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Identificación funcional de una nueva opsina como fotopigmento
Tomás Osorno Ferro
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias, Departamento de Biología
Bogotá, Colombia
2015
Identificación funcional de una nueva opsina como fotopigmento
Tomás Osorno Ferro
Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de:
Magister en Ciencias - Biología
Directora:
PhD. M.D. María del Pilar Gómez Correa
Codirector:
PhD. Enrico Nasi
Línea de Investigación:
Fisiología Celular
Grupo de Neurofisiología Celular:
Grupo de Biofísica de la Señalización Celular
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias, Departamento de Biología
Bogotá, Colombia
2015
Agradecimientos
A Enrico Nasi y María del Pilar Gómez, por todo lo que me han enseñado y por darme las
mejores oportunidades de mi vida académica.
Resumen y Abstract IX
X Identificación funcional de una nueva opsina como fotopigmento
Resumen
El análisis de secuencias de elementos involucrados en fotorecepción ha revelado la
existencia de una nueva subfamilia de opsinas (Gr4), posiblemente acopladas a una
proteína Go. Se ha sugerido que estas proteínas participan en una cascada de
fototransducción novedosa, diferente de las cascadas mediadas por opsinas de tipo C y
R, sin embargo la función de estas moléculas como fotopigmento no ha sido establecida
en ningún sistema biológico.
Una opsina perteneciente a este nuevo grupo, pScop2, es expresada en las células
ciliadas de la retina del bivalvo Pecten irradians, en las cuales la fotorecepción es
mediada por Go. En este trabajo se buscó evaluar si esta proteína es un fotopigmento
funcional y determinar su participación en la cascada de fototransducción de las células
ciliadas de Pecten irradians. La diálisis de anticuerpos, diseñados para interferir con la
interacción pScop2-proteína G, falló en disminuir la fotosensibilidad de las células. Sin
embargo, un acercamiento basado en RNAi disminuyó selectivamente la corriente de
isomerización de fotopigmento, indicando su capacidad de fotoisomerización, y la
corriente prolongada hiperpolarizante en estas células, lo cual muestra su relevancia en
la cascada de fototransducción.
La expresión heteróloga de pScop2 en líneas celulares sólo indujo fotosensibilidad pocas
instancias, posiblemente por un problema de acoplamiento con vías de señalización
endógenas. Para intentar obviar este problema, se hizo un intercambio del tercer bucle
intracelular de esta opsina por el de otra opsina, pScop1, la cual es acoplada a una
proteína Gq, y se registraron incrementos de calcio intracelular gatillados por un estímulo
de luz en células HEK293 transfectadas con esta versión quimérica de pScop2,
indicando su función como fotopigmento.
Palabras clave: Pecten irradians, Fotopigmento, Fototransducción, pScop2, Expresión
heteróloga.
Contenido XI
Abstract
The existance of a new subfamily of Go coupled-opsins (Gr4), revealed by sequence
analysis of fotoreception-related elements, has sugested their involvement in a novel
phototransduction scheme, different from traditional R and C type Opsin mediated
phototransduction. However, their function as photopigments has not been established
on biological systems.
One of these opsins, pScop2, is expressed in retinal ciliary photoreceptors of the scallop
Pecten irradians, which transduce light in a Go dependent manner. The involvement of
pScop2 in the phototransduction of ciliary photoreceptors was tested using antibody
dialysis, designed to block pScop2-G-protein mediated transduction. This approach failed
to reduce cell photosensitivity but a RNAi-based strategy selectively reduced early
receptor currents, indicating pScop2’s capacity for photoisomerization, and prolonged
hiperpolarizing aftercurents, which indicate it’s involvement in the transduction process in
these cells.
Heterologous expression of pScop2 in cultured cell lines only induced photosensitivity in
a few instances, presumably due to poor coupling to native G-protein mediated signaling.
In an attempt to obviate this problem, a modified version of pScop2 containing the
intracellular loop 3 of a Gq-coupled opsin, pScop1, was created by PCR. This pScop2-Gq
chimera produced light-triggered intracellular calcium increments in transfected cells,
indicating pScop2’s function as a photopigment.
Key words: Pecten irradians, Photopigment, phototransduction, pScop2, Heterologous
expression.
Contenido XIII
Contenido
Pág.
Resumen .......................................................................................................................... X
Lista de tablas ............................................................................................................. XVI
Introducción .................................................................................................................... 1
Objetivo General ............................................................................................................ 11
Objetivos específicos .................................................................................................... 11
1. Materiales y métodos ............................................................................................. 13 1.1 Preparación de tejido: .................................................................................... 13 1.2 Registros electrofisiológicos:.......................................................................... 13 1.3 Estimulación y adquisición digital de datos de electrofisiología ...................... 14 1.4 Calibración de intensidad de luz de estimulación ........................................... 15 1.5 Análisis de datos ............................................................................................ 15 1.6 Electroporación y cultivo de retinas................................................................ 16 1.7 Cultivo de líneas celulares mamíferas ........................................................... 16 1.8 Selección de líneas celulares para expresión heteróloga de pScop2 ............. 17 1.9 Transfección .................................................................................................. 17 1.10 Inmunodetección de proteínas expresadas en un sistema heterólogo ........... 17
1.10.1 Inmunocitoquímica .............................................................................. 17 1.10.2 SDS PAGE y Western Blot .................................................................. 18
1.11 Biología molecular ......................................................................................... 19 1.11.1 Interferencia mediada por RNA ........................................................... 19 1.11.2 Diseño de primers ............................................................................... 20 1.11.3 PCR .................................................................................................... 21 1.11.4 Purificación, clonación y secuenciación de productos de PCR ............ 21 1.11.5 Generación del vector de expresión pScop2_Gq ................................ 22
1.12 Registros de fluorescencia de calcio con fluo4-AM ........................................ 23
2. Resultados .............................................................................................................. 25 2.1 Ensayos funcionales de pScop2 en Pecten irradians ..................................... 25
2.1.1 Efecto de la diálisis de anticuerpos anti-pScop2 en la fotosensibilidad de los fotoreceptores ciliados de Pecten irradians: ............................................ 25 2.1.2 Silenciamiento del transcrito de pScop2 por RNAi .............................. 28 2.1.3 Efecto de la electroporación con RNAi-pScop2 en la cantidad de fotopigmento de las células ciliadas .................................................................. 30
2.2 Expresión y función de pScop2 en un sistema heterólogo: ............................ 35 2.2.1 Activación de proteínas G en líneas celulares: .................................... 35
XIV Título de la tesis o trabajo de investigación
2.2.2 Ensayos de expresión transitoria de pScop2-mRFP en líneas celulares35 2.2.3 Registros de Fotocorrientes en Células Transfectadas con pScop2-mRFP 38 2.2.4 Ensayos de expresión transitoria de pScop2-BiRed en líneas celulares38 2.2.5 Registros de fotocorrientes en líneas celulares transfectadas establemente con pScop2-BiRed .......................................................................40 2.2.6 Intercambio de dominios ICL3 entre pScop2 y pScop1: acoplamiento a una proteína Gq ..................................................................................................42 2.2.7 Ensayos de expresión heteróloga de pScop2-Gq ................................46
3. Discusión .................................................................................................................49 3.1 Futuras Investigaciones ..................................................................................55
4. Conclusiones ..........................................................................................................57
Bibliografía .....................................................................................................................61
Contenido XV
Contenido XVI
Lista de tablas
Pág. Tabla 1. Primers usados para intercambio de dominios ICL3 de pScop1 y pScop2 ........ 20
Introducción
La supervivencia de los organismos vivos depende de su capacidad de extraer
información y responder ante estímulos ambientales, pues permite un sinfín de funciones
de gran importancia, como buscar potenciales fuentes de alimento, evitar condiciones
ambientales nocivas, evadir depredadores y navegar el entorno. Esta extracción de
información externa ha llegado a un grado sorprendente de refinamiento a través de la
evolución, hasta el punto de estar limitada por las leyes de la física, no por el diseño de
los sistemas sensoriales.
Por ejemplo, al observar microscópicamente los movimientos de una célula bacteriana E.
coli, su desplazamiento podría parecer azaroso y desordenado, pero en realidad estas
células usan sistemas sensoriales para navegar su ambiente y moverse en la dirección
de gradientes de concentración de moléculas solubles, un proceso conocido como
Quimio-taxis. Esto les permite desplazarse hacia zonas con nutrientes de interés y evitar
lugares con altas concentraciones de sustancias nocivas. Lo más asombroso es que la
fuente de las moléculas atractivas puede estar muy lejos de la célula, y la concentración
local del atrayente puede ser tan baja (10-9M) que la célula sólo esporádicamente
encuentra una molécula. Sin embargo, aún bajo estas condiciones extremas E. coli es
capaz de orientarse y nadar “corriente arriba” hacia la fuente atractiva, demostrando ser
capaz de desempeñarse con la sensibilidad máxima dictada por la física y las
variaciones estocásticas de la difusión de moléculas (Berg y Purcell, 1977).
En otras modalidades, las capacidades sensoriales de los organismos son igualmente
sorprendentes y se expanden a todas las formas de energía disponibles para los seres
vivos, sea química (como en el caso de la Quimio-taxis), electromagnética, mecánica,
térmica, etc. Cada forma de energía contiene información diferente sobre el entorno, en
términos de contenido y características (e.g. resolución temporal, espacial, abundancia,
etc.), por lo que poseer múltiples sistemas sensoriales aumenta la información derivable
y constituye una ventaja biológica. Por esta razón, no es sorprendente que para cada
“categoría” sensorial la evolución haya creado sistemas altamente especializados de
detección, procesamiento y respuesta a estímulos físicos, desde la capacidad del
sistema auditivo de ciertos murciélagos de detectar diferencias temporales de señales
mecánicas en el orden de 10ns (cuando los sistemas fisiológicos funcionan en el orden
de mili-segundos (Bialek, 2012)), hasta la detección de radiación infrarroja de serpientes
cazadoras nocturnas (Cracheva et al., 2010).
En los metazoa, los procesos sensoriales están mediados por células neuronales
especializadas, denominadas células sensoriales, o receptores sensoriales, los cuales se
comunican por medio de una sinapsis con el sistema nervioso. En todos los casos, la
2 Introducción
recepción de un estímulo físico es codificada en una señal eléctrica, que en términos
biológicos significa un cambio en el potencial de membrana de la célula (Fein y Szuts,
1982). Este esquema tiene dos consecuencias principales: 1) la célula debe tener una
maquinaria receptora que sea capaz de absorber eficientemente la forma de energía y, 2)
que esta maquinaria comunique este evento de tal forma que cause un cambio del
potencial de membrana (Nasi, 2010). Este proceso, conocido como transducción
sensorial implica la existencia de una molécula receptora que sufra un cambio
conformacional al interactuar con un estímulo físico, y una maquinaria capaz de
desencadenar un cambio en el transporte de iones a través de la membrana.
La detección de luz es un sentido de gran importancia en todos los grupos animales, lo
cual no es sorprendente dadas sus características: por un lado, la forma de energía
utilizada -la radiación electromagnética- está ampliamente disponible en la superficie
terrestre y no representa un costo metabólico porque es generada casi exclusivamente
por el sol. Su alta velocidad de propagación y su capacidad de ser detectada a distancias
enormes la convierte en una forma de energía atractiva para extraer información.
Adicionalmente, la radiación electromagnética contiene grandes cantidades de
información, derivables de sus diferentes parámetros: Intensidad, Longitud de onda,
dirección, ángulo de polarización y fase. Aunque todos estos parámetros pueden proveer
información sobre el ambiente, los seres vivos sólo detectan algunos y hay gran
variabilidad en la sensibilidad a cada uno. Esta variabilidad se ha visto asociada a las
características particulares del ambiente habitado por cada especie y a los diferentes
grupos taxonómicos (Fein y Szuts, 1982).
Biológicamente, la detección de la luz y su interacción con la materia (absorción,
reflexión, transmisión) permite derivar información de gran utilidad sobre un objeto, por
ejemplo: ¿Dónde está?, ¿qué tan grande es?, ¿hacia dónde se está moviendo y a qué
velocidad?, ¿de qué color es?, etc. Todas estas preguntas pueden ser resueltas a partir
de la detección de radiación electromagnética y el procesamiento de la información
contenida.
Aunque la superficie de la tierra es continuamente irradiada por luz, la rotación de la
tierra impone una gran variación en los niveles de iluminación. El rango de variación de
intensidad lumínica entre una noche oscura y un día soleado puede ser alrededor de un
factor de 1015 (Fein y Szuts, 1982). Para un organismo, es ventajoso poder extraer
información en la mayor parte de este rango de variación, porque implica la posibilidad de
funcionar en una fracción grande del día en lugar de estar limitado a una banda temporal
estrecha. Esto es problemático desde el punto de vista funcional porque las respuestas
sensoriales varían en un rango mucho más estrecho, alrededor de 102: para poder
funcionar en ambientes con gran variación de intensidad lumínica debe haber un
mecanismo para ajustar la sensibilidad según los niveles de iluminación.
En el caso de la visión, las células sensoriales responsables de absorber y generar una
respuesta ante un estímulo de luz son denominadas fotoreceptores. Estos, son capaces
de funcionar eficientemente en 12 de los 15 órdenes de magnitud de variación en los
Introducción 3
niveles de iluminación ambiental gracias a su capacidad de modular su fotosensibilidad,
un proceso denominado adaptación sensorial.
A nivel celular, este proceso es mediado principalmente por mecanismos bioquímicos
que son parte de la cascada de transducción. Por ejemplo, una célula fotoreceptora
expuesta a un ambiente oscuro podría responder eficientemente si cada fotón absorbido
fuera detectable, de tal forma que pocos fotones causen una respuesta fisiológicamente
relevante. En luz brillante, en cambio, la sensibilidad merma para evitar la saturación.
Esto ocurre porque los pasos intermedios de la cascada (es decir entre la absorción de
un fotón por la molécula receptora y el cambio de potencial de membrana) involucran
reacciones enzimáticas que son modulables y por lo tanto pueden imponer una
amplificación variable a la respuesta (Stryer, 1983; Neves et al., 2002).
Sin embargo, la necesidad de absorber fotones con gran eficiencia en condiciones de
baja iluminación impone restricciones en el diseño de una célula fotosensible.
En primer lugar, consideremos el primer paso del proceso, es decir, la captación de luz
por la molécula receptora: un fotopigmento. Los aminoácidos no absorben eficientemente
luz visible, por lo que una proteína, en sí misma, no sería un buen receptor de luz. Los
fotopigmentos consisten en una proteína transmembranal, denominada opsina, y una
molécula orgánica, un cromóforo derivado de la vitamina A, llamado coloquialmente
retinal, el cual es la molécula que absorbe el fotón. El cromóforo está unido
covalentemente a la opsina formando una base de Schiff protonada en una lisina
conservada en esta familia de proteínas (K296 para la rodopsina humana). La absorción
de un fotón causa una isomerización entre su forma -cis y su forma –trans que es
acoplada a un cambio conformacional de la opsina, desencadenando el proceso de
transducción sensorial. La forma 11-cis y 9-cis del retinal han sido seleccionadas
evolutivamente por sus espectros de absorción y energías asociadas a la foto-
isomerización entre la forma cis y la forma trans (Sekharan y Morokuma, 2011).
Para optimizar el proceso de absorción del fotón es preciso, en primer lugar, que la
probabilidad de que un fotón incidente sea absorbido sea alta, es decir que el
fotopigmento tenga un alto coeficiente de extinción molar para las longitudes de onda de
interés. Estudios de fotoquímica han demostrado que los fotopigmentos animales tienen
un coeficiente de extinción molar extremadamente alto, alrededor de 42,000 L*cm-1*Mol-1
para λ= 500nm; sorprendentemente, este valor es miles de veces más alto en el
fotopigmento (opsina + retinal) que para el cromóforo solo o la proteína sola, indicando la
importancia de la interacción entre los dos (Fein y Szuts, 1982; Bridges, 1971).
La absorción de un fotón, sólo indica la elevación en niveles energéticos de electrones
del cromórofo que podría disiparse en vibraciones o rotaciones (disipación térmica) sin
un rearreglo conformacional que desencadene un proceso de señalización. La
probabilidad de que la absorción de la energía de un fotón se traduzca en una transición
al estado activo de la molécula debe ser alto para lograr un fotopigmento eficiente. Esta
probabilidad, denominada eficiencia cuántica, es inusualmente alta para la rodopsina
bovina (0.65 para longitudes de onda 480-500nm) y es más del doble que la eficiencia
4 Introducción
cuántica del cromóforo en solución, indicando de nuevo la importancia de la interacción
proteína-cromóforo. Estudios de resonancia magnética nuclear han demostrado que
además de esta “asistencia protéica”, la tasa de isomerización del cromóforo es mucho
más rápida al estar ligado a la opsina que en solución y depende del entorno local que
provee la proteína (Liu y Colmenares, 2003).
Finalmente, es preciso maximizar la cantidad de fotones que, al incidir sobre la célula
receptora, interactúan con el fotopigmento. Para esto, el fotorreceptor debe expresar un
gran número de rodopsinas. Una estrategia sería simplemente incrementar el tamaño de
la célula, pero esto conlleva dos desventajas: por una parte, el costo metabólico sería
elevado; por otra, si cada fotorreceptor constituye un ‘pixel’ en el mosaico retinal donde
se proyecta la representación del entorno, la resolución espacial sufriría al incrementar el
tamaño celular. Sin embargo, considerando que los fotopigmentos son proteínas
integrales de membrana, estas dos falencias se pueden fácilmente obviar simplemente
plegando la membrana, incrementando así el cociente superficie/volumen; de esta
manera se logra una alta densidad óptica en una célula de dimensiones compactas.
