomendado por la literatura para asegurar que cada
> Proteína hipotética DUF642 clon 4
VHAVRLGNEAQISQELTVEKGSMYSVTSSAARTCAQLESINVSVPSASTTIDLQTVYNVQAWDPYAWAF
EAEDDKVNLVFTNPGMEDDPACGPVLDQVRVFP
41
producto de amplificación se desnaturalice de forma correcta en cada ciclo de la PCR (Sambrook
et al., 2000). Por otra parte, los porcentajes de Guanina-Citosina (GC) de las secuencias de todos
los primers (Anexo 3) están dentro del rango recomendado (40-60%), lo que asegura la
desnaturalización de la doble cadena de ADN durante la PCR (Sambrook et al., 2000).
Con respecto a la región 3’ del core se obtuvieron 4 primers: At3g08030R, AtLIG6F, DOG1R y
PIMT2F, que no cumplieron con la terminación de la secuencia en una base nitrogenada de tipo
G o C. La presencia de alguna de éstas bases en el extremo 3’ permite asegurar su fusión a la
hebra molde y disminuir el riesgo de mispriming (hibridación inespecífica de primers)
(Sambrook et al., 2000).
La longitud de los primers degenerados, que se recomienda entre 20 y 30 pb (Linhart & Shamir,
2002), estuvo ligeramente por encima para la mitad de los primers: At3g08030 R, AtLIG6 F,
AtLIG6 R, CYP7070A2 F, CYP707A2 R, PIMT1 R y PIMT2 R.
En cuanto al grado de degeneración (Anexo 2), se manejaron en general bajos porcentajes para
disminuir la probabilidad de obtener bandas inespecíficas (Sambrook et al., 2000), lo cual pudo
también contribuir a la ausencia de amplificación en caso de que los genes de Passifloras sean
muy diferentes.
8.2 Primer reporte del gen At3g08030 en granadilla
Recientes estudios indican que el gen At3g08030, que codifica una proteína de pared con un
dominio de función desconocida (DUF642), tiene su expresión relacionada con el vigor y la
longevidad de las semillas, incluso en plantas no modelo (Garza Caligari et al., 2012).
At3g08030 ha sido identificado en varias especies vegetales, sin embargo, su secuencia en las
pasifloras permanecía desconocida. Con el actual estudio, se identificó por primera vez el gen
At3g08030 en una muestra de una especie perteneciente a la familia Passifloracea (granadilla),
asegurando su hallazgo por los altos puntajes asociados con los hits del BLAST en diferentes
especies vegetales, y la presencia de un dominio putativo conservado DUF642 en el mismo. El
tamaño del gen fue de 307 nucleótidos, menor al esperado (909 nucleótidos).
Aunque bien se desconoce la función concreta de DUF642, podría inferirse que para explicar su
42
estrecha correlación con el vigor y la longevidad de las semillas, tendría que ver su posible papel
estructural en la pared celular. Teniendo en cuenta que los procesos de vigor y longevidad están
directamente relacionados con la integridad de proteínas de la membrana (Verma et al., 2013),
podría inferirse que al representar la pared celular una barrera protectora de la membrana,
DUF642 estaría resguardando la integridad de las proteínas allí presentes.
Con los primers degenerados At3g08030F 5’-TGTTCATGCTGTTAGACTGggnaaygadgc-3’ y
At3g08030R 5’-AGGAAAAACTCTAACTTGATCAAGAaynggnccrca-3’, las condiciones de
ciclado y las concentraciones de reactivos necesarios para amplificar el gen At3g08030, se
identifica un importante gen con actividad asociada a vigor y longevidad de las semillas,
recientemente reportado como indicador de estos atributos en semillas de diferentes especies.
Así, este trabajo constituye un primer pero importante aporte para estudiar y empezar a
desentrañar los mecanismos moleculares asociados a la longevidad y el vigor de las semillas de
P. ligularis Juss.
8.3 Amplificación inespecífica
Con los primers CYP7070A1 F/R se obtuvo la amplificación no esperada del gen que codifica la
NADH deshidrogenasa subunidad 5 (ND5), una subunidad del complejo enzimático I, que
participa en la transferencia de electrones y protones en la cadena respiratoria de la mitocondria
para la producción de ATP (Taiz & Zeiger, 2010). El objetivo de amplificación con éstos
primers era el gen CYP707A1, que codifica la enzima citosólica 8’ hidroxilasa involucrada con el
catabolismo oxidativo del ABA y con la capacidad germinativa de las semillas (Arc et al., 2013) .
De igual forma, se amplificó con los primers PIMT2 F/R el gen que codifica la proteína GAG de
la cápside de los retrovirus (Ako, Johnson, & Vogt, 2005), siendo el objetivo amplificar el gen
PIMT 2, que codifica la enzima L-isoaspartil O-metiltransferasa, implicada en la reparación de la
estructura de las proteínas y con los procesos de longevidad y vigor en las semillas (Ogé et al.,
2008).
La especificidad de la PCR, es decir, la amplificación exclusiva de fragmentos esperados, se debe
en primera medida al uso de altas temperaturas de hibridación, bajas concentraciones de cationes
divalentes (como el Mg+2) y por su puesto, a la especificidad de los primers (Roux, 2009).
43
Teniendo en cuenta que para la amplificación de los genes de interés en éste estudio se utilizaron
bajas temperaturas de hibridación (en algunos casos mas de 10 °C por debajo de la Tm, siendo
recomendado que sean 5 °C), altas concentraciones de Mg+2 (3mM, siendo la condición estándar
1.5 mM) y primers degenerados (en los que la degeneración, aunque sea poca, aumenta la
probabilidad de amplificaciones inespecíficas), la sumatoria de éstos factores serían una posible
explicación para los productos inespecíficos obtenidos.
8.4 Dificultades en la amplificación
A pesar de que el diseño de los primers degenerados cumplió en general con los parámetros
recomendados por la literatura y que el ADN extraído mediante una larga precipitación con
isopropanol cumplió en términos de integridad, concentración y pureza, se presentó dificultad
para amplificar el ADN de las pasifloras. Varios factores podrían estar implicados.
Los polisacáridos y los polifenoles en las hojas de las pasifloras
Dentro de los fitoconstituyentes o metabolitos secundarios más destacados en el género
Passiflora se encuentran los alcaloides, polifenoles y polisáridos (Dhawan, Dhawan & Sharma,
2004). Aunque se aprovechan las propiedades de algunos de éstos compuestos, principalmente a
partir de los frutos, se han reportado las hojas como la principal fuente de polifenoles
(principalmente ácido gálico y flavonoides) (Carvajal De Pabón et al., 2011), los cuales no sólo
pueden inhibir la DNA polimerasa, sino que contribuyen en la oxidación y degradación de las
cadenas de ADN.
En el caso del maracuyá, Carvajal de Pabón et al., (2011) reportaron que el contenido de fenoles
totales en los frutos era de 282,169 mg de ácido gálico / 100 g de extracto seco mientras que en
las hojas era de 3148, 86 mg de ácido gálico / 100 g de extracto seco. Valores muy similares se
encontraron además para granadilla, cholupa y gulupa.
Teniendo en cuenta que en los protocolos de extracción de ADN del proyecto, se utilizó material
foliar para facilitar el proceso, los polifenoles podrían representar una fuente de contaminación de
inhibidores de la PCR y degradadores del ADN.
Dentro del mecanismo de acción inhibidor de los polifenoles está la co-purificación con los
44
ácidos nucleicos, el cambio de las propiedades químicas del ADN y el ARN y la acción quelante
de metales como el Mg+2, cofactor de la ADN polimerasa (Schrader et al., 2012).
A pesar de reconocer ésta posible contaminación e incluir un mix de adyuvantes de la PCR para
aminorar el problema, es posible que los polifenoles de las muestras de hojas no se hayan
neutralizado con las concentraciones de adyuvantes utilizadas. Esta misma situación pudo
presentarse con el kit Kapa3G.
También es importante resaltar que en las plantas, la síntesis de polifenoles puede acrecentarse
bajo condiciones de estrés abiótico y mantenerse elevada cuando se genera tolerancia al estrés
(Sepúlveda, 2003), situación que pudo desarrollarse bajo las condiciones de laboratorio donde
crecieron las plántulas trabajadas con los dos protocolos de extracción y que podría explicar por
qué no hubo amplificación con éste tipo de muestras.
Propiedades intrínsecas del ADN de las pasifloras
Aunque pudo amplificarse el gen At3g08030 de la muestra 21 de granadilla, no se obtuvo
amplificación de ninguno de los otros genes de interés. Teniendo en cuenta que en general hubo
un buen diseño de los primers, debe considerarse que la desconocida secuencia del genoma de las
pasifloras podría ser la más probable explicación a esta situación.
Una limitante común en la amplificación del ADN es un alto contenido de guanina-citosina que
conduce a la formación de estructuras secundarias, como horquillas y/o tallos-bucles, a causa de
los tres puentes de hidrógeno que unen éstas bases (Roux, 2009).
Las secuencias ricas en guanina-citosina, que se pueden encontrar incluso en los promotores y
enhancers, requieren mayor energía para su desnaturalización en la PCR (en comparación con la
energía necesaria para romper los 2 puentes de hidrógeno que unen la adenina de la timimina), lo
que resulta en resistencia de la separación de la doble hélice, obstaculización de la hibridación de
los primers y de la ADN polimerasa y por ende, disminución del amplicón (Roux, 2009). Bajo
este contexto, podría pensarse que los genes de interés que no fueron amplificados pueden estar
rodeados por regiones ricas en G-C y esto afectaría la efectividad de su amplificación, como se
encuentra reportado en otras especies silvestres de pasifloras (P. miersii Mast., P. actinia Hook.,
45
P. vitifolia Kunth., entre otras) dónde se observaron patrones de heterocromatina rica en G-C
(Melo et al., 2014).
