ihk sod

7/25/2019 IHK SOD

1/8

Wresdiyatiet al Jurnal Veteriner

Pengaruh -Tokoferol Terhadap Profil Superoksida Dismutase

dan Malondialdehida pada Jaringan Hati Tikus di Bawah

Kondisi Stres

THE EFFECT OF -TOCOPHEROL ON THE PROFILES OF SUPEROXIDE DISMUTASEAND MALONDIALDEHYDE IN THE LIVER OF RATS UNDER STRESS CONDITION

Tutik Wresdiyati

1

, Made Astawan

2

, Diini Fithriani

2

, I Ketut Mudite Adnyane

1

, Savitri

Novelina

1

, dan Saptina Aryani

1

1)Bagian Ana omi, Histologi, dan Embriologi, Departemen Anatomi, Fisiologi, danFarmakologi, Fakultas K dokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor

te

or

Jl. Agatis Kampus IPB Dramaga, Bogor, Telp/Fax: 0251-421823, email: [email protected])Bagian Biokimia, Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian,

Institut Pertanian Bog

ABSTRACT

The present study was conducted to observe the effect of -tocopherol on the profile ofsuperoxide dismuase (SOD) and malondialdehyde (MDA) in the liver of rats under stress condition. Atotal of twenty five male Wistar rats were used for this study. They were divided into five groups i.e.(1) a control group, without treatment of both stress and -tocopherol, (2) a stress group was treatedby stress only, without -tocopherol treatment, (3) treated with stress condition followed by treatmentwith -tocopherol, (4) Treated with -tocopherol followed by stress condition, and (5) Treated with -tocopherol before and after stress condition. The stress condition was achieved by five days fastingaccopmpanied by swimming for 5 min/day and only drinking water ad libitum. -Tocopherol was orallyadministrated at a dose 60 mg/Kg/BW/day for seven days. The stress condition decreased SODactivity and Cu,Zn-SOD level, and increased MDA level in the rat liver of stress group as compared tothose of control group. Treatment with -tocopherol increased SOD activity and Cu,Zn-SOD level.

The best results were obtained in rats treated with -tocopherol before and after stress conditionwhich increased both SOD activity (3.7 times) and Cu,Zn-SOD content, and decreased MDA level to80,69%.

Key words : -tocopherol, liver, rat, stress, superoxide dismutase

ABSTRAK

Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari pengaruh -tokoferol terhadap profil superoksidadismutase (SOD) dan malondialdehida (MDA) pada jaringan hati tikus di bawah kondisi stres.Sebanyak dua puluh lima ekor tikus jantan galur Wistar digunakan dalam penelitian ini dan dibagimenjadi lima kelompok perlakuan yaitu (1) kelompok kontrol (tanpa perlakuan stres maupun -tokoferol), (2) kelompok stress (perlakuan stres tanpa pemberian -tokoferol), (3) kelompok stressyang kemudian diberi -tokoferol, (4) kelompok perlakuan -tokoferol yang kemudian diberiperlakuan stres, dan (5) kelompok perlakuan -tokoferol sebelum dan sesudah perlakuan stress.Perlakuan stress diberikan dengan cara puasa selama 5 hari dan berenang selama 5 menit/haridengan pemberian air minum secara ad libitum.Perlakuan -tokoferol diberikan secara oral dengandosis 60 mg/Kg/BW/day selama tujuh hari. Kondisi stres menurunkan aktivitas SOD dan kandunganCu,Zn-SOD, serta meningkatnya kadar MDA jaringan hati bila dibandingkan kelompok kontrol.Pemberian -tokoferol meningkatkan aktivitas SOD dan kandungan Cu,ZnSOD, dan menurunkankadar MDA dalam jaringan hati tikus. Pemberian -tokoferol dengan cara kombinasi sebelum dansesudah perlakuan stress memberikan hasil yang terbaik, yakni dapat meningkatkan kandunganCu,Zn-SOD, dan aktivitas SOD sebanyak 3,7 kali, serta menurunkan kadar MDA sampai 80,69%dalam jaringan hati bila dibandingkan kelompok kontrol..