Estos pliegues de membrana se asocian a estructuras de membrana especializadas, las
cuales se encuentran en todos los fotoreceptores involucrados en visión en el reino
animal. Estas estructuras han sido encontradas en dos formas diferentes: células que
tienen cilios modificados -células ciliadas- o células que tienen microvellosidades –
células rabdoméricas-(Fein y Szuts, 1982). Mediciones de microespectrofotometría han
demostrado que la cantidad de moléculas de fotopigmento en una célula fotoreceptora
está limitada por su área superficial, ya que el arreglo de estas moléculas en la
membrana es altamente compacto y simétrico (Wald, 1963). Estudios de la
microestructura de estas células han demostrado el impacto de estas estructuras en la
capacidad de almacenar moléculas de fotopigmento: para un bastón (Fotoreceptor
ciliado) de rana, el aumento de área de la membrana asociada a cilios especializados es
cercano a un factor de 100 (Fein y Szuts, 1982).
Como se mencionó, los fotoreceptores de tipo rabdomérico usan microvellosidades para
aumentar su área superficial. Estas estructuras son pliegues cilíndricos de la membrana
plasmática de tamaño variable (1-10µm de largo, 50-100nm de ancho) que suelen estar
orientados en patrones hexagonales altamente ordenados (un arreglo que maximiza el
número de microvellosidades en una membrana), denominado rabómero. Una célula
fotoreceptora de Limulus suele tener alrededor de 105 microvellosidades, que cubren
~90% de la superficie del lóbulo foto-sensible. Al igual que en el caso de fotoreceptores
de tipo ciliado, estas estructuras especializadas son el sitio donde está el fotopigmento,
revelado por estudios de microespectrofotometría (Langer y Thorell, 1966).
Una vez un fotopigmento ha sufrido un rearreglo conformacional por la absorción de un
fotón, esto debe ser comunicado a la maquinaria bioquímica responsable de
desencadenar la respuesta fisiológica, la apertura o cierre de un canal iónico. Las
opsinas son proteínas de 7 dominios transmembrana, pertenecientes a la superfamilia de
receptores acoplados a proteínas G (GPCR, del inglés G Protein-Coupled Receptor).
Esta familia de proteínas está involucrada en un gran número de funciones, que incluyen
Introducción 5
regulación del sistema inmune, homeostasis y funciones sensoriales (Olfacción, gusto y
visión). En todos los casos, la activación de estos receptores causa la exposición de
dominios de interacción con proteínas G heterotriméricas, favoreciendo el intercambio de
guanosin difosfato (GDP) por guanosin trifosfato (GTP) en la subunidad α (Gα) de la
proteína G y su separación de las subunidades βγ. La subunidad Gα actúa como
activadora de una cascada enzimática que es capaz de modificar la concentración de
mensajeros secundarios (e.g. nucleótidos cíclicos, Calcio, etc), los cuales controlan la
apertura o cierre de canales iónicos. De esta manera, la absorción de fotones causa un
cambio de potencial eléctrico de la membrana plasmática, lo cual permite la modulación
de eventos sinápticos por la luz. Las células fotoreceptoras deben poseer, además,
mecanismos de inactivación de la cascada de transducción, que incluyen moléculas
encargadas de “apagar” cada paso de la cascada, de lo contrario un estímulo breve
produciría una respuesta sostenida. Por ejemplo, la inactivación de la rodopsina es
mediada en las células fotoreceptoras por una enzima, rodopsina kinasa, que es capaz
de reconocer y fosforilar la forma activada de esta molécula. La rodopsina fosforilada es
reconocida por otra proteína, arrestina, que se liga al receptor e impide su interacción con
proteínas G (Arendt, 2001).
La concepción tradicional de la fotorrecepción sugiere una separación entre la evolución
de los mecanismos de visión en células de animales protostomados, y deuterostomados,
(Eakin, 1963) debido a que se creía que los animales vertebrados sólo poseen células
visuales de tipo ciliado mientras que los invertebrados poseen células rabdoméricas.
Esta visión ha sido reevaluada por el descubrimiento de animales que poseen ambos
tipos de células fotoreceptoras (Barber et al., 1967; Ruiz y Anadon, 1991a; Arendt et al.,
2004). No obstante, está establecido que la dicotomía entre células rabdoméricas y
ciliadas es estricta y no se ha encontrado ningún tipo celular intermedio, sugiriendo que
el ancestro común de protostoma y deuterostomia, Urbilateria, ya poseía los precursores
de estos dos tipos de células fotosensibles (Arendt y Wittbrodt, 2001).
El análisis de secuencias de diferentes elementos involucrados en la fototransducción,
particularmente los fotopigmentos, proteínas G, arrestinas y Rodopsina-kinasas, apoyan
esta hipótesis al agruparse en dos grupos parálogos para estas moléculas asociadas a
cada tipo morfológico de células fotoreceptoras, uno para células de tipo ciliado y uno
para rabdoméricas (Arendt y Wittbrodt, 2001).
Los análisis filogenéticos de los más de 1000 genes de opsinas que han sido
identificados en animales muestran que estas secuencias se agrupan en 3 grupos
generales, dos de los cuales han sido implicados en visión: Las opsinas de tipo C y las
opsinas de tipo R (Terakita, 2005; Porter, et al., 2011). Estos dos grupos se asocian a las
células ciliadas y rabdoméricas, respectivamente. La separación de estos dos subgrupos
de Opsinas correlaciona con el tipo de proteína G cuya activación es acoplada a la foto-
isomerización de la opsina (Arendt y Wittbrodt, 2001): Las opsinas de tipo C se acoplan
a la estimulación de una proteína G de tipo t (también denominada transducina, la
primera proteína G de esta clase estudiada, ver: Lerea et al., 1986; Hargrave et al., 1993)
mientras que las opsinas de tipo R transducen por medio de una proteína G de tipo q. La
6 Introducción
asociación de diferentes proteínas G a cada subfamilia de fotopigmentos ha sido
demostrada, no sólo por métodos bioinformáticos basados en expresión sino que tiene
un fundamento funcional y farmacológico muy fuerte (Lott et al., 1999; Kroll et al., 1989).
El acoplamiento de diferentes tipos de fotopigmentos a diferentes proteínas G genera
divergencia en las cascadas de transducción:
- En las células ciliadas que expresan fotopigmentos de tipo C, la activación luz-
dependiente de una proteína Gt activa una fosfodiesterasa (PDE, por sus siglas en inglés:
PhosphoDiEsterase), que lleva a la disminución de los niveles de nucleótidos cíclicos
citoplasmáticos (específicamente cGMP) y el cierre de canales iónicos cuya apertura es
casusada por cGMP) (CNGC, por sus siglas en inglés: Cyclic Nucleotide Gated
Channels); estos canales mantienen el potencial de membrana relativamente
despolarizado, debido a su permeabilidad catiónica no selectiva, de tal manera que su
cierre como consecuencia de la foto-estimulación causa una hiperpolarización de la
membrana de la célula (Hagins et al., 1970; Baylor et al., 1978).
- En los fotoreceptores que expresan fotopigmentos de tipo R (incluyendo células
derivadas evolutivamente de células rabdoméricas, como las células Ganglionares
intrínsecamente fotosensibles que expresan melanopsina: ver Berson, 2007), la
activación de la proteína Gq por el fotopigmento activado causa la activación de una
fosfolipasa de tipo C (PLC por sus siglas en inglés: PhosphoLipase C) que hidroliza
Fosfatidil-Inositol-4-5-Bis-Fosfato (PIP2) y genera los productos Inositol-tri-Fosfato (IP3) y
Diacil-Glicerol (DAG) y posteriormente causa la apertura de canales catiónicos,
despolarizando la célula (Cockcroft y Gomperts, 1985; Lott et al., 1999). Los mecanismos
de apertura de los canales no son una generalidad de los fotoreceptores con opsinas de
tipo R. En algunos casos se ha implicado la función de ácidos grasos poli-insaturados
(metabolitos de DAG) en la apertura de los canales, como es el caso de Drosophila
(Chyb et al., 1999) y en otros casos se ha demostrado el papel del calcio liberado por
receptores de IP3 intracelulares en la apertura de los canales, como en Branchiostoma
(Peinado et al., 2015).
Es preciso enfatizar que el uso de un conjunto muy limitado de organismos modelos
(ratón, vaca, Pez Cebra y Drosophila) para el estudio de la visión ha sido el responsable
en parte de esta dicotomía entre opsinas R y C: los datos moleculares demuestran que,
al extender el abanico de especies estudiadas, se predice la existencia de otros grupos
novedosos de opsinas en diferentes grupos animales (desde el punto de vista genético)
pero no estudiados desde el punto de vista funcional e histológico. De hecho, estudios
más recientes de secuencias de opsinas muestran la existencia de un nuevo grupo (Gr4,
Opsinas de grupo 4) que representa la emergencia de un sistema visual novedoso
basado en una nueva clase de opsinas acopladas a Go (Porter, et al., 2011).
Esto había sido propuesto inicialmente en una especie de bivalvo japonés, Patinopecten
yessoensis, en la cual se clonó un fotopigmento putativo denominado Scop2 (del inglés,
Scallop Opsin Protein 2), derivado de sencuenciación de cDNA (Kojima et al. 1997). La
secuencia de esta opsina es divergente respecto a las opsinas C y R y parece transducir
Introducción 7
su activación mediante un mecanismo novedoso, una proteína G de tipo o: esto fue
propuesto con base en un análisis de proteínas G en la retina de P. yessoensis, donde
se encontró que la única que se expresaba en la región donde se encuentra Scop2 era
Go. Evidencia indirecta de que Scop2 podría activar Go se obtuvo de ensayos In-Vitro en
los cuales se implantó una secuencia de interacción con proteínas G proveniente de
Scop2, el tercer bucle intracelular, que se ha implicado en determinar la especificidad de
interacción con la proteína G para la superfamilia de receptores de 7 dominios
transmembrana (Cotecchia et al., 1992; Blin et al. 1995, Greasley et al. 2001), en la
rodopsina bovina; se observó que se incrementaba la competencia de esta opsina de tipo
C para estimular una proteína Go (Terakita et al., 2002). Sin embargo, no hay evidencia
directa de la función de Scop2 como fotopigmento, ni de que la cascada de transducción
de luz esté mediada por la proteína Go en fotorreceptores nativos, pues no existen
estudios de fisiología en esta especie.
Se conoce poco sobre este nuevo grupo de fotopigmentos putativos, no obstante se ha
clonado un miembro de esta familia el cordado basal Branchiostoma (Koyanagi M., et. Al,
2002) y se han identificado otros dos miembros de la familia por métodos bioinformáticos
en el genoma del erizo de mar Strongylocentrotus purpuratus (Raible et al., 2006) y en la
ostra Crassostrea gigas. Adicionalmente, otra molécula ortóloga a Scop2, denominada
pScop2, ha sido clonada de cDNA de la retina del molusco marino Pecten irradians,
pariente estrecho de P. yessoensis (Arenas 2013 a,b): se utilizó para este propósito el
transcriptoma de la retina de este animal, sobre el cual se realizó una búsqueda por
homología a Scop2, que sirvió para diseño de primers, amplificaciones de PCR y
extensiones de RACE. Con base en la secuencia obtenida se generaron ribo-sondas
marcadas y anticuerpos específicos, que permitieron un análisis de localización: ensayos
de hibridación in-Situ e inmunohistoquímica demostraron que la expresión de este
pigmento putativo está ceñida a la capa distal de la retina, la cual está compuesta
únicamente por células fotoreceptoras de tipo ciliado (Arenas et al., 2013a,b).
Adicionalmente, la clonación de una proteína Go de la retina de Pecten irradians permitió
confirmar por hibridación in-Situ su expresión en estas células (Arenas et al., Manuscrito
en preparación), abriendo la posibilidad de que efectivamente exista una cascada de
fototransducción mediada por esta clase de fotopigmentos putativo y acoplada a una
proteína Go.
Corroboración de esta conjetura, sin embargo, requiere una demostración funcional: la
simple expresión de esta molécula no implica un papel en la fototransducción: podría
desempeñar funciones alternativas, como fotoregeneración de cromóforos o acoplarse a
una cascada que no resulte en cambios de voltaje de membrana (Porter et al., 2011).
Para afirmar que pScop2 es el fotopigmento, que subyace la transducción de luz en estas
células, es necesario obtener evidencia fisiológica.
Pecten irradians, al igual que Patinopecten yessoensis, pertenece a una familia de
bivalvos, Pectinidae, que son el ejemplo más conocido por violar la segregación
taxonómica- propuesta por Eakin, 1963 - entre fotorreceptores Rabdoméricos en
animales protostomados y Ciliados en deuterostomados: estos animales poseen
8 Introducción
numerosos ojos formadores de imágenes con una retina doble, compuesta de una capa
proximal de fotoreceptores de tipo Rabdomérico y una capa distal de fotoreceptores
Ciliados (Barber, et al. 1967). Adicionalmente, este animal es la única especie que posee
células ciliadas que expresan opsinas de este nuevo grupo en la cual se han logrado
hacer mediciones fisiológicas a nivel celular (Gorman y McReynolds 1969; Gómez y Nasi,
1994a; Gómez y Nasi, 2000; Hunt D., et Al., 2014) y en la cual se conocen aspectos
críticos de la cascada de transducción y las respuestas eléctricas que ocurren como
resultado de la iluminación.
A primera vista los fotoreceptores ciliados de Pecten parecieran pertenecer a la misma
clase que los fotorreceptores vertebrados: tienen una morfología ciliada, la iluminación
causa una hiperpolarización de su membrana celular, y utilizan cGMP como mensajero
interno. Sin embargo, una examinación más detallada demuestra que la transducción
ocurre por un mecanismo completamente diferente: La iluminación es convertida a una
señal eléctrica por medio de una proteína Go, demostrado por ensayos fisiológicos de
RNAi (Arenas et al., Manuscrito en preparación) y farmacológicos, donde se vio una
activación de la cascada con péptidos de mastoparan y una inhibición de la respuesta
con el protómero de toxina pertusis (Gómez y Nasi, 2000). Se descartó el papel de una
proteína Gq en la cascada de transducción porque la iluminación no causa la liberación
de Ca2+ y no hay respuesta fisiológica ante diálisis de IP3 (Gómez y Nasi, 1995).
También fue descartada la participación de Gt porque no hay expresión de esta proteína
en estas células en P. yessoensis (Kojima et al., 1997) ni hay efecto sobre la
fotorespuesta de agentes farmacológicos que actúan sobre PDEs (Gómez y Nasi, 2000).
Además de la proteína G involucrada, esta cascada de transducción en P. irradians es
divergente de la asociada a las opsinas C porque aparentemente involucra una guanilato
ciclasa (GC) y el resultado de la iluminación es un aumento en la concentración de cGMP
en lugar de una disminución (Datos no publicados). El siguiente paso en la cascada es la
apertura de canales de potasio que es gatillada directamente por el aumento de cGMP,
este aumento de conductancia de potasio causa una hiperpolarización de la membrana
celular (Gómez y Nasi, 1995). En contraste, la activación de las cascadas de
transducción acopladas a opsinas C y proteínas Gt causan una hiperpolarización por el
cierre de canales de sodio y calcio (Hagins et al., 1970). Aunque en ambas instancias la
conductancia es activada por cGMP, la luz necesita incrementar sus niveles en un caso,
y disminuirlos en el otro, con lo cual la maquinaria enzimática gatillada por la luz es
necesariamente diferente.
Finalmente, estudios de fisiología en las células ciliadas de Pecten irradians han
demostrado un mecanismo novedoso de adaptación sensorial. Tanto en las células
ciliadas canónicas de vertebrados como en las células rabdoméricas, el calcio juega un
papel crucial en la adaptación sensorial (Yau y Nakatani, 1985; Lisman y Brown, 1972);
en cambio en las células ciliadas de este bivalvo la luz no causa un cambio detectable en
la concentración de calcio intracelular, y tampoco se observa cambio alguno en la
sensibilidad ante manipulaciones exógenas del calcio (Gómez y Nasi, 2005a). Estos
estudios han demostrado el papel de cGMP, la misma molécula activadora de los
Introducción 9
canales sensibles a la luz, en la adaptación sensorial. Este mecanismo de
retroalimentación negativa es novedoso y completamente diferente a los mecanismos
tradicionales de adaptación sensorial de fotoreptores, aunque su mecanismo de acción
no es comprendido del todo.
La expresión de pScop2, sumado a los datos que postulan una cascada de transducción
novedosa en estas células - en cuanto al tipo de proteína G involucrada, elementos
enzimáticos y un mecanismo de adaptación novedoso-, sumados a la posibilidad de
hacer estudios de fisiología en células únicas, convierten a Pecten irradians en un
modelo atractivo para estudiar la función y propiedades de este tipo novedoso de
fotopigmentos putativos. Este trabajo busca examinar si pScop2 funciona como
fotopigmento en los fotorreceptores ciliados de la capa distal de la retina de este animal.
Se espera demostrar por primera vez la función de un fotopigmento acoplado a Go en su
sistema nativo.
10 Introducción
Introducción 11
Objetivo General
Evaluar si la proteína codificada por pScop2 es un fotopigmento funcional y si este es
responsable de conferir foto-sensibilidad a las células ciliadas de la capa distal de la
retina de Pecten irradians.
Objetivos específicos
- Utilizar la técnica del ‘Patch clamp’ en fotorreceptores ciliados de Pecten irradians, para
evaluar el efecto de diálisis de anticuerpos anti-pScop2 en su fotosensibilidad.
- Establecer un protocolo de electroporación y cultivo de fotoreceptores de Pecten
irradians que permita la incorporación de sondas de RNA de interferencia para ‘knock-
down’ de pScop2.
- Evaluar el efecto del silenciamiento del transcrito de pScop2 sobre las corrientes de
isomerización de rodopsina (ERC), y (ii) las corrientes prolongadas hiperpolarizantes
(PHA).
