1.-TITULO

Extensión para PCR en tiempo real de la práctica ‘Investigación de OGMs’. Práctica 1. 2.-OBJETO Realización  de  una  práctica  de  investigación  de  OGMs  mediante  seguimiento  de  las  reacciones  de  PCR  en  tiempo  real.  

3.-ALCANCE Alumnado  del  módulo  “Ensayos  Biotecnológicos”  correspondiente  al  CFGS  “Laboratorio  de  Análisis  y  de  Control  de  Calidad”  

4.-REFERENCIAS • Biotechnology  Explorer™  GMO  Investigator™  Kit  (Catalog  #166-­‐2500EDU.  BIO-­‐RAD)  • Biotechnology  Explorer™  GMO  Investigator™  Kit:  A  Quantitative  Real-­‐Time  PCR  

Extension.  

5.-DESCRIPCION

5.1.- Fundamento

La  PCR   convencional   es   ideal  para  detectar   la  presencia  del  ADN  correspondientes  al   par  de  cebadores  objetivo.  Esta  técnica  detecta  el  producto  amplificado  (amplicón)  por  un  análisis  a  punto   final,   esto   es,   haciendo   correr   el   ADN   en   un   gel   de   agarosa   después   de   que   las  reacciones   se   han   completado.   Si   la   secuencia   de   ADN   diana   no   está   allí,   no   aparecerá   el  amplicón   en   el   gel   de   agarosa.     Si   al   menos   una   única   molécula   de   ADN   que   contiene   la  secuencia   de   ADN   diana   está   en   la   muestra,   la   amplificación   después   de   25-­‐30   ciclos   es  suficiente   para   generar   amplicones   detectables   a   través   electroforesis.     Por   lo   tanto,   la   PCR  convencional  se  un  ensayo  altamente  sensible  para  detectar  una  secuencia  específica  de  ADN,  lo  que  es  útil  para  el  diagnóstico  de  enfermedades,  especialmente  las  de  tipo  viral.    Es  también  un  ensayo  rápido,  altamente  sensible  y  específico  para  la  detección  de  microbios  en  muestras  ambientales.      Mediante  el  uso  de  la  transcriptasa  inversa,  la  PCR  convencional  se  ha  convertido  también  en  el   estándar   para   la   detección   de   dianas   de  ARN,   ensayo   útil   para   el   análisis   de   la   expresión  génica   en   investigación   y   diagnóstico  médico.     En   este   caso,   la   transcriptasa   inversa   genera  ADN  a  partir  de  una  plantilla  de  ARN,  formando  un  molde  para  la  amplificación  de  polimerasa  PCR.    

La   PCR   en   tiempo   real   se   basa   en   los   mismos   principios   que   la   PCR   convencional.     La  reacción   requiere   dos   cebadores   para   ahorquillar   la   región   de   destino   (amplicón),   y   una  ADN   polimerasa   tal   como   Taq.   Sin   embargo,   la   PCR   en   tiempo   real   permite   que   la  acumulación   de   producto   amplificado   sea   detectada   y  medida   a  medida   que   la   reacción  tiene   lugar,   en   "tiempo   real".     La   diferencia   es   la   adición   de   una   sustancia   química   que  emite   fluorescencia,   lo  que  permite  aue   la  amplificación  del  producto   sea  monitorizada  a  medida   que   tiene   lugar   la   reacción   despolimerización   usando   termocicladores  especializados   equipados   con   módulos   de   detección   de   fluorescencia.     La   fluorescencia  medida  refleja  la  cantidad  de  producto  amplificado  en  cada  ciclo.  Los  resultados  pueden  ser  cualitativos  (presencia  o  ausencia  de  una  secuencia)  o  cuantitativos  (número  de  copias  de  ADN).  