Kata kunci : -tokoferol, hati, tikus, stress, superoksida dismutase-----------------------------------------------------------------------------

202

7/25/2019 IHK SOD

2/8


PENDAHULUAN

Radikal bebas sangat diperlukan bagikelangsungan beberapa proses fisiologisdalam tubuh, terutama untuk transportasi

elektron. Namun, radikal bebas yangberlebihan dapat membahayakan tubuhkarena dapat merusak makromolekul dalamsel seperti karbohidrat, protein, DNA dansebagainya. Kerusakan makromolekul se-lanjutnya dapat mengakibatkan kematiansel (Halliwel and Gutteridge, 1999). Secaranormal, tubuh mempunyai strategi yangsistematis untuk memerangi pembentukanradikal bebas atau untuk mempercepatdegradasi senyawa tersebut. Sistem inidapat dibagi menjadi dua kelompok besar,

yaitu sistem pertahanan preventif sepertienzim superoksida dismutase; copper zinc-superoxid dismutase (Cu,Zn-SOD) (Frido-vich, 1975) dan manganese supe xide dis-mutase (Mn-SOD) (Marklund, 1984), kata-lase dan glutation peroksidase (Asayama etal., 1996) dan sistem pertahanan melaluipemutusan reaksi radikal seperti -tokoferol,vitamin C dan vitamin A.

ero

Cu,Zn-SOD merupakan salah satuantioksidan endogen yang amat berperandalam mengkatalisasi radikal bebas anionsuperoxide menjadi hidrogen peroksida dan

molekul oksigen (Mates et al., 1999).Dengan kemajuan teknik imunositokimia,sel-sel penghasil SOD telah dapat dideteksipada jaringan tikus (Dobashi et al., 1989;Wresdiyati and Makita, 1997). Profil SODjuga telah dilaporkan secara imuno-histokimia pada kondisi patofisiologis sepertistres, diabetes mellitus dan hiper-koleste-rolemia (Wresdiyati et al., 2002; Wresdiyati,2003; Wresdiyati et al., 2003; Wresdiyati etal., 2006), serta pada jaringan neoplastik(Keller et al., 1991). Wresdiyati dan Makita

(1995) melaporkan bahwa kondisi stresdapat meningkatkan jumlah peroksisompada jaringan ginjal kera jepang. Pening-katan jumlah radikal bebas tersebut dapatmeningkatkan oksidasi yang terjadi diperoksisom. Sebagai akibatnya, produksiradikal bebas juga meningkat sebagai hasilsamping oksidasi tersebut. Peningkatankadar radikal bebas dalam kondisi stresstelah dilaporkan oleh Wresdiyati et al (2002)dan Wresdiyati (2003), yang ditunjukkandengan menurunnya kandungan antioksidanintrasel seperti copper, zinc-superoksida

dismutase (Cu,Zn-SOD) pada jaringan hatidan ginjal tikus di bawah kondisi stres.

Alfatokoferol adalah antioksidaneksogen yang banyak dipakai dalampengobatan. Peneltian ini dilakukan untuk

mengetahui pengaruh pemberian -tokoferol terhadap profil antioksidan intraselsuperoksida dismutase (SOD), yang meliputiaktivitas SOD dan kandungan Cu,Zn-SOD,dan malon-dialdehida (MDA) pada jaringanhati tikus di bawah kondisi stres. Pemberian-tokoferol diharapkan dapat mencegahkerusakan sel atau organ tubuh akibatakibat stres.