- Elegir líneas celulares apropiadas para la expresión heteróloga de pScop2, que
presenten corrientes iónicas acopladas a proteínas G y realizar transfecciones con
vectores de expresión que contengan la secuencia codificante de pScop2.
- Detectar la producción de la proteína codificada por pScop2 en líneas celulares
transfectadas, mediante técnicas de inmunodetección.
- Evaluar la capacidad de pScop2 de conferir fotosensibilidad a líneas celulares
realizando registros electrofisiológicos en células transfectadas y tratadas con cromóforos
derivados de la vitamina A.
12 Introducción
1. Materiales y métodos
1.1 Preparación de tejido:
Se siguió el protocolo establecido para estudios fisiológicos de fotoreceptores aislados de Pecten irradians (Nasi y Gómez, 1992). Éste consiste en escindir el manto que contiene los ojos de un espécimen de Pecten irradians (obtenidos del Centro Marine Resources, del Marine Biological Laboratory, Woods Hole, MA EEUU) mediante el corte del músculo abductor. Una vez extraído el manto, éste se transfiere a una caja de Petri con un fondo de Sylgard® donde es sujetado con alfileres e iluminado con luz roja tenue (λ > 650 nm) en un estéreo-microscopio para evitar fotoestimulación prolongada durante la disección. Para extraer la retina se hace una incisión circular alrededor del ojo para retirar la córnea, el lente y el tejido pigmentado y se hace un corte por debajo de la retina para separarla del nervio óptico. La retina escindida se transfiere a un tubo con agua de mar artificial (AMA, composición en mM: 480 NaCl, 10 KCl, 49 MgCl2, 10 CaCl2, 10 HEPES, 5 Glucosa, pH 7.8).
Para obtener fotoreceptores ciliados aislados y fisiológicamente viables, las retinas fueron tratadas con pronasa (12mg/ml) en AMA a 22 °C por 45 minutos y, luego de inactivar y diluir la enzima en dos lavados con AMA suplementada con suero fetal bovino, (3%, V/V) se procedió a dispersar las retinas utilizando una pipeta Pasteur pulida a fuego con un orificio de entrada de ~0.5 mm.
1.2 Registros electrofisiológicos:
Para hacer registros electrofisiológicos de fotoreceptores de Pecten irradians se sedimentaron las células aisladas, con el método descrito en la sección anterior, en una cámara de registro durante 35-50 min. La cámara había sido previamente tratada con Concanavalina-A (5mg/ml en 1M NaCl por 2-3 horas, lavada con agua desionizada y secada al aire) para promover la adhesión celular.
Para hacer registros electrofisiológicos de células provenientes de líneas celulares, se usaron células que habían sido previamente cultivadas en laminillas de vidrio estériles (grosor ~160µm). Las laminillas fueron transferidas a una cámara de registro y bañadas con una solución externa que imita la composición del medio extracelular de las células mamíferas (Composición, en mM: NaCl 140, KCl 1.5, MgCl2 1, CaCl2 2.5, HEPES 10, Glucosa 11, pH 7.4).
Los registros electrofisiológicos de células transfectadas y fotoreceptores de Pecten irradians se hicieron en un cuarto oscuro para evitar la foto-estimulación de las preparaciones celulares. La visualización microscópica se hizo con una cámara enfocada en el plano focal conjugado del plano imagen del puerto lateral de un microscopio Zeiss Axiovert S100 o Zeiss ICM405, la cual estaba conectada a un monitor externo. La preparación fue iluminada con luz infraroja o roja tenue (λ > 650 nm).
14 Identificación funcional de una nueva opsina como fotopigmento
Se utilizó la técnica del “Patch Clamp” en modalidad de “Whole Cell Clamp” para realizar todos los registros electrofisiológicos de células individuales. Esta técnica permite la medición de corrientes totales de membrana plasmática y la incorporación de moléculas al citosol de la célula mediante la equilibración de los contenidos celulares con la solución utilizada en el interior del electrodo de registro (composición para células de Pecten irradians, en mM: 100 KCl, 200 K-glutamato, 6 Na2ATP, 6 MgCl2, 10 HEPES, 1 EGTA, 0.1 LiGTP, 300 Sacarosa, pH 7.3)
(Composición para líneas celulares mamíferas, en mM: 15 KCl, 110K-glutamato, 20 NaCl, 0.5 CaCl2, 5 HEPES, 4 MgATP, 0.2LiGTP, 1.5 Na2EGTA, pH 7.4).
Para poder registrar una corriente iónica usando “Patch Clamp” en modalidad de célula entera debe lograrse continuidad entre el interior de la célula y un microelectrodo conectado a un conversor corriente-voltaje. Esto permite controlar el voltaje de la membrana plasmática y simultáneamente medir la corriente que pasa a través de ella. Esta continuidad se logra acercando el microelectrodo a la célula usando un micromanipulador (Custom Medical Research Equipment) hasta hacer contacto con la superficie celular, posteriormente se disminuye la presión en el interior del electrodo para lograr una succión leve (0.5-2 pulgadas de H20) y se monitorea la formación de un contacto de alta resistencia eléctrica (1-10 GΩ), entre el borde del microelectrodo y la membrana de la célula usando un estímulo de voltaje de magnitud conocida (1-10mV P-P) y midiendo la corriente resultante. Una vez logrado este “Giga-sello” se succiona fuertemente (20-100 pulgadas de H20) para romper la región de membrana plasmática que separa el interior de la célula del interior del electrodo.
Los electrodos se fabricaron con capilares de borosilicato calentando el centro del capilar y estirando los extremos con un “estirador” de pipetas (Narishige, modelo pc- 10 o KOFP, modelo 720); para eliminar irregularidades que podrían impedir la formación del sello, la punta de la micropipeta fue pulida acercándola a un filamento de platino caliente bajo visualización microscópica y manipulación por medio de un micro-manipulador (Narishige). Posteriormente, las micropipetas de vidrio fueron llenadas con la solución interna adecuada usando una jeringa de plástico estirada con una llama para adelgazar su punta y permitir el llenado del electrodo (diámetro externo máximo, 1.5 mm). La conversión entre corrientes iónicas y corrientes electrónicas se hizo usando un electrodo reversible de Ag-AgCl sumergido en la solución en el interior del microelectrodo de registro, esto permite el flujo de corriente entre el entorno celular (corrientes iónicas) y los componentes electrónicos del amplificador y los equipos de medición (corrientes electrónicas).
La medición de corrientes por “Patch Clamp” se hizo con un amplificador de fabricación casera (Enrico Nasi), un amplificador List o un amplificador con un “headstage” de retroalimentación óptica (Optopatch, Cairn).
1.3 Estimulación y adquisición digital de datos de electrofisiología
Para estimular las células con luz se utilizó una de las siguientes alternativas:
Materiales y métodos 15
Lámpara halógena de 100W, montada en un riel óptico equipado con filtros cromáticos y de densidad neutra, enfocada sobre la cámara de registro por medio de un prisma montado en el condensador de un microscopio invertido.
Lámpara de Xenón o Mercurio acoplada al puerto de epi-iluminación de un microscopio invertido mediante una fibra óptica o una fibra de agua, respectivamente.
LED’s de alto poder acoplados directamente al puerto de epi-iluminación de un microscopio invertido (Thorlabs, modelos M625L3, M470L3 y LED4D067)
Para la estimulación y el registro de archivos de datos de electrofisiología y fluorescencia de calcio se utilizó el software Collect (escrito y diseñado por Enrico Nasi) y un conversor digital-análogo de 16 bits (Data Translation, modelo DT9834). Para controlar la lámpara halógena, de mercurio y de xenón se utilizó un obturador electromecánico (Uniblitz, Vincent Associates) que permite controlar los periodos de estimulación. En el caso de los LED’s se utilizó un controlador electrónico (ThorLabs modelo DC4100 y LEDD1B) operado directamente por el software Collect.
1.4 Calibración de intensidad de luz de estimulación
La intensidad de la luz fue determinada con un radiómetro UDT Modelo 370, midiendo el diámetro de la zona circular iluminada en el plano de la cámara de registro con un con un gratículo calibrado. Para fines de comparación entre luces de composición espectral diferente, las mediciones fueron convertidas a densidad de flujo de fotones efectivos a 500 nm. Para este fin, se compararon las amplitudes de fotocorrientes producidas con diferentes intensidades de las luces utilizadas para los experimentos, con los efectos de una luz monocromática obtenida con un filtro de interferencia de 3 cavidades (ancho de banda al 50% 10 nm).
1.5 Análisis de datos
Para el análisis de datos de electrofisiología se utilizó el software Analyze (escrito y diseñado por Enrico Nasi,) con el cuál se realizó el análisis de amplitud de fotocorrientes, integración de corrientes en el tiempo para determinar cargas desplazadas, y extracción de valores puntuales de grupos de registros para análisis del efecto de diálisis de anticuerpos anti-pScop2.
Para el análisis y procesamiento de imágenes de microscopía y Western blot se usó el software Fiji (Wayne Rasband, GNU GPL). Para la creación de figuras se usó Photoshop CS6 (Adobe).
Para el análisis y creación de figuras de fluorescencia de calcio en células transfectadas con pScop2-Gq-mRFP se usó MatLab (Mathworks, versión 2014B). Los trazos crudos de fluorescencia (archivos “.D*”) fueron convertidos a un archivo de Excel (Ramirez, 2014) y usados como entrada para un script de MatLab cuya función consistía integrar la señal de fluorescencia durante su duración (~25 ms) para mejorar la razón señal/ruido de cada punto experimental. Posteriormente, el script calculaba el porcentaje de cambio relativo de fluorescencia respecto al nivel basal (promedio aritmético de los puntos disponibles antes del inicio del estímulo de luz, generalmente 6 puntos) y graficaba cada punto en el tiempo como un archivo de tipo “.Tif” de alta resolución.
16 Identificación funcional de una nueva opsina como fotopigmento
El análisis de secuencias de DNA y proteínas se hizo usando BioEdit (Tom Hall, Ibis Biosciences) y PeakTrace Online (Nucleics).
1.6 Electroporación y cultivo de retinas
Se disecaron 10-15 retinas de especímenes de Pecten irradians según el método descrito en la sección “preparación de tejido”, las cuales fueron mantenidas en AMA hasta el comienzo del protocolo de electroporación. Las retinas fueron lavadas en 100µl de solución de electroporación (COMPOSICIÓN SOLUCIÓN ELECTROPORACIÓN) y luego transferidas a 110µl de solución de electroporación con la molécula de interés (RNAi pScop2 100nM, Dextrán-Fluoresceina 10KDa 480nM o RhodIR2 RNAi 2µM), incubadas por 5 minutos y transferidas a una cubeta de electroporación de 1mm. Usando un electroporador BTX ECM 830 se aplicaron 2 pulsos cuadrados de 40V y 30ms de duración separados por un intervalo de 5 s. Durante la electroporación las retinas fueron mantenidas en oscuridad o con iluminación tenue de longitud de onda larga (λ > 650 nm) a 15 °C.
La cubeta se dejó reposar durante 5 minutos. Posteriormente se añadieron 10µl de AMA, seguido de otra incubación de 5 minutos.
Finalmente, las retinas fueron transferidas a 1ml de AMA para lavado e incubadas en 1 ml de medio de cultivo (80% de DMEM al 10% SFB Y 3% Penicilina/estreptomicina, 20% de concentrado de sales para imitar composición de AMA: en mM, NaCl 1574, KCl 28.4, CaCl2 42.8, HEPES 50, MgCl2 236.4) por 24-72 horas a 15 °C en oscuridad con periodos de iluminación de 20 minutos cada 24 horas.
1.7 Cultivo de líneas celulares mamíferas
Las líneas celulares seleccionadas fueron cultivadas en el medio apropiado en Flasks T25 (TPP), suplementado con 10% de suero fetal bovino (Gibco) sin adición de antibióticos. Medios de cultivo (Gibco): DMEM- HEK293, DMEM de alta glucosa- Neuro2A, F12- CHO. Todos los medios fueron suplementados con L-Glutamina, Piruvato de Sodio, Cloruro de Piridoxina y Bicarbonato de Sodio.
Las células fueron cultivadas en un incubador de chaqueta de agua, a 37 °C y con una atmósfera de 5% de CO2, una vez las células alcanzaban una confluencia ~80 % eran tripsinizadas durante 1-2 minutos en una solución de tripsina-HBSS-EDTA al 0.05% y dispersadas mecánicamente para obtener células únicas para sembrar en nuevas cajas de cultivo.
Las células se sembraron en cajas de 6 pozos (TPP) con laminillas de Borosilicato estériles o en cajas de 9 cm2 de fondo de vidrio para transfectar con los vectores de expresión, una vez las células habían alcanzado 60-80 % de confluencia.
Para su almacenamiento, las células eran congeladas en su medio correspondiente con 10% de suero fetal bovino y 10% de Dimetil sulfoxido (DMSO) y preservadas en nitrógeno líquido.
Materiales y métodos 17
1.8 Selección de líneas celulares para expresión heteróloga de pScop2
Se buscaron líneas celulares que tuvieran corrientes iónicas acopladas a la activación no específica de proteínas G heterotriméricas mediante registro electrofisiológico por “Patch Clamp” y diálisis de GTPγs al interior celular.
1.9 Transfección
Los vectores de expresión ya construidos en el laboratorio, los cuales contienen la secuencia codificante de pScop2 (Arenas, 2013 a,b) y el vector de expresión construido en este trabajo, fueron transfectados en las líneas celulares seleccionadas. 1.92-2.0µg de plásmido fue diluido en 500µl de OptiMEM® (Life Technologies). Posteriormente se añadieron 3.9-4.0µl de Lipofectamina LTX (Invitrogen) y se incubó la mezcla durante 25 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación se añadieron los complejos de DNA-Lipofectamina a un plato de cultivo de 35mm con células a una confluencia de 60-80% con 1ml de medio fresco. La expresión de las proteínas codificadas fue verificada mediante microscopía de fluorescencia de proteínas fluorescentes reporteras controladas por el mismo promotor que la secuencia de pScop2.
Para la generación de líneas celulares establemente transfectadas se hizo una selección de clones individuales transfectados por selección con Geneticina (G148). Todos los vectores de expresión usados en este trabajo tienen la secuencia codificante del gen NeoR/KanR, que confiere resistencia a este antibiótico. Inicialmente fue necesario determinar la dosis de selección adecuada para cada línea celular: se crecieron células control a diferentes concentraciones del antibiótico y se monitoreó el crecimiento de los cultivos. Las células HEK293 y Neuro2A fueron incapaces de crecer a dosis <200µg/ml, se escogió una dosis de 800µg/ml para seleccionar clones establemente transfectados. A las 24 horas después de la transfección, las células fueron tripsinizadas y sembradas a baja densidad (~ 1% de confluencia) en medio de cultivo suplementado con 800µg/ml de G148. El medio fue cambiado cada 3 días y se monitoreó la formación de colonias fluorescentes provenientes de una célula única. Las colonias fluorescentes con crecimiento vigoroso fueron aisladas con un cilindro plástico sellado al fondo del plato de cultivo con grasa de alto vacío estéril (Corning) y tripsinizadas. Las células transfectadas establemente fueron cultivadas al menos 4 semanas a 800µg/ml de G148 y posteriormente fueron mantenidas a 600µg/ml de antibiótico.
1.10 Inmunodetección de proteínas expresadas en un sistema heterólogo
1.10.1 Inmunocitoquímica
Se usaron platos de cultivo de 35mm con fondo de vidrio que contenían células transfectadas transitoriamente con pScop2-BiRed o células no transfectadas. El medio de cultivo fue retirado y lavado con 2ml de PBS estéril. La solución fue retirada e inmediatamente las células fueron fijadas con una solución de PBS con 2% de
18 Identificación funcional de una nueva opsina como fotopigmento
formaldehido por 15 minutos a temperatura ambiente y lavadas dos veces con PBS durante 10 minutos.
Las células fijadas fueron permeabilizadas por 5 minutos en hielo en una solución de PBS con 0.2% triton-X100, bloqueadas en PBS con 1% de suero fetal bovino y 0.002% Triton-X100 durante 10 minutos e incubadas por 1 hora con anticuerpos monoclonales de ratón anti-FLAG™ (Pierce) (Concentración 1:200 en PBS + 0.5% BSA + 0.002% Triton-X100).
Después de lavar los anticuerpos primarios con PBS +0.002% Triton-X100 (2 veces, 10 minutos/lavado), las células fueron incubadas por 1 hora en anticuerpos secundarios de cabra anti-Ratón conjugados a Alexa-488 (Life technologies, Invitrogen) (Concentración 1:200 en PBS + 0.5% BSA + 0.002% Triton-X100).
Los anticuerpos fueron lavados con PBS (3 veces, 10 minutos/lavado) y posteriormente, las células fueron cubiertas con una solución de PBS con glicerol al 50% y cubiertas con una laminilla cubreobjetos para evitar la evaporación de la solución.
Las células transfectadas, incubadas sin el anticuerpo primario se usaron como control junto con células no transfectadas incubadas con anticuerpos primarios y secundarios.
Las muestras fueron fotografiadas en un microscopio Zeiss Axiobserver A1 usando óptica de Nomarski y un objetivo de inmersión en aceite con magnificación de 100X (1.4 NA), se usaron filtros Fs38 (BP 470/40, FT 495, BP 525/50, Zeiss) para obtener señales fluorescentes de Alexa-488 y filtros Fs00 (BP 530-585, FT 600, LP 615, Zeiss) para obtener señales fluorescentes de proteína roja fluorescente monomérica. Se usó una lámpara de mercurio de 80 W para estimular las moléculas fluorescentes. Los parámetros de adquisición fueron idénticos para todas las muestras.