A  medida  que  las  reacciones  de  PCR  se  suceden,  el  colorante  I  de  la  SYBR®Green  se  une  con  el  ADN  de  doble  hebra  generado  por  el  proceso  de  PCR.    Con  cada  ciclo  de  la  reacción  de  PCR,  la  cantidad  de  ADN  de  doble  cadena  producida  y  la  fluorescencia  aumentan.    Eventualmente,  la  fluorescencia  emitida  por  las  reacciones  alcanzan  el    nivel  mínimo  de  detección  del  instrumento  y  continua  aumentando  con  cada  ciclo.  Finalmente,  cuando  las  reacciones  de  PCR  se  quedan  sin  reactivos,  la  fluorescencia  deja  de  aumentar.    Son  reactivos  limitantes  los  nucleótidos,  los  cebadores,  el  ADN  molde,  la  ADN  polimerasa,  y  el  colorante  fluorescente  I  de  la  SYBR®Green.      5.2 Material necesario.  

5.2.1 Equipamiento. • Termociclador  PCR  en  tiempo  real.  

5.2.2 Materiales • OGM  Investigator  kit  (166-­‐2500EDU)  

5.2.3 Reactivos • Small  DNA  Electrophoresis  Reagent  Pack  (166-­‐0450EDU)  • iQ  SYBR  Green  Supermix  (170-­‐8880EDU)  • Agua  ultrapura  para  PCR  sin  impurezas  biológicamente  activas  

5.2.4.- Disoluciones

5.3 Procedimiento operativo. 5.3.1.  Programación  del  termociclador.  

Siguiendo  las  instrucciones  del  equipo  utilizado,  se  debe  programar  el  termociclador  según  el  siguiente  protocolo:  Volumen  de  la  reacción:  25  µl  

La  temperatura  cumbre  será  95-­‐100ºC  

Ciclo  1:    95ºC  durante  4min.      

Ciclo  2:     94ºC  durante  1min.  

    59ºC  durante  1min.  

    72ºC  durante  2min.  

  Repetir  segundo  ciclo  40  veces.  

Ciclo   3:   Análisis   de   la   curva   de   fusión.   Programar   el   termociclador   para   calentar   las  muestras  desde  55ºC  a  95ºC  en   incrementos  de  0.5ºC  y  recolectar   los  datos  (o   leer   las  muestras)   después   de   10s   para   cada   incremento.   Alternativamente,   utilizar   el   equipo  para  la  recolección  de  datos  para  análisis  de  curva  de  fusión.  

Guardar  el  protocolo  en  la  librería  del  equipo.  

5.3.2.  Preparación  de  reactivos  

1. Localizar  los  reactivos  siguientes:  

• iQ  SYBR®Green  Supermix  

• Control  de  ADN  OGM  positivo  (a  partir  de  ahora  OGM(+).)  

• Cebadores  de  plantas  

• Cebadores  de  OGM  

2. Descongelar  en  hielo  todos  los  reactivos  y  homogenizar  en  vórtex  o  mediante  golpecitos  en  los  tubos.  

3. Centrifugar    para  que  las  disoluciones  se  vayan  al  fondo  de  los  tubos  (10  segundos  a  velocidad  máxima)  

4. Mantener  en  hielo.  

5.3.3.  Preparación  de  las  muestras  de  ADN  

5. Colocar  el  control  de  ADN  OGM(+).  

6. Etiquetar  ocho  tubos  con  tapón  roscado  para  las  siguientes  diluciones  estándar:  sin  diluir  (1),  1/10,  1/100,  10-­‐3,  10-­‐4,  10-­‐5,  10-­‐6  y  CSM  (control  sin  molde).  

7. Añadir  50  µl  de  control  OGM(+)  al  tubo  #1  para  la  muestra  sin  diluir.  

8. Añadir  90  µl  de  agua  destilada  estéril  a  cada  uno  de  los  tubos  #2  a  #8.  

9. Añadir   10   µl   de   control   OGM(+)   al   tubo   #2   para   obtener   la   dilución   1/10.   Mezclar  repetidamente  con   la  ayuda  de   la  micropipeta  para  asegurarse  de  que  todo  el  ADN  ha  sido  vertido  y  mezclado  a  conciencia.  Homogenizar  mediante  vórtex  durante  al  menos  10s.  ó  dando  20  golpecitos  al  tubo.  