METODE PENELITIAN

Hewan Percobaan dan Pengambilan SampelPada penelitian ini digunakan 25 ekortikus jantan galur Wistar dengan beratbadan 250 g. Setelah diadaptasikan terha-dap lingkungan kandang selama kuranglebih dua minggu, tikus dikelompokkanmenjadi lima kelompok perlakuan dan setiapkelompoknya terdiri atas lima ekor tikus(Tabel 1). Perlakuan stres diberikan dengancara puasa (tidak diberikan pakan), tetapidiberi air minum ad libitum sertaperenangan selama lima menit/hari selamalima hari. -tokoferol dilarutkan dalamminyak jagung dengan dosis 60 mg/Kg/BB/hari dan diberikan ke tikus menggunakansonde. Tikus selanjutnya diberikan pakansecara ad libitum. Setelah perlakuan sesuaidengan rancangan, tikus dibunuh dansampel jaringan hati diambil dari setiaptikus.Sampel jaringanhati dari setiap ekortikus dibagi tiga berturut-turut untukanalisis aktivitas SOD, kandungan Cu,Zn-SOD, dan kadar MDA.

Analisis Aktivitas SOD Hati Tikus

Sebanyak 400 l larutan kloroform/etanol dingin 37,5/62.5 (v/v) ditambahkan kedalam 150 l lisat hati. Kemudian divorteksselama tiga detik dan disentrifus padakecepatan 4400 rpm suhu 4C selama 10menit. Sebanyak 2,9 ml larutan A(campuran larutan xantin dan larutansitokrom c) ditambah 50 l larutan baku(kontrol) atau sampel dan divorteks secaraperlahan. Reaksi dimulai dengan menam-bahkan 50 l larutan B (xantin oksidase)dan divorteks secara perlahan. Pengamatan

terhadap perubahan absorban yang terjadi

203

7/25/2019 IHK SOD

3/8


dilakukan dengan spektro-fotometer (Chenet al., 1996).

Deteksi Imunohistokimia terhadap Cu, Zn-

SOD.

Jaringan hati difiksasi selama 24 jamdalam larutan Bouin, dan selanjutnyadiproses dengan metode standar menggu-nakan paraffin. Pewarnaan imunohisto-kimia pada preparat jaringan hati terhadapCu,Zn-SOD dilakukan sesuai dengan metodeyang dijabarkan Dobashi et al. (1989)

dengan sedikit modifikasi. Setelah dila-kukan inaktivasi terhadap peroksidaseendogen, potongan jaringan diinkubasi da-lam antibodi monoklonal anti-Cu,Zn-SOD(Sigma S2147) dan dilanjutkan dengan

inkubasi dalam antibodi sekunder (DakoK1491). Produk reaksi antigen-antibodidivisualisasi dengan penambahan diaminobenzidine (DAB). Profil antioksidan Cu,Zn-SOD pada jaringan hati tersebut diamatiberdasarkan distribusi dan frekuensiantioksi dan tersebut pada jaringan hati.

Tabel 1. Kelompok perlakuan tikus percobaan dan jenis perlakuan yang diberikan

PerlakuanKelompok -tokoferol (7 hari)

60 mg/Kg/BB/hari

Stres (5 hari)* -tokoferol (7

hari) 60mg/Kg/BB/hari

Kontrol - - -S - + -TS + + -ST - + +TST + + +Keterangan :+ : diberi perlakuan T = -tokoferol

- : tanpa perlakuan S = Stres* : puasa 5 hari dan perenangan 5 menit/hari

Pengamatan dilakukan secara kualitatifpada sitoplasma dan inti sel hati, sertadihitung secara kuantitatif pada inti sel hatiberdasarkan intensitas warna cokelat yangterbentuk. Intensitas warna cokelat tersebutmenunjukkan kandungan Cu,Zn-SOD, ma-kin tua warnanya dan makin meratanyaproduk reaksi menunjukkan makin banyakkandungan Cu,Zn-SODnya. Pengamatankuantitatif dilakukan terhadap inti seltubuli renalis yang memberikan reaksipositif pada berbagai tingkat kandunganterhadap Cu,Zn-SOD (cokelat tua atau

positif kuat/+++, cokelat sedang atau positifsedang/++, dan cokelat muda campur biruatau positif lemah/ +, dan warna biru ataunegatif/-). Penghitungan inti sel-sel tersebutdilakukan 5 lapang pandang padapembesaran 400x yang dipilih secara acak.