1.10.2 SDS PAGE y Western Blot
Se usaron platos de cultivo de 35mm que contenían células transfectadas transitoriamente con pScop2-BiRed o células no transfectadas. El medio de cultivo fue retirado y lavado con 2ml de PBS estéril. La solución fue retirada e inmediatamente las células fueron lisadas en 500µl de buffer de SDS (Composición, en mM: Tris HCl 30, NaCl 100, 1% SDS, Na-EDTA 5, pH 7.4) durante 5 minutos con agitación frecuente (rotación cada 20-30s), el lisado fue transferido a un tubo de 1.5ml y centrifugado por 10 minutos a 12000 RPM. El sobrenadante fue retirado cuidadosamente y mezclado con buffer de carga 4X (Composición en mM: Tris 62.5, NaEDTA 5, Glicerol 10%, SDS 2%, Azul de Bromofenol 0.01%, β-mercaptoetanol 4%, pH 6.8).
Se sembró 30µl de lisado en cada pozo de un gel de acrilamida 29:1 al 4-8% y se separó la muestra durante 3h a 25mA, (Buffer de corrida, en mM: Glicina 192, Tris 25, SDS 1%, pH 8.3). El gel fue transferido con un método semi-seco a una membrana de Nitrocelulosa durante 1h a 25mA (Buffer de transferencia, en mM: Glicina 153, Tris 20, Metanol 20%, pH 8.3).
La membrana fue bloqueada durante 12-16 horas a 4 °C en TBS con 3% de BSA y posteriormente incubada durante 3 horas en solución de anticuerpo primario de ratón Anti-FLAG™ (Pierce) 1:1000 en TBS + 0.5% BSA, a temperatura ambiente y con rotación lenta constante (30-50 rpm).
Materiales y métodos 19
Después de 3 lavados de 10 minutos, con 10 ml de TBS, la membrana fue incubada por 1 hora en una solución de anticuerpos secundarios anti-Ratón conjugados a fosfatasa alcalina (Promega) 1:2000 en TBS + 0.5% de BSA, a temperatura ambiente y con rotación lenta constante (30-50 rpm).
Finalmente, la membrana fue lavada 3 veces, durante 10 minutos con TBS e incubada en la oscuridad con 1 ml de Western Blue (Promega), se monitoreó la aparición de bandas con iluminación roja tenue (λ >600nm). La acción de la enzima fue detenida con ácido acético al 5%.
1.11 Biología molecular
1.11.1 Interferencia mediada por RNA
Se usó el marco de lectura abierto (ORF) de pScop2 (Arenas, 2013) y el programa Block-it RNAi designer (Invitrogen) para obtener secuencias de 25 nucleótidos con buenas características para interferir con la expresión de pScop2 (Basado en los algoritmos del programa). Se seleccionaron 10 candidatos con puntaje máximo (5/5 estrellas) y se definió cuáles de estos eran únicos en el transcriptoma de la retina de Pecten irradians, usando BLAST contra la base de datos de todos los contigs derivados de la secuenciación masiva por 454.
Se seleccionaron dos secuencias, denominadas pScop2_Stealth_170_a y pScop2_Stealth_915_a (cuya mezcla fue denominada pScop2-RNAi), para síntesis química (Invitrogen), 170 y 915 hacen referencia a la posición del nucleótido 3’ de cada secuencia en el ORF de pScop2. Cada secuencia fue sintetizada in-vitro, junto con su secuencia dúplex, y marcada covalentemente con una molécula de Alexa-546 en su extremo 5’ para permitir la identificación de las células que lograron incorporar moléculas de RNAi. Se escogió como molécula fluorescente Alexa-546 porque su pico de absorción es cercano al punto isosbéstico del pigmento de las células ciliadas (λ= 532) (Cornwall y Gorman, 1983) y esto permitió minimizar la peturbación de las poblaciones de fotopigmentos (R y M) mientras se buscaban células fluorescentes, positivas para incorporación de la mezcla de RNAi.
Los pellet liofilizados de los RNAi sintetizados fueron solubilizados en agua de alta pureza y libre de RNAsas, se usó una mezcla de ambos dúplex (170_a y 915_a) como solución de trabajo a una concentración de 1µM. Los RNAi se manipularon en condiciones de alta limpieza y ausencia de RNAsas, además se mantuvieron siempre bajo condiciones de luz tenue u oscuridad para proteger la integridad de las moléculas fluorescentes contenidas en la solución.
Se usaron como controles para las células ciliadas: la electroporación con una molécula inerte (Dextran de 10 kDa conjugado a Fluoresceina) y la electroporación con un RNAi –Fluoresceina diseñado para interferir con la expresión de otro fotopigmento de Pecten irradians, pScop1, que se expresa en los fotoreceptores de tipo rabdomérico. Ambos permiten la identificación de células ciliadas que han incorporado las sondas y sirven de control negativo dentro del grupo de las células ciliadas, permitiendo demostrar la especificidad del pScop2-RNAi.
20 Identificación funcional de una nueva opsina como fotopigmento
También se registraron células de tipo rabdomérico, electroporadas con pScop2-RNAi y con su respectivo control, Dextran 10kDa conjuado a fluoresceina, un control negativo. Estos registros permiten demostrar que el efecto del pScop2-RNAi es específico a las células ciliadas.
1.11.2 Diseño de primers
Se diseñaron primers para amplificar el ICL3 de pScop1 y para eliminar el ICL3 de pScop2. Los primers eran complementarios en los 18 nucleótidos del extremo 3’ del primer. Al extremo 5’ de esta región se añadió un sitio de restricción para BmtI o AgeI (uno por primer), seguido de 6 bases para permitir el corte eficiente de las enzimas de restricción.
Los sitios de restricción se escogieron para que cumplieran los siguientes criterios: 1) No estar presentes en la secuencia del ICL3_Gq, ni en la secuencia de pScop2 (versión silvestre y con codones optimizados), ni en los vectores de expresión disponibles en el laboratorio (pcDNA3-mRFP1, V7XLT.GFPLT CS2). 2) Permitir doble digestión (tener buffers de reacción compatibles) y, 3) Tener secuencias de reconocimiento de 6 pares de bases (para introducir 2 codones nuevos y evitar cambios de marco de lectura). Se escogió AgeI y BmtI porque además de cumplir estos requisitos estaban disponibles en versión de alta fidelidad (HF), eran insensibles a metilación de DNA de tipo dam y dcm, porque tenían los extremos pegajosos más largos (4 bases) y porque introducirían 2 aminoácidos que no cambiarían el entorno local de hidropaticidad (juzgado por un análisis de Kyte-Doolittle, ventana= 18).
Se verificó que los pares de primers tuviesen temperaturas de anillaje similares, pocas estructuras secundarias y dímeros usando OligoCalc (Northwestern University), estos parámetros se optimizaron modificando la secuencia de las 6 bases del extremo 5’ de cada primer.
Adicionalmente, se verificó la especificidad de los primers por medio de BLAST Local. Para los primers del ICL3 de pScop1 se hizo un BLASTn contra la base de datos de los contigs del transcriptoma de la retina de Pecten irradians (para permitir la amplificación específica usando esta fuente) y contra el vector pGEMT-easy (otra fuente posible de esta secuencia). No se detectaron secuencias similares en otras regiones del transcriptoma ni en el vector. Para los primers que eliminarían el ICL3 de pScop2 se verificó la especificidad de la secuencia con un BLASTn contra la secuencia de los vectores de expresión que contienen pScop2.
Tabla 1. Primers usados para intercambio de dominios ICL3 de pScop1 y pScop2
Primer Secuencia (5’3’)
Gq_ICL3_BmtI_FWD
Gq_ICL3_AgeI_REV
Go-ICL3 AgeI pScop2 FWD
Go-ICL3 BmtI pScop2 REV
AAACGAGCTAGCATTATCGGTGCTATTAGG
TGCATTACCGGTCATAGCGATTTTGGTGAT
AAAATAACCGGTCGTGTAACATTGATCAGTTTCAT
AAAAAAGCTAGCCCTAAGAATCATCCCATAGGA
Materiales y métodos 21
1.11.3 PCR
Las reacciones de PCR se hicieron en un volumen de 25µl. Las reacciones para el ICL3_Gq contenían 200µM dNTP Mix, 0.23µl Taq Polimerasa, 2.5 Thermopol Taq PCR Buffer (New England Biolabs), 0.4µM de cada primer. El volumen de la plantilla fue ajustado según su concentración. Las reacciones para PCR inversa de pScop2 contenían 1mM de Mg+2, 2.5µl de 10X PCR buffer for KOD Hot Start Polymerase, 200µM dNTP Mix, 0.4µl de cada primer, 20ng de vector pcDNA3-mRFP1/pScop2 y 0.5µl de KOD “Hot Start Polymerase”. Las mezclas fueron mantenidas en hielo, cubiertas con 25µl de cera y puestas en un termociclador precalentado a 95 °C. Los productos de PCR fueron almacenados a -20 °C o separados inmediatamente después de terminada la amplificación por electroforesis en un gel de agarosa (1- 2% según el tamaño del producto) en Tris-Borato-EDTA (TBE) teñido con 0.0005% de bromuro de etidio (EtBr) y visualizados en un transiluminador UV. Para geles preparativos y extracción de bandas, la luz UV fue atenuada por aproximadamente 1.0 Log con un vidrio de 2 mm de espesor.
Debido a que todos los primers diseñados tienen 12 bases no complementarias a la plantilla, fue necesario implementar un protocolo de PCR con “Touch UP”. Para esto se usó la temperatura de anillaje calculada para los 18 nucleótidos del extremo 3´ de cada primer durante los primeros 2-3 ciclos de la PCR. Para los siguientes ciclos se usó la temperatura de anillaje predicha para la longitud completa de cada primer (Oligocalc, método ´Salt-adjusted´). En todos los casos se usó inicialmente un gradiente de temperatura de +/- 2 °C centrado en la temperatura de anillaje predicha, se escogió la temperatura que resultaba en la mejor amplificación (banda esperada intensa y pocas o nulas bandas inespecíficas).
1.11.4 Purificación, clonación y secuenciación de productos de PCR
Los productos de PCR fueron purificados de dos formas dependiendo de su tamaño: para los productos del ICL3_Gq (146 pb) se hizo una purificación del producto de PCR por columna de afinidad (Quick-Clean 5M PCR purification Kit, GenScript). Para los productos de PCR inversa (mayores a 7 kb), se hizo una extracción de la banda adecuada en un gel preparativo por el método de centrifugación con lana de vidrio y una purificación por el método de fenol-Cloroformo y precipitación en etanol. Los productos purificados fueron eluidos en agua para PCR o en buffer TE pH 8.2 y almacenados a -20 °C.
La concentración y pureza de todos los productos fue determinada por métodos espectrofotométricos (NanoDrop, ThermoScientific).
Para la generación de vectores de clonación, 4µl de producto de PCR purificado fueron incubados con 0.5 µl del vector pGEM t-easy (Promega) en presencia de 5 µl del buffer de ligación 2X, 1 µl de ligasa T4 y agua, para un volumen total de 10 µl por reacción. La reacción se llevó a cabo durante 12-16 horas a 4 °C y se usó para transformar bacterias químicamente competentes E. coli JM109. Para esto se incubaron 25 µl de bacterias con 2 µl la reacción de ligación durante 20 minutos en hielo. Posteriormente, las bacterias fueron sometidas a choque térmico en un baño de agua a 42 °C durante 45 segundos
22 Identificación funcional de una nueva opsina como fotopigmento
seguido de una incubación en hielo por 2 minutos y crecimiento en 800 µl de medio SOC sin antibióticos por 1.5 horas a 37°C con agitación suave (400 rpm).
Posteriormente, las bacterias fueron sembradas en cajas de Petri con agar LB (Lenox) con 100mg/L de ampicilina previamente cubiertas con 100 μl XGal/IPTG (Roche). Las bacterias se dejaron crecer de 18 a 24 horas a 37°C y posteriormente varias colonias blancas se seleccionaron (al insertarse el producto de PCR en el vector pGEM t easy, se interrumpe el gen LacZ que impide la producción de la β-Galactosidasa, por lo tanto no se metaboliza XGal y no hay generación de una coloración azul).
Cada colonia seleccionada fue inoculada en 1ml de medio LB selectivo e incubada a 37°C con agitación fuerte (800 rpm) hasta alcanzar un crecimiento de 2.0 A (medido espectrofotométricamente a OD 600nm). Para corroborar la presencia del inserto en el vector de clonación, se hizo una PCR de colonia usando 1 μl del cultivo de la colonia transformada como plantilla y las mismas condiciones de amplificación usadas originalmente.
Se hizo una extracción plasmídica de los cultivos bacterianos con el kit QuickClean 5M Miniprep (GenScript) para hacer un análisis de restricción con la enzima EcoRI (el plásmido pGEM t-easy tiene un sitio de restricción de EcoRI flanqueando los posibles insertos a cada lado). Los productos de digestión fueron separados y visualizados en un gel de agarosa al 2%. Los plásmidos que dieron un resultado positivo para la PCR de colonia y el análisis de restricción fueron escogidos para secuenciación.
Las muestras fueron secuenciadas en GeneWiz Inc. con secuenciación bidireccional. Se usaron los primers universales M13 Fwd y M13 Rev para secuenciar las muestras de vector de clonación pGEM t-easy.
1.11.5 Generación del vector de expresión pScop2_Gq
Para ensamblar el vector de expresión que contiene la secuencia codificante de pScop2 con el ICL3 de pScop1 se digirió el plásmido pGEM t-easy que contiene el producto de PCR del ICL3 de pScop1 (ICL3-Gq) y el producto purificado de PCR inversa de pScop2 con las enzimas AgeI-HF y BmtI-HF (New England Biolabs) durante 3h a 37°C. Los productos deseados fueron separados en un gel de agarosa (2% para ICL3-Gq, 1.2% para el producto de PCR inversa de pScop2) y purificados de banda (el ICL3-Gq fue purificado con un kit comercial (GenScript) y el producto digerido de la PCR inversa de pScop2 fue purificado por el método de centrifugación con lana de vidrio y precipitación con etanol). Los productos purificados fueron cuantificados y ligados con ligasa T4 durante 12 horas a 4°C (cociente inserto-vector 3:1).
Se transformaron bacterias, se obtuvieron colonias individuales y se obtuvo plásmido purificado con el método descrito en la sección anterior. Se verificó la presencia correcta del ICL3 en la secuencia de pScop2 mediante PCR de colonia (para lograr amplificación del ICL3_Gq) y análisis de restricción, usando dos combinaciones de enzimas de restricción.
Los plásmidos que dieron un resultado positivo para la PCR de colonia y el análisis de restricción fueron secuenciados bidireccionalmente con primers universales y primers internos a la secuencia (ver tabla 1).
Materiales y métodos 23
1.12 Registros de fluorescencia de calcio con fluo4-AM
Para monitorear posibles cambios de la concentración de calcio intracelular en respuesta a la luz se utilizó el indicador fluorescente Fluo 4 (Kd = 0.37 µM). Para introducir el indicador en las células se usó el derivado liposoluble Fluo 4AM (acetoximetil ester), el cual, gracias a su hidrofobicidad atraviesa la membrana celular con facilidad. Una vez dentro de la célula el precursor es degradado por la acción de esterasas endógenas que rompen su enlace ester y liberan el indicador Fluo 4 que es hidrosoluble e incapaz de atravesar la membrana. Con la degradación del precursor al interior de la célula se mantiene un gradiente entre el exterior y el interior celular lo cual permite acumular significativas concentraciones del indicador al interior de la célula.
Las células fueron cultivadas en cajas de cultivo de 9.6 cm2 con fondo de vidrio e incubadas con solución extracelular (ver sección – registros electrofisiológicos) con 4.5 µM de Fluo4AM, 0.1% de Pluronic™ y 0.5% de DMSO por 1 hora a 37 °C en oscuridad. Posteriormente, esta solución fue lavada con 2ml de solución extracelular y reemplazada por solución extracelular con 20 µM de 9 o 11-cis retinal y etanol al 1%. Las células fueron incubadas en esta solución por 1 hora a temperatura ambiente en condiciones de oscuridad y posteriormente fueron registradas en solución externa.
Para la estimulación del fluoróforo, se utilizó una lámpara de Xenón cuyo haz de luz era controlado mediante un obturador electromecánico (Vincent Associates, Rochester). Al activar el obturador, el haz pasaba por un filtro monocromático azul (Fc ≈ 480 nm, Chroma) y era enfocado sobre una fibra óptica líquida (Oriel) que lo transmitía al puerto de epi-fluorescencia de un microscopio invertido. Un reflector dicroico dirigía la luz de excitación a la muestra, a través del objetivo del microscopio. Para detectar la fluorescencia emitida se instaló una cortina mecánica en un plano focal conjugado restringiendo así la medición de luz al área de la célula de interés, incrementando la relación señal/ruido. La luz colectada rebotaba por otro espejo dicroico que desviaba las longitudes de onda <570 nm a un filtro de barrera (λ>520 nm) y un fotomultiplicador (Hammamatsu); la señal obtenida se pasaba por un pre-amplificador con umbral que transformaba los eventos de fotones únicos en señales electrónicas que luego eran contadas por un ratímetro (Modern Instrumentation Technology) y transmitidas al computador por un conversor análogo-digital (Data Translation).
24 Identificación funcional de una nueva opsina como fotopigmento
2. Resultados
2.1 Ensayos funcionales de pScop2 en Pecten irradians
2.1.1 Efecto de la diálisis de anticuerpos anti-pScop2 en la fotosensibilidad de los fotoreceptores ciliados de Pecten irradians:
Análisis moleculares en ortólogos de pScop2 y otras moléculas pertenecientes a éste nuevo grupo de Opsinas putativas predicen que estas moléculas deben funcionar como fotopigmentos, pero esta predicción no ha sido corroborada experimentalmente (Porter et al., 2011). Los datos experimentales postulan a pScop2 como un buen candidato para ser el fotopigmento de las células ciliadas porque, además de las predicciones bioinformáticas, su expresión ha sido demostrada, a nivel tanto de mRNA como de proteína, en los fotoreceptores de la retina distal de Pecten irradians (Arenas, 2013). Sin embargo, para confirmar que pScop2 es el fotopigmento de estas células, es necesario obtener evidencia funcional de su capacidad de foto-isomerizarse al ser irradiado con luz, e iniciar señalización que lleva a controlar canales iónicos.