10. Preparar  las  diluciones  seriadas  de  ADN:  

a. Transferir  10  µl  del  ADN  diluido  desde  el  tubo  #2  al  tubo  #3.  Homogenizar  concienzudamente.  

b. Transferir  10  µl  del  ADN  diluido  desde  el  tubo  #3  al  tubo  #4.  Homogenizar  concienzudamente.  

c. Transferir  10  µl  del  ADN  diluido  desde  el  tubo  #4  al  tubo  #5.  Homogenizar  concienzudamente.  

d. Transferir  10  µl  del  ADN  diluido  desde  el  tubo  #5  al  tubo  #6.  Homogenizar  concienzudamente.  

e. Transferir  10  µl  del  ADN  diluido  desde  el  tubo  #6  al  tubo  #7.  Homogenizar  concienzudamente.  

f. El  tubo  #8  se  deja  sin  añadir  molde  para  la  CSM.    En  cada  caso,  se  debe  mezclar  repetidamente  con  la  ayuda  de  la  micropipeta  para  asegurarse  de  que  todo  el  ADN  ha  sido  vertido  y  mezclado  a  conciencia.  Homogenizar  mediante  vórtex  durante  al  menos  10s.  ó  dando  20  golpecitos  al  tubo.  

5.3.4.  Preparación  de  los  tubos  de  PCR  

11. Por  cada  serie  de  dilución  utilizar  una  tira  de  tubos  de  PCR  de  8  pocillos.  Etiquetar  cada  tubo  con  el  nombre  del  molde  y  la  referencia  del  nivel  de  dilución,  poniendo  atención  en  escribir  únicamente  en  los  laterales  de  los  tubos.  Por  ejemplo,  la  tira  de  ocho  tubos  para  el   grupo   que   analiza   los   cebadores   de   plantas   con   el   control   de   ADN   OGM(+)   serian  etiquetados  del  siguiente  modo:  PMM.1,  PMM.1/10,  PMM.1/100,  PMM.10-­‐3,  PMM.10-­‐4,   PMM.10-­‐5,   PMM.10-­‐6   y   PMM.CSM.   Asegurarse   de   que   las   reacciones   están  programadas  en  el  termociclador  en  la  forma  exacta.  

5.3.5.  Preparación  de  los  mastermix  

12. Para  cada  serie  de  dilución  de  ocho  tubos  se  precisan  150µl  de  iQ  SYBR®Green  2x  y  1.5µl    de  cebadores,  ya  sean  del  fotosistema  II  (a  partir  de  ahora  PSII)  de  plantas  o  del  OGM  Rojo  en  función  del  plan  de  trabajo.    Todos  los  pasos  siguientes  se  deben  realizar  en  hielo.  

13. Etiquetar  dos  tubos  de  tapón  roscado  según  lo  indicado  a  continuación:  

• “PMM”  para  ‘mastermix  plantas’  

• “GMM”  para  ‘mastermix  OGM’  

14. Añadir    150  µl  del  iQ  SYBR®Green  supermix  a  ambos  tubos.    

15. Añadir  1.5µl  de  cebadores  de  plantas  al  tubo  etiquetado  “PMM”.  Pipetear  repetidas  veces  para  garantizar  que  el  ADN  es  liberado  en  el  tubo;  homogenizar  a  conciencia,  girar  hacia  abajo.  

16. Añadir  1.5µl  de  cebadores  de  OGMs  al  tubo  etiquetado  GMM.  Pipetear  repetidas  veces  para  garantizar  que  el  ADN  es  liberado  en  el  tubo;  homogenizar  a  conciencia,  girar  hacia  abajo.  

5.3.6.  Adición  del  mastermix  al  tubo  de  PCR    

17. Distribuir  12.5µl  del  mastermix  de  plantas  (PMM)  a  cada  uno  de  los  8  tubos  de  la  tira  correspondiente.  