Analisis Kadar MDA

Analisis kadar MDA dilakukanmenurut Conti et al., 1991. Pengukurankadar MDA menggunakan spektro-flouro-meter pada panjang gelombang eksitasi 515

nm dan emisi 553 nm. Kadar MDA sampel

yang diperoleh dinyatakan dalam satuanpmol per gram protein.

Analisis data.Hasil pengukuran aktivitas SOD,

kadar MDA, jumlah inti sel hati padaberbagai tingkat kandungan Cu,Zn-SOD hatitikus pada setiap kelompok perlakuandianalisis dengan sidik ragam. Perbedaanaktivitas SOD, kadar MDA, dan kandunganCu,Zn-SOD antar kelompok perlakuan diujilebih lanjut dengan uji beda Duncan.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Aktivitas Superoksida Dismutase pada Hati

Superoksida dismutase merupakanenzim yang berada dalam cairan intraseluleryang berpartisipasi pada proses degradasisenyawa radikal bebas intraseluler. Enzimini mempunyai sebuah atom oligo elemenpada sisi aktifnya. Superoksida dismutasemengkatalisis dismutasi O2 menjadi H2O2.Enzim ini menghambat kehadiran simultandari O2 dan H2O2 yang berasal dari

pembentukan radikal hidroksi (

OH).

204

7/25/2019 IHK SOD

4/8


Analisis aktivitas superoksidadismutase (SOD) pada hati tikusmenunjukkan bahwa kelompok kontrol (K)memiliki aktivitas SOD tertinggi yaitusebesar 5027.90 U/g dan aktivitas SOD

terendah diamati pada kelompok stres (S)yaitu sebesar 1223.33 U/g (Gambar 1).Analisis statistika menunjukkan bahwakelompok -tokoferolstres (TS), stres--tokoferol (ST), dan -tokoferol-stres--tokoferol (TST) tidak menunjukkan hasilyang berbeda nyata. Namun, dari ketiganyahanya kelompok TST saja yang tidakberbeda nyata dengan kelompok kontrol.Kelompok S nyata lebih rendah biladibandingkan dengan semua kelompokperlakuan (p

7/25/2019 IHK SOD

5/8


Tabel 2. Profil Kandungan Cu,Zn-SOD padajaringan hati tikus perlakuan

Jumlah rata-rata inti sel hatipada berbagai tingkat kandu-

ngan Cu,Zn-SOD perlapangpandang pada pembesaran 400x

Kelompok

+++ ++ + -K 42.34

3.67d28,672,52b

18,671.15b

8.331.58a

S 2.67 0.58a

3,001,00a

27,334.16c

59.004.59c

ST 27,673.51b

32,335,69c

12,333.51a

21.333.67b

TS 32.673.06c

28,676,03b

14,333.51ab

20.331.53b

TST 41.334.25d

26,331,53b

16,406.94b

11.332.89a

Keterangan : Notasi yang berbeda pada kolom yangsama menunjukkan nilai yang berbedanyata (p

7/25/2019 IHK SOD

6/8


K

ST

S

TSTTS

Gambar 2. Fotomikrograf jaringan hati tikus perlakuan yang diwarnai secaraimunohistokimia terhadap Cu,Zn-SOD. K=kontrol, S=stres, ST=stress--tokoferol, TS=-tokoferol-stress, TST=-tokoferol-stress -tokoferol.Skala=25m.

207

7/25/2019 IHK SOD

7/8


334.06

2551.8

523.21 544.84

a

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

Kontr ol S S+T T +S T +S+T

P e r l a k u a n

aa

b

a

492.67

Gambar 3. Kadar MDA hati tikusperlakuan. K=kontrol, S=stres,ST=stress--tokoferol, TS=-tokoferol-stress, TST=-toko-ferol- stress- -tokoferol.