Para este fin, una estrategia general implicaría interferir con dicha molécula en los foterreceptores nativos, y determinar si esta manipulación repercute en la respuesta fisiológica a la luz. Se intentaron dos diferentes acercamientos para implementar esta idea. Una posibilidad es introducir un anticuerpo específico contra pScop2 dentro de células ciliadas, el cual pueda impedir las funciones de señalización del fotopigmento.
El anticuerpo policlonal X-pScop2 utilizado para detección y localización fue generado en conejos inmunizados con el péptido sintético TRRNETRTRQGYMPRYIQD. Éste péptido fue escogido con base en diferentes criterios: (i) tener una alta inmunogenicidad predicha (ii) ser un segmento hidrofílico de la proteína (y por lo tanto probablemente accesible a un anticuerpo) (iii) ser una secuencia única en el transcriptoma de la retina de Pecten irradians con lo cual el anticuerpo generado tendría baja propensión a reacciones cruzadas inespecíficas. Según el análisis de la secuencia primaria de pScop2, este péptido se ubicaría en el tercer loop intracelular de pScop2, una región que en variados receptores de siete dominios transmembrana tiene alta importancia para la interacción con la proteína G (Greasley et al. 2001). Por lo tanto, si el anticuerpo es capaz de ligarse a ésta región de la proteína, podría impedir la activación de la proteína G, por parte de fotopigmento expuesto a la luz, reduciendo la sensibilidad de la célula a estímulos de luz.
Sin embargo, debido a que los aminoácidos específicos involucrados en la interacción opsina-proteína G no se conocen (y la longitud predicha del tercer loop intracelular es significativamente mayor que la secuencia inmunogénica utilizada), no hay garantía de
26 Identificación funcional de una nueva opsina como fotopigmento
que el anticuerpo necesariamente resulte ser funcional. Para evaluar el efecto de los anticuerpos anti-pScop2 en la fotosensibilidad de los fotoreceptores ciliados se compararon registros de corrientes de membrana gatilladas por un estímulo de luz entre células control y células tratadas con anticuerpos antipScop2.
Estas mediciones se hicieron con la técnica del “Patch Clamp” en modalidad de célula entera añadiendo los anticuerpos anti-pScop2 diluidos 1:50 – 1:20 en la solución interna estándar (ver métodos), ya que el blanco del anticuerpo es un dominio intracelular de la proteína. Las fotocorrientes en células control fueron registradas con la solución interna estándar, sin anticuerpos. Se midieron las respuestas a breves estímulos de luz (100 ms) de intensidad constante, aplicados repetitivamente a intervalos de 1 minuto durante 30 minutos.
En estos experimentos era indispensable que la intensidad del estímulo no fuera saturante, de lo contrario una disminución en la sensibilidad del fotorreceptor a causa de los anticuerpos, podría pasar desapercibida. Para determinar la intensidad apropiada del estímulo lumínico, se llevaron a cabo protocolos de series de intensidad en células control, en los cuales se aplicaron destellos de luz de intensidad creciente en incrementos de 0.6 logaritmos. A partir de la relación entre intensidad del estímulo y la amplitud máxima de la fotocorriente se escogió la intensidad de 1.2 unidades logarítmicas de atenuación (Fuente halógena 100W) porque éste estímulo produce una fotorrespuesta que está cerca del punto medio de la amplitud máxima medida en estas células (“half-max”) (Figura 1) y por esta razón debería ser apropiado para detectar cambios en la foto-sensibilidad de la célula en el tiempo.
También se determinó que el intervalo que se interpuso entre estímulos sucesivos era suficientemente prolongado para garantizar plena recuperación de la sensibilidad, evitando posibles cambios progresivos resultantes de adaptación a la luz. Finalmente, en cuanto a la longitud de onda se optó por limitarla a la banda comprendida entre 515 y 670 nm, mediante el uso de filtros. El motivo es que el fotopigmento de las células ciliadas de Pecten irradians es bi-estable, eso significa que tiene dos conformaciones térmicamente estables, que representan el estado inactivo, en la oscuridad (Rodopsina (R)) y su forma “activada” (Metarodopsina (M)) luego de sufrir foto-isomerización. Ambos son capaces de absorber luz visible (Cornwall y Gorman, 1983) pero presentan espectros de absorción muy diferentes: por consiguiente, al absorber preferencialmente luz azul (R) o luz roja (M), respectivamente, la molécula puede ser fotoconvertida reversiblemente, y es posible manipular la distribución de los estados de la población de foto-pigmento usando estímulos con diferente contenido cromático (Cornwall y Gorman, 1983).
La longitud de onda usada es cercana al punto isosbéstico del pigmento de las células ciliadas, λ=532 nm, (Cornwall y Gorman, 1983). Esta longitud de onda es absorbida eficientemente por la forma inactiva (R) del pigmento pero no favorece la acumulación de ninguna de las dos poblaciones de pigmento en un estado estacionario y esto permite mantener constante la relación rodopsina/metarodopsina en el tiempo, y así evitar generar artefactos por redistribución de las poblaciones de pigmento.
Resultados 27
En general, las células control tienen respuestas estables en el tiempo a estímulos de luz amarilla atenuados por 1.2 Log y la disminución en la respuesta es lenta y pequeña (Figura 2, panel A). Sin embargo, las células tratadas con anticuerpos tampoco manifestaron una disminución sistemática de las corrientes en el tiempo que fuera significativamente mayor respecto a los controles, incluso con exposición a concentraciones altas de anticuerpos (hasta 1:20 para el Anticuerpo #2 y 1:25 para anticuerpo #1) (Figura 2, paneles B y C).
La incapacidad de los anticuerpos de disminuir la foto-sensibilidad de las células ciliadas puede deberse a que el anticuerpo no sea funcional, como se discutió anteriormente, o a otros factores asociados a usar las foto-corrientes como un indicador de la cantidad “funcional” de fotopigmento: como se argumenta en detalle en la Discusión, el exceso molar del fotopigmento respecto a los demás componentes de la cascada de transducción , y la amplificación que éste imparte a la señal, hacen que la magnitud de la
Figura 1 Serie de Intensidad de una célula ciliada. Panel superior:
registros de fotocorrientes ante estímulos de luz de intensidad creciente (incremento = 0.6 log). Panel inferior: amplitud de la fotocorriente en función de la magnitud del estímulo, ajustado a una función de Boltzmann, Halft-Max = -1.0 Log
28 Identificación funcional de una nueva opsina como fotopigmento
fotocorriente sea relativamente insensible a una disminución moderada del fotopigmento funcional.
La amplificación de la cascada de transducción (mediada por pasos enzimáticos) y el exceso molar del pigmento respecto al resto de los elementos de transducción (una necesidad en el diseño de un fotoreceptor sensible y eficiente) implican que sólo es necesaria la activación de una fracción pequeña del fotopigmento total para causar la máxima respuesta fisiológica (Brown y Coles, 1979). Esto es problemático porque una reducción moderada en la cantidad de fotopigmento podría no reflejarse en cambios en la respuesta fisiológica.
2.1.2 Silenciamiento del transcrito de pScop2 por RNAi
El problema de los registros con anticuerpos podría solucionarse usando un indicador más sensible a la cantidad de fotopigmento. La isomerización de una opsina en una célula fotoreceptora causa muchos procesos fisiológicos medibles además de la fotocorriente, porque activa la cascada de transducción. En el caso de las células ciliadas se podría monitorear los niveles de mensajeros secundarios como el cGMP o el número
Figura 2 Series de tiempo de amplitud de la fotocorriente: diálisis en células
ciliadas, A) Célula control, diálisis con solución interna, B) Diálisis de anticuerpo #1 1:25, C)
Diálisis de anticuerpo #2 1:20.
)
Resultados 29
de proteínas G activadas, pero estos reporteros sufren de los mismos problemas que la fotocorriente (exceso molar y amplificación) o simplemente no es factible su medición en células únicas.
Una posibilidad alternativa más deseable es monitorear alguna variable fisiológica directamente relacionada con la actividad del fotopigmento, para averiguar si se puede atribuir a pScop2. Un buen candidato es la manifestación eléctrica de la foto-isomerización del pigmento. Ésta constituye el primer signo de la activación de la cascada de foto-transducción: todo fotopigmento conocido, al sufrir un cambio conformacional luego de absorber un fotón, padece una re-distribución de su carga eléctrica (e.g. grupos ionizados, dipolos). Un movimiento de carga constituye una corriente pero en este caso sería inevitablemente diminuta, ya que sólo involucra pocos residuos en la molécula misma. Sin embargo, si se logra causar rápidamente un cambio conformacional similar y sincronizado en una población numerosa de moléculas de fotopigmento, la suma de todos los desplazamientos de carga puede manifestarse en una corriente suficientemente grande para ser registrada electrofisiológicamente – denominada ERC (por su sigla en inglés: “early receptor current”) –, o producir un cambio apreciable en el voltaje de membrana (ERP, de “early receptor potential”). En el caso de fotorreceptores ciliados de Pecten, el ERP y ERC habían sido medidos previamente (Cornwall y Gorman, 1983; Ferrer et al., 2012), además esta señal de isomerización ha sido usada para cuantificar el número de copias de rodopsina en fotoreceptores únicos (ver, por ejemplo, Lisman y Bering, 1977).
Este tipo de mediciones eliminaría las dificultades asociadas con el uso de reporteros ‘cuesta abajo’ en la cascada: a diferencia de la fotocorriente fisiológica, la carga desplazada durante la ERC es linealmente relacionada con el número de moléculas de fotopigmento isomerizadas. Si el estímulo es suficientemente intenso, para causar la isomerización de todas las moléculas de fotopigmento en una célula, es posible obtener la carga desplazada total, una medida indirecta pero cuantitativa de su cantidad: por lo tanto, si se reduce el fotopigmento, se espera una disminución correspondiente en la ERC.
Esta estrategia sin embargo, requiere disminuir físicamente la cantidad de fotopigmento, no simplemente interferir con su capacidad de interactuar con la proteína G (como se intentó por medio de los anticuerpos). Por esta razón fue necesario implementar un nuevo acercamiento, bloqueando la síntesis de pScop2 usando interferencia mediada por RNA. Para esto se electroporaron retinas enteras de P. irradians con una mezcla de dúplex de siRNA dirigido contra pScop2 (producido sobre pedido por Invitrogen) y se evaluó el efecto sobre la cantidad total de fotopigmento – estimada a partir de la ERC - después de 1-3 días de cultivo.
Si pScop2 subyace la fototransducción en las células ciliadas de Pecten, una disminución en la cantidad de su mRNA debería tener repercusiones funcionales. Los fotoreceptores rabdoméricos, en cambio, no deberían verse afectados porque utilizan otro tipo de fotopigmento (Arenas, et. Al., 2013).
La electroporación de retinas enteras de Pecten ya ha sido exitosa en el pasado para mostrar el papel de la proteína Go en la cascada de transducción de las células ciliadas por interferencia de RNA (Arenas, et al., Manuscrito en preparación). Para silenciar pScop2 usando este método, fue necesario optimizar el procedimiento de electroporación y cultivo con el fin de lograr un efecto sobre la expresión del pigmento putativo.
30 Identificación funcional de una nueva opsina como fotopigmento
La electroporación debe satisfacer dos criterios, 1) debe permitir la internalización del RNAi en una fracción apreciable de las células, sin producir daño innecesario y 2) debe permitir identificar las células que han incorporado el siRNA, para utilizarlas en registros fisiológicos. Para evaluar dichos criterios se hicieron experimentos de control usando dextran de 10kDa (una masa molecular comparable a la de un siRNA) conjugado a fluoresceína y se evaluó el efecto de diferentes parámetros de electroporación, como la magnitud de los pulsos de voltaje y la composición de la solución de electroporación, en la internalización del dextran y en el estado fisiológico de las células después del procedimiento.
Pulsos de voltaje de gran magnitud (50+ V) resultaron en un mayor número de células que habían incorporado la sonda fluorescente, sin embargo esto también fue acompañado de mayor destrucción de las retinas, y un aumento en el número de células con morfología anómala y carentes de respuestas fisiológicas. Se escogió entonces una amplitud de 40 V porque permitía la incorporación de Dextran 10kDa en una fracción significativa de células, manteniendo la integridad de las retinas; además los fotorreceptores ciliados aislados enzimáticamente eran indistinguibles de los controles no electroporados, tanto en términos morfológicos como funcionales (evaluado por la presencia normal de fotocorrientes).
Se decidió usar una solución con bajo calcio basado en Swezey y Epel, 1989; Wangh, 1989. Esta solución permitía la incorporación eficiente de Dextran 10kDa fluorescente y la obtención de células en buen estado fisiológico al usar incrementos de calcio extracelular a niveles intermedios (800µM) durante un periodo de recuperación después de la electroporación.
Posterior a la electroporación con pScop2-RNAi, las retinas fueron cultivadas entre 1 y 3 días en condiciones de oscuridad. Cada 24 horas los cultivos eran expuestos a la luz por 20 minutos para estimular la síntesis y el recambio de la maquinaria fotosensible. Esto es necesario para la expresión del fenotipo del knock-down ya que si la vida media de una molécula de fotopigmento es muy larga, el efecto del bloqueo de la síntesis de nuevas moléculas por el RNAi pasaría desapercibido.
Existe gran evidencia bibliográfica de la importancia de estímulos de luz en la tasa metabólica, la síntesis de proteínas y la reestructuración de las estructuras celulares involucradas en la fototransducción. Esto se ha demostrado en células de tipo rabdomérico de Limulus donde el amanecer gatilla una reestructuración masiva de los rabdómeros (Chamberlain y Barlow, 1984; Jinks, et. Al., 1996), en la renovación de Opsinas en fotoreceptores del mosquito Aedes aegypti (Stein, et Al., 1979) y en el recambio de discos fotosensibles en conos y bastones de peces (O’day y Young, 1978). Adicionalmente, este efecto “circadiano” ha sido demostrado en células aisladas cultivadas (Herman, 1991), y se cree que es una generalidad de los fotoreceptores (O’day y Young, 1978), abriendo la posibilidad a un efecto similar en retinas aisladas de Pecten.
2.1.3 Efecto de la electroporación con RNAi-pScop2 en la cantidad de fotopigmento de las células ciliadas
Para llevar a cabo estas mediciones es preciso disponer, en primer lugar, de un criterio que permita discernir aquellas células que han internalizado el siRNA, ya que con el protocolo de electroporación de retinas sólo un sub-conjunto de las células son efectivamente permeabilizadas transitoriamente. Éstas fueron identificadas por
Resultados 31
microscopía de fluorescencia, ya que el pScop2-RNAi tiene una molécula de Alexa 546 en su extremo 5’. En segundo lugar, hay que aplicar una luz de intensidad suficiente para saturar la isomerización del fotopigmento. Para averiguar la intensidad de luz requerida, fue necesario construir series de intensidad, en las cuáles se midió la carga desplazada durante la ERC en función de la intensidad del estímulo de luz. Finalmente, es imprescindible que cada medición parta de una distribución inicial equivalente de las poblaciones de fotopigmento. Esto se logra estimulando cada célula previamente a la medición de la ERC, con un flash de 5 segundos de alta intensidad de luz roja (longitud de onda predominante: 625nm) el cual causa por foto-conversión una acumulación de la forma fisiológicamente inactiva del pigmento.
Las corrientes de isomerización de rodopsina fueron integradas en una ventana temporal que evitara la contaminación por parte de la fotocorriente, generalmente un intervalo de ~ 10ms posterior al inicio del estímulo de luz. La curva de intensidad de la carga
desplazada fue ajustada a la función 𝑸𝑬𝑹𝑪(𝑰) = 𝒂 (𝟏 − 𝒆(−𝒃𝑰)) (Lisman y Bering, 1977)
usando MatLab (Mathworks, versión 2014B), donde 𝑸𝑬𝑹𝑪 (carga desplazada por
isomerización de rodopsina) es una función de la intensidad de luz (𝑰), 𝒃 es una
constante proporcional a la foto-sensibilidad del fotopigmento y 𝒂 = 𝐥𝐢𝐦𝑰→∞
𝑸𝑬𝑹𝑪, es decir,
la carga desplazada al isomerizar la totalidad de las moléculas de fotopigmento en una célula.
Los resultados de un ajuste de una serie de intensidad de ERC típica se muestran en la
figura 3a-b. El modelo se ajusta muy bien a los datos (𝑅2 > 0.95 ) y muestra un comportamiento saturante. Esto permitió elegir como intensidad del estímulo, 2.945 X
1019 fotones/cm2*s, más que suficiente para saturar la 𝑄𝐸𝑅𝐶 y apta para permitir una buena separación entre el ERC y el inicio de la fotocorriente: la intensa iluminación concentra la absorción de fotones al comienzo del flash, sincronizando las foto-isomerizaciones y produciendo una señal de gran amplitud y corta duración (Figura 3c). Estas condiciones de registro proveen también indicadores fisiológicos del estado de salud de la célula, tales como la presencia de la fotocorriente. La alternativa para aislar la ERC sería anular la fotocorriente fisiológica eliminando la fuerza motriz sobre los iones de potasio o aplicando bloqueadores de la fotocorriente (4-AP y TEA; Gómez y Nasi, 1994b), pero esto impediría monitorear la viabilidad fisiológica de la célula.