18. Distribuir  12.5µl  del  mastermix  de  OGMs  (GMM)  a  cada  uno  de  los  8  tubos  de  la  tira  correspondiente.  

19. La  configuración  de  la  placa1  completa  debería  ser  similar  a  la  indicada  en  la  imagen  siguiente:  

                                                                                                                         1  Para  una  placa  de  termociclador  de  48  pocillos.  Si  se  dispone  de  un  termociclador  con  placa  de  96  pocillos  se  puede  ampliar  la  práctica  poniendo  más  reacciones  con  distintos  mastermixes  (PMM,  GMM)  o  haciendo  más  réplicas.  

 Configuración  de  la  placa.  Las  columnas  1-­‐3  representan  muestras  con  mastermix  de  plantas  (PMM),  las  columnas  4-­‐6  representan  muestras  con  mastermix  de  OGMs  (GMM).  

5.3.7.  Adición  de  muestras  de  ADN  a  los  tubos  

20. Añadir  12.5µl  del  tubo  #1  (sin  diluir)  a  los  tubos  de  reacción  apropiados.  ATENCION:  usar  una  punta  de  pipeta  nueva  en  cada  caso.  Homogenizar  cada  reacción  generosamente  mediante  algunos  movimientos  suaves  de  pipeteo  ascendentes/descendentes.  Se  debe  recordar  que  se  realizará  una  lectura  óptica  por  lo  que  es  importante  no  introducir  burbujas  en  la  mezcla  de  reacción.  

21. Repetir  el  paso  anterior  hasta  completar  todas  las  diluciones  (tubos  #2  a  #7)  así  como  para  la  reacción  del  control  sin  molde  (#8).    

22. Una  vez  completadas  la  placa  debería  mostrar  la  siguiente  configuración:  

 Configuración  de  la  placa.  Las  columnas  1-­‐3  representan  muestras  con  mastermix  de  plantas  (PMM),  las  columnas  4-­‐6  representan  muestras  con  mastermix  de  OGMs  (GMM).  Las  filas  A-­‐G  representan  la  adición  de  controles  GMO(+)  a  las  concentraciones  indicadas.  La  fila  H  representa  el  control  sin  molde.  

5.3.8.  Reacción  de  PCR  

23. Lanzar  las  reacciones  en  el  termociclador  a  tiempo  real.  

24. Observar  las  reacciones  de  PCR  en  tiempo  real  y  su  progresión  durante  los  sucesivos  ciclos.  (De  exisitir  la  posibilidad,  es  una  buena  idea  conectar  el  ordenador  al  cañón  de  

proyección  del  laboratorio).  

5.3.9.  Creación  de  curvas  estándar  

25. Prácticamente  todos  los  equipos  de  PCR  en  tiempo  real  disponen  de  software  para  la  creación  de  curvas  estándar.  Síganse  las  instrucciones  del  manual  del  usuario  del  equipo  a  utilizar.  Otra  alternativa  es  trasvasar  los  datos  a  una  hoja  de  cálculo  y  generar  la  curva  en  él,  o  directamente  sobre  papel  semilogarítmico.  Representar  los  valores  CT  sobre  el  eje  x,  y  los  valores  logarítmicos  sobre  el  eje  y.  El  factor  de  dilución  puede  ser  usado  para  el  eje  y,  o  también  un  número  arbitrario  de  copias:  10  copias  del  ADN  molde  de  inicio  en  la  dilución  10-­‐6,  100  copias  del  molde  de  inicio  en  la  dilución  10-­‐5,  etc.    Se  obtienen  dos  curvas,  una  para  las  reacciones  que  utilizan  cebadores  de  plantas  (PMM)  y  otra  para  las  que  usan  cebadores  de  OGMs  (GMM).  