Radikal bebas akan dinetralkanmenjadi produk yang lebih stabil oleh enzimantioksidan intraseluler, seperti superoksidadismutase, katalase, dan glutathionperoksidase. Peningkatan jumlah radikalbebas yang terus-menerus pada kondisi strespuasa akan meningkatkan pemakaian enzimantioksidan intraseluler. Hal ini dapatmenurunkan aktivitas maupun kandunganantioksidan, seperti terlihat pada kelompokstres dengan aktivitas SOD dan kandunganCu,Zn-SOD yang menurun secara tajam biladibandingkan kelompok kontrol.

Pemberian -tokoferol sebagai tindakanpreventif (TS), kuratif (ST) ataupunkombinasi keduanya (TST) ternyata dapatmengatasi penurunan aktivitas SOD dankandungan Cu,Zn-SOD, serta peningkatan

MDA yang terjadi pada kondisi stres. Halini disebabkan oleh -tokoferol yangberfungsi sebagai antioksidan, yang bereaksidengan radikal bebas untuk membentukproduk yang lebih stabil. Menurut Noguchidan Niki (1998), -tokoferol termasukantioksidan primer yang bekerja sebagaiantioksidan pemutus rantai dengan caramenjadi donor ion hidrogen bagi radikalbebas sehingga radikal bebas menjadimolekul yang lebih stabil. Hal ini membuatSOD lebih ringan dalam mengkatalis reaksi

dismutase radikal superoksida menjadiproduk lain yang lebih stabil, sehingga

kadarnya dalam sel menjadi lebih terjaga.Kadar MDA yang menurun pada kelompokyang diberi -tokoferol juga mengindi-kasikan berkurangnya jumlah radikal bebas.

Menurut Machlin (1991), -tokoferol

dapat disimpan oleh tubuh. Hati merupakansalah satu organ yang dapat menyimpan-tokoferol dalam jumlah besar. -tokoferolyang tersimpan dalam hati dapat bereaksidengan radikal bebas yang terbentuk padasaat stres, sehingga peningkatan radikalbebas pada kondisi stres dapat ditekan.Penurunan jumlah radikal bebas inimembantu mengurangi aktivitas danpenggunaan enzim SOD.

Pada kelompok TST, -tokoferoldiberikan sebagai tindakan preventif dan

sekaligus kuratif, dan pemberian -tokoferolkembali pada akhir stres dapat lebihmembantu dalam menurunkan kadarradikal bebas yang sebelumnya jumlahnyatelah berkurang dengan adanya simpanan -tokoferol. Akibatnya penggunaan enzimCu,Zn-SOD lebih sedikit jika dibandingkandengan kelompok ST dan TS. Hal inilahyang menjelaskan terjadinya peningkatanaktivitas SOD dan kandungan Cu,Zn-SOD,serta penurunan MDA yang terbaik terjadipada kelompok TST (Tabel 2, Gambar 1 - 3).

SIMPULAN

Pemberian -tokoferol dapat me-ngatasi profil superoksida dismutase danmalondialdehida pada jaringan hati tikuspada kondisi stres. Pemberian -tokoferolbaik secara preventif maupun kuratifberhasil mempertahankan aktivitas SODdan kandungan Cu,Zn-SOD, serta kadarMDA. Efek -tokoferol yang paling baikterlihat pada pemberian secara kombinasi

preventif dan sekaligus kuratif.

UCAPAN TERIMA KASIH

Penelitian ini sebagian didanai olehPenelitian Hibah Bersaing X dari ProyekPengkajian dan Penelitian Ilmu Penge-tahuan Terapan - Direktorat Pembinaan Pe-nelitian dan Pengabdian Pada Masyarakat,Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi, De-partemen Pendidikan Nasional No.

103/LII/BPPK-SDM/IV/2002 untuk TW.