La disminución de la cantidad total de fotopigmento en las células ciliadas debería
manifestarse en una disminución en 𝑄𝐸𝑅𝐶.
La electroporación con pScop2-RNAi causó una disminución de la 𝑄𝐸𝑅𝐶 desde el día 1 hasta el día 3 post-electroporación, en casos extremos esta corriente de isomerización era prácticamente indetectable por encima del ruido basal (Figura 3D). Los controles de electroporación, que incluyen electroporación con dextrán de 10kDa conjugado a fluoresceína y un RNAi dirigido contra la secuencia de otra opsina de Pecten irradians (la cual se expresa en los fotoreceptores de tipo rabdomérico presentes en la misma retina) no manifestaron una disminución significativa de QERC respecto a células no electroporadas (Figura 3E).
32 Identificación funcional de una nueva opsina como fotopigmento
Figura 3 Efecto del RNAi-pScop2 en la cantidad de fotopigmento de las células ciliadas
A) Serie de intensidad de ERC, B) 𝑄𝐸𝑅𝐶 en función de la intensidad de estimulación (unidades arbitrarias) ,
la flecha azul indica una intensidad de iluminación de 2.945 𝑋 1019 fotones/cm2*s. C) Separación del ERC
de la fotocorriente: ambos trazos han saturado 𝑄𝐸𝑅𝐶 , pero una intensidad mayor permite mayor separación. D) 𝑄𝐸𝑅𝐶 en una célula ciliada control (trazo rojo) y en una célula electroporada con pScop2-RNAi, día 2 (trazo negro). En ambos casos la intensidad de iluminación es la misma. E) Resumen del
efecto de pScop2-RNAi en fotoreceptores de Pecten irradians. La disminución de 𝑄𝐸𝑅𝐶 es ceñida a las células ciliadas.
Resultados 33
Viceversa, la especificidad de los efectos de la reducción de pScop2 fue corroborada demostrando que la ERC de fotoreceptores de tipo rabdomérico electroporados con pScop2-RNAi no era diferente a la de controles rabdoméricos electroporados con Dextran-FL 10kDa (Figura 3E).
Los datos presentados en la sección anterior demuestran sin ambigüedad que pScop2 subyace por lo menos en gran medida la corriente de foto-isomerización. Una conclusión definitiva de que pScop2 es en efecto el fotopigmento nativo requeriría demostrar además su competencia para estimular la proteína G, culminando en la activación de la fotocorriente. Ya se mencionaron las falencias de medir directamente la amplitud de la fotocorriente para este propósito. Sin embargo, existe un fenómeno fisiológico que en cambio es sensible a la cantidad de fotopigmento funcional y además involucra los efectores ‘cuesta abajo’ de la cascada de señalización de luz. Este fenómeno, discutido a continuación, depende críticamente del hecho de que el fotopigmento en cuestión sea bi-estable, como es el caso de los fotorreceptores ciliados de Pecten (Cornwall y Gorman, 1983; Arenas et al., Manuscrito en preparación).
Cuando un fotorreceptor ciliado de Pecten es estimulado con una luz de gran intensidad, que causa una gran acumulación de fotopigmento en el estado activo ‘M’, la fotocorriente resultante persiste durante un largo tiempo (la así llamada ‘post-corriente hiperpolarizante prolongada’, o PHA, por sus siglas en inglés: Prolonged Hyperpolarizing Aftercurrent). Esto se debe al exceso molar del fotopigmento sobre las demás moléculas de la cascada de señalización de luz, incluyendo las responsables de la terminación de la respuesta, como la arrestina: la luz azul es particularmente efectiva porque es fuertemente
absorbida por la rodopsina en estado inactivo (R; max 500 nm) mientras es pobremente
absorbida por el estado activado (M; max 570 nm). Por consiguiente, hay mucha
fotoconversión RM y muy pocas conversiones MR, produciendo una gran acumulación neta de metarodopsina (Cornwall y Gorman, 1983; Gómez y Nasi, 1994a).
La Figura 4A ilustra el fenómeno: destellos de luz azul de intensidad creciente producen fotocorrientes que gradualmente van adquiriendo una ‘cola’ prolongada, la cual refleja un déficit en la capacidad de terminar la activación de la cascada de transducción. Las corrientes prolongadas hiperpolarizantes de Pecten pueden perdurar hasta varios minutos (Figura 4B). Este fenómeno ha sido extensamente documentado en Limulus, Balaneus sp. y en Drosophila, donde puede durar varias horas después de que ha terminado el estímulo de luz (para una revisión, ver: Hillman et al, 1983).
Resulta sencillo demostrar que las corrientes prolongadas son causadas por activación masiva de fotopigmento, porque es posible terminarlas rápidamente aplicando un estímulo que foto-convierta M a R. En el caso de Pecten, una luz roja aplicada durante la PHA causa un retorno a la línea de base (Figura 4B).
Si pScop2 activa la cascada de señalización de luz, se predice que su reducción debería mermar las PHA: al haber una menor cantidad de fotopigmento, la arrestina tendría menos dificultad en inactivarlo, aún después de una fuerte luz azul.
Las células ciliadas electroporadas con pScop2-RNAi son incapaces de mantener un efecto de PHA tan pronunciado como las células control, mostrando una cinética más rápida del apagado de la cascada de transducción (Figura 4C). Estos resultados apoyan fuertemente la conjetura de que pScop2 es el fotopigmento fisiológicamente relevante de las células ciliadas.
34 Identificación funcional de una nueva opsina como fotopigmento
Figura 4 Efecto del RNAi-pScop2 en las Corrientes prolongadas hiperpolarizantes
de las células ciliadas
A) Estímulos de intensidad creciente causan respuestas cada vez más prolongadas (incremento
= 1.0 log). B) Terminación de una PHA por un destello de luz roja, el cual causa una
fotoconversion neta MR. C) PHA en una célula control (trazo rojo) y en una célula
electroporada con RNAi-pScop2 (𝑄𝐸𝑅𝐶 = 0.05 𝑝𝐶) (trazo negro).
Resultados 35
2.2 Expresión y función de pScop2 en un sistema heterólogo:
2.2.1 Activación de proteínas G en líneas celulares:
Estudiar la función de pScop2 en el sistema nativo no es la única forma de demostrar que pScop2 es un fotopigmento. Otra posibilidad es inducir fotosensibilidad a células no foto-sensibles mediante la expresión heteróloga de pScop2. Por supuesto esto requiere que la célula posea la maquinaria necesaria para responder a la activación de un fotopigmento implantado. Para escoger líneas celulares que sean apropiadas para expresar pScop2 heterólogamente éstas líneas celulares deben tener proteínas G cuya activación cause un proceso fisiológico medible. Se escogió inicialmente como proceso fisiológico la apertura o cierre de canales iónicos porque la corriente de membrana se puede monitorear con gran sensibilidad y resolución temporal. Se registraron corrientes de membrana de células de las líneas Neuro2A (N2A), HEK293 y CHO-K1 con la técnica de “patch clamp” en modalidad de célula entera. Se introdujo mediante diálisis al interior de las células por la micro-pipeta de registro, un análogo poco hidrolizable de GTP,
GTPγs. Este puede intercambiarse con el GDP acoplado a la sub-unidad de toda proteína G heterotrimérica en el estado inactivo, induciendo su activación; además,
siendo poco susceptible a la acción de GTP-asa endógena de G, la estimulación resultante es persistente (Dowling et al., 2004). En presencia de GTPγs, todas las líneas celulares registradas mostraron corrientes de entrada de amplitud variable (Figura 5), Las células controles registradas con una solución interna estándar no presentaron cambios de sus corrientes de membrana durante el intervalo de registro (Figura 5, trazos rojos). Esto significa que las líneas celulares son en principio, candidatos viables para expresar pScop2 y examinar posibles consecuencias electrofisiológicas de la iluminación.
2.2.2 Ensayos de expresión transitoria de pScop2-mRFP en líneas celulares
El vector pcDNA3-mRFP/pScop2, pScop2-mRFP (Arenas, 2013) el cual contiene la secuencia codificante de pScop2 unida en su extremo 3’ a la secuencia codificante para una proteína fluorescente roja monomérica, mRFP (Campbell, et A., 2002), se transfectó en las líneas celulares seleccionadas usando lipofectamina 2000 o lipofectamina LTX (Invitrogen). La expresión de la proteína codificada se evaluó a las 24-48 h usando microscopía de fluorescencia, la cual permitió determinar el porcentaje de células transfectadas y el patrón de expresión de pScop2. La razón para escoger mRFP como proteína fluorescente reportera es que puede ser estimulada con luz de una longitud de onda cercana al punto isosbéstico del fotopigmento (es decir, absorbida igualmente por la forma inactiva y la activa; Cornwall y Gorman, 1983) y por esta razón la identificación de las células transfectadas se puede llevar a cabo sin causar una gran acumulación de metarodopsina.
Las transfecciones con esta versión fusión de pScop2 mostraron que la localización de la proteína varía según la línea celular. Se detectó ubicación perinuclear, citoplasmática,
36 Identificación funcional de una nueva opsina como fotopigmento
concentración de la señal fluorescente en puntos pequeños del citoplasma y posiblemente en la membrana plasmática (Figura 6 A-C).
Figura 5 Diálisis de GTPγs en líneas celulares
Los trazos rojos muestran controles con solución interna, los trazos negros muestran
corrientes activadas por la estimulación no específica de proteínas G heterotriméricas
en células A) Neuro2A, B) CHO-K1 y C) HEK293.
Resultados 37
Figura 6 Transfección de pScop en líneas celulares
A) Células CHO-K1, vector pScop2-mRFP, B) Células Neuro2A, vector pScop2-mRFP, C) Células HEK293, vector pScop2-mRFP, D) Células HEK293, vector Scop2-BiRed
38 Identificación funcional de una nueva opsina como fotopigmento
2.2.3 Registros de Fotocorrientes en Células Transfectadas con pScop2-mRFP
La capacidad de pScop2 de conferir foto-sensibilidad a células no fotosensibles, se evaluó electrofisiológicamente, aplicando estímulos de luz y registrando corrientes de membrana en células transfectadas con pScop2-mRFP. Antes de los registros, las células transfectadas fueron incubadas con 11-cis o 9-cis retinal durante 1 h para reconstituir el fotopigmento (Frederiksen et al., 2012).
En general células transfectadas con pScop2-mRFP fueron incapaces de responder a un estímulo de luz de longitud de onda azul o roja (470nm y 625nm respectivamente). Sus corrientes de membrana no cambian en el tiempo y son indistinguibles de los registros de células control no transfectadas (Figura 7).
2.2.4 Ensayos de expresión transitoria de pScop2-BiRed en líneas celulares
El vector pScop2-mRFP produce una versión de pScop2 que tiene una proteína fluorescente unida a su extremo C terminal, la cual podría interferir con su función al presentar un impedimento estérico (Campbell et Al., 2002; Hammond et Al., 2010). Para descartar esta posibilidad se transfectaron células con el vector de expresión pScop2-BiRed.
Éste es un vector bicistrónico que codifica una versión de pScop2 cuyos codones han sido optimizados para expresión en líneas celulares humanas, y una proteína roja fluorescente monomérica bajo el control del mismo promotor (Diseñado y construido por Oscar Arenas). La secuencia codificante de esta versión de pScop2 fue sintetizada in-Vitro (GeneWiz) y, al igual que el vector pScop2-mRFP, está basado en el vector de expresión, pcDNA3-mRFP1 (Addgene, Cambridge MA).
Figura 7 Registro de células transfectadas con pScop2-mRFP
Trazo representativo de las células transfectadas con pScop2-mRFP, no hay cambio en la
corriente de membrana ante un estímulo de luz azul o roja.
Resultados 39
Las transfecciones con el vector bicistrónico en células HEK muestran un patrón homogéneo de fluorescencia de mRFP (Figura 6D) lo cual es de esperarse porque el reportero fluorescente se expresa como proteína soluble, separadamente del fotopigmento . Para determinar la ubicación de pScop2 en células transfectadas con el vector bicistrónico se aprovechó el hecho de que la secuencia de pScop2 insertada en este vector contiene dos epítopes FLAG (es decir, la secuencia codificante para DYKDDDDK) en su extremo 3,’ por lo que es posible detectar la localización de pScop2 con anticuerpos anti-FLAG. Por lo tanto, se hizo una localización por inmunocitoquímica con anticuerpos primarios de ratón anti-FLAG y anticuerpos secundarios fluorescentes anti-Ratón (Alexa 488) en células HEK293 transfectadas transitoriamente. Los resultados muestran que sólo hay detección de pScop2 en células que tienen señal de mRFP, indicando que hay una correlación entre la expresión de proteína fluorescente roja y expresión de pScop2 (Figura 8A), como es de esperarse. La señal del anticuerpo secundario muestra que la localización de la proteína es diversa, e incluye una fracción citoplasmática, una peri-nuclear y una de membrana plasmática. (Figura 9).
Figura 8 Expresión de pScop2-BiRed en células HEK293
A) Detección de pScop2 por anticuerpos X-FLAG. Las células positivas para la inmunocitoquímica también expresan mRFP. B) Detección de pScop2 por western blot con anticuerpos X-FLAG, la banda de ~60kDa solo se detecta en el carril de células transfectadas (T), esto es evidente en la diferencia en los perfiles de banda de cada carril (paneles superiores).
Para la confirmación de la expresión de pScop2-FLAG en células HEK293 se hizo un SDS PAGE y Western-Blot de células transfectadas, usando un anticuerpo primario de ratón anti-FLAG y un anticuerpo secundario anti-Ratón acoplado a fosfatasa alcalina. Se detectó una banda de aproximadamente 60 Kda en el carril de células transfectadas pero no en el carril de células control (Figura 8B).
40 Identificación funcional de una nueva opsina como fotopigmento
2.2.5 Registros de fotocorrientes en líneas celulares transfectadas establemente con pScop2-BiRed
Inicialmente, para registrar posibles foto-corrientes en células transfectadas con pScop2-mRFP, fue necesario identificar las células positivas para la expresión del pigmento por microscopía de fluorescencia. Aunque el uso de mRFP para identificar células transfectadas es menos deletéreo que otras alternativas que requieren una longitud de onda de excitación más corta, (como la GFP), de todas maneras implica irradiación con luz intensa, lo cual podría causar una de-sensibilización o el blanqueamiento del fotopigmento expresado.
Para resolver este problema, se decidió generar líneas celulares que expresaran establemente el vector pScop2-BiRed. Esto produciría una población que expresa uniformemente el fotopigmento, obviando la necesidad de seleccionar la célula-blanco por microscopía de fluorescencia. Para este fin se hicieron transfecciones transitorias y se seleccionaron colonias fluorescentes provenientes de células únicas usando G148, dado que el plásmido confiere resistencia a este antibiótico. El resultado de un proceso de selección para células HEK293 transfectadas establemente con pScop2-BiRed se muestra en la figura 10.
Figura 9 Localización de pSco2 en la membrana plasmática en células HEK293
Al menos una fracción de pScop2 está presente en la membrana. Los perfiles de línea (paneles del lado derecho) muestran la coincidencia espacial de la señal fluorescente con el núcleo (N) y la membrana (MP) en la imágen de DIC.
Los perfiles de línea se trazaron a lo largo de la línea amarilla.
Resultados 41
Figura 10 Transfección estable de pScop2-BIRed en células HEK293 Después de un proceso de
selección con G148, todas las células expresan establemente el vector pScop2-BiRed. Los controles son
células no transfectadas.
Se hicieron registros electrofisiológicos en células N2A y HEK293 transfectadas establemente e incubadas con el cromóforo, y en algunos casos se observó un cambio en la corriente de membrana al aplicar un estímulo de luz azul (Figura 11), indicando una posible inducción de fotosensibilidad. Las fotocorrientes fueron de amplitud modesta (50-150 pA), tenían una latencia variable entre 3-28s. Estas respuestas sólo se obtuvieron en pocas instancias (n=5), del total de ensayos, mostrando poca reproducibilidad.
Figura 11 Registro de fotocorrientes en
células establemente transfectadas con
pScop2-BiRed
Se muestran ejemplos de posibles corrientes
activadas por luz azul en células HEK293 y
Neuro2A.
42 Identificación funcional de una nueva opsina como fotopigmento
2.2.6 Intercambio de dominios ICL3 entre pScop2 y pScop1: acoplamiento a una proteína Gq
Uno de los posibles problemas asociados a la falta de fotosensibilidad en las células transfectadas con pScop2 podría ser un acoplamiento defectuoso entre la opsina y la(s) proteína(s) G endógena(s) del sistema heterólogo. Es conocido que un receptor puede estimular varios tipos de proteínas G (Brydon, et Al., 1999; Francken et Al., 2002; Hsu y Luo, 2007; Liu et Al., 2014), pero la promiscuidad funcional entre diferentes receptores de 7 dominios trans-membrana y diferentes clases de proteínas G es limitada, y en algunas instancias no se detecta interacción alguna (Francken et al., 2000; Beadling, et Al., 1999). Nativamente pScop2 se acopla a una proteína G de tipo “o”. Las células HEK293 expresan el ortólogo humano de Go, según se determinó por microarreglos, en cuyo caso no hay garantía de expresión de la proteína (Francken, et Al. 1998; Brydon, et Al., 1999); lo mismo ocurre en una línea celular de neuroblastoma de ratón similar a N2A (Oh y Schnitzer, 2001). Sin embargo la secuencia de aminoácidos de Go de Pecten difiere en un 22 % del ortólogo humano GNO1, por lo cual no hay garantía de acoplamiento entre pScop2 y esta proteína G. Sería factible, como posible solución, co-expresar pScop2 conjuntamente con la proteína Go nativa de las células ciliadas de Pecten irradians (la cual ha sido clonada en el laboratorio; Gómez et al., 2008; Arenas et. Al. Manuscrito en preparación). Sin embargo, un problema aún mayor es que aunque la activación de pScop2 lograra estimular Go, no hay evidencia de que esto pueda resultar en la apertura o cierre de canales iónicos: de hecho, con la excepción de las células bipolares tipo “ON” de la retina, los efectores de Go son desconocidos en mamíferos (Dhingra, et Al., 2004).