8.5 Análisis filogenético
Las proteínas de pared celular son moléculas estructurales fundamentales para las plantas a nivel
de dos aspectos: limitación física al ingreso de patógenos y modificación fisicoquímica de la
pared ante señales del ambiente y de la propia planta durante su desarrollo. La evolución ha
favorecido la conservación de éstas moléculas. En el proteoma de la pared celular de A. thaliana,
se encontró que cerca del 15% corresponde a proteínas con un “dominio de función desconocida”
(DUF) (Vázquez et al., 2012).
Dentro de las DUF, las DUF642 son altamente conservadas y específicas de plantas con semillas.
Aunque su función concreta permanece desconocida, los niveles de expresión del gen que las
codifica (At3g08030), están relacionados en diferentes especies vegetales, por un lado con
mantener el vigor y la longevidad de las semillas (Garza Caligari et al., 2012), así como con el
mecanismo de defensa frente a patógenos como Agrobacterium tumefaciens y Rhodococcus
fascians (Vázquez et al., 2012).
Los resultados del análisis de parsimonia en éste proyecto, exhiben que los ortólogos de la
proteína hipotética DUF642 clon 4, obtenida de una muestra de granadilla (P. ligularis), se
encuentran en diferentes familias vegetales (Figura 7).
El patrón de agrupamiento de las secuencias proteicas de las especies vegetales se presentó
globalmente con base en las familias a las que pertenecen, con algunas ligeras excepciones
(Euphorbiaceae no están en un mismo clúster). Los números cercanos a los nodos indican el
apoyo estadístico arrojado por el Bootstrap. Los nodos con valores menores a 50 se descartaron.
Se encontró que los grupos terminales están bien soportados mientras que los internos no tienen
el apoyo adecuado. La secuencia parcial del gen DUF642 de granadilla se agrupó con la
secuencia homóloga de Ricinus communis, especie perteneciente a la familia Euphorbiaceae.
46
Figura 7. Fenograma de máxima parsimonia basado en las secuencias de la proteína DUF642. Los valores de los
nodos indican el apoyo del Bootstrap. A la derecha se indican las familias a las que corresponden las especies
vegetales.
Aunque el fenograma infiere mayor similitud entre la secuencia proteica objetivo de P. ligularis
(Passifloraceae) con la secuencia de Ricinus communis (Euphorbiaceae), debe resaltarse que el
grupo hermano reciente de Passifloraceae es Salicaceae (APG III, 2009), familia a la que
pertenecen Populus trichocarpa y Populus euphratica. Aunque P. ligularis no se agrupó con este
clúster, su relación se refleja al encontrarse como grupo adyacente.
Brassica_rapa
Brassica_napus
Arabidopsis_thaliana
Passiflora_ligularis
Ricinus_communis
Jatropha_curcas
Eucalyptus_grandis
Morus_notabilis
Populus_euphratica
Populus_trichocarpa
Citrus_sinensis
Citrus_clementina
Prunus_persica
Prunus_mume
Malus_domestica
Pyrus_x_bretschneideri
Sesamum_indicum
Solanum_tuberosum
Solanum_lycopersicum
Nicotiana_tomentosiformis
Nicotiana_sylvestris
6 5
100
5 0
8 8
8 7
9 4
5 9
9 4
1006 9
Salicace
Los
resultado
s del
análisis
de
parsimoni
a en éste
proyecto,
exhiben
que los
ortólogos
a la
proteína
hipotética
DUF642
clon 4,
obtenida
a partir
de una
muestra
de
granadilla
(P.
ligularis),
se
encuentra
Rutaceae
Passifloraceae
Brassicaceae
Los
Euphorbiaceae
Rosaceae
Solanaceae
Moraceae
Myrtaceae
Pedaliaeae
47
Respecto a la relación con la proteína de A. thaliana, que es la única caracterizada
funcionalmente, también se encontró similitud entre las dos secuencias, al encontrarse en el grupo
adyacente de P. ligularis.
El nivel de conservación de la proteína DUF642 era esperado por lo reportado en la literatura, sin
embargo, se hace evidente el desconocimiento de las Passifloraceae: en el análisis BLAST por
ejemplo, no se encontró homología con ninguna proteína de otro miembro de esta familia.
Con la secuencia parcial del gen DU542 de granadilla, se podrán diseñar primers específicos
tanto para completar la secuencia completa del gen en granadilla empleando técnicas como
RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends), así como para realizar estudios de expresión
diferencial por medio de qRT-PCR y poder conocer un poco más acerca de las funciones de este
gen y su relación con rasgos de calidad fisiológica en las semillas de granadilla y otras pasifloras.
48
9. CONCLUSIONES
De las 7 parejas de primers diseñadas para amplificar los diferentes genes candidatos, la pareja At3g08030 permitió por primera vez la amplificación del gen
At3g08030 en P. ligularis (granadilla), un gen reportado A. thaliana, C. aesculifolia y W.
urens como marcador molecular del vigor y la longevidad de sus semillas. Debido a factores aún desconocidos, se presentaron dificultades para amplificar los
genes AtLIG6, CYP707A1, CYP707A2, DOG1, PIMT1 y PIMT2 tanto con el ADN de granadilla como con el de las otras especies de pasifloras. De igual forma, se presentaron dificultades al momento de reproducir la amplificación del gen At3g08030 con otras muestras de granadilla.
Aunque Ricinus communis no es la especie mas cercana a P. ligularis dentro de las
incluidas en el análisis, se encontró mayor similitud en sus secuencias proteicas (DUF642) que con miembros (Populus trichocarpa y Populus euphratica.) de su grupo hermano Salicaceae.
10. RECOMENDACIONES
Se recomienda estandarizar los protocolos de extracción de ADN para otras especies del
género Passiflora diferente de P. ligularis.
Se recomienda estudiar a profundidad los posibles factores que dificultan la amplificación
del ADN de las pasifloras y que por ende, obstaculizan la reproducibilidad de los ensayos
que se efectúan con este grupo taxonómico.
Se recomienda realizar estudios de expresión génica diferencial con el gen At3g08030
para conocer un poco más acerca de sus funciones y relación con rasgos de calidad
fisiológica en las semillas de granadilla y otras pasifloras.
49
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53
12. ANEXOS
Anexo 1. Especies y accesiones de las secuencias proteicas con las que se realizó alineamiento múltiple para la construcción de los primers degenerados.
1.a
54
1.b
55
1.c
Especie Accesión Especie Accesión
Amborellatrichopoda XP_011625107.1 Arabidopsisthaliana NP_001078740.1
Arabidopsislyratasubsp.lyrata XP_002877607.1 Arabisalpina KFK30048.1
Arabidopsisthaliana NP_851013.2 Brassicarapa XP_009134050.1Arabisalpina KFK34124.1 Camelinasativa XP_010482335.1
Brachypodiumdistachyon XP_003574920.1 Cicerarietinum NP_001265927.1
Brassicanapus CDX77899.1 Citrussinensis XP_006476922.1
Camelinasativa XP_010426320.1 Cucumismelo XP_008464494.1
Capsellarubella XP_006293335.1 Cucumissativus XP_011653620.1
Cicerarietinum NP_001266141.1 Elaeisguineensis XP_010912938.1Citrusclementina KHG05902.1 Eucalyptusgrandis XP_010037493.1
Citrussinensis XP_006476922.1 Glycinemax XP_003523115.2
Cucumismelo XP_008464492.1 Glycinesoja KHN34372.1
Cucumissativus XP_011653592.1 Gossypiumarboreum KHG05902.1Elaeisguineensis XP_010904540.1 Jatrophacurcas XP_012079946.1Erythrantheguttatus XP_012829341.1 Malusdomestica XP_008360769.1
Eucalyptusgrandis XP_010037493.1 Medicagotruncatula KEH31743.1
Eutremasalsugineum XP_006404276.1 Morusnotabilis XP_010102929.1
Fragariavescasupsp.vesca XP_004299164.1 Musaacuminatasubsp.malaccensis XP_009420314.1
Glycinemax XP_003523115.2 Nicotianasylvestris XP_009795961.1
Glycinesoja KHN34372.1 Phaseolusvulgaris XP_007155500.1
Gossypiumarboreum KHG28978.1 Phoenixdactylifera XP_008797095.1
Gossypiumraimondii XP_012468635.1 Populuseuphratica XP_011005609.1Jatrophacurcas XP_012079946.1 Prunusmume XP_008239363.1Malusdomestica XP_008374365.1 Prunuspersica XP_007211188.1
Medicagotruncatula KEH31743.1 Solanumlycopersicum XP_004236292.1
Morusnotabilis XP_010102929.1 Solanumtuberosum XP_006351432.1Musaacuminatasubsp.malaccensis XP_009420314.1 Tarenayahassleriana XP_010533504.1
Nelumbonucifera XP_010248719.1 Vitisvinifera XP_002278792.2
Nicotianasylvestris XP_009795961.1Oryzabrachyantha XP_006659683.1
Phaseolusvulgaris XP_007137987.1
Phoenixdactylifera XP_008797095.1
Populuseuphratica XP_011005609.1
Populuseuphratica XP_011005608.1
Populustrichocarpa XP_002318690.2
Prunusmume XP_008239363.1
Pyrusxbretschneideri XP_009333916.1Ricinuscommunis XP_002511285.1
Sesamumindicum XP_011086998.1Setariaitalica XP_004974182.1Solanumlycopersicum XP_004236292.1Solanumtuberosum XP_006351432.1Tarenayahassleriana XP_010545995.1Theobromacacao XP_007037797.1Vitisvinifera XP_002278792.2Zeamays NP_001140310.1
PIMT1 PIMT2
56
1.d
Anexo 2. Grado de degeneración y “stricness” de la degeneración utilizado en el software
CODEHOP para diseñar los primers degenerados de los 7 genes.