208

7/25/2019 IHK SOD

8/8


DAFTAR PUSTAKA

Asayama KK, Dobashi Y, Kawada T,Nakane, Kawaoi A, Nakazawa S.1996. Immunohistochemical localiza-

tion and quantitative analysis ofcellular glutathione peroxidase infetal and neonatal rat tissues:fluorescence microscopy image analy-sis. Histoch m J 28:63-71.e

c

Chen HM, Muramoto K, Yamauchi F. 1996.Structural Analysis of Anti-oxidativePeptides from Soybean -Conglicinin.J Agria Food Chem43:574-578.

Conti M, Moramd PC, Levillain P,Lemonnier A. 1991. Improve Fluro-metric Determination of Malonal-

dehyde. J Clin Chem 37(7):1273-1275.Dobashi K, Asayama K, Kato K, Kobayashi

M, Kawaoi A. 1989. Immuo-histochemical localization andquantitative analysis of superoxidedismutase in rat tissue. ActaHistochem Cytochem22:351-365.

Fridovich I. 1975. Superoxide dismutases.Ann Rev Biochem 44:147-159.

Keller GA, Warner TG, Steimer KS,Halliwell RA. 1991. Cu, Zn-superoxide dismutase is a peroxi-

somal enzyme in human fibroblastsand hepatoma cells. Pro Natl AcadSci USA. 88:7381-7385.

Halliwell B, Guttridge JMC. 1989. Freeradicals in biology and medicine.Clarendon Press Oxford. Pp.301

Machlin LJ. 1991. Vitamin E In.Handbook ofVitamins. Ed.2. Marcel Dekker, Inc:New York. Pp. 99-136

Marklund SL. 1984. Extracellularsuperoxide dismutase and othersuperoxide dismutase isoenzymes in

tissues from nine mammalianspecies. Biochem J 222:649-655.

Mates JM, Gomez CP, Castro IN. 1999.Antioxidant enzymes and humandiseases. Clin Biochem 32(8):595-603.

Montgomery R, Dryer RL, Conway TW,Spector AA. 1993. Biokimia: SuatuPendekatan Berorientasi Kasus-Kasus Jilid 1. Diterjemahkan IsmadiM. Penerbit Gajah Mada UniversityPress. Yogyakarta.

Noguchi, Niki E. 1998. Chemistry of ActiveOxygen Species and Antioxidantdalam Antioxidant Status, Diet,Nutrition and Health CRC Press.Boca Raton. Pp: 3-20

Orellana M, Fuentes O, Rosenbluth H, LaraM, Valdes F. 1992. Modulatios of ratsliver peroxisomal and microsomalfatty acids oxidation by starvation.FEBS310: 193-196.

Wresdiyati T. 2003. ImunohistochemicalStudy of Oxygen-Free RadicalScavenger-Copper, Zinc-SuperoxideDismutase (Cu,Zn-SOD) in The RatsLiver Under Stress Condition Biota8: 107-112

Wresdiyati T, Makita T. 1995. Remarkable

increase of peroxisomes in the renaltubule cells of Japanese monkeysunder fasting stress. Pathophysiol2:177-182.

Wresdiyati T, Makita T. 1997. Immunocyto-chemical localization of Cu, Zn-SOD(Cooper, zinc-superoxide dismutase)in the renal tubules and glomerulusof rat kidney. Mol Biol of Cell8:342.

Wresdiyati T, Mamba K, Adnyane IKM,Aisyah US. 2002. The effect ofstress condition on the intracellularanti-oxidant copper, zinc-superoxide

dis-mutase in the rat kidney: animmunohistochemical study. Hayati9: 85-88.

Wresdiyati T, Lelana RPA, Adnyane IKM,Noor K. 2003. Immunohistoche-mical study of superoxide dismutase(SOD) in the liver of diabeticexperiment Macaca fascicularisHayati 10:61-65.

Wresdiyati T, Astawan M, Hastanti LY.2006. Profil imunohistokimia anti-oksidan superoksida dismutase

(SOD) pada jaringan hati tikus dibawah kondisi hiperkolesterolemia.Hayati (in press)

209

ihk sod

Documents