Los datos de diálisis de GTPγs demuestran que en todas las líneas celulares examinadas hay corrientes iónicas acopladas a la activación de proteínas G, pero no establecen su identidad. Hay evidencia de la expresión de Gq y la existencia de receptores endógenos acoplados a esta proteína, cuya activación causa la liberación de calcio intracelular y activación de corrientes iónicas en dos de las líneas celulares escogidas para la expresión de pScop2 (Atwood et al., 2011; Mundel y Benovic, 2000, Luo et al., 2008). Por lo tanto, una opción es modificar la secuencia de pScop2 para mejorar su acoplamiento a Gq.
Esto se podría lograr intercambiando dominios de la proteína que han sido implicados en establecer la especificidad de interacción entre receptores 7DTM y diferentes sub-clases de proteínas G heterotriméricas (MacKenzie et al., 1993; Hirsch et al., 1996; Yin et al., 2004). Este acercamiento ha sido exitoso con otras opsinas en ensayos in-vitro (Terakita et al., 2002). Para este fin fue necesario identificar la región de pScop2 a ser eliminada, y una secuencia de otro receptor 7DTM que la reemplazara. Existe gran evidencia de la importancia del tercer loop intracelular (ICL3, por sus siglas en inglés; Cotecchia et al., 1992; Blin et al. 1995, Greasley et al. 2001), para dictar la especificidad de la interacción receptor-Proteína G.
Para intentar mejorar la capacidad de pScop2 de acoplarse con una proteína G de tipo “q”, se transplantó el tercer loop intracelular (ICL3) de la opsina de tipo R, pScop1, la cual se expresa en los fotorreceptores rabdoméricos de la capa proximal de la retina de Pecten. Al igual que en otros fotorreceptores de este linaje, la activación de pScop1 está acoplada a la estimulación de una proteína Gq y cuyo efector es una vía de señalización dependiente de PLCβ que causa liberación de calcio de depósitos intracelulares y la apertura de canales iónicos (Gómez y Nasi, 2005b). Estas propiedades han sido explotadas en ensayos de expresión heteróloga de otros fotopigmentos de tipo R: Tres fotopigmentos de la familia de la melanopsina provenientes del Tiburón elefante
Resultados 43
(Callorhinchus mili) y del Humano (Homo Sapiens) han sido expresados funcionalmente en células Neuro2A (N2A) y su activación resultó gatillar corrientes iónicas de entrada (Davies, et al., 2012., Melyan, et Al., 2005). Otra variante de la melanopsina, proveniente de ratón (Mus musculus) ha sido expresada funcionalmente en células HEK293 y su activación, acoplada a la activación de una proteína Gq y PLC, causa incrementos intracelulares de calcio y la apertura de canales iónicos (Qiu, et. Al., 2005).
El análisis de secuencias de diferentes fotopigmentos acoplados a proteínas Gq, incluido pScop1, muestra que hay gran conservación del ICL3 a nivel de aminoácidos, lo cual hace plausible que el constructo quimérico pScop2/Icl3-pScop1 podría acoplarse a una proteína Gq endógena del sistema heterólogo (Figura 12C).
Figura 12 ICL3
A-B) Perfiles de hidrofobicidad de pScop2 (A) y pscop1 (B), las regiones identificadas como ICL3
están señaladas con una barra negra. C) El alineamiento de multiples opsinas de tipo R
acopladas a Gq revela gran conservación del ICL3.
44 Identificación funcional de una nueva opsina como fotopigmento
Los ICL3 de pScop1 y pScop2 fueron identificados por medio de perfiles de hidrofobicidad basados en el método de Kyte-Doolittle, con una ventana de 18 residuos. Este método bioinformático permite predecir las regiones hidrofóbicas e hidrofílicas de proteínas y su efectividad ha sido verificada con datos de estructuras cristal y difracción de rayos X (Kyte y Doolittle, 1982). Se usaron las secuencias de aminoácidos predichas a partir de las secuencias de nucleótidos clonadas en el laboratorio (Arenas, 2013; Datos no publicados). Para pScop1 se escogió una región de 123 nucleótidos que ocupa las posiciones 682-804 en el ORF de esta opsina y está ubicada en el tercer bucle intracelular de pScop1 (Figura 12 B).
Para pScop2 se escogió un fragmento equivalente, en términos del perfil de hidrofobicidad (Figura 12A), localizado entre los nucleótidos 643-725 del ORF de pScop2. Desde la clonación inicial de Scop2 se había identificado la divergencia en esta región de la proteína al compararla a otras opsinas de las clases R y C (Kojima, et Al., 1997). Adicionalmente, se ha demostrado la importancia de este ICL3 de Scop2 en la capacidad de activar una proteína Go al ser implantado en un constructo quimérico de Rodopsina bovina, medido in-vitro (Terakita et Al., 2002).
La estrategia para generar esta versión quimérica de pScop2 acoplado a Gq, denominado pScop2-Gq, consistió en: 1) amplificar el ICL3 de pScop1 (ICL3-Gq) por PCR “touch-up”, añadiendo sitios de restricción en ambos extremos para permitir la correcta inserción direccional del producto en un vector, 2) Eliminar el ICL3 de pScop2 (ICL3-Go) usando PCR inversa “touch-up” (Erster y Liscovitch, 2010), añadiendo los mismos sitios de restricción que en el caso de ICL3 de pScop1, y 3) Ligar los productos doblemente digeridos para insertar el ICL3-Gq en el producto de PCR de pScop2 cuyo ICL3-Go ha sido eliminado.
Se usaron los primers Gq_ICL3_BmtI_Fwd y Gq_ICL3_AgeI_Rev (Ver: métodos) para amplificar el ICL3 de pScop1 a partir de 4 fuentes diferentes de cDNA: 3 plásmidos que contenían parte de la secuencia de pScop1, resultado de amplificaciones anteriores y, una librería de cDNA 5’ Race ready de la retina de Pecten irradians. Se usó un protocolo de PCR con “Touch up” y gradiente de temperatura para obtener productos de PCR del ICL3-Gq que contuvieran los sitios de restricción BmtI y AgeI (New England Biolabs) en los extremos 5’ y 3’ del ICL3-Gq, respectivamente. Todas las reacciones fueron exitosas y amplificaron una banda limpia del peso esperado (Figura.13A.). Dos de estos productos, provenientes de fuentes independientes fueron purificados, ligados en el vector de clonación pGemT-easy (Promega) y transformados en bacterias competentes JM109 de alta eficiencia (Promega).
Se verificó la presencia del producto de PCR en las colonias bacterianas mediante PCR de colonia, con los mismos primers que lograron la amplificación del ICL3, y por análisis de restricción con EcoRI. Cuatro de los plásmidos que mostraron presencia del producto adecuado fueron enviados a secuenciar, y uno de los que mostró la secuencia adecuada fue escogido para los experimentos posteriores (Figura 13B-C).
Se usaron los primers Go_ICL3_AgeI_pScop2_Fwd y Go_ICL3_BmtI_Rev para eliminar el ICL3-Go de pScop2 por PCR inversa con “Touch-UP”. Este procedimiento requiere una fuente circular de DNA para lograr la amplificación, por esta razón se decidió usar el vector de expresión pcDNA3-mRFP-pScop2 para este propósito. El tamaño esperado del producto de PCR supera los 7 Kb, demasiado grande para clonarlo en vectores convencionales como pGemT-easy. Por esta razón y para minimizar los errores de la
Resultados 45
polimerasa, se decidió usar una enzima de alta fidelidad, con ‘Hot Start’ y con proofreading (actividad exonucleasa 5’-3’) denominada KOD (EMD).
Figura 13 Intercambio de dominios ICL3 – Construcción de pScop2-Gq
A) Amplificación por PCR del ICL3 de pScop1, (producto esperado 146 pb). Las flechas indican los productos purificados y
transformados en bacterias. B) PCR de colonia de bacterias transformadas con los productos obtenidos en (A) (Producto
esperado 146 pb). C) Análisis de restricción con EcoRI de los plásmidos obtenidos de las bacterias usadas en (B), banda
esperada a 146 pb. D) Eliminación del ICL3 de pScop2-mRFP por PCR inversa. E) PCR de colonia de bacterias transformadas
con la reacción de ligación entre ICL3_Gq y el producto de PCR inversa de pScop2-mRFP (Producto esperado, 146 pb). F)
Análisis de restricción de los plásmidos obtenidos de las bacterias usadas en (E) muestra los productos esperados: E1-850pb y
E2-630pb indicando la correcta modificación del ICL3 de pScop2-mRFP. Esto fue confirmado por secuenciación de B1 y B2.
46 Identificación funcional de una nueva opsina como fotopigmento
La reacción de PCR amplificó un producto de alto peso molecular, que fue separado por electroforesis en un gel de agarosa y purificado por centrifugación con lana de vidrio silanizada y el método de Fenol-Cloroformo (Figura 13D).
Éste producto purificado de PCR y el plásmido pGEMT-easy que contenía la secuencia correcta para el ICL3-Gq de pScop1 fueron digeridos con BmtI y AgeI y separados por electroforesis. Las bandas deseadas fueron purificadas del gel (Banda de alto peso molecular para pScop2, purificada por centrifugación con lana de vidrio y precipitación con etanol. Banda de ~150 pb para el ICL3-Gq, purificada con un kit comercial) y ligadas a 4 °C durante 12 horas con T4 Ligasa (Promega).
Se transformaron bacterias competentes JM109 con esta reacción de ligación y se verificó la presencia del vector pcDNA3-mRFP-pScop2-Gq (pScop2-Gq) en 10 colonias seleccionadas por PCR de colonia. Para 8 de las 10 colonias, se logró amplificar la banda esperada para el ICL3-Gq (146 pb) (Figura 13E). De estas, se escogieron 3 para hacer un análisis de restricción con dos combinaciones de enzimas, escogidas para liberar segmentos de DNA únicamente en caso de la presencia del ICL3-Gq en la secuencia de pScop2.
Los 3 plásmidos escogidos, denominados B1, B2 y B3, liberaron las bandas esperadas en el análisis de restricción (Figura 13F). Se escogieron los plásmidos B1 y B2 para secuenciación, que confirmó la presencia del ICL3 en la posición correcta dentro de pScop2, la eliminación del ICL3-Go de pScop2 y un 100% de identidad, a nivel de aminoácidos, con la secuencia predicha para este nuevo vector de expresión.
2.2.7 Ensayos de expresión heteróloga de pScop2-Gq
Se hicieron transfecciones transitorias del vector pScop2-Gq en células HEK293 para verificar el patrón de expresión de la proteína. La examinación microscópica a las 24 horas post-transfección muestra un patrón de fluorescencia indistinguible respecto al vector pcDNA3-mRFP1/pScop2 (Figura 14A).
Como ensayo fisiológico se eligió medir posibles incrementos de calcio intracelular gatillados por un estímulo de luz aprovechando la vía endógena de Gq/PLCβ de las células HEK-293, que conlleva a la síntesis de IP3 (Inositol tri-fosfato) y a la liberación de calcio de depósitos intracelulares (Neves et al., 2002). .
Estas mediciones se hicieron con un indicador fluorescente de calcio, Fluo4 (Kd= 0.37µM), en células individuales. Para medir el nivel de fluorescencia, es necesario estimular el indicador con luz azul (λ max= 495), que está muy cerca del pico de absorción de la forma inactiva de pScop2, R y necesariamente estimularía también pScop2. Para minimizar el impacto de la luz de epifluorescencia sobre el fotopigmento se utilizó un registro discontinuo, en el cuál los periodos de estimulación eran muy breves (40 ms) y espaciados en el tiempo (2 seg), de tal forma que el estímulo de luz para medir fluorescencia sólo esté encendido una fracción muy pequeña del tiempo (2% en nuestras condiciones experimentales). El análisis de los breves períodos de iluminación permite extraer la señal de fluorescencia para construir una serie de tiempo. Esta estrategia ha sido exitosa en estudios de células bipolares y horizontales de la retina de pollo (que expresan Melanopsina), donde se ha demostrado que estímulos breves no alcanzan a causar un incremento de calcio (Hernández, 2013; Ramírez, 2014). La razón es que, a diferencia de los fotoreceptores visuales, los niveles de expresión de fotopigmento son
Resultados 47
muy bajos (comparados con el indicador fluorescente, que puede acumularse a grandes concentraciones) y por lo tanto se puede obtener una señal de fluorescencia de calcio en condiciones en las que la probabilidad de absorción por parte del fotopigmento es baja. El nivel de expresión de pScop2-Gq en líneas celulares también es muy bajo, juzgando por la modesta señal del reportero fluorescente (Figura.14A), lo cual sugiere que se cumplen los requisitos para implementar el mismo acercamiento.
Esta estrategia de registro discontinuo permite medir cambios de calcio con una cinética lenta, en el orden de varios segundos, similar al curso temporal de las respuestas que han sido obtenidas con la expresión heteróloga de fotopigmentos animales acoplados a proteínas Gq en líneas celulares (Melyan, et. Al., 2005, Qiu, et. Al., 2005; Davies, et al., 2012). La fotorespuesta nativa de los fotorreceptores ciliados de Pecten es más rápida, con un curso temporal del orden de 1 segundo; sin embargo, esta velocidad depende de los efectores del proceso de transducción, que difieren de los elementos presentes en el sistema heterólogo. Por esta razón era razonable pensar que la estrategia de registro podría funcionar en células transfectadas con pScop2-Gq.
Figura 14 Expresión de pScop2-Gq y ensayos de fluorescencia de calcio
A) El vector pScop2-Gq/mRFP fue transfectado transitoriamente en células HEK293. La baja
expression de la proteína es evidente al requerir alta exposición para registrar su patrón de fluorescencia (Exposición ~10 veces mayor que para pScop2/mRFP). B) Las células
transfectadas con pScop2-Gq mostraron incrementos de fluorescencia de calcio al recibir un estímulo intenso de luz (barra azul) sólo al ser incubadas con 11-cis-retinal. La incubación con 9-cis- retinal no logró inducir fotosensibilidad.
48 Identificación funcional de una nueva opsina como fotopigmento
El protocolo implicaba registrar el nivel basal de calcio con varios pulsos breves y
espaciados de epi-iluminación, luego aplicar una luz continua durante 10-15 segundos
con el propósito de estimular pScop2, y reanudar el régimen pulsado para monitorear
posibles cambios de calcio. Los registros muestran que una fracción grande de las
células registradas (57%) mostraron incrementos de calcio intracelular gatillados por un
estímulo intenso de luz azul (Figura 14B). Los controles no mostraron incremento alguno
de calcio intracelular al recibir el mismo estímulo (a excepción de un registro anómalo,
con fluorescencia basal 10-40 veces mayores que el resto de las células, indicativo de
altos niveles basales de calcio y mal estado fisiológico). Estos incrementos de calcio sólo
ocurrieron cuando las células fueron incubadas con 11-cis retinal para promover la
reconstitución del fotopigmento. Los registros en células transfectadas con pScop2-Gq,
incubadas con 9-cis retinal no lograron reproducir las respuestas observadas.
3. Discusión
El estudio de la foto recepción, en términos fisiológicos, ha sido ceñido a unos pocos organismos modelo, particularmente Drosophila, Limulus y algunos vertebrados (Rana, roedores y primates). Estos estudios han establecido dos cascadas de fototransducción divergentes que han sido asociadas a dos tipos morfológicos: 1) fotoreceptores ciliados – comúnmente encontrados en animales vertebrados, donde está involucrada una proteína Gt, PDE, disminución de la concentración de nucleótidos cíclicos y cierre de canales iónicos que conlleva a una hiperpolarización-, y 2) fotoreceptores rabdoméricos – asociados a animales invertebrados, donde la transducción es mediada por una proteína Gq, PLC y la apertura de canales iónicos, que causan una despolarización de la membrana-.
La clonación de fotopigmentos en Drosophila (O’Tousa et al., 1985) y en la vaca (Nathans y Hogness, 1983) ha dilucidado divergencias grandes en la secuencia de estos fotopigmentos y ha constituido los miembros fundadores de dos familias de opsinas: opsinas R y opsinas C, respectivamente. Esta dicotomía ha sido reforzada por la determinación de la estructura de las proteínas que forman los fotopigmentos asociados a las células ciliadas y rabdoméricas; sin embargo, estos estudios tampoco han tenido una representación taxonómica grande y han estado limitados a sistemas que permiten extraer grandes cantidades de proteínas: el calamar, Todarodes pacificus, (Murakami y Kouyama, 2008) y la vaca (Palczewski et al., 2000).
El estudio estructural de los ojos, por otra parte ha tenido una representación taxonómica mucho más diversa, particularmente en animales invertebrados, donde ha habido numerosas investigaciones morfológicas, histológicas, de óptica y de desarrollo (Land y Nilsson, 2012; Schwab, 2012). Estos estudios muestran que existe una gran diversidad en las adaptaciones, las funciones y en general la forma de captar la luz por estos órganos especializados. Sin embargo, a nivel celular esta diversidad se ve reducida nuevamente a los dos esquemas canónicos morfológicos (células ciliadas en ojos de animales deuterostomados y rabdoméricas para protostomados), reforzando la noción de que las células ciliadas y las células rabdoméricas realmente representan dos caminos con origen evolutivo independiente (Fein y Szuts, 1982).