Gen candidatoGrado de
degeneración
Rigurosidad de la
degeneración
At3g08030 150 0,15
AtLIG6 128 0,00
CYP707A1 128 0,00
CYP707A2 128 0,00
DOG1 150 0,15
PIMT1 128 0,00
PIMT2 150 0,00
57
Anexo 3. Grado de degeneración y porcentajes de guanina-citosina de las secuencias de los
primers obtenidos con la herramienta CODEHOP.
Anexo 4. Valores de concentración y absorbancia de las muestras de ADN con el protocolo de
Doyle & Doyle (1991). Cho: cholupa. Gran: granadilla. Mara: maracuyá. (Sovic et al., 2012)
(Nagai, Yoshida, & Sato, 1998)
Gen candidatoGrado de
degeneración % GC
At3g08030F: 24 47,8At3g08030R: 64 41,7AtLIG6F: 64 42,9AtLIG6R: 32 41,4
CYP707A1F: 128 55,2CYP707A1R: 32 50,0CYP707A2F: 64 39,4CYP707A2R: 96 33,9DOG1F: 64 57,1DOG1R: 96 45,4PIMT1F: 64 41,7PIMT1R: 128 45,6PIMT2F: 64 41,1PIMT2R: 64 39,7
MuestraConcentración
(ng/µl)
concentración
promedio
(ng/µl)
Absorbancia
(nm)
260/280
Absorbancia
promedio
(nm)
260/280
Cho1 105,71 1,69
Cho2 181,34 1,79
Cho3 194,61 1,74
Cho4 145,78 1,77
Gran1 400,17 1,89
Gran2 202,10 1,90
Gran3 445,45 1,88
Gran4 42,030 1,84
Mara1 439,68 1,77
Mara2 686,57 1,84
Mara3 243,02 1,83
Mara4 320,22 1,74
ExtracciónADNfoliarconisopropanolfríoincubandoportodalanoche
a-20°C
156,8
272,4
422,3
1,7
1,8
1,8
58
Anexo 5. Amplificación con primers degenerados, bajo condiciones de ciclado y reactivos
inespecíficos, de la muestra 21 de granadilla. M: Marcador de tamaño 1kb (Generuler). En los
pocillos se muestran consecutivamente la amplificación con los primers At3g08030 (1), AtLIG6
(2), CYP707A1 (3), CYP707A2 (4), DOG1 (5), PIMT1(6) y PIMT2 (7).
Anexo 6. Secuencias obtenidas de la compañía MACROGEN con cada uno de los plásmidos
purificados enviados a secuenciar.
>Secuencia At3g08030 clon 1 F
GGGCCGACAAATATAGGGCGATTGGGCCCGACGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCGGCCGCGGGA
ATTCGATTTGTTCATGCTGTTAGACTGGGTAATGATGCTGCAACTGCACTAGCCGAATTTTTAGAAGAG
GCCATAGCAGCGAAACAGAGATCGGCATCGAACCAATTCGGGAGATATGGGCAGTCACCGCTGGGAA
GTTGGTATGACAGGAGTTGCGGTCCCGTTCTTGATCAAGTTAGAGTTTTTCCTAATCACTAGTGAATTC
GCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGCTTGAGTATTCTA
TAGTGTCACCTAAATAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTC
ACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCT
AACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATT
AATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACT
GACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTT
ATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAA
CCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATC
GACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAG
CTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGA
AGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCCTCCAAGCT
GGGCTGTGTGCACGACCCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTACTATCGTCTTGAGTCC
AACCCGGTAAGAACACGACTATCGCACTGCAGCAGCCACTGGTTACAGAATAGCAGAGCGAGTATGT
AGGCGGTGCTACGAGTCTGAGTGGTTGCCTACTACGGCTACCTGAAGAACGTATTGCTATCTTGCGCC
TCTGCCTGAAGCTCAGTAC
>Secuencia At3g08030 clon 1 R
GGCCGTGAGGAAAAACTGAGGAGCTTAATTGCCATTGTTTGACGATCGGGGATCATCCGGGTCTGTGG
CGGGAACTCCTGCAAGATGTCGCAACGTGCGAAATATCGCGTTGCATCCCGGTCTTGCCTGGACAGTC
GCGCCCGACGCGGTTGATGTGGACGCCGGGACCGATCATCTTGTCGCTCACGATCGTGGCGTTCTGCT
TGGCGGCCGTTGGTGGCGGCATGATCTCGGGACCTTCGACCGCCTGTGCCGCATACATCCCGTGGGCC
AAGAACTCCACCGTGAAATCCCCACGCTGGAGGATCATCCTGGCAGCGTCCCAGAAAAGAAGTCCGA
59
AACCCAACCTTTCATAGGAAGGCGGCCGGGGAATCGAAATCTCGTGATGGCAAGTTGGGCGTCGCTTG
GTCGGACATTTCTAACCCGACAGTCCCTCTCAGAAGAACTCGTCAAGAATGCGATATAAAGCGAGGCC
CTGCGAATCGGGCTCGGAGATACTGCACGCACGAAGAAGGAATGATCCCATTCAGCGCCAGGGTCTC
AGCGATATCGCGGTTATCAAAGCTATGGCCTGATAGCGGTCCTTCACACCCAATCGGGCACACTCGAT
GAATCCACATCACCAGTCATTTTCCACCATGATATTCGGCAAGCAGGCAGCGCCATGGGTGACGATGA
GATCATCGGCGTAAGGAATGCTCGCCTTCAGCCTGACGAAAGTTCGGGTGGAGCGAGACTCTTGATGG
TCTTCGTACACATCATCGTGATCGACATTTGGGGCTTCCATCGGAGTATCTGCGTCGCTCGATGGATGT
TTCTGTTTCTGGATGAGATGAGAGGCAACGCTGATTGAGTCCAATCCTTCGACTCGACGCGTCTGTAG
AGATTCATAATTTTTGGTCAAGAGACTAGGTGGATGTAACAAAAGATACTGCCCAATGCAAATA
>Secuencia At3g08030 clon 2 F
GAGGCTAACTAATATACGGCGATTGGGCCCGACGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCGGCCGCGGGA
ATTCGATTTGTTCATGCTGTTAGACTGAGGAACGAAGCATGAAGCACCAGGACCGGTGCAAGCCCCAG
TTCCACCAGAGCCGGCAGCTATGATAAGGGTGAAGGTACCACCTGTACCAGCACAGCCAGCGGAGCAA
GTGCAAGATGTTGGGAGAGCCCCTATGCGTGCGACAAAGCTGCTGAATGAAGCACGACAGTTGGGGTG
TAAAAGTTTTAATGGCACTGGAGGAGTTACTGCGGCCCCGTTCTTGATCAAGTTAGAGTTTTTCCTAAT
CACTAGTGAATTCGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAG
CTTGAGTATTCTATAGTGTCACCTAAATAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAA
TTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCT
AATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGT
GCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCT
TCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGC
GGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAA
AAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCA
TCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTT
CCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTT
CTCCTTTCGGGAAGCGTGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGTATCTCAGTTCGTGTAGTCGTTCGCTC
AGCTGGCTGTGTGCACGACCCCCCGTCAGCCCGACGGCTGCGCTATCGTACCTATCGTCTGAGTTCACC
CGTTAGATGACTATCGCCACTTGGCAGCAGCCACTGTTACCAGGATTAGCCAAAGCGGAAGGGT
>Secuencia At3g08030 clon 2 R
GGGGGGTCAATTTAGGTGACCTATAGAATACTCAAGCTATGCATCCAACGCGTTGGGAGCTCTCCCAT
ATGGTCGACCTGCAGGCGGCCGCGAATTCACTAGTGATTAGGAAAAACTCTAACTTGATCAAGAACGG
GGCCGCAGTAACTCCTCCAGTGCCATTAAAACTTTTACACCCCAACTGTCGTGCTTCATTCAGCAGCTT
TGTCGCACGCATAGGGGCTCTCCCAACATCTTGCACTTGCTCCGCTGGCTGTGCTGGTACAGGTGGTAC
CTTCACCCTTATCATAGCTGCCGGCTCTGGTGGAACTGGGGCTTGCACCGGTCCTGGTGCTTCATGCTTC
GTTCCTCAGTCTAACAGCATGAACAAATCGAATTCCCGCGGCCGCCATGGCGGCCGGGAGCATGCGAC
GTCGGGCCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGAC
TGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAAT
AGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGACGCGCCC
TGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGC
CCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTC
TAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATT
AGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCA
CGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGA
TTTATAAAGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGC
GAATTTAACAAATATAACGCTTACAATTTCCTGATGCGTATTTCTCTACGCATCTGTGCGGTATTCACAC
CGCATCAGTTGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGACCCTACTGATATTTTCTAATACATCCAATATGTA
TCCGATCATGACAGTACATGATATGCTTCATATATTCTAAGGGAGGAAATGGAGTATC
>Secuencia At3g08030 clon 3 F