5.3.10.  Análisis  por  electroforesis  en  gel.  

Se  debe  recordar  que  la  técnica  de  PCR  en  tiempo  real  proporciona  información  específica  sobre  la  cantidad  de  molde  de  partida,  mientras  que  la  electroforesis  en  gel  de  agarosa  ofrece  información  sobre  el  tamaño  de  los  amplicones  producidos.  Los  cebadores  de  plantas  de  esta  práctica  producen  un  amplicón  de  unos  455pb,  y  los  de  OGMs  producen  2  amplicones  de  203  y  225pb.  Sin  embargo,  en  usencia  de  molde  de  partida  (como  ocurre  en  el  tubo  #8  CSM  o  en  la  dilución  10-­‐6),  los  mismos  cebadores  producirán  un  amplicón  de  dímeros  de  cebador  de  un  tamaño  mucho  menor.  

 

La  gráficas  de  PCR  en  tiempo  real  obtenidas  para  el  producto  de  PCR  buscado  y  para  el  artefacto  de  dímeros  de  cebador  son  muy  semejantes,  mientras  que  los  patrones  de  bandas  obtenidas  en  gel  de  agarosa  para  esos  dos  productos  son  completamente  distintos.  Así  las  cosas,  para  ganar  experiencia  en  la  interpretación  de  resultados  de  PCR  en  tiempo  real  que  puedan  contener  tanto  los  amplicones  esperados  como  artefactos  diméricos,  es  muy  recomendable  separar  por  electroforesis  en  gel  de  agarosa  los  productos  de  la  PCR  en  tiempo  real.        

26. Preparar  geles  de  agarosa  al  3%  con  suficientes  vías  como  para  analizar  al  menos  una  serie  completa  de  diluciones  con  cebadores  de  plantas  y  una  serie  completa  de  diluciones  con  cebadores  de  OGMs  (ambas  incluyendo  el  CSM),  más  una  vía  adicional  para  la  regla  molecular  de  ADN.  Esto  es,  al  menos  17  vías.  

27. Añadir  6  µl  de  tampón  de  carga  Orange  G  a  cada  tubo  de  reacción  de  25  µl  que  vaya  a  ser  cargado  en  el  gel.  

28. Añadir  50  µl  de  tampón  de  carga  Orange  G  al  vial  de  la  regla  molecular  de  pesos  para  PCR.  Mezclar  bien  y  centrifugar.  

29. Cargar  20  µl  de  cada  muestra  de  PCR  y  20  µl  de  regla  molecular  en  el  gel  de  agarosa.  

30. Correr  el  gel  de  agarosa  a  100V  durante  30min.  

31. Analizar  los  resultados.  

 

Esquema gráfico

6.- Tratamiento de datos (Resultados esperados)  

Los  productos  descritos  en  esta  sección  crean  una  serie  de  diluciones  del  ADN  molde.  Las  reacciones  de  PCR  en  tiempo  real  mostrarán  una  serie  de  curvas  semejantes  a  las  mostradas  en  el  gráfico  siguiente.  El  ADN  #1  (sin  diluir),  más  concentrado,  da  curvas  que  aparecen  “de  forma  temprana”,  por  ejemplo,  antes  del  ciclo  10.  Las  más  diluidas  aparecen  después  (más  a  la  derecha).  Como  quiera  que  las  curvas  de  amplificación  obtenidas  en  los  equipos  de  PCR  en  tiempo  real  son  dependientes  y  proporcionales  a  la  concentración  inicial  de  ADN,  a  medida  que  el  ADN  va  siendo  más  diluido,  las  curvas  van  estando  cada  vez  más  desplazadas  hacia  la  derecha,  tal  y  como  se  muestra  en  el  siguiente  ejemplo.  

 Gráfico  de  amplificación  de  PCR  en  tiempo  real.  Rojo=10x;  verde=100x;  azul=1000x;  amarillo=10.000x;  rosa=100.000x;  cian=1.000.000x.  No  se  muestran  en  este  gráfico  la  muestra  sin  diluir  (1x)  ni  el  control  sin  molde  (CSM).  Obsérvese  que  los  datos  de  fluorescencia  se  muestran  es  escala  logarítmica.  

7.- Notas de seguridad y medioambiente

8.- Anexos