A pesar de esto, hay contradicciones a esta segregación taxonómica que sugieren que ambos tipos celulares estaban presentes en Urbilateria. Primero, el descubrimiento del factor de transcripción Pax6, y de patrones de expresión génica compartidos en el desarrollo de los ojos en todos los grupos animales sugiere que estos tipos celulares son homólogos (Nilsson, 2005). Esto predice la existencia de animales protostomados y deuterostomados con ambos tipos de células fotosensibles, una hipótesis que ha sido comprobada en bivalvos (Barber et al., 1967), un gusano (Arendt et al., 2004) y ha sido propuesta en Branchiostoma (Ruiz y Anadón, 1991b). Adicionalmente, el descubrimiento
50 Identificación Funcional de una nueva opsina como fotopigmento
de ambos tipos de fotoreceptores en Cnidarios (Fain et al., 2010) propone un origen anterior a Urbilateria para estos dos linajes de células.
El advenimiento de las técnicas de secuenciación de nueva generación ha permitido extender el estudio de las secuencias de los elementos de fototransducción a grupos animales poco estudiados fisiológicamente y molecularmente. Estos estudios han mostrado que, además de las opsinas de tipo C y R, existen grupos novedosos de fotopigmentos, entre los cuales se cuentan las opsinas de grupo 4 (Gr4) y las Cnidopsinas (Opsinas expresadas en Cnidaria con funciones y propiedades desconocidas) (Porter et al., 2011) abriendo la posibilidad de la existencia de cascadas de fototransducción novedosas.
Tal puede ser el caso del bivalvo Pecten irradians. Este animal posee, además de fotoreceptores rabdoméricos convencionales, células ciliadas foto-sensibles con características fisiológicas que se alejan de las propiedades de los conos y bastones de los vertebrados: se ha demostrado funcionalmente el papel de elementos de transducción novedosos como una Guanilato Ciclasa (Gómez y Nasi, 1995), una proteína Go (Gómez y Nasi, 2000; Arenas et al., Manuscrito en preparación) y canales iónicos con propiedades diferentes a los canales de luz de las células ciliadas vertebradas (Gómez y Nasi, 1994a). Adicionalmente, se ha demostrado la expresión de una opsina putativa de grupo 4 en estas células, denominada pScop2.
Este trabajo consistió en evaluar: 1) el papel de pScop2 en la cascada de transducción de las células ciliadas y, 2) su función como fotopigmento. Si esta proteína estuviera involucrada en la cascada de transducción, esto constituiría la primera evidencia de la función de una opsina de grupo 4 acoplada a Go. Estudios anteriores del ortólogo de pScop2, Scop2, se habían enfocado en estudios histológicos de expresión y predicciones bioinformáticas (Kojima et al., 1997) o alternativamente, en estudios In-Vitro de proteínas quiméricas (Terakita et al., 2002) pero ninguno ha logrado demostrar su función In-Vivo,.
Inicialmente, para evaluar el papel de esta proteína en la fototransducción se intentó interferir con su función usando anticuerpos generados con un péptido sintético proveniente del tercer bucle intracelular de pScop2, una región involucrada en la interacción con proteínas G. Este acercamiento ha sido exitoso en otros contextos, como por ejemplo para demostrar el papel de la arrestina en estas células (Gómez et al., 2011). En el caso de pScop2, el efecto esperado es un posible impedimento estérico a la transducción, el cual debería reflejarse en una disminución de la fotosensibilidad de la célula en el tiempo.
Sin embargo, la diálisis de anticuerpos anti-pScop2 no causó una disminución en la foto-respuesta. A pesar del resultado negativo eso no descarta que pScop2 sea el fotopigmento de estas células, por dos motivos principales, mencionados anteriormente: la incertidumbre de que el anticuerpo pueda efectivamente causar un bloqueo estérico de la transducción (por la falta de conocimiento detallado de los determinantes estructurales del sitio de interacción Opsina-Proteína G) y, el hecho de que monitorear la fotocorriente sea un indicador poco adecuado para observar un cambio de foto-sensibilidad. Este último factor se debe a la gran expresión de fotopigmento (que se esbozó como una necesidad para lograr alta sensibilidad), mucho mayor que la de los otros elementos de la cascada de transducción, los cuales actúan catalíticamente (e.g. Canales iónicos, enzimas involucradas en fototransducción como fosfodiesterasas, ciclasas, etc). Por consiguiente, sólo es necesario activar una pequeña fracción del fotopigmento para lograr la máxima respuesta fisiológica posible: Esto es exactamente lo que muestran
Discusión 51
estudios en sistemas vertebrados e invertebrados. En Limulus, el cangrejo de Herradura, este fenómeno llega a niveles extremos, requiriendo la activación de 1 de cada ~ 600,000 moléculas de fotopigmento para lograr una respuesta saturante. Esta fracción diminuta constituye apenas ~400 moléculas de fotopigmento, de las 1600 millones disponibles (Brown y Coles, 1979; Lisman y Bering 1977).
En las células ciliadas de Pecten irradians, el exceso de fotopigmento respecto a los efectores fisiológicos de la respuesta, los canales activados por la luz, está en el rango de un factor de ~4200-7000, según se derivó del tamaño máximo de las foto-corrientes (3-5nA a Vm= -30mV), la conductancia individual de los canales (26 pS, ~1.35pA con 50mV de fuerza motriz), la probabilidad de apertura de los canales en condiciones saturantes (Po=0.27)(Gómez y Nasi, 1994a) y el número total de moléculas de fotopigmento en estas células, calculado a partir de la carga máxima desplazada durante la fotoisomerización (1.3 pC) y la carga elemental desplazada en varios fotopigmentos animales (0.14e) (Ferrer et Al., 2012).
Fisiológicamente, este desbalance es exacerbado por los pasos enzimáticos intermedios que imparten amplificación a la señal, al punto que un solo fotopigmento isomerizado es capaz de causar una respuesta macroscópica detectable (Yau et al., 1977; Baylor et Al., 1979, Brown y Coles, 1979; Wong, 1978).
Por lo tanto, un fotorreceptor es capaz de responder normalmente, incluso cuando una fracción significativa de su pigmento ha sido eliminada. Aunque de todas formas ocurriría una disminución de la foto-sensibilidad, el efecto al ser modesto, fácilmente pasaría desapercibido
Estas dificultades fueron eliminadas al medir directamente los concomitantes eléctricos de la isomerización que la luz produce en el fotopigmento; para este fin se acudió a una reducción física de la cantidad de pScop2 expresado (mediante siRNA), en lugar de intentar interferir funcionalmente con su interacción con proteínas G. Los resultados demostraron la capacidad de pScop2 de foto-isomerizarse y contribuir a la corriente de desplazamiento, ERC, la primera manifestación de la fotosensibilidad.
La disminución en Qerc en las células ciliadas fue parcial; la explicación más plausible es que en las células tratadas con el RNAi no se eliminó por completo pScop2. Hay dos razones para pensar esto: 1) La eficiencia de silenciamiento de transcritos por RNA es altamente variable, en algunos casos puede alcanzar más del 90% pero en otros no supera el 2% de reducción en la expresión del gen (Primrose y Twyman, 2006), 2) el protocolo de cultivo post electroporación y exposición a la luz cada 24 horas fue diseñado para permitir el recambio de la maquinaria fotosintética, sin embargo no se conoce el tiempo de vida media del fotopigmento de estas células y en otros organismos varía, desde un recambio masivo con el ciclo circadiano (Chamberlain y Barlow, 1984), hasta ~2 semanas para la desaparición de fotopigmentos recién sintetizados en ratas, 10 días para ratones y 7 semanas para ranas (Young, 1967). En consecuencia, aún con bloqueo completo de la síntesis de nuevas opsinas, las existentes podrían permanecer durante un tiempo considerable. Finalmente, es poco probable que otras moléculas, fuera de pScop2, sean responsables por la corriente residual de foto-isomerización después del tratamiento con siRNA, porque la disminución de la ERC no fue acompañada en un cambio de cinética, únicamente en una reducción en su magnitud.
Aunque esta disminución en Qerc únicamente demuestra que pScop2 es capaz de foto-isomerizarse, existen razones para creer que el ERC es la manifestación física de la activación del pigmento involucrado en la cascada de transducción de las células
52 Identificación Funcional de una nueva opsina como fotopigmento
ciliadas: existe evidencia previa, de estudios espectrales del ERP (Cornwall y Gorman, 1983) que muestran una correspondencia entre el espectro de absorción del fotopigmento, medido por ERP y el espectro de fotosensibilidad de estas células en términos de su respuesta fisiológica.
Sin embargo, es fundamental obtener evidencia de la capacidad de pScop2 de estimular una proteína G. Esto se demostró al evaluar el impacto de la electroporación de pScop2-RNAi en las corrientes prolongadas hiperpolarizantes (PHA), las cuales, contrariamente a las fotocorrientes producidas por luces de intensidad corriente, requieren la activación de grandes cantidades de fotopigmento, y por lo tanto son sensibles a su reducción.
Los resultados obtenidos constituyen evidencia robusta de la función de pScop2 como el fotopigmento de estas células en Pecten irradians. Esta conclusión es apoyada por los datos de expresión específica de pScop2 en las células ciliadas de la retina de este animal (Arenas et Al., 2013), por los análisis bioinformáticos, que sitúan a pScop2 y a su ortólogo de Patinopecten yessoensis en un grupo novedoso de opsinas acopladas a Go
(Kojima, et Al., 1997; Arenas et Al. 2013), la cual es la proteína G involucrada en la cascada de transducción de éstas células (Kojima, et Al., 1997; Gómez y Nasi, 2000; Terakita et Al., 2002; Arenas et. Al, Manuscrito en preparación).
Los datos del presente estudio constituyen la primera evidencia de la función de una opsina de grupo 4 en su sistema nativo y fortalecen la noción de la existencia de una cascada de transducción novedosa que difiere radicalmente de los sistemas canónicos en cuanto al tipo de opsina, proteína G, enzima de transducción, cambio en concentración de mensajero secundario y canales iónicos involucrados.
Para un análisis detallado de las propiedades y los mecanismos de señalización de este novedoso fotopigmento, sería ventajoso poder llevar a cabo mediciones en un sistema controlado, exento de algunas de las complejidades presentes en las células nativas. Por ejemplo, se podría purificar la proteína y reconstituirla in-Vitro para estudios espectrofotométricos, o de interacciones con otras moléculas de señalización. Sin
embargo, la cantidad minúscula de tejido relevante (sólo 10 000 fotorreceptores ciliados por retina) hace este acercamiento poco viable. Una alternativa apetecible es obtener expresión heteróloga en líneas celulares de vertebrados, lo cual podría permitir tanto estudios funcionales en un sistema hospedero más simple (incluyendo modificaciones genéticas o fusión con proteínas fluorescentes para estudios de interacciones por medio de FRET), como la purificación técnicamente sencilla del fotopigmento para análisis in vitro, al añadirle una marca (TAG) que permita su separación en una matriz de afinidad. Hay que recalcar, sin embargo, que la expresión heteróloga de fotopigmentos de invertebrados (de tipo R) ha resultado ser notoriamente problemática (Knox et al., 2003); sorprendentemente, pScop2 resultó viable para ser implantado en diversas líneas mamíferas, según se verificó por medio de un reportero fluorescente y Western blot. En cuanto a reconstitución funcional, sin embargo, hubo dificultades: al reconstituir el fotopigmento mediante incubación con diversos cromóforos derivados del retinal y llevar a cabo mediciones de corrientes de membrana por ‘patch clamp’ sólo en una pequeña fracción de los casos se observaron indicios de corrientes gatilladas por foto-estimulación. El principal obstáculo probablemente es el acoplamiento a la proteína G endógena de la célula hospedera. Debido a que en células HEK293 se ha documentado la presencia de una Gq, y la posibilidad de activar corrientes iónicas y transientes de calcio mediante estimulación de receptores acoplados a ella, se desarrolló un constructo quimérico que pudiese superar esta dificultad. Para este fin se aprovechó el hecho de
Discusión 53
que la misma retina de Pecten contiene fotorreceptores rabdoméricos, cuya rodopsina tipo R (pScop1, acoplada a Gq) había sido previamente clonada en el laboratorio. Se reemplazó el tercer bucle intracelular de pScop2 con el tramo correspondiente de pScop1; esta porción contribuye a establecer la especificidad de interacción del receptor con diferentes proteínas G heterotriméricas. El acercamiento de expresión heteróloga mostró la capacidad de la quimera pScop2-Gq de causar incrementos de calcio en respuesta a un estímulo de luz en una célula no fotosensible, lo cual corrobora que pScop2-Gq es suficiente para formar un fotopigmento funcional, capaz de señalizar en una forma luz-dependiente.
3.1 Futuras Investigaciones
La identificación de pScop2 como el fotopigmento de los fotorreceptores ciliados de Pecten y la demostración de que es posible implantarlo heterólogamente abre importantes posibilidades para ulteriores estudios y aplicaciones. El fotopigmento pScop2 es térmicamente estable, contrariamente a las rodopsinas de vertebrados en las cuales la transición al estado activo forma un intermediario altamente inestable (Metarodopsina II en mamíferos), que decae rápidamente a un estado disociado entre la opsina y el retinal (Tsukamoto y Terakita, 2010).
Este proceso se conoce como blanqueamiento del fotopigmento (Wald et al., 1950), y contribuye a la disminución de la sensibilidad de la célula ante iluminación intensa y sostenida, permitiendo una expansión del rango dinámico: la reducción del número de opsinas disponibles disminuye la probabilidad de absorción de luz, resultando en respuestas más pequeñas ante el mismo estímulo. (Burkhardt, 1994).
Una consecuencia inevitable del blanqueamiento es la necesidad de un mecanismo de regeneración del fotopigmento. En el caso de la retina de vertebrados, este ciclo visual (Wald, 1934) involucra una maquinaria enzimática compleja (Hubbard y Wald, 1952-53; Saari, 1999) que ni siquiera reside en el fotorreceptor mismo, y requiere el transporte del cromóforo entre diferentes células de la retina
En cambio, el fotopigmento de las células ciliadas de P. irradians al ser isomerizado es convertido a un estado activo térmicamente estable (meta-rodopsina), en el cual la opsina y el cromóforo permanecen unidos. Además, la meta-rodopsina también absorbe luz visible, pero con un espectro diferente a la forma inactiva. La absorción de luz por la metarodopsina causa una fotoisomerización al estado inicial inactivo fisiológicamente. Este fenómeno de biestabilidad y fotoregeneración del fotopigmento ha sido medido en este bivalvo por métodos eléctricos que miden las consecuencias físicas de la isomerización y sus efectos fisiológicos (Cornwall y Gorman, 1983; Arenas et al. Manuscrito en preparación).
Esta bi-estabilidad trae consigo dos consecuencias importantes: 1) el estado activo se puede rápidamente terminar con simple iluminación cromática 2) En un sistema heterólogo se puede activar repetidamente el fotopigmento, sin la necesidad de una maquinaria bioquímica de regeneración. Hay un antecedente que documenta estas propiedades en un ortólogo de pScop2, AmphiRh, el cual se expresa en Branchiostoma; este fotopigmento fue examinado en ensayos espectroscópicos in-vitro, luego de expresión heteróloga en células cultivadas y purificación (Koyanagi et al., 2002; Terakita et al., 2004; Tsukamoto et al., 2005). Adicionalmente, se ha demostrado la capacidad de esta proteína de unirse no solamente a 11-cis-retinal, sino también a all-trans-retinal, formando un producto que es indistinguible espectrofotométricamente a la forma activa fisiológicamente en ensayos de reconstitución (Tsukamoto et al., 2005). Esta capacidad de ligar all-trans-retinal no ocurre en pigmentos que sufren blanqueamiento al fotoisomerizarse (Tsukamoto y Terakita, 2010). Las implicaciones de la bi-estabilidad son que en principio debería ser posible ejercer control sobre la activación e inactivación de pScop2 hetrólogamente expresado, usando luces de diferentes longitudes de onda. Aún no se ha explorado la capacidad de esta molécula de ser re-isomerizada por luz roja en un sistema heterólogo, como ocurre con el pigmento nativo. Para evaluar esta posibilidad es necesario que la cascada del sistema hospedero tenga mecanismos de inactivación similares a los de los fotoreceptores nativos. De lo contrario, aunque el
56 Identificación funcional de una nueva opsina como fotopigmento
fotopigmento sufriera inactivación por fotoconversión M R el resto de la cascada seguiría activada y no se vería el efecto fisiológico de la biestabilidad.
Si esta capacidad de fotoconversión reversible se conservara en la opsina expresada heterólogamente, esto sería de gran interés biotecnológico porque permitiría activar y desactivar una vía de señalización dependiente de proteínas G. El alcance de este acercamiento es potencialmente grande: los diferentes espectros de absorción de la forma R y M de pScop2 permiten dosificar la fracción de fotopigmento activado, al variar el contenido cromático del estímulo. Por otra parte, el intercambio de dominios ICL3 permite, en teoría, acoplar a pScop2 a cualquier vía de señalización mediada por proteínas G heterotriméricas.
Esta herramienta tendría gran potencial para controlar experimentalmente y estudiar una gama variada de procesos fisiológicos in-vivo o intervenir en situaciones patológicas, un equivalente metabotrópico de los “Channel-opsins”, canales iónicos directamente activados por luz, que han revolucionado el campo de las neurociencias recientemente (Para revisión ver: Fenno et al., 2011).
4. Conclusiones
pScop2 es el fotopigmento nativo de las células ciliadas de Pecten irradians.
Los experimentos con RNAi demostraron su capacidad de fotoisomerización y su
relevancia en la cascada de transducción de estas células.
pScop2 tiene la capacidad de inducir fotosensibilidad a una célula no fotosensible.
Adicionalmente, la capacidad de cambiar la proteína G por la cual transduce, al
hacer intercambio de ICL3, y la posible conservación de sus características
biestables en un sistema heterólogo, lo convierte en una herramienta
biotecnológica con gran potencial en investigación.
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