TAAGTTGCCTAATTATTAGGGGCGATTGGGCCCGACGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGGGGCCGCG
GGAATTCGATTTGTTCATGCTGTTAGACTGGGGAATGAAGCTCCTCTCCTGCCTGGCAGCACATCTCAT
CACCGCCTCTGCGGCCCAGTTCTTGATCAAGTTAGAGTTTTTCCTAATCACTAGTGAATTCGCGGCCGC
CTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGCTTGAGTATTCTATAGTGTCAC
60
CTAAATAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCAC
ACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTA
ATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGC
CAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGC
TCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATC
AGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGC
CGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCA
GAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCT
CTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTT
CTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCAC
GAACCCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCGTAATCCGGTAACTATCGTCTGAGTCCAACCCGGTAAG
ATCACGACATTATCCGCCACTGGACAGCAGCCACTGGGTAACAGATTAGCATGAGCGAGTATGTAGAC
GGTGCTACAGAAGTTCATTGAAAGTGATGGCCCTAACCTACGCTAGCCTAGAAAGAAACTGACTATTT
CGTATCTGCGCCTCTGCCTTGAGTCTCAGTTACCTTACGGAACAAGACTTGATAGCCTTGAATTCTGTC
AAATCAAAACCCACCCGCTCTGTGATAC
>Secuencia At3g08030 clon 3 R
GCGACCGGCAATTTTACGTGACCTATAGAATACTCAAGCTATGCATCCAACGCGTTGGGAGCTCTCCCA
TATGGTCGACCTGCAGGCGGGCGCGAATTCACTAGTGATTAGGAAAAACTCTAACTTGATCAAGAACT
GGGCCGCAGAGGCGGTGATGAGATGTGCTGCCAGGCAGGAGAGGAGCTTCATTCCCCAGTCTAACAGC
ATGAACAAATCGAATTCCCGCGGCCGCCATGGCGGCCGGGAGCATGCGACGTCGGGCCCAATTCGCCC
TATAGTGAGTCGTATTACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTT
ACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACC
GATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGC
GCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTC
GCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTT
TAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTA
GTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGAC
TCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCC
GATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATT
AACGCTTACAATTTCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATCACGT
GGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCC
GCTCATGAGACAATAACCTGATAATGCTTCAATAATATTGAGAAAGGCAGAGTATGAGTATTCAACAT
TCCGGTGTCGGCCCGTTATTGCCTTTTTTTGGCAGCAATTTGGCCATTCCCTGATTTATGCTTCACCCAA
GCAACGCTGGGTGCAAAGTAAAGATGCCTGAAGATCATTGGGATGCACCGGAGGTGGAGGTCTTCATA
TCGAGACCTGGGAATCTTTCA
>Secuencia At3g08030 clon 4 F
ATGGTGACTTATATACGGGCGATTGGGCCCGACGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCGGCCGCGGGA
ATTCGATTTGTTAAGCTGTTAGACTGGGTAATGAGGCGCAGATCAGCCAGGAACTGACTGTGGAGAAA
GGGTCTATGTACTCGGTTACGTCCAGTGCGGCTCGCACATGCGCCCAACTGGAGTCGATAAACGTGTCA
GTGCCGTCTGCATCAACCACCATAGACCTGCAGACGGTTTATAATGTGCAAGCGTGGGACCCATACGC
GTGGGCTTTCGAGGCTGAGGATGATAAAGTGAATTTGGTTTTCACTAATCCCGGTATGGAGGATGACCC
AGCCTGTGGCCCTGTTCTTGATCAAGTTAGAGTTTTTCCTAATCACTAGTGAATTCGCGGCCGCCTGCA
GGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGCTTGAGTATTCTATAGTGTCACCTAAA
TAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAA
CATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTG
CGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAAC
GCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGG
TCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGG
GATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCG
TTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGG
TGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCTCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCCTCTCCT
GTTCGACCTGCGCTTACGGGATACCTGTCCGCTTTCTCCTCGGGAGCGTGCGCTTTCTCATAGCTCACGC
TGTAGTATCTCAGTCGGTGTAGTCGGTCGCTCAGCCTGGCTGGTGTGCACGACCCTCGGTCAGTCGACG
TTGCCTATCGGTACTATCGCTTGGATCAAGCTGGATAAGAAACCGCAACTTATCGG
61
>Secuencia At3g08030 clon 4 R
GGGGCCAGCATTTTAGGTGACCTATAGAATACTCAAGCTATGCATCCAACGCGTTGGGAGCTCTCCCAT
ATGGTCGACCTGCAGGCGGCCGCGAATTCACTAGTGATTAGGAAAAACTCTAACTTGATCAAGAACAG
GGCCACAGGCTGGGTCATCCTCCATACCGGGATTAGTGAAAACCAAATTCACTTTATCATCCTCAGCCT
CGAAAGCCCACGCGTATGGGTCCCACGCTTGCACATTATAAACCGTCTGCAGGTCTATGGTGGTTGATG
CAGACGGCACTGACACGTTTATCGACTCCAGTTGGGCGCATGTGCGAGCCGCACTGGACGTAACCGAG
TACATAGACCCTTTCTCCACAGTCAGTTCCTGGCTGATCTGCGCCTCATTACCCAGTCTAACAGCATGA
ACAAATCGAATTCCCGCGGCCGCCATGGCGGCCGGGAGCATGCGACGTCGGGCCCAATTCGCCCTATA
GTGAGTCGTATTACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCC
AACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATC
GCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGG
CGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTT
TCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGG
GTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGG
GCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTG
TTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGATTTTGCCGATTTC
GGCCTATGGTTAAAAAATGAGCTGATTACAAAATTTACGCGATTTAACAAAATATACGCTACATTTCTG
ATGCGTATTTTCTCTTACGCATCTGTGCGTATTCACACGGCATCAGTGCACTTTCGCAATGGACCGACCT
ATTGATATTTCTGAATACATCGAAATATGTTTATTCGGC
>Secuencia CYP707A1 clon 1 F
GGGCCTAACTAAATACGGCGATTGGGCCCGACGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCGGCCGCGGGAA
TTCGATTCAGCAAAGCCAGCTTAGCCAGCTCGTTACCTTTTACCTATGCCATGATGCTCATGGGCAGCT
TATCTCTAATTGGATTTCCTTTTCTAACTGGATTTTATTCCAAAGATGTGATCTTAGAGCTCGCTTACAC
TAAGTATACCATCAGTGGGAACTTTGCTTTCTGGTTGGGAAGTGTCTCTGTCCTTTTCACTTCTTATTAC
TCTTTTCGTTCACTTTTTCTAACATTTCTAGTACCAACTAATTCATTCGGGCGAGACATCGTAAGATGTC
ATGATGCGCCCATTCCTATGGCCATTCCTTTAATACTTTTGGCTCTCGGGAGTCTCTTTGTAGGATACTT
GGCCAAAGTGTGACCCGTTAGCCCATAAGTAAGTACTGTGACGAAGCGGCTGTTGCTCACCCGACACG
ATCGTACGAGGTCACAATTCACCCAACACGATCATCCGGGGTGAACAAGAATTGGGGATCGGATGCGG
GCGAAATTCCCGCCAATGGCTGAGATGTTCAGTCGACTCCCTCCCCCTTTGTGGGGGTCCGAACCCCTA
CGAGTGAGCAGAAAAGGGAGGAGGAAAGAGGCCCTGGCGAACCGTCATAATTAGTGAACAAGTGTAA
GCTTCGCTGCCCGACAGTATGGAGTACTGACCACACCGACACCGAGGGACAGGCCCTGAAGCGAAGG
ACGGCAACGAACTGGCTAAGCTGGAAATGCTGAATCACTAGTGAATTCGCGGCCGCCTGCAGGTCGAC
CATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGCTTGAGTATTCTATAGTGTCACCTAAATAGCTTG
GCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGA
GCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCG
CTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGG
GAGAGGCGTTGCGTATTGGGCGCTCTTCGCTTCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGTCGTCGCTGCCG
CCGAGCGCAATCAGCTCACTCGAGCCGTAATACGGTTATCCCACAGATTTCAGGGGTATATACCGCTCA
AGGGGA
>Secuencia CYP707A1 clon 1 R
AAGGATGCCAATGTTGGGGTTCTAGGCGGCTCGTGGTATGCGGAAACGCGTCGGGAGGTCTAAATATT
GTCGACCAGCAGGAAGAGGACCCATAACCCCCGATTCATGATTTCCAGCTACGCCAGTTCGCTGCGGT
CCTCCGCTGCGGGGCCTGTCTCTCGGGGGGGGTGTGGGCCGCTCTCCAAACCGTCCCGGTGTCAAGCTT
ACACATGTTCGGAATGGAAAAGGTCTTCAGGCCCCCCATGCTGCTTGCTGATATGCTCTGTATGAGGGC
ATCGGAATCCACCGGCGGGAACGGAATCGATGAAACAGACGATTGCTTGGTGTGAATTTCGACCGCGC
CCCATCCAAAAAAAGAGATTCAATTGTGTGATGTTTGGTCGGGAAATGAGCAATCGGACCTGGAGGAG
TGGGACCTTTTTTCGGTTCAGTTCTTAACTCGTATGTTGGGTAACATCTTAACATCTTGACTTTGTTCGG
GCTTGGGAGTCTGCCTATAACTGAATATTTTACTGGATTGGACTTATGTCTCGGCGTGTTATGACATCTT
GCGATGGTGTGACTAAAGGGAGTCTGTGTCCTTACAAAACTCTAAAAAACCTGAAGCATCAGAATTAT
AGTAAGTGGAAAGGGTTTGGAGGGCGTGATCCAGAAAGACATAACTTGACGACGACTCTATACTTAAT
GTAATCTAGGATCCAACAATGCAACTTTGGAATATGACCCCTGCGCCAAACGATATGCAGTTTATTTAT
TAGCTGCCGCATGAGCATCAGATCGTCGTGACAATGTAACGAGCTGGATTAGCTGGAAATGGTCGAAC
CGATTTCCCGATGTCGCCTCGTCGGCCAGGGAGCTCTGCGAACATCGGGCCCAAATCAGCGCATTGGT
62
GAGTCGTAATTGCAATTTCACATGGTCTGTTCTGTTATAGCCTGGGTGGATTGGGGAAAACCCCGGACG
TTCCGCGACCTAGATCGCCCTGTTACACATCCCCCTTTTCTGCCAGCTTGGCGTGATTATCGAAAAAAG
CCCTCCACCGAATCTGCCCTTTCCCTAAAAGTAGACTCCGGCT
>Secuencia CYP707A1 clon 5 F
AGGCTAACTAATATAGGGCGATTGGGCCCGACGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCGGCCGCGGGAA
TTCGATTCAGCATTTCCGGCTTAGCCAATTCGTTGCCTTTTACCTATGCCATGATGCTCATGGGCAGCTT
ATCTCTAATTGGATTTCCTTTTCTAACTGGATTTTATTCCAAAGATGTGATCTTAGAGCTCGCTTACACT
AAGTATACCATCAGTGGGAACTTTGCTTTCTGGTTGGGAAGTGTCTCTGTCCTTTTCACTTCTTATTACT
CTTTTCGTTCACTTTTTCTAACATTTCTAGTACCAACTAATTCATTCGGGCGAGACATCGTAAGATGTCA
TGATGCGCCCATTCCTATGGCCATTCCTTTAATACTTTTGGCTCTCGGGAGTCTCTTTGTAGGATACTTG
GCCAAAGTGTGACCCGTTAGCCCATAAGTAAGTACTGTGACGAAGCGGCTGTTGCTCACCCGACACGA
TCGTACGAGGTCACAATTCACCCAACACGATCATCCGGGGTGAACAAGAATTGGGGATCGGATGCGGG
CGAAATTTCCGCCAATGGCTGAGATGTTCAGTCGACTCCCTCCCCCTTTGTGGGGGTCCGAACCCCTAC
GAGTGAGCAGAAAAGGGAGGAGGAAAGAGGCCCTGGCGAACCGTCATAATTAGTGAACAAGTGTAAG
CTTCGCTGCCCGACAGTATGGAGTACTGACCACACCGACACCGAGGGACAGGCCCTGAAGCGAAGGAC
GGGAACGAGCTGGCTAAGCTGGAAATGCTGAATCACTAGTGAATTCGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCA
TATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGCTTGAGTATTCTATAGTGTCACCTAAATAGCTTGGC
GTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGC
CGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAAATTGCGTTGCG
CTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGGCCAACGCGCG
GGGAGAGGCGGTTTGCGTATGGGGCGCTCTTCGCTTCTCGCCTCACTGACTCGCTGCGCTCGTTCGGTC
GCTGCCGCGGACGATCAGCTCACTCGAGCGTAAATACCGTTATTCCACAGAAATCAGGGAATATAACG
A
>Secuencia CYP707A1 clon 5 R
TGGGGGGCCAATTTACGTGACCTATAGAATACTCAAGCTATGCATCCAACGCGTTGGGAGCTCTCCCAT
ATGGTCGACCTGTAGGCGGCCGCGAATTCACTAGTGATTCAGCATTTCCAGCTTAGCCAGCTCGTTCCC
GTCCTTCGCTTCAGGGCCTGTCCCTCGGTGTCGGTGTGGTCAGTACTCCATACTGTCGGGCAGCGAAGC
TTACACTTGTTCACTAATTATGACGGTTCGCCAGGGCCTCTTTCCTCCTCCCTTTTCTGCTCACTCGTAG
GGGTTCGGACCCCCACAAAGGGGGAGGGAGTCGACTGAACATCTCAGCCATTGGCGGAAATTTCGCCC
GCATCCGATCCCCAATTCTTGTTCACCCCGGATGATCGTGTTGGGTGAATTGTGACCTCGTACGATCGT
GTCGGGTGAGCAACAGCCGCTTCGTCACAGTACTTACTTATGGGCTAACGGGTCACACTTTGGCCAAGT
ATCCTACAAAGAGACTCCCGAGAGCCAAAAGTATTAAAGGAATGGCCATAGGAATGGGCGCATCATG
ACATCTTACGATGTCTCGCCCGAATGAATTAGTTGGTACTAGAAATGTTAGAAAAAGTGAACGAAAAG
AGTAATAAGAAGTGAAAAGGACAGAGACACTTCCCAACCAGAAAGCAAAGTTCCCACTGATGGTATA
CTTAGTGTAAGCGAGCTCTAAGATCACATCTTTGGAATAAAATCCAGTTAGAAAAGGAAATCCAATTA
GAGATAAGCTGCCCATGAGCATCATGGCATAGGTAAAAGGCAACGAATTGGCTAAGCTGGAAATGCTG
AATCGAATTCCCGCGGCCGCCATGGCGGCCGGGAGCATGCGACGTCGGGCCCAATTCGCCCTATAGTG
AGTCGTATTACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAAC
TTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCC
CTTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGCAG
TGTGTGTACGCGCAGCGTGACGCTAACACTGCAGCGTCCTAGCGTCGCTTCTTCGCATTCTCATCCTTTC
TCGCACGATCGCGGCTTTCCCGTCAGCTCTAATCGGGGGACTCCTTTAAGGATTTCCGAT
>Secuencia PIMT2 clon 6 F
GGGGCTAACTCATATAGGGCGATTGGGCCCGACGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCGGCCGCGGGA
ATTCGATTAGAAGGTTGCTGAAGTTATGGAGACGATGACTGAGAGTTTGGCCCAGGAATTGAAGGATA
AAGGCAGAAATGTGGCAGTTTCACCAGCACTAGTTATTGATTCTGCTGAAAAGTCAACATTGGAAGGG
AAAAGTTCACGGGATAATCAAATTGATCTCGTGGTCAAGGCGGAGAATGTGGAAGTTACAGAATCCAG
TAAGGAAGTAAGAGTGGAGAATAAAGGGACTGAAGTGAATGTGGAGACGGTGACTGAGAGTTTGGCC
CAGGACTTGAAGGTTGTTGATAAGAATCTGGATGAATCACTAGTGAATTCGCGGCCGCCTGCAGGTCG
ACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGCTTGAGTATTCTATAGTGTCACCTAAATAGCT
TGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATAC
GAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTG
CGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCG
63
GGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTT
CGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAA
CGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTG
GCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGTGGCGA
AACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCG
ACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTTCGGGAGCGTGCGCTTTCTCATAGCTCACG
CTGTAGTATCTCAGTCGGTGTAGTCGGTCGCCTCAAGCCTGGGCTGTGTGCACGACCCCCGTTCAGTCG
ACGCTGCGCTAATCGTTACTATCGCTGATCACCGGTAAGAACCGACTATCGCCACTGCAGCCAGCCAC
GTGG
>Secuencia PIMT2 clon 6 R
AGAAAGGAATAGGAGCGACCGGGAGGCATCTCGATCTCTGGAAAAACGAGTAGGGAGCTCAAAATAA
GGGGTAAGGTCGCCCGCGCCCAGTGATTCTGGATCGTATAAAAAAAAGGGGTCTTGACACGAATCCTT
ATACTCAGAGACGGGGGGTCCCTCTCAAACCACCCTAACATTCTCATGTTTGCCAAGAGTCTCTCGGGG
GGCAGGAAGTACACTCGCTGCCCAAAATGGTGGGCGGCATGAATGGGAATGTGTGGACAACTCACCG
ATCACAAATGGGAGACTCAACATGCTCAATGTTTGATCATGAATGGGACATAATTAATGCCCGACATG
AAATCCAATGACGACTCGTCGGGAAACCAAACCAGAACCCGACCGGGTTTAAATCGGACGTCCCTTCC
ATAACTACAACATCCTACTAATGGATTCGACGGCCGCCTTGGAGGACGGGAGCATGGGACGGGTTTTG
CTATTTTTACTTTACTGAGTCCTATTAGATGCAATGGCCGTCGGTTTACTACGACATGAATGATAAAGC
CCGTGTGTTACCCAACTTCTCGCCTTGCCAAAATCCCCCTTATGCAAGCTGGCGTAATAATGACAGCGC
GCACCGAACACCCTTCACGACGATTGCACGGACTGAATGTCTAATGCACGCGCCCTGTGATGGTTCATT
TACCTCGGCCGTCGTGGCGGTTACGGTTCATTGTGATGCTACACTTGCAAGGATCCTAGTGCCCGCTCC
ATTCGCTGTCTTCAATCGTTTCTCGCCACATTCACCGGATTTCGACGCTCAAGCTCGAAATCGAGGCTC
CCCTTAGAATTCCAATATACAGCGTTACAGCACCTCCATCCCCAATCAGCTTGATAGTGGTGATGGTTC
ACGCGAGGAGCCATCGCGCTGAAAGACCGTTTTCCACCCTTTGACGTGGAGTCCACGTTTCTTACTA
>Secuencia PIMT2 clon 7 F
GGGGGTCATTTACGTGACCTATAGAATACTCAAGCTATGCATCCAACGCGTTGGGAGCTCTCCCATATG
GTCGACCTGCAGGCGGCCGCGAATTCACTAGTGATTCATCCAGATTCTTATCAACAACCTGAAAGTCTT
GACACCTAATCCTTATACTCAGAGACATATAGTCACTCACAAACCACCCTAACATTCTTAATTTTGCCA
CCAATCTCTCGGGGTTCGGGAATTACACTCTCTAACCGAACCTCCACACACCATGTATGCAAATGTATG
CACGACTCACAAATCAGAAATGGGAGACTCGACATGCACAATGCATGATCATGAATGGGACATAATTA
ATGCAGGACATGAAATGCAAGGGCGACTCAACCGGAAACCAAACCGGGTCCCCAACCGGGTTTAAAT
CGGACATCGCTTCCATAACTTCAGCAACCTTCTAATCGAATTCCCGCGGCCGCCATGGCGGCCGGGAGC
ATGCGACGTCGGGCCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACG
TCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTG
GCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGA
CGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTG
CCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGT
CAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAA
CTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTG
GAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAACTGGACACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTT
TGATTTATAGGATTTTGCCGATTCGGCTATGATAAAAAATGAGCTGATTACAAAATTTACGCGATTTAA
CAAAATATACGCTACATTCTGATGCGGCATTTTCTCGTACGCATCTTGTGGCGGTATCACGATCAGTGG
ACTTTCGGAATGTGTGCCGCGAACCCCCCAAATATTGGG
>Secuencia PIMT2 clon 7 R
GGGGGTCATTTACGTGACCTATAGAATACTCAAGCTATGCATCCAACGCGTTGGGAGCTCTCCCATATG
GTCGACCTGCAGGCGGCCGCGAATTCACTAGTGATTCATCCAGATTCTTATCAACAACCTGAAAGTCTT
GACACCTAATCCTTATACTCAGAGACATATAGTCACTCACAAACCACCCTAACATTCTTAATTTTGCCA
CCAATCTCTCGGGGTTCGGGAATTACACTCTCTAACCGAACCTCCACACACCATGTATGCAAATGTATG
CACGACTCACAAATCAGAAATGGGAGACTCGACATGCACAATGCATGATCATGAATGGGACATAATTA
ATGCAGGACATGAAATGCAAGGGCGACTCAACCGGAAACCAAACCGGGTCCCCAACCGGGTTTAAAT
CGGACATCGCTTCCATAACTTCAGCAACCTTCTAATCGAATTCCCGCGGCCGCCATGGCGGCCGGGAGC
ATGCGACGTCGGGCCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACG
TCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTG
64
GCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGA
CGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTG
CCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGT
CAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAA
CTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTG
GAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAACTGGACACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTT
TGATTTATAGGATTTTGCCGATTCGGCTATGATAAAAAATGAGCTGATTACAAAATTTACGCGATTTAA
CAAAATATACGCTACATTCTGATGCGGCATTTTCTCGTACGCATCTTGTGGCGGTATCACGATCAGTGG
ACTTTCGGAATGTGTGCCGCGAACCCCCCAAATATTGGG
>Secuencia PIMT2 clon 9 F
TTCATCCCTTTGAGGGCGAATTGGGCGCTGATGTCGCCCGCTCCCGGCCGCCGGGGGGGCCGCGGGAT
TCTAGAAGAGGTTGCTGAACTTATGGAGACTGTTCTCCAGGATCCTTTACATTGCCGGTGCATATCTCC
AAGATACCCGCGGAGGCTCAGTTCTTGGGTTGCGAGAGCTTCAGTGGCACAGGAAATGTTTCTGTTGTT
CAGTCGTGGCTAGAGTAGTCACGCTTGCTGTCAACATTTGAGACTGTCCGAGGTGGACATACGATTTTA
TCTACCCGGTTACTACAGGGTGATGCCAGGACTTGAAGGTTGTTGATAAGAATCTGGATGACTCACTAG
TGAATTCTCGGCCGCCTGCAAGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGCTTGAA
TATTCTATACTGGCACCTAAATAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTAT
CCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGT
GAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCGCTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCTGTGCCAGC
TGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGC
TCACTGAGTCGGTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCAGCGAGCGGTATCATCTCACTCAGAGGCGTTAATAC
GGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCACGAAAGATCATGTGATCAAAAGGCCTGCAAAATGCCAA
GAACCGTGAAAAGGCGGCGTTGCTGGCGTTTTTCAGTAGGCTTCTGCCCCGCGTGACGAGCATCGCAA
AAATCAACGGTCAAGTCAAAGGTGGCGAAGACGCGACAGGACTATGAGATCCCAGGCGTTTCCCTCTT
GAAGCTCCCTCATGCGCTCTCTGTCCGACCATGCCGCTAACAGGAAACCTGTTCCGCCTTTTCTTCCGTT
CAGGAGCAGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTAGACAGTATCTCAAATCGTGGAAGTCGTTCGCTTCGAA
CTGGTCTGGGTGATCGAAACCCGCGATTAGGCCGAACGCTTGGACTATAACCGGTACCATATCGGTCTT
TGAATTCCACCCGGTAAAACACGGA
>Secuencia PIMT2 clon 9 R
GGGGCAGCATTAGTGACCTATAGAATACTCAAGCTATGCATCCAACGCGTTGGGAGCTCTCCCATATG
GTCGACCTGCAGGCGGCCGCGAATTCACTAGTGATTCATCCAGATTCTTATCAACAACCTTCAAGTCCT
GGCATCACCCTCTAGTAACCGGGTAGCTAAAATCACTATGTCCACCTCGGACAGTCTCAAATCTTCTGC
AGCAAGCGTGACTCTCTCTAGCCACGACTGAACAACAGAAACATTTCCTGTGCCACTGAAGCTCTCGC
AACCCAAGAACTGAGCCTCCTTCGGTATCTTGGAGATCTGCACCGGCAATCTCGCTGATCCTGGAGCTA
CCGTCTCCATAACTTCAGCAACCTTCTAATCGAATTCCCGCGGCCGCCATGGCGGCCGGGAGCATGCGA
CGTCGGGCCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGA
CTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAA
TAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGACGCGCC
CTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCG
CCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCT
CTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGAT
TAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCC
ACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTTATTCTTTT
GATTTATAAGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATGTAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTACGCGATT
TAACAAATATACGCTACATTCCTGATGCGATTTTCTCTACGCATCTGTGCGGATTCCACCGCATCAGTG
CACTTTCGGAATGTCGCCGAACCTATGGTAATTTCTAATCGTCCAATTGTATCCGCCTCTAGGAACTAC
CAGTAAGCTCATATGAAGGAATGGAATTTCACCA
65
Anexo 7. Secuencias consenso obtenidas por medio de Cap3.
> Consenso At3g08030 clon 2
TGTTCATGCTGTTAGACTGAGGAACGAAGCATGAAGCACCAGGACCGGTGCAAGCCCCAGTTCCACCA
GAGCCGGCAGCTATGATAAGGGTGAAGGTACCACCTGTACCAGCACAGCCAGCGGAGCAAGTGCAAG
ATGTTGGGAGAGCCCCTATGCGTGCGACAAAGCTGCTGAATGAAGCACGACAGTTGGGGTGTAAAAGT
TTTAATGGCACTGGAGGAGTTACTGCGGCCCCGTTCT TGATCAAGTTAGAGTTTTTCCT
> Consenso At3g08030 clon 3
TGTTCATGCTGTTAGACTGGGGAATGAAGCTCCTCTCCTGCCTGGCAGCACATCTCATCACCGCCTCTG
CGGCCCAGTTCTTGATCAAGTTAGAGTTTTTCCT
> Consenso At3g08030 clon 4
TGTTCATGCTGTTAGACTGGGTAATGAGGCGCAGATCAGCCAGGAACTGACTGTGGAGAAAGGGTCTA
TGTACTCGGTTACGTCCAGTGCGGCTCGCACATGCGCCCAACTGGAGTCGATAAACGTGTCAGTGCCGT
CTGCATCAACCACCATAGACCTGCAGACGGTTTATAATGTGCAAGCGTGGGACCCATACGCGTGGGCT
TTCGAGGCTGAGGATGATAAAGTGAATTTGGTTTTCACTAATCCCGGTATGGAGGATGACCCAGCCTGT
GGCCCTGTTCTTGATCAAGTTAGAGT TTTTCCT
>Consenso CYP707A1 clon 5
CAGCAAAGCCAGCTTAGCCAGCTCGTTACCTTTTACCTATGCCATGATGCTCATGGGCAGCTTATCTCT
AATTGGATTTCCTTTTCTAACTGGATTTTATTCCAAAGATGTGATCTTAGAGCTCGCTTACACTAAGTAT
ACCATCAGTGGGAACTTTGCTTTCTGGTTGGGAAGTGTCTCTGTCCTTTTCACTTCTTATTACTCTTTTCG
TTCACTTTTTCTAACATTTCTAGTACCAACTAATTCATTCGGGCGAGACATCGTAAGATGTCATGATGC
GCCCATTCCTATGGCCATTCCTTTAATACTTTTGGCTCTCGGGAGTCTCTTTGTAGGATACTTGGCCAAA
GTGTGACCCGTTAGCCCATAAGTAAGTACTGTGACGAAGCGGCTGTTGCTCACCCGACACGATCGTAC
GAGGTCACAATTCACCCAACACGATCATCCGGGGTGAACAAGAATTGGGGATCGGATGCGGGCGAAA
TTCCCGCCAATGGCTGAGATGTTCAGTCGACTCCCTCCCCCTTTGTGGGGGTCCGAACCCCTACGAGTG
AGCAGAAAAGGGAGGAGGAAAGAGGCCCTGGCGAACCGTCATAATTAGTGAACAAGTGTAAGCTTCG
CTGCCCGACAGTATGGAGTACTGACCACACCGACACCGAGGGACAGGCCCTGAAGCGAAGGACGGCA
ACGAACTGGCTAAGCTGGAAATGCTG
> Consenso PIMT2 clon 7
CATCCAGATTCTTATCAACAACCTGAAAGTCTTGACACCTAATCCTTATACTCAGAGACATATAGTCAC
TCACAAACCACCCTAACATTCTTAATTTTGCCACCAATCTCTCGGGGTTCGGGAATTACACTCTCTAAC
CGAACCTCCACACACCATGTATGCAAATGTATGCACGACTCACAAATCAGAAATGGGAGACTCGACAT
GCACAATGCATGATCATGAATGGGACATAATTAATGCAGGACATGAAATGCAAGGGCGACTCAACCG
GAAACCAAACCGGGTCCCCAACCGGGT TTAAATCGGACATCGCTTCCATAACTTCAGCAACCTTCT
Anexo 8. Resultado del BLAST-P con la secuencia nucleotídica consenso At3g08030 clon 4
(Query).
>ref|XP_002519690.1| conserved hypothetical protein [Ricinus communis]gb|EEF42663.1| conserved
hypothetical protein [Ricinus communis]Length=393
Query 5 HAVRLGNEAQISQELTVEKGSMYSVTSSAARTCAQLESINVSVPSASTTIDLQTVYNVQA 184
HAVRLGN+A+ISQELTVEKGS+YS+T SAARTCAQLES+NVSVPSAS TIDLQTVYNVQ
Sbjct 87 HAVRLGNDAEISQELTVEKGSIYSITFSAARTCAQLESLNVSVPSASQTIDLQTVYNVQG 146
Query 185 WDPYAWAFEAEDDKVNLVFTNPGMEDDPACGPVLDQVRV 301
WDPYAWAFEAE+DKVNLVF NPGMEDDP CGP++D + +
Sbjct 147 WDPYAWAFEAEEDKVNLVFRNPGMEDDPTCGPIIDDIAI 185
66
>ref|XP_012072100.1| PREDICTED: uncharacterized protein LOC105633987 [Jatropha
curcas]gb|KDP37968.1| hypothetical protein JCGZ_04611 [Jatropha curcas]Length=391
Query 5 HAVRLGNEAQISQELTVEKGSMYSVTSSAARTCAQLESINVSVPSASTTIDLQTVYNVQA 184
HAVRLGN+A+ISQELTVEKG++YSVT SAARTCAQLES+NVSVP AS TIDLQT+YNVQ
Sbjct 87 HAVRLGNDAEISQELTVEKGAIYSVTFSAARTCAQLESLNVSVPPASQTIDLQTLYNVQG 146
Query 185 WDPYAWAFEAEDDKVNLVFTNPGMEDDPACGPVLDQVRV 301
WDPYAWAFEAE+DKV+LVF NPGMEDDP CGP++D + +
Sbjct 147 WDPYAWAFEAEEDKVSLVFRNPGMEDDPTCGPIIDDIAI 185
>gb|KDO78161.1| hypothetical protein CISIN_1g0159862mg, partial [Citrus sinensis]Length=363
Query 5 HAVRLGNEAQISQELTVEKGSMYSVTSSAARTCAQLESINVSVPSASTTIDLQTVYNVQA 184
HAVRLGN+A+ISQE+ VEKGS YSVT SAARTCAQLES+NVSVP AS TIDLQT+YNVQ
Sbjct 57 HAVRLGNDAEISQEVKVEKGSTYSVTFSAARTCAQLESLNVSVPPASQTIDLQTLYNVQG 116
Query 185 WDPYAWAFEAEDDKVNLVFTNPGMEDDPACGPVLDQVRV 301
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>ref|XP_006449683.1| hypothetical protein CICLE_v10015527mg [Citrus clementina]gb|ESR62923.1|
hypothetical protein CICLE_v10015527mg [Citrus clementina]Length=393
Query 5 HAVRLGNEAQISQELTVEKGSMYSVTSSAARTCAQLESINVSVPSASTTIDLQTVYNVQA 184
HAVRLGN+A+ISQE+ VEKGS YSVT SAARTCAQLES+NVSVP AS TIDLQT+YNVQ
Sbjct 87 HAVRLGNDAEISQEVRVEKGSTYSVTFSAARTCAQLESLNVSVPPASQTIDLQTLYNVQG 146
Query 185 WDPYAWAFEAEDDKVNLVFTNPGMEDDPACGPVLDQVRV 301
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Sbjct 147 WDPYAWAFEAEDDNVKLLFKNPGMEDDPTCGPIIDDIAI 185
>ref|XP_011015145.1| PREDICTED: uncharacterized protein LOC105118803 [Populus
euphratica]Length=393
Query 5 HAVRLGNEAQISQELTVEKGSMYSVTSSAARTCAQLESINVSVPSASTTIDLQTVYNVQA 184
HAVRLGN+A ISQELTVEKGS+YSVT SAARTCAQLES+NVSVP AS TIDLQT+YNVQ
Sbjct 88 HAVRLGNDADISQELTVEKGSIYSVTFSAARTCAQLESLNVSVPPASQTIDLQTLYNVQG 147
Query 185 WDPYAWAFEAEDDKVNLVFTNPGMEDDPACGPVLDQVRV 301
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Sbjct 148 WDPYALAFEAPEDKVRLVFSNPGMEDDPTCGPIIDDIAI 186
>ref|XP_006352963.1| PREDICTED: uncharacterized protein LOC102582541 [Solanum
tuberosum]Length=391
Query 5 HAVRLGNEAQISQELTVEKGSMYSVTSSAARTCAQLESINVSVPSASTTIDLQTVYNVQA 184
HAVRLGN+A+ISQEL VEKGS+YS+T SAARTCAQLES+NVSVP AS TIDLQT+YNVQ
Sbjct 89 HAVRLGNDAEISQELKVEKGSIYSITFSAARTCAQLESLNVSVPPASQTIDLQTLYNVQG 148
67
Query 185 WDPYAWAFEAEDDKVNLVFTNPGMEDDPACGPVLDQVRV 301
WD YAWAF+AE+D V +VFTNPGMEDDP CGP++D + +
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>ref|XP_009603034.1| PREDICTED: uncharacterized protein LOC104098081 [Nicotiana tomentosiformis]
Length=391
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HAVRLGN+A+ISQEL VEKGS+YSVT SAARTCAQLES+NVSVP AS TIDLQT+YNVQ
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Query 185 WDPYAWAFEAEDDKVNLVFTNPGMEDDPACGPVLDQVRV 301
WD YAWAF+AE+D V VFTNPGMEDDP CGP++D + +
Sbjct 149 WDSYAWAFQAEEDDVRAVFTNPGMEDDPTCGPIIDDIAI 187
>ref|XP_010056890.1| PREDICTED: uncharacterized protein LOC104444833 [Eucalyptus grandis]
gb|KCW73803.1| hypothetical protein EUGRSUZ_E02406 [Eucalyptus grandis]
Length=394
Query 5 HAVRLGNEAQISQELTVEKGSMYSVTSSAARTCAQLESINVSVP-SASTTIDLQTVYNVQ 181
HA RLGN+A+ISQELTVEKGS+YSVT SAARTCAQLES+NVSVP SAS TIDLQT+Y+VQ
Sbjct 87 HAARLGNDAEISQELTVEKGSIYSVTFSAARTCAQLESLNVSVPPSASQTIDLQTLYSVQ 146
Query 182 AWDPYAWAFEAEDDKVNLVFTNPGMEDDPACGPVLDQVRV 301
WDPYAWAFEA DDKV L F NPGMEDDP CGP++D + +
Sbjct 147 GWDPYAWAFEALDDKVTLAFRNPGMEDDPTCGPIIDDIAI 186
>ref|XP_009788467.1| PREDICTED: uncharacterized protein LOC104236274 [Nicotiana
sylvestris]Length=390
Query 5 HAVRLGNEAQISQELTVEKGSMYSVTSSAARTCAQLESINVSVPSASTTIDLQTVYNVQA 184
HAVRLGN+A+ISQEL VEKGS+YSVT SAARTCAQLES+NVSVP AS TIDLQT+YNVQ
Sbjct 88 HAVRLGNDAEISQELKVEKGSIYSVTFSAARTCAQLESLNVSVPPASQTIDLQTLYNVQG 147
Query 185 WDPYAWAFEAEDDKVNLVFTNPGMEDDPACGPVLDQVRV 301
WD YAWAF+AE+D +VFTNPGMEDDP CGP++D + +
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>ref|XP_002317331.2| hypothetical protein POPTR_0011s08980g [Populus trichocarpa]gb|ABK95079.1|
unknown [Populus trichocarpa]gb|EEE97943.2| hypothetical protein POPTR_0011s08980g [Populus
trichocarpa]Length=393
Query 5 HAVRLGNEAQISQELTVEKGSMYSVTSSAARTCAQLESINVSVPSASTTIDLQTVYNVQA 184
HAVRLGN+A ISQELTVEKGS+YSVT SAARTCAQLES+NVSV AS TIDLQT+YNVQ
Sbjct 88 HAVRLGNDADISQELTVEKGSVYSVTFSAARTCAQLESLNVSVLPASQTIDLQTLYNVQG 147
Query 185 WDPYAWAFEAEDDKVNLVFTNPGMEDDPACGPVLDQVRV 301
WDPYA AFEA++DKV LVF+NPGMEDDP CGP++D + +
Sbjct 148 WDPYALAFEAQEDKVRLVFSNPGMEDDPTCGPIIDDIAI 186
>ref|XP_008371603.1| PREDICTED: uncharacterized protein LOC103434995 [Malus domestica]Length=394
68
Query 5 HAVRLGNEAQISQELTVEKGSMYSVTSSAARTCAQLESINVSVPSASTTIDLQTVYNVQA 184
HAVRLGN+A+ISQ++ VEKGS+YSVT SAARTCAQLES+NVSVP AS TIDLQT+YNVQ
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Query 185 WDPYAWAFEAEDDKVNLVFTNPGMEDDPACGPVLDQV 295
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Sbjct 147 WDPYAWAFEAEEDDAMLVFRNPGMEDDPTCGPIIDDV 183
>ref|XP_004233117.1| PREDICTED: uncharacterized protein LOC101246207 [Solanum lycopersicum]
Length=391
Query 5 HAVRLGNEAQISQELTVEKGSMYSVTSSAARTCAQLESINVSVPSASTTIDLQTVYNVQA 184
HAVRLGN+A+ISQEL VEKGS+YS+T SAARTCAQLES+NVSVP AS TIDLQT+Y+VQ
Sbjct 89 HAVRLGNDAEISQELKVEKGSIYSITFSAARTCAQLESLNVSVPPASQTIDLQTLYSVQG 148
Query 185 WDPYAWAFEAEDDKVNLVFTNPGMEDDPACGPVLDQVRV 301
WD YAWAF+AE+D V +VFTNPGMEDDP CGP++D + +
Sbjct 149 WDSYAWAFQAEEDDVRVVFTNPGMEDDPTCGPIIDDIAI 187
>ref|XP_009360881.1| PREDICTED: uncharacterized protein LOC103951270 [Pyrus x
bretschneideri]Length=394
Query 5 HAVRLGNEAQISQELTVEKGSMYSVTSSAARTCAQLESINVSVPSASTTIDLQTVYNVQA 184
HAVRLGN+A+ISQ++ V+KGS+YSVT SAARTCAQLES+NVSVP AS TIDLQT+YNVQ
Sbjct 87 HAVRLGNDAEISQQVKVDKGSIYSVTFSAARTCAQLESLNVSVPPASQTIDLQTLYNVQG 146
Query 185 WDPYAWAFEAEDDKVNLVFTNPGMEDDPACGPVLDQV 295
WDPYAWAFEAE+D LVF NPGMEDDP CGP++D V
Sbjct 147 WDPYAWAFEAEEDNAMLVFRNPGMEDDPTCGPIIDDV 183
>ref|XP_007213876.1| hypothetical protein PRUPE_ppa006814mg [Prunus persica]gb|EMJ15075.1|
hypothetical protein PRUPE_ppa006814mg [Prunus persica]Length=394
Query 5 HAVRLGNEAQISQELTVEKGSMYSVTSSAARTCAQLESINVSVPSASTTIDLQTVYNVQA 184
HAVRLGN+A+ISQ++ VEKGS+YSVT SAARTCAQLES+NVSVP AS TIDLQT+YNVQ
Sbjct 87 HAVRLGNDAEISQQVKVEKGSIYSVTFSAARTCAQLESLNVSVPPASQTIDLQTLYNVQG 146
Query 185 WDPYAWAFEAEDDKVNLVFTNPGMEDDPACGPVLDQVRV 301
WDPYAWAF AE+D LVF NPGMEDDP CGP++D V +
Sbjct 147 WDPYAWAFAAEEDDAMLVFRNPGMEDDPTCGPIIDDVAI 185
>ref|XP_008225474.1| PREDICTED: uncharacterized protein LOC103325117 [Prunus mume]Length=393
Query 5 HAVRLGNEAQISQELTVEKGSMYSVTSSAARTCAQLESINVSVPSASTTIDLQTVYNVQA 184
HAVRLGN+A+ISQ++ VEKGS+YSVT SAARTCAQLES+NVSVP AS TIDLQT+YNVQ
Sbjct 86 HAVRLGNDAEISQQVKVEKGSIYSVTFSAARTCAQLESLNVSVPPASQTIDLQTLYNVQG 145
Query 185 WDPYAWAFEAEDDKVNLVFTNPGMEDDPACGPVLDQVRV 301
WDPYAWAF AE+D LVF NPGMEDDP CGP++D V +
Sbjct 146 WDPYAWAFAAEEDDAMLVFRNPGMEDDPTCGPIIDDVAI 184
>ref|XP_009115202.1| PREDICTED: uncharacterized protein LOC103840445 [Brassica rapa]Length=409
Query 5 HAVRLGNEAQISQELTVEKGSMYSVTSSAARTCAQLESINVSVPS---------ASTTID 157
69
HAVRLGN+A+ISQELTVEKGS+YSVT SAARTCAQLESINVSV S AS +D
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Query 158 LQTVYNVQAWDPYAWAFEAEDDKVNLVFTNPGMEDDPACGPVLDQVRV 301
LQT+YNVQ WDPYAWAFEAE+D V LVF NPGMEDDP CGP++D + +
Sbjct 156 LQTLYNVQGWDPYAWAFEAEEDHVRLVFKNPGMEDDPTCGPIIDDIAI 203
>ref|XP_013662588.1| PREDICTED: uncharacterized protein LOC106367371 [Brassica napus]
emb|CDY26302.1| BnaA09g26530D [Brassica napus]Length=409
Query 5 HAVRLGNEAQISQELTVEKGSMYSVTSSAARTCAQLESINVSVPS---------ASTTID 157
HAVRLGN+A+ISQELTVEKGS+YSVT SAARTCAQLESINVSV S AS +D
Sbjct 96 HAVRLGNDAEISQELTVEKGSVYSVTFSAARTCAQLESINVSVASVNANEGDTLASRDVD 155
Query 158 LQTVYNVQAWDPYAWAFEAEDDKVNLVFTNPGMEDDPACGPVLDQVRV 301
LQT+YNVQ WDPYAWAFEAE+D V LVF NPGMEDDP CGP++D + +
Sbjct 156 LQTLYNVQGWDPYAWAFEAEEDHVRLVFKNPGMEDDPTCGPIIDDIAI 203
>ref|XP_010110985.1| hypothetical protein L484_021680 [Morus notabilis]gb|EXC29371.1| hypothetical
protein L484_021680 [Morus notabilis]Length=443
Query 5 HAVRLGNEAQISQELTVEKGSMYSVTSSAARTCAQLESINVSVPSASTTIDLQTVYNVQA 184
HAVRLGN+A+ISQ+LTVEKGS+YSVT SAARTCAQLES+NVSV +AS TIDLQT+YNVQ
Sbjct 70 HAVRLGNDAEISQDLTVEKGSIYSVTFSAARTCAQLESLNVSVGAASQTIDLQTLYNVQG 129
Query 185 WDPYAWAFEAEDDKVNLVFTNPGMEDDPACGPVLDQVRV 301
WDPYA AF+AE DKV L F NPGMEDDP CGP++D + +
Sbjct 130 WDPYAVAFDAESDKVTLAFRNPGMEDDPTCGPIIDDIAI 168
>ref|XP_011096549.1| PREDICTED: uncharacterized protein LOC105175704 [Sesamum
indicum]Length=398
Query 5 HAVRLGNEAQISQELTVEKGSMYSVTSSAARTCAQLESINVSVPSASTTIDLQTVYNVQA 184
HAVRLGN+A+ISQE+ VEKGS+YSVT SAARTCAQLES+NVSVP AS TIDLQT+Y+VQ
Sbjct 88 HAVRLGNDAEISQEVKVEKGSLYSVTFSAARTCAQLESLNVSVPPASQTIDLQTLYSVQG 147
Query 185 WDPYAWAFEAEDDKVNLVFTNPGMEDDPACGPVLDQVRV 301
WD YAWAF+AE++ V +VF NPGMEDDP CGP++D + +
Sbjct 148 WDSYAWAFQAEEEDVRVVFRNPGMEDDPTCGPIIDDIAI 186
Anexo 9. Concentraciones de los reactivos utilizados para la PCR con el kit de plantas KAPA3G.
Reactivo Concentración
Buffer-MgC l+2-dNTPs 1X
Primerforward 0,3μM
Primerreverse 0,3μM
ADNpolimerasa 1U
ADN 0,5mmdediámetrofoliar
Adyuvantes 0.2x
50μl
70
Anexo 10. Condiciones de ciclado utilizadas para la PCR con el kit de plantas KAPA3G.
Programa de amplificación de PCR
Proceso Temperatura Tiempo
Desnaturalización inicial 95° C 5 min
40 ciclos
Desnaturalización 94° C 30 s
Hibridación 55° C 30 s
Extensión 72° C 20 S
Extensión final 72° C 5 min